Summary
כאן, פרוטוקול פשוט מוצג לייצור חלקיקי mRNA המבוססים על פולי (בטא אמינואסטר) פולימרים, קל להתאמה על ידי שינוי mRNA אנקפסולציה. זרימת העבודה לסינתזה של הפולימרים, הננו-חלקיקים והאפיון החיוני שלהם מתוארים גם הם. כמו כן מתווספת הוכחת תפיסה בנוגע לחיסון.
Abstract
חיסון היה אחת ההצלחות הגדולות של החברה המודרנית והוא הכרחי בשליטה ומניעת מחלות. חיסונים מסורתיים היו מורכבים מכל או שברים של חומר זיהומיות. עם זאת, האתגרים נותרו, וטכנולוגיות חיסונים חדשות הן חובה. בהקשר זה, השימוש ב- mRNA למטרות חיסון הראה ביצועים משופרים, כפי שהוכח באישור מהיר של שני חיסוני mRNA המונעים זיהום SARS-CoV-2. מעבר להצלחה במניעת זיהומים ויראליים, חיסוני mRNA יכולים לשמש גם ליישומי סרטן טיפוליים.
עם זאת, חוסר היציבות של mRNA ואת הסיווג המהיר שלה מהגוף בשל נוכחות של גרעינים עושה את המסירה העירומה שלה לא אפשרי. בהקשר זה, ננו-רפואה, ובמיוחד חלקיקים פולימריים, הן מערכות מסירה קריטיות של mRNA. לכן, מטרת מאמר זה היא לתאר את הפרוטוקול לגיבוש ובדיקה של מועמד לחיסון mRNA המבוסס על חלקיקים פולימריים קנייניים. הסינתזה והאפיון הכימי של פולי (בטא אמינואסטרים) פולימרים המשמשים, המורכבות שלהם עם mRNA כדי ליצור חלקיקים, ומתודולוגיית lyophilization שלהם יידונו כאן. זהו צעד מכריע להפחתת עלויות האחסון וההפצה. לבסוף, הבדיקות הנדרשות כדי להפגין את יכולתם במבחנה transfect ומודל בוגר תאים דנדריטיים יצוינו. פרוטוקול זה יועיל לקהילה המדעית העובדת על חיסון בשל הרבגוניות הגבוהה שלו המאפשרת לחיסונים אלה למנוע או לרפא מגוון רחב של מחלות.
Introduction
מחלות זיהומיות מהוות איום חמור על מיליוני בני אדם ברחבי העולם, והן עדיין אחד הגורמים המובילים למוות בכמה מדינות מתפתחות. חיסון מניעתי היה אחת ההתערבויות היעילות ביותר של החברה המודרנית כדי למנוע ולשלוט במחלות זיהומיות1,2. אבני דרך קריטיות אלה של המדע ברלוונטיות של המאהה-20 נאמרו על ידי מגיפת Covid-19 העולמית האחרונה שנגרמה על ידי נגיף SARS-CoV-23. מתוך הכרה בחשיבות של חיסונים יעילים לצמצום הפצת המחלה, מאמצי שיתוף פעולה מכל הקהילות הביו-רפואיות הביאו בהצלחה לחיסונים מניעתיים רבים בשוק תוך פחות משנה4.
באופן מסורתי, חיסונים היו מורכבים מווירוסים מוחלשים (חיים, הפחתת ארס) או מומתים (חלקיקי מוות). עם זאת, עבור מחלות מסוימות ללא מרווח לשגיאות בטיחות, חלקיקים ויראליים אינם אפשריים, ו- subunits חלבון משמשים במקום. עם זאת, subunits בדרך כלל לא מאפשר שילוב של יותר אפיטופ אחד / אנטיגן, ואדג'ובנטים נדרשים כדי לשפר את עוצמת החיסון5,6. לכן, הצורך בסוגי חיסונים חדשניים ברור.
כפי שהוכח במהלך המגפה הנוכחית, מועמדים חדשים לחיסון המבוססים על חומצות גרעין יכולים להיות יתרון מבחינת הימנעות מתהליכי פיתוח ארוכים ומתן רב-תכליתיות גבוהה תוך ייצור, במקביל, חיסון חיוני למטופל. זהו המקרה של חיסוני mRNA, שתוכננו בתחילה כחיסונים ניסיוניים לסרטן. הודות ליכולת הטבעית שלהם לייצר תגובות תאי T ספציפיות אנטיגן3,5,6,7. בהיותה mRNA המולקולה המקודדת את החלבון האנטיגני, רק משתנה זהה, ניתן להתאים את החיסון במהירות כדי לחסן וריאנטים אחרים של אותו מיקרואורגניזם, זנים שונים, מיקרואורגניזמים זיהומיים אחרים, או אפילו להפוך לטיפול אימונותרפי לסרטן. בנוסף, הם יתרון במונחים של עלויות ייצור בקנה מידה גדול. עם זאת, ל-mRNA יש משוכה משמעותית המעכבת את הממשל העירום שלהם: יציבותו ויושרו נפגעות בתקשורת הפיזיולוגית, מלאות גרעין. מסיבה זו, השימוש במנשא ננומטרי שמגן עליו וקטורינג mRNA לתאים המציגים אנטיגן נדרש2,8.
