Summary
在这里，提出了一种基于聚（β-氨基酯）聚合物的mRNA纳米颗粒的简单方案，易于通过改变封装的mRNA进行定制。还描述了合成聚合物，纳米颗粒及其 体外 基本表征的工作流程。还增加了关于免疫接种的概念验证。
Abstract
疫苗接种是现代社会的重大成功之一，在控制和预防疾病方面是不可或缺的。传统疫苗由全部或部分感染因子组成。然而，挑战依然存在，新的疫苗技术是强制性的。在这种情况下，将mRNA用于免疫目的已显示出增强的性能，正如迅速批准两种预防SARS-CoV-2感染的mRNA疫苗所证明的那样。除了成功预防病毒感染外，mRNA疫苗还可用于治疗性癌症应用。
然而，由于核酸酶的存在，mRNA的不稳定性及其从体内的快速清除使得其裸递送是不可能的。在这种情况下，纳米药物，特别是聚合物纳米颗粒，是关键的mRNA递送系统。因此，本文的目的是描述基于专有聚合物纳米颗粒的mRNA候选疫苗的配方和测试方案。本文将讨论所用聚（β-氨基酯）聚合物的合成和化学表征，它们与mRNA的络合形成纳米颗粒，以及它们的冻干方法。这是降低存储和配送成本的关键步骤。最后，将进行必要的测试，以证明其 体外 转染和成熟模型树突状细胞的能力。该协议将使从事疫苗接种工作的科学界受益，因为它具有高度的多功能性，使这些疫苗能够预防或治愈各种疾病。
Introduction
传染病对全球数百万人构成严重威胁，仍然是一些发展中国家死亡的主要原因之一。预防性疫苗接种一直是现代社会预防和控制传染病最有效的干预措施之一1，2。这些科学在20世纪相关性中的关键里程碑已经通过最近由SARS-CoV-2病毒3引起的全球Covid-19大流行来表达。认识到拥有有效疫苗以遏制疾病传播的重要性，所有生物医学界的合作努力已成功导致许多预防性疫苗在不到一年的时间内进入市场4。
传统上，疫苗由减毒（活的，降低的毒力）或灭活的（死亡颗粒）病毒组成。然而，对于一些没有安全误差余地的疾病，病毒颗粒是不可能的，而是使用蛋白质亚基。然而，亚基通常不能实现一种以上表位/抗原的组合，并且需要佐剂来增强疫苗接种效力5，6。因此，对新型疫苗类型的需求是显而易见的。
正如在当前大流行期间所表明的那样，基于核酸的新型候选疫苗在避免漫长的开发过程和提供高多功能性方面可能是有利的，同时产生重要的患者免疫接种。mRNA疫苗就是这种情况，它最初被设计为实验性癌症疫苗。由于它们产生抗原特异性T细胞反应的天然能力3，5，6，7。由于mRNA是编码抗原蛋白的分子，只是改变相同，疫苗可以快速定制以免疫同一微生物的其他变体，不同的菌株，其他传染性微生物，甚至成为癌症免疫治疗。此外，它们在大规模生产成本方面具有优势。然而，mRNA有一个阻碍其裸施用的重大障碍：其稳定性和完整性在充满核酸酶的生理介质中受到损害。因此，需要使用纳米载体来保护它并将mRNA矢量化到抗原呈递细胞2，8。
在这种情况下，聚（β-氨基酯）（pBAE）是一类生物相容性和可生物降解的聚合物，由于其阳离子电荷9，10，11，它们表现出在纳米颗粒中复合mRNA的显着能力。这些聚合物由酯键组成，这使得它们在生理条件下容易被酯酶降解。在pBAE候选文库中，那些用末端阳离子寡肽功能化的pBAE文库显示出更高的能力，可以形成小纳米颗粒，通过内吞作用有效地穿透细胞并转染包封的基因材料。此外，由于它们的缓冲能力，内体室的酸化允许内体逃逸12，13。即，一种特定类型的pBAE，包括其骨架上的疏水部分（所谓的C6 pBAE）以增强其稳定性和终寡肽组合（用三赖氨酸修饰的60%聚合物和40%的聚合物用三组氨酸修饰），其在肠胃外给药后选择性地转染抗原呈递细胞并产生mRNA编码的抗原呈递，然后进行小鼠免疫接种，最近已发表14.此外，还证明这些配方可以规避纳米医学配方的主要瓶颈步骤之一：在不失去功能的情况下冷冻干燥它们的可能性，这使得在软干燥环境中具有长期稳定性15。
在这种情况下，当前方案的目标是通过描述方案中的关键步骤并使用于传染病预防和肿瘤治疗应用的有效疫苗能够生产，使mRNA纳米颗粒的形成程序可供科学界使用。
以下方案描述了合成寡肽末端修饰聚（β-氨基酯） - OM-pBAE聚合物的完整锻炼，这些聚合物将进一步用于纳米颗粒合成。在该协议中，还包括纳米颗粒制剂。此外，还提供了程序成功的关键步骤和代表性结果，以确保所得配方完成所需的质量控制表征特征，以定义阳性或阴性结果。该协议总结在 图1中。
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Protocol
1. pBAE聚合物与末端寡肽（OM-pBAE）的合成
- C6-pBAE的聚合
- 加入5-氨基-1-戊醇（38毫摩尔;分子量= 103.16 Da）1-己胺（38毫摩尔;MW = 101.19 Da）放入圆底玻璃瓶（100 mL）中。然后，加入1，4-丁二醇二丙烯酸酯（82毫摩尔;MW = 198.22 Da）。
- 将硅油浴预热至90°C，将圆底烧瓶放入油浴中，并借助磁力搅拌棒搅拌混合物过夜（〜18小时）。然后，从圆底烧瓶中取出产品并将其置于-20°C的冰箱中。
