Summary
Kemirgenler migren semptomlarını bildiremezler. Burada, migrenli hastalarda en yaygın ve rahatsız edici semptomlardan biri olan ışıktan kaçınmayı ölçmek için yönetilebilir bir test paradigmasını (açık / karanlık ve açık alan testleri) açıklıyoruz.
Abstract
Migren, fotofobi olarak gözlenen, baş ağrısı ve ışığa aşırı duyarlılık gibi duyusal anormalliklerle karakterize karmaşık bir nörolojik bozukluktur. Bir farenin migren yaşadığını doğrulamak imkansız olsa da, ışıktan kaçınma, fotofobinin migren semptomu için davranışsal bir vekil olarak kullanılabilir. Işıktan kaçınmayı test etmek için, farelerin açık veya karanlık bir ortamda özgürce geçirmeyi seçtikleri zamanı ölçmek için açık / karanlık tahlilini kullanıyoruz. Tahlil, iki kritik modifikasyon getirilerek rafine edilmiştir: test prosedürünü çalıştırmadan önce odaya önceden maruz kalma ve ayarlanabilir oda aydınlatması, 55 lüks ila 27.000 lüks arasında bir dizi ışık yoğunluğunun kullanılmasına izin verir. Karanlıkta daha fazla zaman geçirme seçimi de kaygının göstergesi olduğundan, kaygıyı ışıktan kaçınan davranıştan ayırt etmek için ışıktan bağımsız bir anksiyete testi olan açık alan testini de kullanıyoruz. Burada, aydınlık / karanlık ve açık alan tahlilleri için değiştirilmiş bir test paradigmasını açıklıyoruz. Bu testlerin uygulanması, iki fare suşunda kalsitonin geniyle ilişkili peptidin (CGRP) intraperitoneal enjeksiyonu ve optogenetik beyin stimülasyon çalışmaları için tanımlanmıştır.
Introduction
Migren, Amerikalıların yaklaşık %17'sini etkileyen1 yaygın bir nörolojik hastalıktır ve dünya çapında ikinci önde gelen sakatlık nedenidir2,3. Hastalar aşağıdaki semptomlardan en az biriyle birlikte 4-72 saat süren baş ağrısı yaşarlar: bulantı ve / veya kusma veya fotofobi ve fonofobi4. Şu anda FDA onaylı olan kalsitonin geniyle ilişkili peptid (CGRP) antikorlarının geliştirilmesindeki son gelişmeler, migren tedavisi için yeni bir çağ başlatmıştır5,6,7. Bu antikorlar CGRP'yi veya reseptörünü bloke eder ve migren hastalarının yaklaşık %50'sinde migren semptomlarını önler7. Geçtiğimiz yıl içinde, CGRP reseptörünün iki küçük moleküllü antagonisti de migrenin abortif tedavisi için FDA onaylıdır ve iki tanesi daha boru hattındadır8. Bu terapötik ilerlemeye rağmen, migren ataklarının meydana geldiği mekanizmalar hala belirsizliğini korumaktadır. Örneğin, CGRP eyleminin siteleri bilinmemektedir. Kan-beyin bariyerini önemli ölçüde geçmeyen terapötik antikorların etkinliği, CGRP'nin meninksler ve / veya trigeminal gangliyonlar gibi periferik bölgelerde hareket ettiğini göstermektedir. Bununla birlikte, kan-beyin bariyeri olmayan çevresel organlardaki merkezi eylemleri göz ardı edemeyiz9. En azından fotofobi için, hRAMP1'in sinir dokusunda aşırı eksprese edildiği transgenik nestin / hRAMP1 fareleri kullanarak ışıktan kaçınma ile elde ettiğimiz sonuçlar göz önüne alındığında bunun daha az olası olduğunu düşünüyoruz10. Migren patofizyolojisinin mekanizmalarını anlamak, migren terapötiklerinin gelişimine yeni yollar sağlayacaktır.
Preklinik hayvan modelleri, hastalık mekanizmalarını ve yeni ilaçların geliştirilmesini anlamak için kritik öneme sahiptir. Bununla birlikte, hayvanlarda migren değerlendirmesi zordur, çünkü hayvanlar ağrı duyumlarını sözlü olarak bildiremezler. Migren hastalarının% 80-90'ının fotofobi sergilediği göz önüne alındığında11, hayvan modellerinde ışıktan kaçınmanın migrenin bir göstergesi olduğu düşünülmektedir. Bu, farelerde ışıktan kaçınmayı değerlendirmek için bir tahlil geliştirme ihtiyacına yol açtı.
Açık / koyu tahlil bir ışık bölgesi ve bir karanlık bölge içerir. Farelerde, ışığa karşı doğuştan gelen isteksizlikleriyle karşı karşıya kalan yeni ortamların kendiliğinden keşfine dayanarak kaygıyı ölçmek için yaygın olarak kullanılır12. Bazı çalışmalar odanın 1 / 3'ünü karanlık bölge olarak belirlerken, diğerleri odanın 1 / 2'sini karanlık bölge olarak belirlemiştir. Eski ayar genellikle kaygıyı tespit etmek için kullanılır13. Başlangıçta eşit büyüklükte açık / karanlık odaları seçmiş olsak da, iki göreceli boyutu karşılaştırmadık. Her iki odanın genel boyutunun önemli bir faktör olmadığını söyleyebiliriz, çünkü ilk test kutusu14 sonraki cihazdan15 önemli ölçüde daha büyüktü, ancak sonuçlar temelde aynıydı.
Işıktan kaçınmayı değerlendirmek için bu aydınlık / karanlık testinde iki kritik değişiklik şunlardı: test koşulu ve ışık yoğunluğu (Şekil 1). İlk olarak, fareler keşif sürüşünü azaltmak için açık/karanlık odaya önceden maruz bırakılır16 (Şekil 1A). Ön pozlamaların gerekliliği ve zamanları fare suşlarına ve modellerine bağlıdır. Wildtype C57BL/6J fareler genellikle iki ön pozlama gerektirir10, CD1 fareler için sadece bir ön pozlama yeterlidir17. Bu şekilde, ışıktan kaçınan davranış, bu iki fare suşunda maskelenebilir. İkinci olarak, oda aydınlatması, loş (55 lüks) ile parlak (27.000 lüks) arasında ayarlanabilir bir ışık yoğunluğu aralığı içerecek şekilde uyarlanmıştır; burada 55 lüks, karanlık bulutlu bir günle karşılaştırılabilir ve 27.000 lüks, gölgedeki parlak güneşli bir günle karşılaştırılabilir10. Gerekli ışık yoğunluğunun suş ve genetik modele göre değiştiğini bulduk. Bu nedenle, bireyler öncelikle deneysel paradigmaları için minimum ışık yoğunluğunu değerlendirmelidir.
Işıktan kaçınan bir fenotipi ortaya çıkarabilen tahlildeki bu değişikliklerle bile, yalnızca ışığa bağlı ışıktan kaçınma ile kaygıdan kaynaklanan ışık isteksizliğini ayırt etmek için anksiyete benzeri davranışları test etmek gerekir. Açık alan tahlili, yeni ortamların kendiliğinden araştırılmasına dayanan kaygıyı ölçmenin geleneksel bir yoludur. Açık/karanlık tahlilinden farklıdır, çünkü keşif dürtüsü, korunmasız açık alanlara karşı doğuştan gelen isteksizlikle karşı karşıya kalır. Odanın hem merkezi hem de kenarları ışıktadır, bu nedenle açık alan testi ışıktan bağımsız bir anksiyete testidir. Böylece, aydınlık / karanlık ve açık alan tahlillerinin kombinasyonu, ışıktan kaçınma nedeniyle ışıktan kaçınma ile kaygıdaki genel bir artış arasında ayrım yapmamızı sağlar.