בהקשר זה, פולי (אמינו בטא) (pBAE) הם סוג של פולימרים ביו-תואמים ומתכלים שהפגינו יכולת יוצאת דופן ל-mRNA מורכב בחלקיקים ננומטריים, הודות למטענים הקטיים שלהם9,10,11. פולימרים אלה מורכבים קשרים אסתר, מה שהופך את השפלתם קלה על ידי אסטראזות בתנאים פיזיולוגיים. בין המועמדים לספריית pBAE, אלה שתפקדו עם אוליגופפטידים קטיקטיים בסופו הראו יכולת גבוהה יותר ליצור חלקיקים קטנים לחדור ביעילות לתאים באמצעות אנדוציטוזיס ולהדביק את חומר הגן encapsulated. יתר על כן, הודות ליכולת האגירה שלהם, החמצת התא אנדוזום מאפשרת בריחה אנדוזומית12,13. כלומר, סוג מסוים של pBAE, כולל עגבת הידרופובית על עמוד השדרה שלהם (מה שנקרא C6 pBAE) כדי לשפר את היציבות שלהם ואת השילוב הסופי-אוליגופפטידים (60% של פולימר שונה עם תלת ליצין ו 40% של הפולימר עם tri-histidine) כי באופן סלקטיבי טרנסקלציה אנטיגן מציג תאים לאחר ניהול parenteral לייצר את מצגת אנטיגן מקודד mRNA ואחריו חיסון עכברים פורסם לאחרונה14 . בנוסף, הוכח גם כי ניסוחים אלה יכולים לעקוף את אחד השלבים צוואר הבקבוק העיקרי של ניסוחים nanomedicine: האפשרות להקפיא לייבש אותם מבלי לאבד את הפונקציונליות שלהם, המאפשר יציבות לטווח ארוך בסביבות יבשותרכות 15.
בהקשר זה, מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא להפוך את ההליך להיווצרות חלקיקי mRNA לזמינים לקהילה המדעית על ידי מתן תיאור הצעדים הקריטיים בפרוטוקול ומאפשר ייצור חיסונים יעילים ליישומים למניעת מחלות זיהומיות וטיפול בגידולים.
הפרוטוקול הבא מתאר את האימון המלא לסנתז אוליגופפטיד שינוי קצה פולי (אמינו בטא) - פולימרים OM-pBAE שישמשו עוד יותר עבור סינתזה ננו-חלקיקים. בפרוטוקול, ניסוח ננו-חלקיקים כלול גם. בנוסף, ניתנים גם צעדים קריטיים להצלחת ההליך והתוצאות הייצוגיות כדי להבטיח שהניסוחים המתקבלים ישיגו את תכונות אפיון בקרת האיכות הנדרשות כדי להגדיר תוצאה חיובית או שלילית. פרוטוקול זה מסוכם באיור 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. סינתזה של פולימר pBAE עם אוליגופפטידים סוף (OM-pBAE)
- פילמור של C6-pBAE
- הוסף 5-אמינו-1-פנטנול (38 mmol; MW = 103.16 Da) 1-הקסילמין (38 mmol; MW = 101.19 Da) לתוך בקבוק זכוכית עגולה (100 מ"ל). לאחר מכן, להוסיף 1,4-בוטנדיול דיאקרילט (82 mmol; MW = 198.22 Da).
- מחממים מראש את אמבט שמן הסיליקון ב-90 מעלות צלזיוס, מניחים את הבקבוקון העגול באמבט השמן ומערבבים את התערובת בעזרת מוט ערבוב מגנטי למשך הלילה (כ-18 שעות). לאחר מכן, לקחת את המוצר מן הבקבוקון התחתון העגול ומניחים אותו במקפיא ב -20 °C (70 °F).
הערה: המוצר הוא בצורה של אבקה דביקה והוא נלקח מן הבקבוק בעזרת מרית. זה חיוני כדי לאמת את המבנה של הפולימר המתקבל באמצעות 1H-NMR. ספקטרום NMR נרשם במכשיר 400 MHz (ראה טבלה של חומרים) באמצעות כלורופורם-d ו- D2O כממסים. סביב 10 מ"ג של כל אסטר פולי (β אמינו) נלקחו ומומסים 1 מ"ל של ממס deuterated.
- תגובה עם פפטידים כדי להשיג OM-pBAE
- הוסף 25 מ"ל של 0.1 M HCl לפפטידים נבחרים, למשל, פפטיד Cys-His-His-His עם חומצה טריפלואורואצטית (TFA, 200 מ"ג), לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל ששקל בעבר שיכול לעמוד ייבוש בהקפאה ולערבב באופן ידני לילה כדי להשיג פתרון ברור.
- להקפיא את הפתרון ב -80 °C למשך 1 שעות וייבש להקפיא את פפטיד הידרוכלוריד וכתוצאה מכך.