注意：该产品呈粘性粉末形式，在刮刀的帮助下从烧瓶中取出。必须通过 1H-NMR验证所得聚合物的结构。核磁共振波谱记录在400 MHz仪器（见 材料表）中，使用氯仿-d和D2O作为溶剂。取约10mg每种聚（β-氨基酯）并溶解在1mL氘化溶剂中。
- 与肽反应得到OM-pBAE
- 将25 mL 0.1 M HCl加入选定的肽中，例如，与三氟乙酸的Cys-His-His-His肽（TFA，200mg）一起加入先前称重的50 mL离心管中，该离心管可以静置冷冻干燥并手动搅拌过夜以获得澄清溶液。
- 将溶液在-80°C下冷冻1小时，并将所得的肽盐酸盐冷冻干燥。
注：检查最终权重是否与理论值相对应。 - 在二甲基亚砜中制备C6-pBAE（0.031毫摩尔）溶液。另外，在二甲基亚砜中使肽盐酸盐（0.078毫摩尔）溶液。
- 将两种溶液混合在螺旋盖管中，然后拧在盖子上。用磁性搅拌棒在受控温度为25°C的水浴中搅拌混合物溶液20小时。
- 将混合物加入7：3（v / v）乙醚/丙酮中。在4°C下以25，000×g离心所得悬浮液以除去溶剂。接下来，用7：3（v / v）乙醚/丙酮洗涤固体两次。然后，在真空（<0.2个大气压）下干燥产品。
- 在二甲基亚砜中制成100mg / mL的产物溶液。所得产物被命名为C6-肽-pBAE。必须通过 1H-NMR验证所获得的聚合物的结构，以确认与末端丙烯酸酯相关的烯烃信号的消失。如果不使用，聚合物可以在-20°C下冷冻。
2. 多相体形成
注意：所有程序都应在有空调的房间内进行，以保持恒定的温度。
- 解冻聚合物C6-肽-pBAE并涡旋溶液。
- 上下移取聚合物混合物，并在乙酸钠（NaAc）中制备12.5mM（V 1）的溶液。然后，涡旋混合物并等待10分钟。
- 以0.5mg / mL制备mRNA并通过移液混合（V2）。
注意：避免涡旋mRNA至关重要。 - 以最终浓度涡旋聚合物混合物，以达到DMSO中的聚合物储备物与醋酸盐缓冲液之间的均勻溶液。
注：最终聚合物浓度取决于所选的N/P（氮与磷酸盐基团）比率。N/P比率取决于要使用的每种特定mRNA。例如，对于eGFP封装，使用了25：1的比率，如前所述14。 - 将遗传物质溶液和C6肽BAE溶液（mRNA浓度的25倍）以1：1（Vi = V1 + V2）的比例混合。
注意：将C6-肽-pBAE上样在微量离心管中，通过上下移液混合加入mRNA。制备后，将多链体、核酸和C6-肽-pBAE浓度减半稀释。 - 在25°C下在热块中孵育30分钟。通过将样品加入装有水的预加载微量离心管中，用1：2 RNase游离水沉淀。
- 包括赋形剂。通过上下移液，在HEPES 20 mM和蔗糖4%中加入与mRNA和pBAE（Vi）混合物相同体积的体积。此时，样品已被稀释3倍。
3. 多复合物冻干
- 瞬间，将先前的聚相溶液在-80°C冰箱中冷冻1小时。
- 通过以下步骤进行初级干燥：（1）在-60°C和0.001 hPa下1小时;（2）-40°C和0.0001 hPa下1小时;（3）在-20°C和0.0001 hPa下4小时;（4）在5°C和0.0001 hPa下12小时。
- 立即储存在-20°C，以避免在使用前补液。
4. 多孔重用松
注意：该协议描述了用于重建冻干的C6-肽-pBAE纳米颗粒的过程，以进一步用于表征 ，体外 或 体内 分析。
- 在使用时从-20°C取冻干纳米颗粒，并迅速加入相应量的脱热原（DEPC）水以重新散布固体以达到所需的浓度。
注意：如果设想相同的浓度，则体积将与纳米颗粒的初始体积相同，但每个实验都会指示。 - 轻轻移液直至完全重悬，用移液器随液体。
注：确保小瓶壁上没有残留物质。 - 溶解后，用力上下移液，避免气泡。
注：样品应具有透明至半透明方面，这在较高浓度下更为明显。 - 将样品储存在冰上或在4°C下重构后最长时间为24小时。避免冻结。
5. 多工表征
- 动态光散射
注：使用Zeta电位分析仪在25°C，633nm激光波长和173°信号检测器下测量纳米颗粒的流体动力学直径（nm），多分散指数（PDI）和表面电荷（见 材料表）。- 流体动压直径（纳米）
- 如前所述，通过将基因材料移液到聚合物级分中，将mRNA和pBAE充分混合到0.25mg / mL的最终浓度（步骤2）。
- 用过滤的稀释介质预冲洗微立方体，以完全清洁其杂质。然后，用至少50μL样品溶液填充比色皿并盖上盖子。接下来，将样品引入DLS仪器内部，确保正确插入细胞。
注：稀释介质使用0.22μm注射器过滤器过滤。 - 打开创建 的标准操作过程 （SOP） 文件，并引入所需的 示例名称。选择 尺寸测量。
注意： 表 1中提供了用于创建尺寸测量 SOP 的所有参数。 - 使用DLS运行粒度测量，方法是单击 Play。
注：发出三声蜂鸣音后，分析完成。 - 选择与测量表上的样品相对应的结果，以获得平均粒径、平均PDI、标准偏差和图形。完成后，从DLS设备中移除单元。
- 取出样品，保持其进行zeta电位分析，并用去离子水清洁和冲洗细胞。最后，在压缩空气气流下干燥清洁的比色皿。