CGRP, vazodilatasyonu, nosiseptifi ve inflamasyonu düzenleyen çok fonksiyonlu bir nöropeptittir18. Periferik ve merkezi sinir sistemlerinde yaygın olarak eksprese edilir. Migren patofizyolojisinde önemli rol oynar18. Bununla birlikte, migrende CGRP etkisinin altında yatan mekanizma belirsizdir. Bu modifiye edilmiş test paradigması ile açık / karanlık ve açık alan tahlillerini kullanarak, periferik 10,16 (Şekil 2) ve merkezi 14,15,16,19 CGRP uygulamasını takiben farelerde ışıktan kaçınma davranışını tanımlayabildik. Nöropeptitlere ek olarak, ışıktan kaçınmada rol oynayan beyin bölgelerinin tanımlanması da migren patofizyolojisinin anlaşılmasında önemlidir. Posterior talamik çekirdekler, ağrı ve ışık işleme için bütünleştirici bir beyin bölgesidir19 ve talamus migren sırasında aktive edilir20. Bu nedenle, bu bölgeye kanalrodopsin-2 (ChR2) veya eYFP içeren adeno ilişkili virüs (AAV) enjekte ederek posterior talamik çekirdekleri hedefledik. Bu optogenetik yaklaşımı bu iki tahlille birleştirerek, arka talamik çekirdeklerdeki ChR2 eksprese eden nöronların optik stimülasyonunun ışıktan kaçınmayı indüklediğini gösterdik19 (Şekil 3). Bu deneyde, bu optogenetik olarak manipüle edilmiş farelerde uyandırılan ışıktan kaçınma üzerindeki dramatik etki göz önüne alındığında, odaya önceden maruz kalma atlandı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan prosedürleri, Iowa Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından belirlenen standartlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Açık / koyu tahlil
- Açık/karanlık oda aparatı (bakınız Malzeme Tablosu) kurulumu. Bu bölümdeki tüm ekipmanlar ticari olarak temin edilebilir.
- Bir rafa, hazneye kolay erişim ve koyu renkli kesici uç için çekmece içeren ses azaltıcı hücreyi (iç: G x Y x D cinsinden 59,7 x 38 x 35,6 cm) yerleştirin.
- DC güç kaynağını ve DC ayarlı bir güç kaynağını ses yalıtımlı kabine bağlayın.
- Şeffaf dikişsiz açık alan odacığını (27,31 x 27,31 x 20,32 cm U x G x Y) kabinin çekmecesine yerleştirin.
- Siyah, kızılötesi (IR) şeffaf plastik koyu renkli kesici ucu (28,7 X 15 X 20,6 cm U x G x Y) açık alan odasına yerleştirin. Odanın eşit büyüklükte iki bölgeye ayrıldığından emin olun: karanlık bölge ve aydınlık bölge.
- Açık alan odasının X, Y ve Z eksenlerindeki üç set 16 ışınlı IR dizisini kablolarla IR USB denetleyicisine bağlayın.
- IR USB denetleyicisini bir bilgisayara bağlayın.
- Fare konumunu ve etkinliğini kaydedebilen ve toplayabilen izleme yazılımını bilgisayara yükleyin.
- Işık paneli kurulumu için, önce ışık yayan diyot (LED) ışık panelini (L x G cinsinden 27,70 x 27,70 cm; 360 LED, gün ışığı dengeli renk, 5600K, 60° sel ışını yayılımı) orijinal muhafazasından çıkarın.
- Işık panelini LED sürücü, ısı emici ve güç kaynağı ile monte edin. Birden fazla LED ışık paneli, tek bir ışık paneli kontrolü elde etmek için bir güç kaynağına, ısı emiciye ve LED sürücüsüne bağlanabilir.
- 0,53 cm aralıklarla 7 özdeş raftan oluşan özelleştirilmiş bir akrilik platform (U x G x Y'de 29,77 x 27,70 x 8,10 cm) oluşturun (Şekil 1B). Özelleştirilmiş akrilik rafı, odanın üstündeki kabinin içindeki tavana kalıcı olarak yapıştırın.
- LED ışık panelini alttaki iki raf arasındaki yuvaya yerleştirin. Işık panelini gerekirse farklı yüksekliklere ayarlayın (Şekil 1B, C) (örneğin, optogenetik fareler kullanılıyorsa). Ayrıntılar Bölüm 3'te tartışılmıştır).
- Isı emiciyi, LED sürücüsünü ve güç kaynağını açın. LED sürücüsünün, oda zeminindeki ışık yoğunluğunu ölçerek LED ışık yoğunluğunu belirleyebileceğini ve zeminin eşit şekilde aydınlatıldığını doğrulayın.
- Davranışsal test prosedürü
NOT: Fareler 12 saatlik bir ışık döngüsüne yerleştirilir. Tüm davranışsal deneyler ışık döngüsü sırasında gerçekleştirilir. 10-20 haftalık hem erkekler hem de dişiler de dahil olmak üzere fareler kullanılır. Bu protokolde, naif vahşi tip CD1 ve C57BL / 6J fareleri, açık / karanlık odaya iki ön maruziyet yaşar, ardından tedavi ile maruz kalma ve tedavi sonrası maruz kalma ile maruz kalma görülür. Farelerin iyileşmesine izin vermek için her maruz kalma arasında üç günlük bir aralık vardır (aşağıda açıklandığı gibi Gün 1, 4, 7 ve 10 ve Şekil 1A). Bununla birlikte, CD1 fareleri 2. ön pozlama gerektirmez ve loş ışıkta test edilebilir.- 1. günde (ön işlem 1), açık/koyu tahlil cihazını açın ve ışık yoğunluğunu 27.000 lüks olarak ayarlayın.
- İzleme yazılımını açın ve yeni bir protokol ayarlayın. Yeni Protokol ayarında, Süre'yi 30 dakika olarak ayarlayın. Yeni Analiz ayarında, Süreye Göre Veri Kutuları'nı 300 sn olarak ayarlayın.
- Yeni Bölge ayarında, Önceden Tanımlanmış Bölgeler'i seçin. 2'yi ve ardından Yatay'ı seçin. Odanın kayıt için yatay olarak iki eşit boyutlu bölgeye bölünüp bölünmediğini kontrol edin.
- Testten önce fareleri 1 saat boyunca test odasına alıştırmak. Alışkanlık sırasında, farenin sirkadiyen ritmini bozmamak için odayı açık tutun. Farelerin test odası ortamına tam olarak alışmasını sağlamak için açık/koyu tahlil için tüm ekipmanların açık olduğundan emin olun.
- Veri Al'ı seçin. Fare kimliklerini girin. Protokolü başlatın.
- Açık/koyu bölmeye ve koyu renkli ek parçaya erişmek için çekmeceyi ses azaltıcı kabinin dışına çekin. Fareyi yavaşça kuyruğun tabanından alın, odanın ışık bölgesine yerleştirin ve çekmeceyi kabinin içine itin. Yazılımın fareyi hemen algıladığından ve etkinliği kaydetmeye başladığından emin olun.
- Kaydın 30 dakika sonra otomatik olarak durmasını bekleyin. Fareyi ev kafesine geri döndürün.
- Önceki farenin bıraktığı koku alma ipuçlarını ortadan kaldırmak için% 55.0 izopropil alkol,% 0.25 alkil C12-18 dimetil etilbenzil amonyum ve% 0.25 alkil C12-18 dimetil benzil amonyum klorür içeren% 0.25 alkil C12-18 dimetil benzil amonyum klorür içeren alkol-koku mikrop öldürücü tek kullanımlık mendiller kullanarak odayı ve koyu renkli eki temizleyin.
- 4. günde (ön tedavi 2), 1.2.1 ila 1.2.8 arasındaki adımları tekrarlayın.
- 7. günde (tedavi günü), adım 1.2.1 ve 1.2.4'ü tekrarlayın. Alışkanlıktan sonra, CGRP uygulayın (0.1 mg / kg, fare vücut ağırlığına göre 10 μl / g, intraperitoneal enjeksiyon (yani )), farenin başını öne doğru eğin ve sağ alt kadrana enjekte edin. Fareyi ev kafesine geri getirin.
- 30 dakika sonra, protokolü başlatın ve fareyi 1.2.5 ila 1.2.7 arasındaki adımlarda belirtildiği gibi açık/karanlık odada çalıştırın. Enjeksiyonlardan sonra ev kafeslerindeki iyileşme süresi, tedaviye bağlı olarak kısaltılabilir veya uzatılabilir21.