הערה: בדוק אם המשקל הסופי תואם לערך התיאורטי. - הפוך פתרון של C6-pBAE (0.031 mmol) בדימתיל סולפוקסיד. כמו כן, להפוך פתרון של פפטיד הידרוכלוריד (0.078 mmol) דימתיל סולפוקסיד.
- מערבבים את שני הפתרונות בצינור כובע בורג ובורג על הכובע. מערבבים את תמיסה תערובת באמבט מים עם טמפרטורה מבוקרת של 25 °C (20 °F) במשך 20 שעות עם מוט ערבוב מגנטי.
- מוסיפים את התערובת ל-7:3 (v/v) דיאתיל אתר/אצטון. צנטריפוגה ההשעיה וכתוצאה מכך ב 25,000 x g ב 4 °C (70 °F) כדי להסיר את הממס. לאחר מכן, לשטוף את מוצק עם 7:3 (v/v) דיאתיל אתר / אצטון פעמיים. לאחר מכן, לייבש את המוצר תחת ואקום (<0.2 atm).
- הפוך פתרון של 100 מ"ג/מ"ל של המוצר דימתיל גופרתי. המוצר המתקבל נקרא C6-פפטיד-pBAE. זה חיוני כדי לאמת את המבנה של הפולימר המתקבל באמצעות 1H-NMR כדי לאשר את היעלמותם של אותות olefin הקשורים אקרילטים מסוף. אם לא נעשה שימוש, הפולימר יכול להיות קפוא ב -20 °C (50 °F).
2. היווצרות פוליפלקסים
הערה: כל ההליכים צריכים להתבצע בתוך חדר מותנה כדי לשמור על טמפרטורה קבועה.
- להפשיר את הפולימרים C6-פפטיד-pBAE ומערבולת הפתרון.
- פיפטה הפולימר מערבבים מעלה ומטה ומכינים פתרון של 12.5 מ"מ (V1)בנתרן אצטט (NaAc). לאחר מכן, מערבולת את התערובת ולחכות 10 דקות.
- הכן את mRNA ב 0.5 מ"ג / מ"ל ומערבבים על ידי pipetting (V2).
הערה: זה חיוני כדי למנוע מערבולת mRNA. - מערבולת תערובת הפולימר בריכוז הסופי כדי להשיג פתרון הומוגני בין מלאי הפולימר ב- DMSO לבין מאגר אצטט.
הערה: ריכוז הפולימר הסופי תלוי ביחס N/P (חנקן לקבוצות פוספט) שנבחר. יחס ה- N/P תלוי בכל mRNA ספציפי לשימוש. עבור אנקפסולציה eGFP, למשל, נעשה שימוש ביחס של 25:1, כפי שדווח בעבר14. - מערבבים את פתרון החומר הגנטי ואת פתרון C6-פפטידPBAE (פי 25 מריכוז ה-mRNA) ביחס של 1:1 (Vi = V1 + V2).
הערה: C6-פפטיד-pBAE טעון בצינור microcentrifuge שבו mRNA מתווסף על ידי צנרת למעלה ולמטה לערבוב. לאחר הכנת, הפוליפלקס, חומצת הגרעין וריכוז C6-פפטיד-pBAE מדוללים למחצה. - דגירה ב 25 °C (30 °F) במשך 30 דקות בלוק תרמוב. לזרז עם 1:2 RNase מים חינם על ידי הוספת המדגם לצינור microcentrifuge טעון מראש עם מים.
- כלול את ההפרשות. הוסף את אותו נפח כמו התערובת של mRNA ו pBAE (Vi) ב HEPES 20 mM וסוכרוז 4% על ידי צנרת למעלה ולמטה. בשלב זה, המדגם כבר מדולל 3x.
3. ליופיליזציה פוליפלקסים
- באופן מיידי, להקפיא ב -80 °C מקפיא של פתרון polyplex הקודם עבור 1 שעה.
- בצע את הייבוש הראשי על ידי ביצוע השלבים: (1) 1 שעות ב -60 °C (60 °F) ו 0.001 hPa; (2) 1 שעות ב -40 °C ו 0.0001 hPa; (3) 4 שעות ב -20 °C (70 °F) ו 0.0001 hPa; (4) 12 שעות ב 5 °C (5 °F) ו 0.0001 hPa.
- יש לאחסן במהירות של -20 מעלות צלזיוס באופן מיידי כדי למנוע התייבשות עד לשימוש.
4. התחדשות פוליפלקס
הערה: פרוטוקול זה מתאר את התהליך המשמש לשחזור חלקיקי C6-פפטיד-pBAE lyophilized לשימוש נוסף שלהם או עבור אפיון, במבחנה, או ניתוח vivo.
- קח את חלקיקי ליופילים מ -20 °C רק ברגע השימוש ולהוסיף במהירות את הכמות המתאימה של depyrogenated (DEPC) מים כדי להפיץ מחדש את מוצק כדי להשיג את הריכוז הרצוי.
הערה: הנפח יהיה זהה לנפח הראשוני של הננו-חלקיקים אם אותו ריכוז צפוי, אך הוא יצוין עבור כל ניסוי. - פיפטה בעדינות עד resuspension הכולל, מלווה את הנוזל עם pipette.