- 表面电荷（毫伏）
- 如前所述，通过将基因材料移液至聚合物级分至0.25mg / mL的终浓度mRNA，彻底制备混合mRNA和pBAE的纳米颗粒（步骤2，Polyplex形成）。接下来，冷冻并干燥溶液。
注意：在这种情况下，为了测量表面电荷，强烈建议在执行将样品重新分散到适当缓冲液中的措施之前对样品进行冷冻干燥，模拟pH和电解质浓度的体条件。 - 用水重悬冻干样品。在水中稀释样品1/10（终浓度0.025mg / mL）。
- 用过滤的稀释介质预冲洗一次性折叠毛细管细胞（zeta电位比色皿），以完全清洁其杂质。然后，使用1 mL注射器用稀释的纳米颗粒填充比色皿，并盖住填充物的两面。
注意：纳米颗粒分散体必须填充比色皿中可用的体积（〜1 mL），特别注意气泡的形成，这可能会扰动措施。 - 在DLS中介绍示例;确保单元格已正确插入。
- 打开为zeta电位分析创建的SOP文件，并引入所需的 样品名称。选择 Zeta 电位测量。
注：为zeta电位测量创建SOP的参数如 表2所示。 - 使用DLS运行zeta电位测量，方法是单击 Play。
注：发出三声蜂鸣音后，分析完成。 - 选择与测量表上的样品相对应的结果，以获得平均zeta电位、标准偏差和图形。完成后，从DLS设备中取出单元。
- 如有必要，取出样品并保留。接下来，用去离子水清洁并冲洗比色皿细胞，然后再次用乙醇和水冲洗。最后，在压缩空气气流下干燥清洁的比色皿。
注：要分析数据，请使用推荐的软件。
- 如前所述，通过将基因材料移液至聚合物级分至0.25mg / mL的终浓度mRNA，彻底制备混合mRNA和pBAE的纳米颗粒（步骤2，Polyplex形成）。接下来，冷冻并干燥溶液。
- 流体动压直径（纳米）
- 纳米颗粒跟踪分析
注：使用纳米颗粒跟踪分析仪在25°C，488nm激光波长下测量纳米颗粒的流体动力学直径（nm）和浓度（见 材料表).- NTA和样品制备
- 打开计算机和设备。首先，检查是否所有组件都已正确插入。接下来，打开推荐的软件。该软件将检查所有配件是否正确连接。
- 将顶板，这里，O形圈单元，连接到激光模块中。
注：请勿过度拧紧此部件。 - 首先用1 mL注射器将缓冲液和/或去离子水装入腔室。重复该过程至少两次。避免在腔室中引入气泡。
- 通过将DLS尺寸测量中使用的浓度稀释1/1000在去离子水中来制备样品。准备至少1毫升并将其装入1毫升注射器中，避免引入气泡。
- 使用注射器将样品装入腔室。然后，将激光模块插入NTA大腔室。
注意：大腔室表示放置腔室以进行测量的空间。
- 图像优化
- 首先，在 硬件中，检查是否选择了 相机 和正确的激光器。
注意：这里只有一个摄像头和蓝色激光488 nm。 - 从相机级别为 0 开始，然后按"拍摄"窗口中的 "启动相机 "。
注意：此时，请调整以下参数。 光束位置 （可以在屏幕上上下移动）。 相机电平：避免过饱和像素。 对焦（侧轮）：尽量更好地对焦。最好是有光晕的粒子，而不是不聚焦的粒子。浓度：调整浓度，使每个场有10到100个粒子。
- 首先，在 硬件中，检查是否选择了 相机 和正确的激光器。
- 录像
- 在软件中，转到"测量选择- SOP"窗口（左下）并选择"标准测量"。
注：程序执行三个测量值，每个测量值为 30 秒（使软件能够执行平均值和标准偏差计算）。提供名称和文件夹路径（在基本文件名上）以保存示例的记录。正确设置 SOP 参数后，按 "创建 并 运行脚本"。一旦测量了第一个重复，程序将要求添加新的样品。然后，必须通过推动注射器的柱塞将样品的另一部分引入腔室中。最后，重复第三次以分析第三次重复。
- 在软件中，转到"测量选择- SOP"窗口（左下）并选择"标准测量"。
- 视频处理
- 三个测量完成后，重新调整 屏幕增益 和 检测阈值 ，以分析测量的颗粒。此时，每帧中应出现大约100个粒子来执行分析（预计会有高红十字和低蓝十字）。
- 分析完成后，将结果导出为pdf文件。此外，还可以导出为视频和excel文件。
- 清洁 NTA
注意：在研究以下样品之前，请关闭所有打开的测量值;由于生成的文件是巨大的，并且取决于计算机，因此维护多个打开的文件并不容易。- 在进行后续测量之前，通过反复冲洗水来清洁NTA室，直到没有观察到颗粒;随后，刷新使用的缓冲区 （PBS） 以继续采取措施。
- 冲洗腔室内的空气，并在当天的最后一次测量完成后用显微镜级纸将其干燥。
- 通过透射电子显微镜（TEM）表征尺寸和形状。准备样品。最终体积的30 μL足以用于TEM表征。
注意：可以测量新鲜和冻干 - 重悬后 - 纳米颗粒。 - 将10μL样品滴在碳涂层的铜网格上。让它干燥10分钟。如有必要，通过轻轻敲击滤纸来除去多余的液体。
- 滴下10μL乙酸铀酰（2%w / v）溶液进行阴性染色。让它干燥1分钟。如有必要，通过轻轻敲击滤纸来清除多余的液体。
- 在显微镜中引入样品并进行扫描（电压操作80 kV）。
注：适当的软件可用于进一步分析图像。
- NTA和样品制备
- 封装效率
- 样品制备