- Odayı ve koyu renkli kesici ucu adım 1.2.8'de açıklandığı şekilde temizleyin.
- 10. günde (tedavi sonrası gün), 1.2.1 ila 1.2.8 arasındaki adımları tekrarlayın. Deneme, açık alan testine başlamadan önce adım 1.2.13'te duraklatılabilir.
2. Açık alan tahlili
- Aparat kurulumu
- Açık alan odası kurulumu: Karanlık kesici ucu kullanmadan açık/koyu tahlilde kullanılan aynı ses azaltıcı hücreyi ve açık alan odacığını kullanın.
- Işık paneli kurulumu: Açık/koyu testinde kullanılan ayarların aynısını kullanın. Işık yoğunluğunun açık/koyu testinde kullanılanla aynı olduğundan emin olun.
- Davranışsal test prosedürü
- Aparatı açın. Işık yoğunluğunu 27.000 lüks olarak ayarlayın.
- İzleme yazılımını açın.
- Yeni Bölge ayarları dışında açık/koyu tahlilinde kullanılanla aynı şekilde yeni bir protokol oluşturun. Yeni Bölge ayarlarında 1'i ve ardından Orta'yı seçin. Çevresini çevreden 3,97 cm, merkezi ise 19,05 cm × 19,05 cm olarak ayarlayın.
- Fareleri adım 1.2.4'te açıklandığı gibi test odasına alıştırmak.
- CGRP'yi (fare vücut ağırlığına göre 0,1 mg/kg, 10 μl/g, yani farenin başını öne eğerek sağ alt kadrana enjekte ederek uygulayın. Fareyi ev kafesine geri getirin.
- 30 dakika sonra protokolü başlatın. Çekmeceyi sesi azaltan kabinin dışına çekin ve fareyi yavaşça açık alan odasının ortasına yerleştirin. Çekmeceyi kabinin içine itin.
- Davranışı 30 dakika boyunca izleyin. Sonra fareleri ev kafeslerine geri döndürün.
- Aparatı adım 1.2.8'de açıklandığı gibi temizleyin.
3. Optogenetik fareler için modifiye edilmiş açık / karanlık testi
- Aparat kurulumu
- Koyu renkli kesici uçta iki değişiklik yapın.
- Koyu renkli kesici ucun açıklığını 5,08 x 5,08 cm (G x Y) olarak değiştirin ve üst kısım ile koyu renkli kesici ucun açıklığı arasında 0,95 x 10,16 cm (G X Y) boyutunda küçük bir yarık (Şekil 1D sol üstte).
NOT: Bu değişiklik, fare kafasındaki fiber optik kanül yama kablosuna takıldığında farenin karanlık bölgeye zorlanmadan gitmesini sağlar. - Koyu renkli kesici ucun üst kısmını açık alan üzerinde üçgen bir sundurma olarak genişletin (H=6,5 cm) (Şekil 1D sağ üst ve sol alt). Sundurmadan dairesel bir delik (D = 1,7 cm) kesin ve lazeri ve fiber optik yama kablolarını birbirine bağlayan döner eklemi yerleştirmek ve stabilize etmek için deliğe bir tutucu yerleştirin (Şekil 1D sol üst ve sol alt).
NOT: Değişiklikler, karanlık bölgenin zeminine ulaşan ışık yoğunluğunda küçük bir değişikliğe neden olur (modifikasyonlarla 17 lux ve modifikasyonsuz 14 lux, karanlık bölgenin sağ arka köşesinde 27.000 lux'ün altında ölçülür).
- Koyu renkli kesici ucun açıklığını 5,08 x 5,08 cm (G x Y) olarak değiştirin ve üst kısım ile koyu renkli kesici ucun açıklığı arasında 0,95 x 10,16 cm (G X Y) boyutunda küçük bir yarık (Şekil 1D sol üstte).
- Döner bağlantıyı, koyu kesici uç üzerindeki tutucuya yerleştirin.
- 30,5 cm'lik fiber optik yama kablosunu döner bağlantıya bağlayın. Döner bağlantının düzgün bir şekilde dönebildiğini onaylayın, böylece fare odadan geçerken yama kablosu zorlanmadan dönebilir.
- Kurulumun geri kalanı için, bölüm 1'de (açık/koyu tahlil) kullanılanla aynı cihaz kurulumunu kullanın.
- Koyu renkli kesici uçta iki değişiklik yapın.
- Davranışsal test prosedürü
NOT: Vahşi tip farelerin aksine, optogenetik fareler ön maruziyet almaz (ön tedavi 1 ve 2).- Test gününde, yama kablosunu bağlamak için yer açmak üzere LED ışık panelini ikinci en düşük yuvaya (kamberin zemininden 28,23 cm) yerleştirin. Açık/koyu tahlil aparatını açın ve ışık yoğunluğunu 55 lüks olarak ayarlayın.
- Adım 3.2.3'teki lazer stimülasyon protokolüyle uyumlu olması için Yeni Analiz ayarında Süreye Göre Veri Kutuları'nın 60 sn'ye ayarlanması dışında, 1.2.2 ve 1.2.3'teki protokol ayarlarının aynısını kullanın.
- Lazer güç düğmesini açın. Lazer darbe kontrol cihazını 1 dakika boyunca uyaracak şekilde ayarlayın, ardından 30 dakika boyunca uyarılma olmadan 1 dakika bekleyin.
- Testten önce fareleri test odasına ışık açıkken 1 saat boyunca alışkanlık haline getirin.
- Protokolü başlatın. Açık/koyu renkli odaya ve koyu renkli kesici uca erişmek için çekmeceyi ses azaltıcı kabinin dışına çekin.
- Fareyi nazikçe kısıtlayın ve fare kafasındaki optik-fiber kanülü bir çiftleşme manşonu aracılığıyla fiber optik yama kablosuna bağlayın (Şekil 1D sağ altta). Fareyi yavaşça ışık bölgesine yerleştirin ve çekmeceyi kabinin içine itin. Protokolün fare davranışını otomatik olarak kaydetmeye başlayacağından emin olun.
- 1 dakikada, darbe kontrol cihazını açın ve ardından arıza emniyetli anahtarı AÇIK konuma getirin. Hedeflenen beyin bölgesinin lazer stimülasyonunun her iki dakikada bir gerçekleştiğinden emin olun.
- Protokol otomatik olarak durduğunda 30 dakika sonra, arıza emniyetli anahtarı KAPALI konuma getirin. Ardından nabız kontrol cihazını kapatın.
- Fareyi ve fiber optik yama kablosunu ayırın. Fareyi ev kafesine geri getirin.
- Odayı ve koyu renkli kesici ucu adım 1.2.8'de açıklandığı şekilde temizleyin.
4. Optogenetik fareler için modifiye açık alan testi
- Aparat kurulumu
- Bir stand ve kelepçe kullanarak odanın üzerindeki döner eklemi stabilize edin (Şekil 1E).
- Fiber optik yama kablosunu döner bağlantıya 50 cm uzunluğunda bağlayın. Döner bağlantının düzgün bir şekilde dönüp dönemediğini kontrol edin.
- Döner mafsalı stand üzerinde uygun yüksekliğe ayarlayın: fiber optik yama kablosunun yalnızca odanın her köşesine ulaşabildiğinden emin olun, bu da fare hareketiyle herhangi bir paraziti önlemeye yardımcı olur.
- Kurulumun geri kalanı için, bölüm 1'de (açık/koyu tahlil) kullanılanla aynı aparat kurulumunu kullanın, ancak koyu kesici uç olmadan.
- Davranışsal test prosedürü
- Açık/koyu tahlil aparatını açın ve ışık yoğunluğunu 55 lüks olarak ayarlayın.
- Yeni Bölge ayarları dışında, değiştirilmiş açık/koyu tahlilinde (bölüm 3) kullanılanla aynı protokol kurulumunu kullanın. Yeni Bölge ayarlarında Ortala'ya göre takip eden 1 simgesini seçin. Çevresini çevreden 3,97 cm, merkezi ise 19,05 cm × 19,05 cm olarak ayarlayın.