הערה: ודא כי לא נשאר חומר על קיר של המשחקון. - לאחר מומס, pipette למעלה ולמטה במרץ, הימנעות בועות.
הערה: המדגם צריך להיות שקוף עד שקוף היבט, אשר ניכר יותר בריכוזים גבוהים יותר - יש לאחסן את הדגימות על קרח או ב-4 °C (75 °F) לתקופה מקסימלית של 24 שעות לאחר ההקמה מחדש. הימנע הקפאה.
5. אפיון פוליפלקס
- פיזור אור דינמי
הערה: קוטר הידרודינמי (nm), אינדקס polydispersity (PDI), ומטען פני השטח של חלקיקיםנמדדו ב 25 °C (633 ננומטר אורך גל לייזר, וגלאי אותות 173°, באמצעות מנתח פוטנציאלי זטה (ראה טבלה של חומרים ).- קוטר הידרודינמי (nm)
- הכן את הננו-חלקיקים המערבבים mRNA ו- pBAE ביסודיות על ידי הקטרת חומר הגן לשבר הפולימר לריכוז סופי של mRNA של 0.25 מ"ג / מ"ל כפי שתואר לעיל (שלב 2).
- יש לשטוף מראש מיקרו-קובט עם מדיית דילול מסוננת כדי לנקות אותה לחלוטין מ זיהומים. לאחר מכן, למלא את cuvette עם לפחות 50 μL של הפתרון לדוגמה וכיפה זה. לאחר מכן, הצג את הדוגמה בתוך מכשיר DLS, ודא שהתא נוסף כראוי.
הערה: מדיית הדילול מסוננת באמצעות מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר. - פתח את קובץ שגרת הפעולה הרגילה (SOP) שנוצר והכנס את השם לדוגמההרצוי . בחר מדידת גודל.
הערה: כל הפרמטרים ליצירת SOP למדידות גודל מסופקים בטבלה 1. - הפעל את מדידת גודל החלקיקים באמצעות DLS על-ידי לחיצה על הפעל.
הערה: לאחר צלילי הצפצוף המשולש, הניתוח הושלם. - בחר את התוצאות המתאימות לדגימה בגליון המדידה כדי להשיג את גודל החלקיקים הממוצע, PDI הממוצע, סטיית התקן והגרפיקה. לאחר סיום, הסר את התא מציוד DLS.
- הסר את המדגם, שמור אותו לניתוח פוטנציאל זטה, ולנקות ולשטוף את התא עם מים deionized. לבסוף, יבש את cuvette ניקה תחת זרם גז אוויר דחוס.
- מטען פני השטח (mV)
- הכן את הננו-חלקיקים המערבבים mRNA ו- pBAE ביסודיות על ידי הקטרת חומר הגן לשבר הפולימר לריכוז סופי של mRNA של 0.25 מ"ג / מ"ל כפי שתואר לעיל (שלב 2, היווצרות פוליפלקס). לאחר מכן, להקפיא ולייבש את הפתרון.
הערה: במקרה זה, למדידת מטען פני השטח, מומלץ מאוד לייבש את המדגם לפני ביצוע האמצעים כדי לשפץ את המדגם במאגר המתאים, המדמה את תנאי הגוף של ריכוז pH ואלקטרוליט. - resuspend מדגם ליופילי באמצעות מים. לדלל את המדגם 1/10 במים (ריכוז סופי 0.025 מ"ג / מ"ל).
- יש לשטוף מראש תא נימי מקופל חד פעמי (זטה פוטנציאלי cuvette) עם מדיית דילול מסוננת כדי לנקות אותו לחלוטין מזיהומים. לאחר מכן, מלא את cuvette עם חלקיקים מדוללים, באמצעות מזרק 1 מ"ל, וכובע שני הצדדים של חומרי המילוי.
הערה: פיזור הננו-חלקיקים צריך למלא את הנפח הזמין בקובט (~ 1 מ"ל), תוך תשומת לב מיוחדת להיווצרות הבועה, אשר יכול להכשיל אמצעים. - הצג את המדגם בתוך DLS; ודא שהתא נוסף כראוי.
- פתח את קובץ SOP שנוצר עבור ניתוח פוטנציאלי zeta והכנס את השם לדוגמההרצוי . בחר מדידה בעלת פוטנציאל זטה.
הערה: פרמטרים ליצירת SOP עבור מדידות פוטנציאליות של זטה ניתנים בטבלה 2. - הפעל מדידה פוטנציאלית של זטה באמצעות DLS על-ידי לחיצה על הפעל.
הערה: לאחר צליל הצפצוף המשולש, הניתוח הושלם. - בחר את התוצאות המתאימות לדגימה בגליון המדידה כדי להשיג את פוטנציאל הזטה הממוצע, סטיית התקן והגרפיקה. לאחר סיום, הסר את התא מציוד DLS.
- הסר את המדגם ולשמור אותו אם יש צורך. לאחר מכן, לנקות ולשטוף את תא cuvette עם מים deionized, ואחריו אתנול ומים שוב. לבסוף, יבש את cuvette ניקה תחת זרם גז אוויר דחוס.