- 以所需的浓度制备纳米颗粒并冷冻并干燥它们。然后，重悬纳米颗粒并将其稀释至6μg/ mL的终浓度。
- 从20倍储备溶液中制备1x TE缓冲液。
注：Vt（总体积）=（样品数量 x 100 μL x 4）（样品数量 x 290 μL）+ 2 mL。 - 从100μg/ μL的储备中用3μg/ μL肝素制备TE缓冲液。
注：Vt = 样品数量 x 50 μL x 2。 - 准备标准
- 在1x Tris-EDTA（TE）缓冲液中制备范围从0.2μg/ mL到0.025μg/ mL的RNA标准品（表S1A）。
注意：在RNA标准品中使用mRNA，以防与核糖体RNA不同。 - 用肝素制备RNA：pBAE标准品（表S1B）。准备肝素标准品（表S1C）。
- 按如下方式准备96孔板。
- 在96孔板的第一泳道中加载295μLTE缓冲液（与要分析的样品一样多）。然后，将50μL1x TE缓冲液加载到泳道B和C中（每个样品重复）。
- 将50μL1x TBE缓冲液与3μg/ μL肝素上样到泳道D和E中（每个样品重复）。接下来，在通道F，G和H中加载每个标准品的100μL（每种标准品的重复）。
- 在泳道A中加载5μL每个样品（每个孔中的浓度为0.1μg/ mL）。通过移液正确混合，并将每个样品的50μL加载到下面的四个孔上（其中两个含有50μL缓冲液1x TE，另外两个含有1x TE缓冲液和3μg/ μL肝素）。
- 将样品在37°C下孵育30分钟。 根据制造商的实验方案（见 材料表）在1x TE缓冲液中制备RiboGreen试剂。
注意：稀释1：200并涡旋。避光。Vt = 满孔数 x 100 μL。 - 将100μL核糖绿溶液加载到每个孔中。使用激发波长为500nm，发射波长为525nm的酶标仪检测荧光。
- 结果分析
- 准备三条校准曲线
注意：首先，核糖体RNA标准品。在此校准曲线中插入不含肝素的样品。其次，mRNA：pBAE与肝素。在此校准曲线中插入含有肝素的样品。第三，肝素。用于保证工作浓度在线性范围内。 - 计算封装效率 （EE%）如下：
- 准备三条校准曲线
- 样品制备
6. 体外 表征
- 用于定性评估的荧光显微镜
- 转染24小时后将96孔板放在显微镜上。开始使用 10 倍物镜可视化单元格。
注意：在这种情况下使用HeLa细胞。使用透射模式（明场）对电池进行定位，此时必须调整焦点。- 首先，应用白平衡来参考有关样品背景的软件。然后，获取图像以在分析过程中将其与荧光图像叠加。
- 将显微镜模式更改为反射模式（荧光），并将滤光片轮移动到蓝色激光（488 nm）以可视化eGFP。
注：此时，必须调整曝光时间和增益。增益必须在3到5之间调整值，以避免背景信号上的伪影和过多。曝光时间的调整取决于转染效率（从ms到1 s）。 - 使用相同的曝光时间获取所有条件或孔的图像，以比较所有样品。
- 转染24小时后将96孔板放在显微镜上。开始使用 10 倍物镜可视化单元格。
- 用于定量评估的流式细胞术 （FC）
- 使用多通道移液器为流式细胞术实验准备96孔板。
注意：当处理半贴壁细胞时，例如在JAWSII细胞系中，恢复所有培养基体积并将其储存到另一个96孔板中。不要渴望这种培养基，因为它可能含有大量转染的细胞。 - 用100μL /孔的1x PBS清洁细胞（这里使用HeLa细胞）并吸气。接下来，加入25μL/孔胰蛋白酶，并在37°C下孵育5分钟。
- 一旦细胞分离，加入先前回收的培养基以停止胰蛋白酶作用并固定细胞，加入31.25μL/孔福尔马林10%持续20分钟（终浓度2.5%）。
注意：在这一点上，通过显微镜观察细胞的状态以确保细胞的分离至关重要。强烈建议上下移液几次，以帮助细胞分离并避免其结块。这将产生可靠的结果。 - 打开流式细胞仪和软件。在软件中，为实验设置适当的条件（板类型，样品体积和其他参数，例如振荡，样品之间的漂洗。
注：对于步骤6.2.5，流速应为120μL/分钟。每1分钟混合一个周期，每孔冲洗一个周期。混合对于保持细胞分散在培养基中并允许更好地分析单个细胞至关重要。此外，需要冲洗以清洁样品之间细胞计数器的微流体。最后，检查是否有足够的缓冲区以及是否所有组件都已正确连接。 - 设置适当的参数以量化阳性转染细胞的百分比。
- 首先，查看（前向散射光）FSC与SCC（侧向散射光）散射图上的流动数据，以区分细胞和碎片。然后，绘制另一个比较振幅（FSC-A）与高度（FSC-H）的散点图以门控和区分单个细胞。
注意：未经处理的群体允许门控对应于阳性转染细胞的群体。然后，在直方图上的适当通道上对阳性转染细胞进行定量。因此，阳性转染的细胞必须表示为直方图上事件的连续体。
- 首先，查看（前向散射光）FSC与SCC（侧向散射光）散射图上的流动数据，以区分细胞和碎片。然后，绘制另一个比较振幅（FSC-A）与高度（FSC-H）的散点图以门控和区分单个细胞。
- 使用多通道移液器为流式细胞术实验准备96孔板。
7. 体外 功能测试：使用卵清蛋白（OVA）作为抗原模型mRNA来激活模型免疫细胞的能力