- Lazer güç düğmesini açın. Lazer darbe kontrol cihazını 1 dakika boyunca uyaracak şekilde ayarlayın, ardından 30 dakikadan fazla stimülasyon olmadan 1 dakika bekleyin.
- Adım 3.2.6'daki iki değişiklik dışında, alışkanlık ve testin geri kalanını adım 3.2.4 ila 3.2.10'da açıklandığı gibi gerçekleştirin: fareyi ışık bölgesi yerine odanın ortasına yavaşça yerleştirin; farenin kafasına bağlanan yama kablosu nedeniyle çekmeceyi kabinin dışında tutun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu davranışsal test paradigması, ışıktan kaçınan davranışı test etmek için tasarlanmıştır. Hedeflenen bir nöronal popülasyonun uyarılması sırasında gerçek zamanlı olarak ışıktan kaçınmayı araştırmak için hem naif vahşi tip fareler hem de optogenetik fareler kullanılarak gerçekleştirilebilir.
Bu prosedür, CD1 ve C57BL / 6J farelerde periferik CGRP tedavisinin 10,16 ve C57BL / 6J farelerde19 posterior talamik çekirdeklerdeki nöronların optik stimülasyonunun ışıktan kaçınma davranışı üzerindeki etkisini incelemek için kullanılmıştır. Deneylerde 10-20 haftalık erkek ve dişileri de içeren fareler kullanıldı (Şekil 2A, Şekil 2B-D ve Şekil 3). Sonuçlar, CGRP'nin i.p. enjeksiyonunun, CD1 (Şekil 2A) ve C57BL / 6J (Şekil 2B) farelerinde açık / karanlık tahlilinde ışık bölgesinde geçirilen süreyi önemli ölçüde azalttığını, ancak CD1 (veriler gösterilmemiştir) ve C57BL / 6J farelerde (Şekil 2D) 10, açık alan tahlilinde merkezde geçirilen zamanı etkilemediğini ortaya koymuştur. 16. Bu, periferik CGRP'nin ışıktan kaçınmayı indüklediğini, ancak genel kaygıyı indüklemediğini göstermektedir. CGRP ile tedavi aynı zamanda karanlık bölgede dinlenen ancak hem CD1 (veriler gösterilmemiştir) hem de C57BL / 6J farelerde (Şekil 2C) ışık bölgesinde dinlenmeyen farelerin süresini arttırmıştır.
Optogenetik protokol için, AAV2-CaMKIIa-hChR2(E123A)-eYFP veya kontrol virüsü AAV2-CaMKIIa-eYFP19 enjekte ederek posterior talamik çekirdeklerdeki kalmodulin kinaz II alfa (CaMKIIa)-eksprese eden nöronları hedefledik. Aynı zamanda, posterior talamik çekirdeklere fiber optik bir kanül implante edildi. ChR2 ekspresyonu için yeterli zamana izin vermek için enjeksiyondan üç hafta sonra, posterior talamik çekirdeklerdeki nöronların optik stimülasyonunu gerçekleştirdik ve ChR2 enjekte edilen farelerde açık / karanlık tahlilde ışık bölgesinde geçirilen farelerin, kontrol virüsü enjekte edilen farelere (eYFP) kıyasla karşılık gelen bir azalma olduğunu belirttik (Şekil 3A). ChR2 ve kontrol eYFP fareleri arasındaki açık alan tahlilinde merkezdeki sürede kayda değer bir fark yoktu (Şekil 3C), yalnızca anksiyete tarafından yönlendirilmeyen hafif engelleyici bir yanıtın göstergesidir19. Ayrıca, karanlık bölgede dinlenme süresinde bir artış olduğu, ancak ışık bölgesinde olmadığı da kaydedilmiştir (Şekil 3B). Aynı sonuçlar 55 lüks ve 27.000 lüks kullanıldığında da elde edilmiştir (Şekil 3). 55 lüks prosedür dahil edildi çünkü migren hastaları loş ışığa bile duyarlı.
Şekil 1: Açık / koyu tahlil zaman çizelgesi ve aparatı. (A) Test paradigmasının zaman çizelgesi: Açık / karanlık odaya iki ön maruziyetten sonra (Pre 1 ve Pre 2), farelere CGRP (0.1 mg / kg, i.p.) ve ardından bir tedavi sonrası ölçüm (Post) uygulanır. Açık / koyu tahlilden en az bir gün sonra, farelere tekrar CGRP (0.1 mg / kg, i.p.) verilir ve açık alan tahlilinde çalıştırılır. Ön: ön işlem; Tx: tedavi; Post: işlem sonrası (B) LED panel, odanın üst kısmında akrilik bir raf tarafından tutulur ve test alanını aydınlatır. Işık panelinin yüksekliği, farklı yüksekliklerdeki yuvalar kullanılarak ayarlanabilir. (C) Açık/koyu renkli oda, küçük bir açıklığa sahip koyu renkli bir kesici uç içerir. Odanın üzerinde bir LED ışık paneli bulunur. (D) Modifiye edilmiş koyu kesici ucun ön, yan ve üst görünümleri. Karanlık kesici uçtaki açıklık, yama kablosunun hareketi için küçük bir yarıkla uzatılmıştır (sol üstte). Koyu renkli kesici ucun üst kısmı, döner bağlantı için bir tutucuya sahip üçgen bir sundurma olarak ışık alanı boyunca uzanır (sağ üst ve sol alt). Optik-fiber yama kablosu, fiber optik kanüle bir çiftleşme manşonu (sağ altta) aracılığıyla bağlanır. (E) Değiştirilmiş açık alan testi. Stand ve kelepçe döner eklemi tutar. Oda, fare kafasına takılı yama kablosu ile farenin serbest dolaşımına izin vermek için kapılar açık bırakılarak kabinin önüne doğru çekilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Periferik CGRP uygulaması, iki vahşi tip fare suşunda parlak ışıkta ışıktan kaçınmayı uyandırır. CD1 ve C57/BL6J fareler Şekil 1A'da açıklanan zaman çizelgesine göre test edilmiştir. (A) CD1 farelerinin ışık bölgesinde 30 dakika (27.000 lüks) boyunca 5 dakikalık aralıkta geçirdiği süre. Işık verilerindeki süre, test sırasında zaman içinde (sol panel) ve bireysel fareler için 5 dakikalık aralık başına ortalama süre olarak (sağ panel) gösterilir. Her zaman noktasında araç ve CGRP arasında ve parantez içinde belirtildiği gibi Tx ve Pre2 veya Post arasında karşılaştırmalar yapıldı. (Veh, n=19; 0.1 mg/kg CGRP, n=19) (B) C57BL/6J farelerin ışık bölgesinde 30 dakikadan (27.000 lüks) 5 dakikalık aralıklarla geçirilen zamanı. Işık verilerindeki süre, test sırasında zaman içinde (sol panel) ve bireysel fareler için (sağ panel) 5 dakikalık aralık başına ortalama süre olarak gösterilir (Veh, n = 42; 0.1 mg / kg CGRP, n = 44). (C) B panelindeki fareler, açık / karanlık testi sırasında karanlık ve aydınlık bölgelerdeki dinlenme davranışları açısından da analiz edildi. (D) B panelindeki fareler daha sonra açık alan testinde test edildi. Araç veya CGRP ile tedaviden sonra 30 dakikadan fazla 5 dakikalık aralıkta odanın merkezinde geçirilen zamanın yüzdesi (0.1 mg / kg, i.p.) (Veh, n=9; 0.1 mg/kg CGRP, n=9). Merkez verilerindeki zamanın yüzdesi, test sırasında zaman içinde (sol panel) ve bireysel fareler için 5 dakikalık aralık başına merkezdeki zamanın ortalama yüzdesi olarak gösterilir (sağ panel). Tüm paneller için ortalama±SEM gösterilir, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001. Bu rakam Mason et al. 201710'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Posterior talamik çekirdeklerdeki CaMKIIa eksprese eden nöronların optik uyarılması hem loş hem de parlak ışıkta ışıktan kaçınmayı indükler. (A) ChR2 veya eYFP (55 lükste: eYFP n = 8, ChR2 n = 11; 27.000 lükste: eYFP n = 12, ChR2 n = 18) lazer mavisi (473 nm, 20 Hz, 5 ms darbe genişliği, 10 mW/mm2). Sol panel, ışık bölgesinde ışık bölgesinde 5 dakika boyunca 30 dakika boyunca 55 veya 27.000 lükste geçirilen zamanı gösterir. Her zaman noktasında eYFP ve ChR2 grupları arasında karşılaştırmalar yapıldı. Sağ panel, bireysel fareler için 5 dakikalık aralık başına ortalama süreyi gösterir. (B) A panelindeki fareler, açık / koyu tahlil sırasında ışık (sol panel) ve karanlık (sağ panel) bölgelerinde dinlenme davranışı açısından da analiz edildi. (C) A panelindeki fareler daha sonra açık alan testinde test edildi. Açık alan odasının merkezinde 30 dakika boyunca 5 dakikalık aralıkta geçirilen sürenin ortalama yüzdesi (Lazer: 473 nm, 20 Hz, 5 ms darbe genişliği, 10 mW/mm2). (eYFP n = 8, ChR2 n = 9). Tüm paneller için ortalama±SEM gösterilir, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001. Bu rakam Sowers et al. 202019'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aydınlık / karanlık testi, kaygı benzeri davranışları değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır12. Tahlil, farelerin ışığa karşı doğuştan gelen isteksizliğine ve yeni bir ortama (ışık bölgesi) yerleştirildiğinde keşfetme dürtülerine dayanır. Bununla birlikte, burada bildirdiğimiz gibi, bu tahlil aynı zamanda ışıktan kaçınma davranışını değerlendirmek için de kullanılabilir.