הערה: כדי לנתח את הנתונים, השתמש בתוכנה המומלצת.
- הכן את הננו-חלקיקים המערבבים mRNA ו- pBAE ביסודיות על ידי הקטרת חומר הגן לשבר הפולימר לריכוז סופי של mRNA של 0.25 מ"ג / מ"ל כפי שתואר לעיל (שלב 2, היווצרות פוליפלקס). לאחר מכן, להקפיא ולייבש את הפתרון.
- קוטר הידרודינמי (nm)
- ניתוח מעקב חלקיקים (NTA)
הערה: קוטר הידרודינמי (nm) וריכוז של חלקיקים נמדדו ב 25 °C (75 °F), אורך גל לייזר 488 ננומטר באמצעות מנתח מעקב חלקיקים (ראה רשימת חומרים).- נת"ע והכנת מדגם
- תדליק את המחשב ואת הציוד. תחילה, בדוק אם כל הרכיבים מחוברים כראוי. לאחר מכן, פתח את התוכנה המומלצת. התוכנה תבדוק אם כל האביזרים מחוברים כראוי.
- חבר את הלוח העליון, כאן, תא O-טבעת, לתוך מודול הלייזר.
הערה: אל תגזים בחלק זה. - ראשית לטעון את התא עם חוצץ ו / או deionized מים עם מזרק 1 מ"ל. חזור על ההליך לפחות פעמיים. הימנע החדרת בועות בחדר.
- הכן את המדגם על ידי דילול 1/1000 במים דה-יונים מהריכוז המשמש במדידת גודל DLS. הכן לפחות 1 מ"ל לטעון אותו לתוך מזרק 1 מ"ל, הימנעות החדרת בועות.
- טען את הדגימות לתוך התא באמצעות מזרק. לאחר מכן, חבר את מודול הלייזר לתא הגדול של NTA.
הערה: תא גדול מציין את הרווח שבו ממוקם התא למדידה.
- מיטוב תמונה
- ראשית, בחומרה, בדוק אם המצלמה והלייזר המתאים נבחרו.
הערה: כאן, יש רק מצלמה אחת ואת לייזר כחול 488 ננומטר. - התחל ברמת המצלמה ב- 0 והקש על התחל מצלמה בחלון לכידה.
הערה: בשלב זה, התאם את הפרמטרים הבאים. מיקום קרן (ניתן להזיז אותו למעלה ולמטה על המסך). רמת המצלמה: הימנע פיקסלים רוויים יתר על המידה. פוקוס (גלגל לרוחב):נסה להתמקד טוב ככל האפשר. עדיף שיהיו חלקיקים עם הילה במקום חלקיקים לא ממוקדים. ריכוז: התאם את הריכוז כך שיהיו בין 10 ל-100 חלקיקים בכל שדה.
- ראשית, בחומרה, בדוק אם המצלמה והלייזר המתאים נבחרו.
- הקלטת וידאו
- בתוכנה, עבור אל חלון בחירת מדידה- SOP (משמאל למטה) ובחר מדידה רגילה.
הערה: תוכנית לבצע שלושה מדדים של 30 s כל אחד (כדי לאפשר לתוכנה לבצע חישובי ממוצע וסטיית תקן). ספק שם ונתיב תיקיה (בשם קובץ בסיס) כדי לשמור את הרשומות של הדוגמה. כאשר פרמטרי SOP מוגדרים כראוי, הקש יצירה והפעלה של קובץ Script. לאחר השכפול הראשון נמדד, התוכנית תבקש להוסיף מדגם חדש. לאחר מכן, חלק נוסף של המדגם חייב להיות הציג בחדר על ידי דחיפת הבוכנה של המזרק. לבסוף, חזור על פעם שלישית כדי לנתח את השכפול השלישי.
- בתוכנה, עבור אל חלון בחירת מדידה- SOP (משמאל למטה) ובחר מדידה רגילה.
- עיבוד וידאו
- הסתגל מחדש את סף השגת המסך והזיהוי לאחר סיום שלושת האמצעים כדי לנתח את החלקיקים הנמדדים. ברגע זה, כ -100 חלקיקים צריכים להופיע בכל מסגרת כדי לבצע את הניתוח (צלבים אדומים גבוהים וצלבים כחולים נמוכים צפויים).
- ייצאו את התוצאות בקובץ PDF לאחר השלמת הניתוח. בנוסף, ניתן לייצא כמו קטעי וידאו וקבצי Excel.
- ניקוי נת"ע
הערה: סגור את כל המדידות שנפתחו לפני לימוד המדגם הבא; מאז הקבצים שנוצרו הם עצומים בהתאם למחשב, זה לא קל לשמור על יותר מאחד פתוח.- נקה את תא NTA על ידי שטיפה חוזרת ונשנית של מים לפני ביצוע המדידה הבאה עד שלא נצפו חלקיקים; לאחר מכן, רוקן את המאגר המשמש (PBS) כדי להמשיך עם האמצעים.
- לשטוף אוויר בתוך התא ולייבש אותו עם נייר כיתה מיקרוסקופי לאחר המדידה האחרונה של היום הושלמה.