- 转染前一天在96孔板中板10，000个细胞/孔（此处使用JAWSII细胞）。
注意：根据需要盘入尽可能多的孔，以便每种情况一式三份。让细胞附着在板上至少12小时（建议过夜孵育）。 - 按照以下注释中所述制备pBAEs NPs，以转染每孔0.6μgmRNA。
注意：作为阳性对照，使用转染试剂转染细胞。在这里，我们每孔使用0.1μgmRNA和每孔0.25μL转染试剂。购买了用于OVA的mRNA编码（见 材料表）。它是聚腺苷酸化的，用5-甲氧基尿苷修饰，并针对哺乳动物系统进行了优化，并通过带有Cap1结构的封端保护，Cap1结构是供应商的专有方法。 - 将96孔板在37°C和5%CO 2的干燥空气培养箱中孵育24小时。
注：在此时间之后，请勿使用培养基，因为它可能包含一定数量的细胞。回收细胞并将其保存在另一个孔或板中。 - 用25μL1x PBS洗涤留在孔中的细胞。接下来，将其吸出并加入25μL胰蛋白酶，并在37°C下孵育板5分钟以分离细胞。通过将先前恢复的培养基添加到相应的孔中来停止胰蛋白酶反应。
- 在4°C下以400×g离心板5分钟。 渴望媒体。加入50μL/孔的1x PBS和2.5%的福尔马林。将其在4°C下孵育20分钟以固定细胞。
- 重复步骤 7.5 和 7.5.1。然后，加入50μL/孔的1x PBS和3%BSA（封闭缓冲液），并在4°C下孵育30分钟。 再次重复步骤7.5和7.5.1，然后在1x PBS和3%BSA中加入50μL/孔一抗（小鼠α-OVA），并在4°C下孵育30分钟。
- 重复步骤7.5和7.5.1，然后用50μL/孔1x PBS洗涤细胞。Aspire培养基，然后加入二抗溶液（α-小鼠-AlexaFluor488/PerCP和Cy5.5-CD11b/APC-CD86）在1x PBS和3%BSA中。在4°C下孵育1小时。
- 将板以400×g离心5分钟。 然后，用50μL/孔1x PBS洗涤细胞。接下来，离心（400×g，持续5分钟），吸气，然后将细胞重悬于100μL/孔的1x PBS和2.5%福尔马林中。
- 如上所述，通过流式细胞术对其进行分析（步骤6.2）。
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Representative Results
聚合物合成和表征
OM-pBAE合成过程如图 2所示。如图 2A 所示，获得OM-pBAE的第一步是通过将胺（1-己胺和5-氨基-1-戊醇，比例为1：1）添加到二丙烯酸酯（1，4-丁二醇二丙烯酸酯）中来合成C6-pBAE。该反应在90°C下进行20小时，并不断搅拌。之后，将寡肽溶液加入到从先前反应中获得的C6聚合物溶液中（图2B）。最后，使用DMSO作为溶剂在25°C下连续搅拌20小时进行合成， 图2C 显示了OM-pBAE的结构，OM-pBAE是聚合的产物。所得聚合物由 1H-NMR表征（见 补充图S2）。在表征中，阳性结果是具有几个单体单元（图中的n + m）组成的结果在7-10之间;分布一半单元类型和另一半单元类型;而超出此范围的任何其他数字都是负结果。
纳米颗粒合成与理化表征
表3 显示了GFP mRNA封装纳米颗粒作为概念验证的物理化学表征结果。先前已经证明，无论封装14的mRNA类型如何，大小和表面电荷都没有显着差异。在新鲜制备和冻干的纳米颗粒中进行了表征，以证明其物理化学性质的稳定性，并证明，如前所述，冷冻干燥过程被调整到这些制剂15。当多链体的流体动力学半径范围约为150-220 nm时，被认为是正确的。此外，PDI 必须是恒定的，大约为 0.2，但最高可达 0.3。因此，在冻干前后，大小和PDI均未显示出显着差异，如此处使用代表性结果所示。此外，使用NTA进行纳米颗粒施胶，以确认先前获得的结果。超出上述指定范围的任何值都被视为负结果，应丢弃粒子以供进一步使用。
在这种类型的样品的物理化学表征过程中，将DLS获得的结果与NTA获得的结果进行比较是很方便的。这两种技术都通过测量扩散系数来确定颗粒的流体动力学半径。NTA中每帧计数的纳米颗粒数量在80到100之间，以准确跟踪颗粒。还表征了表面电荷以确保纳米颗粒的正电荷，促进与细胞膜的静电相互作用。最后，采用透射电子显微镜（TEM）对多丛的形貌进行了表征。图3证实了直径约为50nm的球形和单分散纳米颗粒的形成。通过分析TEM图像获得较小的直径，因为NTA和DLS都测量流体动力学直径。尽管与散射测量相比，在进行电子显微镜测量16，17时总是需要较小的尺寸，但在这里必须强调差异接近100nm，这通常是不预期的。这归因于这些纳米颗粒的高吸湿性，由包封的mRNA和组成聚合物的末端寡肽共同给出。
mRNA包封效率测定
另一个要测量的关键参数是纳米颗粒封装mRNA的能力，这是活性原理，需要封装才能实现其对nucelases的保护18，19，20。该协议的开发是为了按照供应商的说明分析核酸截留的封装效率（EE;以百分比表示）。获得的值给出了成功捕获到纳米颗粒中的核酸百分比的想法。核糖绿染料，一种荧光核酸染色剂，用于此目的。该协议包括定量荧光染料仍然可访问的任何RNA。为了量化总RNA，纳米颗粒需要被拆卸，肝素用于此目的。