Testten önce ön maruziyetlerin sayısını ve gerekliliğini göz önünde bulundurmak çok önemlidir. Bu, fare gerilmesine veya modeline bağlıdır. Örneğin, açık / koyu tahlil protokolümüzde, naif vahşi tip CD1 ve C57BL / 6J fareleri, tedavi testi prosedüründen geçmeden önce iki kez aydınlık / karanlık odaya önceden maruz kalırken, optogenetik fareler ön maruziyete maruz kalmazlar. Yakın tarihli bir yayın, CD1 farelerinin i.p. CGRP uygulamasından sonra ışıktan kaçınmayı göstermesi için bir ön maruziyetin yeterli olduğunu bildirmiştir17. Sonuç olarak, yenilik parametresinin önemi, tedavi gününün gelmesiyle azalmış olacaktır10,16. Ön pozlamalar, keşif dürtüsünü azaltarak ve böylece keşif ve isteksizlik arasındaki dengeyi değiştirerek ışıktan kaçınan fenotiplerin maskesini düşürebilir. Bazı durumlarda, ön maruz kalma gerekli değildir. Örneğin, sinir sisteminde artmış CGRP reseptörlerine sahip genetik olarak değiştirilmiş farelerde, ön maruziyet gerekli değildi14. Benzer şekilde, posterior talamik çekirdeklerdeki CaMKIIa eksprese eden nöronların optik stimülasyon için hedeflendiği optogenetik olarak manipüle edilmiş farelerde, muhtemelen beynin doğrudan uyarılmasıyla ışıktan kaçınıcı yanıt çok sağlam olduğu için ön maruz kalma gerekli değildi19. Bu nedenle, farklı fare suşları veya modelleri kullanılırken odaya önceden maruz kalmanın sayısı ve gerekliliği dikkatlice düşünülmelidir. Gerçekten de, farelerin odaya aşırı maruz kalması, keşif davranışını azaltabilir. Bu, farelerin tercihen karanlık bölgeyi işgal etmesine yol açacaktır, tedaviden bağımsız olarak, orada ışıktan kaçınan bir yanıt gözlemleme yeteneğini azaltacaktır. Tersine, tahlil öncesi yetersiz maruz kalma, potansiyel ışıktan kaçınıcı davranışı maskeleyen keşif davranışına yol açabilir.
Tedavi sonrası maruz kalma, bir farenin 2 gün önce uygulanan CGRP enjeksiyonundan tamamen iyileşip iyileşmediğini belirlemeye yarar. Bu, gelecekteki davranış testlerini etkileyecek uzun süreli bir tedavi etkisinin mevcut olmadığını doğrulamak için açık alan tahlilini veya başka bir tahlili çalıştırmadan önce gereklidir.
Önceki gözlemlere dayanarak 30 dakikalık bir protokol süresi seçtik10. Fareleri açık / koyu testinde 10 dakika 15, 20 dakika 16 ve 30 dakika 10 ayrı ayrı test ettik. CGRP, farelerin ışıkta geçirdiği süreyi 0-30 dakika arasında azalttı, ancak 30 dakikayı geçen kontrol fareleri, 0-30 dakikaya kıyasla karanlıkta daha fazla zaman geçirmeyi tercih etti, bu nedenle 30 dakika test etme kararına yol açtı. Benzer şekilde, test süresi, farklı fare modelleri için zaman-tepki eğrisine referansla ayarlanabilir. Açık / karanlık odaya maruz kalma süresinin uzatılmasının, ışık bölgesini keşfetme motivasyonunu azaltabileceği unutulmamalıdır.
Hayvan davranışını değerlendirmek için birçok farklı parametreyi analiz ettik. Açık / koyu tahlilinin temel bir özelliği, bir farenin ışık bölgesinde geçirdiği zamanın ölçülmesidir ve doğrudan ışıktan kaçınmayı yansıtır. Dinlenmek için harcanan zamanın yüzdesi, açık veya karanlık bölgelerdeki dikey ışın kırılmalarının sayısı (yetiştirme aktivitesini ölçmek için) ve iki bölge arasındaki geçişlerin sayısı hareketliliği değerlendirmek için kullanılır. Dinlenme süresi ve dikey ışın kırılmaları, hareketle ilgili yanlış sonuçlardan kaçınmak için her bölgede harcanan zamana normalleştirilir. Analizlere dahil ettiğimiz tüm fareler hariç: 30 dakikalık testin tamamı boyunca ışık bölgesinde kalan fareler, zamanın% 90'ından fazlasını toplamda dinlenerek geçiren fareler (hem açık hem de karanlık bölgeler) ve istatistiksel aykırı değerler (ortalamadan >3 SD). Hariç tutulan farelerin sayısı genellikle% 1'den azdır. Açık alan tahlili için, merkezdeki zamanın yüzdesi, kaygı benzeri davranışları değerlendirmek için kullanılan ana ölçümdür.
Modifiye edilmiş açık / koyu tahlilde, fiber optik kanülün bazı beyin bölgelerinde konumlandırılması, fare hareketini büyük ölçüde kısıtlayabilir ve bazı durumlarda farenin karanlık bölgeye ulaşmasını engelleyebilir. Sonuç olarak, karanlık bölgeye giriş negatif olarak güçlendirilecek ve birden fazla denemeden sonra, fare tüm test süresi boyunca ışık bölgesinde kalsa bile, ışık için öğrenilmiş bir tercih gösterebilir. Bu, koyu kesici uçtaki açıklığın boyutunu ve şeklini değiştirerek düzeltilebilir. Örnek olarak, vahşi tip C57BL / 6J farelerin beyinciğine fiber optik kanüller yerleştirildiğinde, fareler karanlık ekin açıklığını geçmekte zorlandılar. Açıklığın genişliğini 5.08 cm yerine 6.10 cm'ye değiştirdikten sonra, fareler açıklığı serbestçe geçebildiler.
Açık alan odasının boyutuna bağlı olarak modifiye edilmiş açık / koyu tahlilinde farenin serbestçe hareket etmesini sağlayan 30,5 cm'lik bir fiber optik yama kablosu kullanılır. Daha kısa bir kablo uzunluğu farenin köşelere hareket etmesini önlerken, daha uzun bir kablo dolaşabilir ve hareketi engelleyebilir. Modifiye açık alan tahlili için kullanılan fiber optik yama kablosunun uzunluğu 50 cm'dir. Uzunluk, açık / koyu tahlildeki kadar katı değildir, çünkü döner bağlantının yüksekliği, fiber optik yama kablosunun uzunluğuna göre ayarlanabilir ve farenin odanın köşelerine ulaşabilmesini sağlar.