- לאפיין את הגודל והצורה על ידי מיקרוסקופיה אלקטרונית שידור (TEM). הכינו את הדגימות. 30 μL של אמצעי האחסון הסופי מספיק לאפיון TEM.
הערה: הן טרי וליופילי - לאחר resuspension - חלקיקים ניתן למדוד. - זרוק 10 μL של מדגם על רשת נחושת מצופה פחמן. תן לו להתייבש במשך 10 דקות. הסר את הנוזל העודף, במידת הצורך, על ידי הקשה רכה על נייר מסנן.
- זרוק 10 μL של uranyl אצטט (2% w / v) פתרון עבור כתמים שליליים. תן לו להתייבש במשך 1 דקות. הסר את עודף הנוזל, במידת הצורך, על ידי הקשה רכה על נייר מסנן.
- הצג את המדגם במיקרוסקופ וסריקה (פעולת מתח 80 kV).
הערה: ניתן להשתמש בתוכנה מתאימה לניתוח נוסף של התמונות.
- נת"ע והכנת מדגם
- יעילות אנקפסולציה
- הכנת דוגמה
- הכן את הננו-חלקיקים בריכוז הרצוי והקפיא וייבש אותם. לאחר מכן, resuspend הננו-חלקיקים לדלל אותם בריכוז הסופי של 6 מיקרוגרם / מ"ל.
- הכן מאגר TE אחד מפתרון המלאי של 20x.
הערה: Vt (נפח כולל) = (מספר הדגימות x 100 μL x 4) (מספר הדגימות x 290 μL) + 2 מ"ל. - הכן מאגר TE עם 3 מיקרוגרם / μL של הפרין מהמלאי של 100 מיקרוגרם / μL.
הערה: Vt = מספר הדגימות x 50 μL x 2. - הכנת התקנים
- הכן תקן RNA הנע בין 0.2 מיקרוגרם ל-0.025 מיקרוגרם/מ"ל במאגר טריס-EDTA (TE)(טבלה S1A).
הערה: השתמש ב- mRNA בתקן ה- RNA במקרה שונה מה- RNA ריבוזומלי. - הכן RNA:pBAE סטנדרטי עם הפרין (טבלה S1B). הכן תקן הפרין(טבלה S1C).
- הכן צלחת 96-גם כדלקמן.
- טען 295 μL של מאגר TE בנתיב הראשון של צלחת 96 באר (כמו בארות רבות כמו דוגמאות לנתח). לאחר מכן, טען 50 μL של מאגר TE 1x לנתיבים B ו- C (כפילויות עבור כל מדגם).
- טען 50 μL של 1x TBE חוצץ עם 3 מיקרוגרם / μL של הפרין לנתיבים D ו- E (כפילויות עבור כל מדגם). לאחר מכן, טען 100 μL של כל תקן בנתיבים F, G ו- H (כפילויות עבור כל תקן).
- עומס 5 μL של כל מדגם בנתיב A (ריכוז בכל באר הוא 0.1 מיקרוגרם / מ"ל). ערבבו כראוי על ידי צנרת וטעינה של 50 מיקרו-אל של כל דגימה בארבע הבארות שלהלן (שתיים מהן מכילות 50 μL של מאגר 1x TE ועוד שניים המכילים חיץ TE 1x עם 3 מיקרוגרם/מיקרו-ל של הפרין).
- לדגור על המדגם במשך 30 דקות ב 37 °C (50 °F). הכן ריאגנט RiboGreen לפי פרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים) במאגר TE אחד.
הערה: לדלל 1: 200 ומערבולת. הגן מפני אור. Vt = מספר בארות מלאות x 100 μL. - לטעון 100 μL של פתרון ריבוגרין לתוך כל באר. לזהות פלואורסצנטיות באמצעות קורא המיקרו-לוח עם אורך גל עירור של 500 ננומטר ואורך גל פליטה של 525 ננומטר.
- ניתוח תוצאות
- הכן את שלוש עקומות הכיול
הערה: ראשית, תקן RNA ריבוזומלי. אינטרפולציה בעקומת כיול זו הדגימות שאינן מכילות הפרין. שנית, mRNA: pBAE עם הפרין. אינטרפולציה בעקומת הכיול הזו המדגם שיש לו הפרין. שלישית, הפרין. משמש כדי להבטיח את ריכוז העבודה הוא בטווח הליניארי. - חשב יעילות אנקפסולציה (EE%) כדלקמן:
- הכן את שלוש עקומות הכיול
- הכנת דוגמה
6. אפיון במבחנה
- מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות להערכה איכותית
- מניחים את הלוח 96-well על המיקרוסקופ לאחר 24 שעות של transfection. התחל לדמיין תאים עם המטרה 10x.
הערה: תאי HeLa משמשים במקרה זה. התאים מותאמים לשפות שימוש במצב השידור (שדה בהיר), ויש להתאים את המוקד כעת.- ראשית, החל איזון לבן כדי להפנות לתוכנה על הרקע של הדגימות. לאחר מכן, לרכוש תמונה כדי לכסות אותו עם תמונת פלואורסצנטיות במהלך הניתוח.