表4 显示了封装GFP和OVA mRNA的OM-pBAE多链体的封装效率（EE%），作为概念证明。RiboGreen荧光测定允许计算通过肝素除去反汇编后包留在纳米颗粒中的mRNA的量以释放其含量。获得的效率值必须高于80%，并且如本文所示，根据mRNA的类型，不会显示出显着差异。较低的封装效率值表示负结果，并构成丢弃这些配方的信号。这些结果证实了OM-pBAE的mRNA的高包封容量，其多功能性及其在基因递送中的有希望的应用。
体外 代表性结果
确定pBAEs多相丛的能力至关重要。首先，转染，其次，激活免疫细胞14。转染效率通过两种不同的技术进行评估，使用eGFP作为报告mRNA：荧光显微镜以目视确定报告蛋白和流式细胞术表达以量化转染效率。采用配备CCD相机，5x，10x，20x和40x物镜以及UV，蓝色和绿色滤光片激光器的荧光显微镜来定性地确定jaWSII细胞系（一种小鼠树突状细胞系）中eGFP蛋白的表达。eGFP蛋白在488nm处具有激发最大值，对应于蓝色激光，最大发射波长约为510nm，对应于绿色。为了量化靶蛋白的转染效率表达，在用eGFP mRNA的pBAEs多链体转染24小时后对转染细胞进行流式细胞术分析。当细胞用荧光报告基因（如GFP或RFP）转染时，固定步骤是有帮助的。
图4 显示了JAWSII细胞系转染24小时后eGFP表达的定性分析。同样，与阴性对照相比，eGFP报告信号明显更高。此外， 表5 显示了JAWSII细胞系中OM-pBAE纳米颗粒显示的转染效率。同样，效率值与使用经典转染试剂进行的阳性对照相当。
已经评估了加载有OVA mRNA的pBAEs NPs激活模型免疫细胞的能力，JAWSII细胞系是一种小鼠未成熟的树突状细胞系。为了确定免疫细胞的激活，使用了两种不同的标记物：CD11b和CD86。首先，为流式细胞仪配置选择合适的荧光团。这里使用PerCP-Cy5.5（CD11b）和PE（CD86）。未成熟和非活化的细胞系必须显示CD11b-/CD86-谱，而活化的细胞必须显示CD11b+/CD86+谱。采用488 nm处的蓝色激光测定靶蛋白表达，并采用抗OVA抗体加二级抗小鼠Alexa488抗体。 表6 显示了该实验中使用的最终面板。 图5 显示了OVA mRNA负载的OM-pBAE纳米颗粒激活DC的能力，这表明细胞免疫反应的激活。非转染细胞显示表达CD11b和CD86膜标志物的细胞数量较少，而mRNA OVA OM-pBAEs处理的细胞显示CD11b和CD86标记物的表达显着增加。这一结果表明，OM-pBAE纳米颗粒促进成熟。总之，这些结果证实了OM-pBAEs纳米颗粒有效转染树突状细胞并介导免疫反应的激活促进未成熟DC成熟的能力。
图1：整个合成协议的示意图。 在此图中，详细介绍了mRNA疫苗合成步骤，包括关键表征参数。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：合成C6-pBAE寡肽末端修饰（OM-pBAE）（A）原料化学品以执行Michael添加。（B） pBAE + 寡肽。（C） OM-pBAE.R可以是组氨酸（H）或赖氨酸（K）。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：封装OM-pBAE纳米颗粒的新鲜GFP mRNA的TEM图像。 对多链体进行负染色以进行电子显微镜表征。图中显示了直径约为60nm的单分散颗粒。（A）和（B）图像代表同一样品的两种不同显微镜。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：用OM-pBAE/eGFP mRNA纳米颗粒对JAWSII转染细胞进行荧光显微镜成像。（B） GFP 荧光（绿色）。（C） 前两个图像的合成。比例尺 = 100 mm。请单击此处查看此图的放大版本。
图5：用OM-pBAE / OVA mRNA纳米颗粒转染后JAWSII的活化。 负对照 （CN） 值对应于黑色标签。转染的细胞对应于灰色标签。柱对应于三个仿行的标准偏差 （SD）。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 材料 | 材料 | 微囊泡 |
| 折射率 | 1.4 | |
| 吸收 | 0.01 | |
| 分散 剂 | 分散 剂 | 水 |
| 温度（°C） | 25 | |
| 粘度 （cP） | 0.8872 | |
| 折射率 | 1.33 | |
| 温度 | 温度（°C） | 25 |
| 平衡时间（s） | 10 | |
| 细胞 | 电池片类型 | 禅0040 |
表 1：用于创建用于尺寸测量的 SOP 的参数。
| 材料 | 材料 | 微囊泡 |
| 折射率 | 1.4 | |
| 取消 | 0.01 | |
| 分散 剂 | 分散 剂 | 水 |
| 温度（°C） | 25 | |
| 粘度 （cP） | 0.8872 | |