Güç analizlerine dayanarak, i.p. CGRP'li CD1 ve C57BL / 6J fareler için ve önemli ışık kaçınmasını tespit etmek için optogenetik C57BL / 6J fareler için grup başına 10-12 fareye ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, C57BL / 6J grup boyutu, CD1 grup boyutundan (Şekil 2A, B) önemli ölçüde daha büyüktü, çünkü C57BL / 6J fareleri, testlerin bir alt kümesinde CGRP'ye yanıt vermiyordu10, yani bu farelerde ışıktan kaçınma davranışındaki bu yüksek değişkenliği hesaba katmak için birden fazla test yapıldı. Spesifik olarak, CD1 fareleri için iki deney birleştirildi ve C57BL / 6J fareleri için i.p. CGRP ile dört deney birleştirildi (Şekil 2A, B) 10. Bu değişkenliğin nedeni bilinmemektedir, ancak insanlar CGRP ve ışığa verdikleri tepkilerde değişkenlik göstermektedir. CGRP'nin intravenöz (i.v.) enjeksiyonu, migren hastalarının yaklaşık% 63 ~ 75'inde migren ataklarına neden olurken, migren atakları sergileyen hastaların% 70 ~ 90'ı fotofobi sergilemektedir22,23,24,25. Toplamda, tahlil önemli değişkenliğe sahiptir ve fare sayısına ek olarak, farklı fare kohortlarıyla en az iki ve tercihen üç tam bağımsız deney yapmak esastır.
Açık / karanlık odada yatak takımları gerekli değildir ve deneycinin fareleri önceden tutması veya alışkanlık haline getirmesi gerekmez. İhtiyati bir önlem olarak, iki maruziyet öncesi prosedür, fareleri deneycinin koku alma ve fiziksel ipuçlarına alıştırma amacına hizmet eder; Bununla birlikte, Ueno H. ve ark., tekrarlanan kullanımdan sonra fareler ile kullanımı olmayan fareler arasında aydınlık / karanlık tahlilinde ışıkta zaman veya açık alan tahlilinde merkezdeki zaman açısından bir fark olmadığını göstermiştir26.
Açık alan testi, anksiyetenin hafiften kaçınan bir fenotipe katkısını değerlendirebilir. Yüksek sıfır labirent ve yükseltilmiş artı labirent27 gibi iyi doğrulanmış kaygı ile ilgili başka testler de vardır; Bununla birlikte, açık alan testi, her iki tahlil için de aynı test odası kullanıldığından, açık / karanlık protokolü için prosedürel olarak en uygun kontroldür. Buna rağmen, kaygının değerlendirilmesi, birden fazla tahlil kullanılarak veya kaygının karmaşık ve çok yönlü bir davranış olduğu göz önüne alındığında, tek bir testte birden fazla parametreyi ölçerek güçlendirilebilir. Önemli olarak, açık alan testinde anksiyete fenotipi olmasa bile, bu, ışıktan kaçınan fenotipe bir anksiyete bileşenini dışlamaz. Örneğin, ışık bir anksiyete tepkisini tetikliyor olabilir. Açık alan tahlili sadece kaygının tek başına ışığa verilen tepkiyi yönlendirmediğini gösterir. Bu tahlilde benzodiazepame gibi anksiyolitik bir ilaç kullanılabilirken, böyle bir yaklaşımın komplikasyonları olacaktır, örneğin, anksiyolitik ilaçlar lokomotifi etkiler. Bunun yerine, ışıktan uzak fenotipin migren benzeri durumunu doğrulamak için sumatriptan da dahil olmak üzere klinik anti-migren ilaçları kullanmayı seçtik. Sumatriptan, hem CD1 hem de C57BL / 6J farelerde10 CGRP kaynaklı ışık isteksizliğini başarıyla tersine çevirdi.
Modifiye edilmiş açık / koyu tahlilden farklı olarak, çekmecedeki oda, farenin kafasına bağlanan yama kablosu nedeniyle modifiye açık açık alan tahlilinde kabin kapıları açık olan kabinin dışındadır. 55 lüks yerine, oda ışığı odanın zeminine ~ 1000 lükste ulaşır. Işık yoğunluğu farklı olsa da, açık alan testi ışıktan bağımsız bir testtir. Ayrıntılı olarak, açık alan tahlilinde ışık yoğunluğunun 55'ten 27.000 lükse çıkarılması, C57BL/6J farelerde merkezde zamanın azalmasına neden oldu ve ışık yoğunluğunun fare davranışını etkileyebileceğini düşündürdü28. Bununla birlikte, kontrol ve deney grupları arasındaki fark, ne 55 ne de 27.000 lux28 altında anlamlı değildi. Ek olarak, 55 ila 1000 lüks arasındaki ışık yoğunluğu farkı, 55 ila 27.000 lüks arasındaki farktan çok daha incedir. Kablosuz optogenetik, yama kablosu olmayacağı için bu sorunu çözebilir ve açık alan odasının ses azaltıcı kabinin içine itilmesine izin verir.
Ek olarak, yama kablosu optimum uzunluk seçmesine rağmen fare hareketini hala sınırlar. Gelecekte, kablosuz optogenetik, kablo tabanlı optogenetik tekniklere invaziv olmayan bir alternatif sunacaktır.
Migren ataklarına eşlik eden uzun süreli CGRP salınımını sadece kısmen kopyalayan akut CGRP enjeksiyonunu kullandığımıza dikkat edilmelidir. Plazma CGRP düzeylerinin arttığı29 ve migren hastalarında i.v CGRP'nin migren ataklarını indüklediği öncülüne dayanarak migreni modellemek için farelere CGRP enjekte ederken22,23,24,25,30, bu, CGRP'nin nispeten uzun bir süre boyunca yüksek seviyelerde tutulduğu hastadaki durumu çoğaltmayacaktır (hasta ölçümleri, migren başladıktan 3 saat sonra medyan 3 saatte alınmıştır29 ), ataklar arasında bile seviyelerin yükseldiği bildirilen kronik migreni de çoğaltmaz31. Dahası, diğer ağrıya bağlı aracılar paradigmamızda test edilmemiştir.
Mogil grubu, farelerde ışıktan kaçınmayı ölçmek için yükseltilmiş artı labirenti değiştirdi, kapalı kollar parlak ışıkla aydınlatıldı ve açık kollar karanlık kaldı32. Standart yükseltilmiş artı labirent, hayvanlarda kaygı ile ilgili davranışları tespit etmek için sıklıkla kullanılmıştır. Bu tahlil, bir farenin yeni bir çevreyi keşfetme konusundaki doğuştan gelen arzusu ile açık korumasız labirent kollarında uzlaşmacı bir konuma yerleştirilmesi arasındaki çatışmaya dayanmaktadır. Modifiye protokolde, fareler parlak ışıkla aydınlatılmış kapalı kollar ile karanlık olan açık korumasız kollar arasında seçim yapmak zorunda kalırlar. İlkine yapılan tercih, kaygının ışıktan kaçınmayı geçersiz kıldığını, ikincisine yapılan tercihin ise hafif isteksizliğin kaygıdan daha öncelikli olduğunu öne sürdüğünü göstermektedir. Mogil grubu ayrıca anksiyete benzeri davranışları değerlendirmek için standart bir yükseltilmiş artı labirent uyguladı32. Amaç, protokolümüzdeki açık alan tahlilini yapmakla aynıdır. Ailesel bir hemiplejik migren modeli olan Cacna1a mutant fareleri, kapalı kollar parlak olduğunda fotofobi gösterdi. Buna karşılık, standart yükseltilmiş artı labirent yapıldığında anksiyete benzeri davranış tespit edilmemiştir32. Sıçanlarda, hem modifiye edilmiş yükseltilmiş artı labirent hem de açık / karanlık testi kullanılarak, nitrogliserinin (NTG) sumatriptan34 tarafından kurtarılan fotofobiyi33,34 indükleyebildiği gösterilmiştir. Kapalı kollarda ışığın bulunmadığı standart yükseltilmiş artı labirent ortamında, NTG, sıçanlarda anksiyete benzeri davranışı indükledi34, NTG'nin neden olduğu ışıktan kaçınmanın kaygı ile birlikte olduğunu düşündürdü. Bildiğimiz kadarıyla, aynı fare modelinde açık / koyu tahlil ve modifiye edilmiş yükseltilmiş labirenti kullanan hiçbir yayın yoktur. Sonuç olarak, hem modifiye edilmiş yükseltilmiş artı labirent hem de bu protokolde önerilen açık / karanlık tahlili, farelerde ışıktan kaçınma davranışının etkili ölçümleri olarak gösterilmiştir.