- שנה את מצב המיקרוסקופ למצב השתקפות (פלואורסצנטיות) והזז את גלגל המסנן ללייזר הכחול (488 ננומטר) כדי לדמיין eGFP.
הערה: בשלב זה, יש להתאים את זמן החשיפה ואת הרווח. יש להתאים את הרווח בערכים שבין 3 ל- 5 כדי להימנע מממצאים ועודף על אות הרקע. התאמת זמן החשיפה תלויה ביעילות ההדבקה (מ- ms ל- 1 s). - לרכוש תמונות עבור כל התנאים או בארות המעסיקים את אותו זמן חשיפה כדי להשוות את כל הדגימות.
- מניחים את הלוח 96-well על המיקרוסקופ לאחר 24 שעות של transfection. התחל לדמיין תאים עם המטרה 10x.
- ציטומטריית זרימה (FC) להערכה כמותית
- השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להכין את צלחת 96 באר לניסוי cytometry זרימה.
הערה: בעת עבודה עם תאים דבקים למחצה, כגון בשורת התא JAWSII, לשחזר את כל עוצמת המדיה ולאחסן אותו לתוך צלחת אחרת 96 באר. אל תשאפו למדיה זו מכיוון שהיא עשויה להכיל מספר משמעותי של תאים שהודבקו. - נקה את התאים (תאי HeLa משמשים כאן) עם 100 μL / באר של 1x PBS ולשאף אותו. לאחר מכן, להוסיף 25 μL / באר של טריפסין ודגרה אותו ב 37 °C (5 דקות).
- לאחר שהתאים מנותקים, הוסף מדיה שהתאוששה בעבר כדי לעצור את פעולת טריפסין ולתקן את התאים, הוספת 31.25 μL / well של פורמלין 10% במשך 20 דקות (ריכוז סופי 2.5%).
הערה: בשלב זה, חשוב לדמיין את מצב התאים על ידי מיקרוסקופיה כדי להבטיח את ניתוק התאים. מומלץ מאוד pipette למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לעזור לתאים לנתק ולהימנע agglomeration שלהם. זה יניב תוצאה אמינה. - הפעל את ציטומטר הזרימה ואת התוכנה. בתוכנה, להגדיר את התנאים המתאימים עבור הניסוי (סוג של צלחת, נפח מדגם, ופרמטרים אחרים כגון רועד, שטיפה בין דגימות.
הערה: עבור שלב 6.2.5, קצב הזרימה צריך להיות 120 μL / min. מערבבים מחזור אחד כל דקה אחת ושוטפים מחזור אחד כל אחד היטב. ערבוב חיוני כדי לשמור על התאים מפוזרים בתקשורת ולאפשר ניתוח טוב יותר של תאים בודדים. בנוסף, שטיפה יש צורך לנקות את microfluidics של cytometer בין דגימות. לבסוף, בדוק אם קיימים מספיק מאגרים ואם כל הרכיבים מחוברים כראוי. - הגדר את הפרמטרים המתאימים כדי לכמת את אחוז התאים שהודבקו באופן חיובי.
- תחילה, הצג את נתוני הזרימה על (אור מפוזר קדימה) FSC לעומת SCC (אור מפוזר בצד) לחלק כדי להבחין בין התאים לבין הפסולת. לאחר מכן, חלקת פיזור נוספת המשווה את המשרעת (FSC-A) לעומת גובה (FSC-H) משורטטת לשער ולהפלות תאים בודדים.
הערה: האוכלוסייה שלא טופלה מאפשרת לשער את האוכלוסיות המתאימות לתאים שהודבקו באופן חיובי. לאחר מכן, כימות התאים שהודבקו באופן חיובי מתבצע בערוץ הנכון בעלילת היסטוגרמה. לכן, התאים שהודבקו באופן חיובי חייבים להיות מיוצגים כרצף של אירועים בהיסטוגרמה.
- תחילה, הצג את נתוני הזרימה על (אור מפוזר קדימה) FSC לעומת SCC (אור מפוזר בצד) לחלק כדי להבחין בין התאים לבין הפסולת. לאחר מכן, חלקת פיזור נוספת המשווה את המשרעת (FSC-A) לעומת גובה (FSC-H) משורטטת לשער ולהפלות תאים בודדים.
- השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להכין את צלחת 96 באר לניסוי cytometry זרימה.
7. בדיקות פונקציונליות במבחנה: קיבולת להפעיל תאי מערכת החיסון מודל באמצעות אליבאמין (OVA) כמו mRNA מודל אנטיגני
- צלחת 10,000 תאים /טוב (תאי JAWSII משמשים כאן) בצלחת 96-באר יום לפני transfection.
הערה: צלחת כמו בארות רבות כנדרש יש משולשים עבור כל תנאי. תן לתאים להתחבר לצלחת לפחות במשך 12 שעות (מומלץ דגירה לילית). - הכן את ה-NPs של pBAEs כמתואר בפתק שלהלן כדי להעביר 0.6 מיקרוגרם mRNA לבאר.