| 折射率 | 1.33 | |
| 温度 | 温度（°C） | 25 |
| 平衡时间 | 10 | |
| 细胞 | 电池片类型 | DTS1070 系列 |
表 2：为 zeta 电位测量创建 SOP 的参数。
| GFP mRNA/OM-pBAE | T (oC) | 氢化二氢物质直径（纳米） | 断续器 | 表面电荷（毫伏） | |
| 断续器 | 断续器 | ||||
| 新鲜 | 25 | 124 ± 32 | 134 ± 8 | 0.2 ± 0.04 | 32 ± 0.7 |
| 冻 | 25 | 135 ± 35 | 138 ± 2 | 0.17 ± 0.02 | 34 ± 0.7 |
表3：封装OM-pBAE纳米颗粒的mRNA的物理化学表征。 对包封的OM-pBAE多链体的GFP mRNA在制备后立即进行表征 - 新鲜 - 和冻干过程后，以确保颗粒的稳定性。图中显示了DLS和NTA尺寸以及表面电荷数据。
| 废旧% | |
| GFP mRNA/OM-pBAE | 82.3 ± 1.5 |
| OVA mRNA/OM-pBAE | 83.1 ± 1.5 |
表4：封装OM-pBAE纳米颗粒的mRNA的封装效率（EE%）数据。 包封OM-pBAE纳米颗粒的GFP和OVA mRNA的包封效率百分比。对冻干样品进行RiboGreen荧光测定，以评估多链中包留的mRNA的量。
| 样本 | % GFP 阳性细胞 | 标清 |
| 阴性对照 | 1.85% | 0.21% |
| OM-pBAE/eGFP mRNA 转染细胞 | 57.79% | 5.28% |
表5：JAWSII细胞系中OM-pBAE/eGFP mRNA纳米颗粒的转染效率。 通过流式细胞术跟踪转染效率。
| 抗体 | 细胞染色 | 荧光标签 |
| CD11b | 激活的 DC | 每氯乙烯-氰 5.5 |
| 镉86 | 激活的 DC | 体育 |
| α鼠标 AlexaFluor488 | OVA阳性细胞 | 亚历克沙福陆 488 |
表6：流式细胞术面板。 该组合用于流式细胞术研究，以确定mRNA疫苗的 体外 功能。
补充信息： 请参阅包含所有补充信息的补充文件。请点击这里下载下面的文件。
表S1A： 核糖体RNA标准品。
表S1B： RNA：pBAE与肝素标准品
表 S1C： 肝素标准品。
图 S2：1个C6-pBAE和OM-pBAE的H-NMR质子光谱。 （A） 来自 C6-pBAE 的 1H-核磁共振。氯仿-d用作溶剂（δ= 7.25 ppm）。（B） 来自 C6CH3 的 1H-NMR。D2O用作溶剂（δ= 4.64 ppm）。
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Discussion
在去年Covid-19大流行爆发后，疫苗在传染病控制方面的重要性已表现为关键组成部分8。全世界科学家的努力使许多疫苗得以投放市场。历史上第一次，mRNA疫苗已经证明了他们以前假设的成功，这要归功于他们的快速设计，因为他们有能力在几个月内适应任何新的抗原5，6，21。mRNA或信使核糖核酸是指从DNA中的编码信息驱动蛋白质合成的核酸。在这里，出于疫苗接种目的，mRNA编码为属于感染性微生物的抗原蛋白（或在治疗性肿瘤疫苗接种的情况下为肿瘤抗原）8，22。在这种情况下，科学界必须有明确的合成mRNA疫苗方案。
考虑到这一想法，基于专有聚合物纳米颗粒合成mRNA疫苗的直接程序旨在描述24。如方案部分所述，首先，聚合物使用两步法合成，该程序基于Michael将伯胺添加到丙烯酸酯基团中以合成聚合物主链，然后添加末端寡肽以增强阳离子特性和从内体逸出到所得聚合物的能力12，13，14.然后，在进一步的步骤中，通过将聚合物与mRNA混合来制备纳米颗粒，以实现它们的静电相互作用以形成小的纳米颗粒。
虽然聚合物的合成是一个简单的方案，但对于纳米颗粒配方来说，情况并非如此。世界各地的许多合作者都使用这些聚合物，并在涉及颗粒的制备和使用时发现了共同的关键步骤。考虑到合成是通过手动混合进行的，用户的能力起着至关重要的作用。最棘手的步骤是混合聚合物和mRNA，这必须以受控的方式进行，因为必须完成混合物进一步沉淀步骤到水和缓冲液的添加。对混合这两种成分的机制的任何修改都将导致微粒（而不是纳米颗粒），这不能用于人类。因此，混合是需要一些练习才能正确实现的故障排除步骤之一。
另一个引人注目的点是冷冻干燥。众所周知，它代表了纳米制表的瓶颈步骤之一。在这种特定情况下，花了几年时间调整所有参数并描述成功的协议15。即使调整了这一点，该协议的另一个关键步骤是配方的重新分散，如果执行不当，就会带来纳米颗粒的聚集，并且它们会失去功能。在这种情况下，必须将配方迅速置于干燥，略微寒冷的环境中，以避免其不受控制的再水合作用。由于其高吸湿性，必须特别注意通过小心地上下移液由冻干形成的所有粘性粉末，以受控的方式重新水化它们。如果样品以非受控方式再水合，它们将立即聚集形成半透明胶至不透明分散体。