Gün ışığı LED panelini gün ışığı dengeli bir renge (5600K), 60 ° sel ışını yayılımına sahip, 55 lüks veya 27.000 lükste odanın zemininden ~ 30 cm yükseklikte gölgeleme sağlamayan bir şekilde kullanıyoruz. Işıktan kaçınmayı araştıran diğer çalışmalar, ışık / karanlık tahlilini çeşitli modifikasyonlarla kullanmıştır. Örneğin, çalışmalar ışık bölgesi için yüzlerce ila binlerce lüks arasında değişen farklı ışık yoğunlukları kullanmıştır35,36,37; farklı dalga boylarında kullanılan ışık (örneğin mavi ve sarı)38; veya farklı ışık sıcaklıkları (soğuk ve sıcak) kullandı39. Işık tarafından üretilen ısı için dikkatli olunmalıdır, çünkü karanlık ve aydınlık bölgelerin sıcaklığını etkileyebilir ve farelerin davranışına müdahale edebilir ve potansiyel olarak belirli bir bölgenin tercih edilmesine neden olabilir. Ayrıca, odanın zemininde gölgeyi önlemek için ışığı iyi bir görüş açısıyla kullanmak da önemlidir. Işık yoğunluğu da test için önemlidir. 25.000 -27.000 lüks, yaklaşık olarak parlak gün ışığına eşdeğerdir. Açık / karanlık tahlilini bu kadar yüksek bir ışık yoğunluğunda yaparak, tedavi etkisini arttırmak mümkündür; Bununla birlikte, retina hasarını40 ve bu kadar yüksek ışık yoğunluğunun farenin ışığa girme isteği üzerindeki olumsuz etkisini göz önünde bulundurmak önemlidir. Bazı çalışmalar, doğrudan ışığa maruz kalan fare gözlerinin41 ve birkaç saat boyunca parlak ışığa maruz kalan farelerin (örneğin, 4 saat boyunca 30.000 lüks42) retinal hasar gördüğünü bildirmiştir. Açık / koyu tahlilinde, fare isterse farenin parlak ışıktan kaçması için karanlık bir bölge vardır. Ek olarak, önceki çalışmalar, kontrol grubundaki farelerin (C57BL / 6J fareleri) ışık bölgesinde 55, 1000 ve 27.000 lux28 altında benzer miktarda zaman geçirdiğini bulmuştur. CD1 fareleri için, kontrol grubu zamanın yaklaşık 1 / 3'ünü 27.000 lüksün altında ışıkta geçirdi10 ve yayınlanmamış veriler 55 lükste benzer sonuçlar göstermiştir. 27.000 lüks ışığın tek başına CD1 ve C57BL / 6J farelerini sıkıntılı hale getirmediğini öne sürüyor. Bununla birlikte, daha yüksek bir ışık yoğunluğu seçerken dikkatli olunmalıdır.
Işık ayarındaki farklılıkların yanı sıra, araştırmacılar açık / karanlık verileri analiz etmede çeşitli yaklaşımlar seçtiler. Işıktan kaçınmayı değerlendirirken, ışık kapalıyken (veya farelerin gözlerinin kırmızı ışığa daha az duyarlı olduğu göz önüne alındığında, ışık bölgesinin kırmızı ışık aydınlatmasıyla) ışık bölgesinde geçirilen süre hesaplamaya dahil edilir. Örneğin, aversion index= (lighttest'te light0 lux-time)/ light0 lux'te time, Gorin grubu tarafından ışıktan kaçınmayı değerlendirmek için kullanılmıştır43. Burada, 'ışık kapalı' veya 'kırmızı ışık' koşulları, ışık bölgesinden kaçınmanın, basit yer tercihinin aksine ışığın mevcut olması şartına bağlı olduğunu doğrulamak için dahil edilmiştir. Bu prosedürü i.p. CGRP enjeksiyonu ile gerçekleştirdik ve CGRP alan farelerin ışık bölgesinde ışık kapalıyken bir yer tercihine sahip olmadıklarını ve CGRP kaynaklı isteksizliğin ışığa bağımlı olduğunu doğruladık16. Son olarak, Gorin grubu, ışık bölgesinin çevresinde ışık bölgesinin çevresinde geçirilen zaman farelerini kaygı ölçüsü olarak kullandı36. Anksiyete için geleneksel bir test, açık alan testi kullanıyoruz. Hangi analiz yöntemi seçilirse seçilsin, kaygının ışıktan kaçınmaya katkısının göz ardı edilemeyeceği unutulmamalıdır. Bu protokol, ışık / karanlık ve açık alan tahlillerini birlikte kullanarak kaygı benzeri ve ışıktan kaçınıcı davranışları bölmeye çalışır.
Bu protokol, farelerde ışıktan kaçınma davranışının tespiti için açık / karanlık ve açık alan tahlillerinin kullanımını ele almaktadır. Bu, fotofobiyi yönlendiren sinir devrelerinin ve beyin bölgelerinin mekanizmalarını tanımlamak için yararlı bir araç sağlar. Test paradigması migrene özgü olabilir veya fotofobi içeren diğer bozukluklara genişletilebilir. Migren ile ilgili olarak, migren patogenezi ile ilişkili diğer iki nöropeptiti test ettik: hipofiz adenilat siklaz aktive edici polipeptit (PACAP) ve vazoaktif intestinal peptid (VIP). PACAP ve VIP'nin CD1 farelerde ışıktan kaçınmaya neden olduğu gösterilmiştir17,21. Migrene ek olarak, fotofobi ayrıca bradyopsi, akut oküler yaralanma veya iltihaplanma, travmatik beyin sendromları, Lyme hastalığı, albinizm ve koni distrofisi36 dahil olmak üzere diğer birçok bozukluğun bir belirtisidir. Bu nedenle, bu test paradigması, fotofobi ile ilişkili bozuklukların altında yatan mekanizmaları araştırmak için bir araç sağlar. Ayrıca, optogenetik yöntemlerin geleneksel farmakolojik yaklaşımlarla eşleştirilmesi, şüphesiz fotofobi ile ilişkili bozukluklar için yeni terapötiklerin geliştirilmesine yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların bildirecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH NS R01 NS075599 ve RF1 NS113839'dan gelen hibelerle desteklenmiştir. İçerikler VA veya Amerika Birleşik Devletleri Hükümeti'nin görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Activity monitor | Med Assoc. Inc | Software tracking mouse behavior | |
| Customized acrylic shelf | For adjusting the height of the LED panel | ||
| Dark box insert | Med Assoc. Inc | ENV-511 | |
| DC power supply | Med Assoc. Inc | SG-500T | |
| DC regulated power supply | Med Assoc. Inc | SG-506 | |
| Fiber-optic cannula | Doric | MFC_200/ 240-0.22_4.5mm_ZF1.25_FLT | |
| Germicidal disposable wipes | Sani-Cloth | SKU # Q55172 | |
| Heat Sink | Wakefield | 490-6K | Connecting to LED panel |
| IR controller power cable | Med Assoc. Inc | SG-520USB-1 | |
| IR USB controller | Med Assoc. Inc | ENV-520USB | |
| Mating sleeve | Doric | SLEEVE_ZR_1.25 | |
| Modified LED light panel | Genaray Spectro | SP-E-360D | Daylight-balanced color (5600K) |
| Power supply | MEAN WELL USA | SP-320-12 | Connecting to LED panel |
| Seamless open field chamber | Med Assoc. Inc | ENV-510S | |
| Sound-attenuating cubicle | Med Assoc. Inc | ENV-022MD-027 | |
| Stand and clamp | |||
| Three 16-beam IR arrays | Med Assoc. Inc | ENV-256 |
References
- Loder, S., Sheikh, H. U., Loder, E. The prevalence, burden, and treatment of severe, frequent, and migraine headaches in US minority populations: statistics from National Survey studies. Headache. 55 (2), 214-228 (2015).