虽然这里提到了关键步骤，但合成pBAE多链的方案简单快捷，这在基因递送系统的其他合成方法中是有利的。这里，详细提供了mRNA疫苗接种的具体应用。然而，它代表了一种通用的方法，也可以应用于封装其他类型的核酸和非疫苗使用，例如在肿瘤学和心血管领域，如先前发表的13，23，24。
总之，该协议将使这些专有聚合物能够供科学界设计新的mRNA疫苗，同时避免所有这些故障排除。与其他mRNA脂质制剂相比，这些聚合物在冷冻干燥的可能性，长期稳定性以及通过不需要超低温降低储存和分配成本方面具有优势。因此，预计OM-pBAE疫苗在预防和治疗应用的疫苗接种领域发挥至关重要的作用。
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Disclosures
作者无需披露任何内容，也没有任何利益冲突。
Acknowledgments
MINECO/FEDER（授予SAF2015-64927-C2-2-R，RTI2018-094734-B-C22和COV20/01100）的财政支持得到确认。CGF承认了她的IQS博士奖学金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-butanediol diacrylate | Sigma Aldrich | 123048 | |
| 1-hexylamine | Sigma Aldrich | 219703 | |
| 5-amino-1-pentanol | Sigma Aldrich | 411744 | |
| Acetone | Panreac | 141007 | |
| CD11b antibody | BD | 550993 | |
| CD86 antibody | Bioligend | 105007 | |
| Chlor hydroxhyde | Panreac | 181023 | |
| Chloroform-d | Sigma Aldrich | 151823 | |
| Cys-His-His-His peptide | Ontores | Custom | |
| Cys-Lys-Lys-Lys peptide | Ontores | Custom | |
| D2O | Sigma Aldrich | 151882 | |
| DEPC reagent for Rnase free water | Sigma Aldrich | D5758 | This reagent is important to treat MilliQ water to remove any RNases of the buffers |
| Diethyl eter | Panreac | 212770 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| mRNA EGFP | TriLink Technologies | L-7601 | |
| mRNA OVA | TriLink Technologies | L-7610 | |
| RiboGreen kit | ThermoFisher | R11490 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | 71196 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 11570626 | |
| α-mouse AlexaFluor488 antibody | Abcam | Ab450105 | |
| Equipment | |||
| Nanoparticle Tracking Analyzer | Malvern Panalytical | NanoSight NS300 | |
| Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer | Varian | 400 MHz | |
| ZetaSizer | Malvern Panalytical | Nano ZS | For zeta potential and hydrodynamic size determination |
| Software | |||
| NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | MAN0515-02-EN-00 | |
| NovoExpress Software | Agilent | Not specified | |
| ZetaSizer software | Malvern Panalytical | DTS Application | To analyze surface charge and hydrodynamic sizes |
References
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