- Collaborators, G. B. D. H. Global, regional, and national burden of migraine and tension-type headache, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 17 (11), 954-976 (2018).
- GBD 2017 Disease and Injury Incidence and Prevalence Collaborators. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
- international headache society. Headache classification committee of the international headache society (IHS). The international classification of headache disorders, 3rd edition. Cephalalgia. 38 (1), 1 (2018).
- Edvinsson, L., Haanes, K. A., Warfvinge, K., Krause, D. N. CGRP as the target of new migraine therapies - successful translation from bench to clinic. Nature Reviews Neurology. 14 (6), 338-350 (2018).
- Rapoport, A. M., McAllister, P. The headache pipeline: Excitement and uncertainty. Headache. 60 (1), 190-199 (2020).
- Maasumi, K., Michael, R. L., Rapoport, A. M. CGRP and Migraine: The role of blocking calcitonin gene-related peptide ligand and receptor in the management of Migraine. Drugs. 78 (9), 913-928 (2018).
- Caronna, E., Starling, A. J. Update on calcitonin gene-related peptide antagonism in the treatment of migraine. Neurologic Clinics. 39 (1), 1-19 (2021).
- Eftekhari, S., Edvinsson, L. Possible sites of action of the new calcitonin gene-related peptide receptor antagonists. Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 3 (6), 369-378 (2010).
- Mason, B. N., et al. Induction of migraine-like photophobic behavior in mice by both peripheral and central cgrp mechanisms. Journal of Neuroscience. 37 (1), 204-216 (2017).
- Russell, M. B., Rasmussen, B. K., Fenger, K., Olesen, J. Migraine without aura and migraine with aura are distinct clinical entities: A study of four hundred and eighty-four male and female migraineurs from the general population. Cephalalgia. 16 (4), 239-245 (1996).
- Crawley, J. N. Exploratory behavior models of anxiety in mice. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 9 (1), 37-44 (1985).
- Crawley, J., Goodwin, F. K. Preliminary report of a simple animal behavior model for the anxiolytic effects of benzodiazepines. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 13 (2), 167-170 (1980).
- Recober, A., et al. Role of calcitonin gene-related peptide in light-aversive behavior: implications for migraine. Journal of Neuroscience. 29 (27), 8798-8804 (2009).
- Recober, A., Kaiser, E. A., Kuburas, A., Russo, A. F. Induction of multiple photophobic behaviors in a transgenic mouse sensitized to CGRP. Neuropharmacology. 58 (1), 156-165 (2010).
- Kaiser, E. A., Kuburas, A., Recober, A., Russo, A. F. Modulation of CGRP-induced light aversion in wild-type mice by a 5-HT(1B/D) agonist. Journal of Neuroscience. 32 (44), 15439-15449 (2012).
- Kuburas, A., et al. PACAP induces light aversion in mice by an inheritable mechanism independent of CGRP. Journal of Neuroscience. , (2021).
- Russo, A. F. Calcitonin gene-related peptide (CGRP): a new target for migraine. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 533-552 (2015).
- Sowers, L. P., et al. Stimulation of Posterior Thalamic Nuclei Induces Photophobic Behavior in Mice. Headache. 60 (9), 1961-1981 (2020).
- Afridi, S. K., et al. A positron emission tomographic study in spontaneous migraine. Archives of Neurology. 62 (8), 1270-1275 (2005).
- Mason, B. N., et al. Vascular actions of peripheral CGRP in migraine-like photophobia in mice. Cephalalgia. 40 (14), 1585-1604 (2020).
- Guo, S., Vollesen, A. L. H., Olesen, J., Ashina, M. Premonitory and nonheadache symptoms induced by CGRP and PACAP38 in patients with migraine. Pain. 157 (12), 2773-2781 (2016).
- Christensen, C. E., et al. Migraine induction with calcitonin gene-related peptide in patients from erenumab trials. Journal of Headache and Pain. 19 (1), 105 (2018).
- Younis, S., et al. Investigation of distinct molecular pathways in migraine induction using calcitonin gene-related peptide and sildenafil. Cephalalgia. 39 (14), 1776-1788 (2019).
- Asghar, M. S., et al. Evidence for a vascular factor in migraine. Annals of Neurology. 69 (4), 635-645 (2011).
- Ueno, H., et al. Effects of repetitive gentle handling of male C57BL/6NCrl mice on comparative behavioural test results. Scientific Reports. 10 (1), 3509 (2020).
- Campos, A. C., Fogaca, M. V., Aguiar, D. C., Guimaraes, F. S. Animal models of anxiety disorders and stress. Revista Brasileira De Psiquiatria. 35, 101-111 (2013).
- Kuburas, A., Thompson, S., Artemyev, N. O., Kardon, R. H., Russo, A. F. Photophobia and abnormally sustained pupil responses in a mouse model of bradyopsia. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (10), 6878-6885 (2014).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
- Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia. 22 (1), 54-61 (2002).
- Cernuda-Morollon, E., et al. Interictal increase of CGRP levels in peripheral blood as a biomarker for chronic migraine. Neurology. 81 (14), 1191-1196 (2013).
- Chanda, M. L., et al. Behavioral evidence for photophobia and stress-related ipsilateral head pain in transgenic Cacna1a mutant mice. Pain. 154 (8), 1254-1262 (2013).
- Mahmoudi, J., et al. Cerebrolysin attenuates hyperalgesia, photophobia, and neuroinflammation in a nitroglycerin-induced migraine model in rats. Brain Research Bulletin. 140, 197-204 (2018).
- Farajdokht, F., Babri, S., Karimi, P., Mohaddes, G. Ghrelin attenuates hyperalgesia and light aversion-induced by nitroglycerin in male rats. Neuroscience Letters. 630, 30-37 (2016).
- Jacob, W., et al. Endocannabinoids render exploratory behaviour largely independent of the test aversiveness: Role of glutamatergic transmission. Genes, Brain, and Behavior. 8 (7), 685-698 (2009).
- Thiels, E., Hoffman, E. K., Gorin, M. B. A reliable behavioral assay for the assessment of sustained photophobia in mice. Current Eye Research. 33 (5), 483-491 (2008).
- Ramachandran, R., et al. Role of Toll-like receptor 4 signaling in mast cell-mediated migraine pain pathway. Molecular Pain. 15, 1744806919867842 (2019).
- Marek, V., et al. Implication of Melanopsin and Trigeminal Neural Pathways in Blue Light Photosensitivity in vivo. Frontiers in Neuroscience. 13, 497 (2019).
- Christensen, S. L. T., Petersen, S., Sorensen, D. B., Olesena, J., Jansen-Olesen, I. Infusion of low dose glyceryl trinitrate has no consistent effect on burrowing behavior, running wheel activity and light sensitivity in female rats. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 80, 43-50 (2016).
- De Vera Mudry, M. C., Kronenberg, S., Komatsu, S., Aguirre, G. D. Blinded by the light: retinal phototoxicity in the context of safety studies. Toxicologic Pathology. 41 (6), 813-825 (2013).
- White, D. A., Fritz, J. J., Hauswirth, W. W., Kaushal, S., Lewin, A. S. Increased sensitivity to light-induced damage in a mouse model of autosomal dominant retinal disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (5), 1942-1951 (2007).
- Song, D., et al. Retinal pre-conditioning by CD59a knockout protects against light-induced photoreceptor degeneration. PloS One. 11 (11), 0166348 (2016).
- Matynia, A., et al. Light aversion and corneal mechanical sensitivity are altered by intrinscally photosensitive retinal ganglion cells in a mouse model of corneal surface damage. Experimental Eye Research. 137, 57-62 (2015).