הערה: כבקרה חיובית, הדבק את התאים באמצעות ריאגנט transfection. כאן, השתמשנו 0.1 מיקרוגרם mRNA לבאר ו 0.25 μL של ריאגנט transfection לבאר. mRNA קידוד עבור OVA נרכש (ראה טבלת חומרים). הוא רבידנילט, שונה עם 5-methoxyuridine, ומותאם למערכות יונקים, והוא מוגן באמצעות כיסוי קצה עם מבנה Cap1, שיטה קניינית מהספק. - לדגור על צלחת 96-באר עבור 24 שעות באינקובטור אוויר יבש ב 37 °C (5% CO2).
הערה: לאחר זמן זה, אל תאשר את המדיה מכיוון שהיא עשויה להכיל מספר מסוים של תאים. לשחזר את התאים ולשמור אותם באר אחרת או צלחת. - לשטוף את התאים שנותרו על הבאר עם 25 μL של 1x PBS. לאחר מכן, לשאוף אותו ולהוסיף 25 μL של טריפסין ודגרה את הצלחת במשך 5 דקות ב 37 °C (77 °F) כדי לנתק את התאים. הפסק את תגובת טריפסין על-ידי הוספת המדיה שנמצאה בעבר לבאר הכתב.
- צנטריפוגות את הצלחת ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F). לשאוף לתקשורת. הוסף 50 μL / באר של PBS 1x ו 2.5% של פורמלין. לדגור אותו ב 4 °C (55 °F) במשך 20 דקות כדי לתקן תאים.
- חזור על שלבים 7.5 ו- 7.5.1. לאחר מכן, להוסיף 50 μL / באר של 1x PBS ו 3% BSA (חוצץ חסימה) ודגרה במשך 30 דקות ב 4 °C (70 °F). שוב, חזור על שלבים 7.5 ו- 7.5.1 ולאחר מכן הוסף 50 μL / well של הנוגדן העיקרי (עכבר α-OVA) ב 1x PBS ו 3% BSA ודגרה במשך 30 דקות ב 4 °C (7 °F).
- חזור על שלבים 7.5 ו- 7.5.1 ולאחר מכן לשטוף את התאים עם 50 μL / באר של 1x PBS. שאף מדיה ולאחר מכן הוסף פתרון נוגדנים משני (α-עכבר-AlexaFluor488/PerCP ו- Cy5.5-CD11b/APC-CD86) ב- 1x PBS ו- 3% BSA. לדגור אותו במשך 1 שעות ב 4 °C (5 °F).
- צנטריפוגות את הצלחת ב 400 x g במשך 5 דקות. לאחר מכן, לשטוף את התאים עם 50 μL / באר של 1x PBS. לאחר מכן, צנטריפוגה (400 x g במשך 5 דקות), לשאוף, ולאחר מכן resuspend התאים ב 100 μL / well של 1x PBS ו 2.5% פורמלין.
- לנתח אותו על ידי ציטומטריית זרימה, כמתואר לעיל (שלב 6.2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סינתזה ואפיון פולימרים
הליך הסינתזה של OM-pBAE ניתן באיור 2. כפי שמראה איור 2A, הצעד הראשון להשגת ה-OM-pBAE הוא לסנתז את ה-C6-pBAE על ידי הוספת האמינים (1-הקסילאמין ו-5-אמינו-1-פנטנול, יחס 1:1) ל-diacrylate (1,4-בוטנדיול ניאקרילט). תגובה זו מתבצעת ב 90 °C (50 °F) במשך 20 שעות עם ערבוב מתמיד. לאחר מכן, פתרון של אוליגופפטידים מתווסף לפתרון של פולימר C6 המתקבל מהתגובה הקודמת (איור 2B). לבסוף, הסינתזה מתבצעת באמצעות DMSO כממס ב 25 °C (5 °F) עם ערבוב מתמשך עבור 20 שעות. איור 2C מראה את המבנה של OM-pBAE, שהוא המוצר המתקבל של פילמור. הפולימרים המתקבלים מאופיינים ב-1H-NMR (ראו איור משלים S2). באפיון, תוצאה חיובית היא זו עם מספר יחידות מונומר (n + מ 'במספרים) המורכבות בין 7-10; מופץ חצי סוג יחידה אחת וחצי השני; בעוד כל מספר אחר מחוץ לטווח זה הוא תוצאה שלילית.
סינתזת ננו-חלקיקים ואפיון פיסיקוכימי
טבלה 3 מציגה את תוצאות האפיון הפיזיקוכימי של ה- GFP mRNA אנקפסולציה חלקיקים כהוכחת מושג. הוכח בעבר כי גודל ומטען פני השטח אינם מראים הבדלים משמעותיים ללא קשר לסוג mRNA עטוף14. האפיון בוצע הן בננו-חלקיקים טריים והן בננו-חלקיקים ליופיליים כדי להוכיח את יציבות המאפיינים הפיזיקוכימיים שלהם ולהדגים כי כפי שפורסם בעבר, תהליך ייבוש ההקפאה הותאם לניסוחים אלה15. הרדיוס ההידרודינמי של הפוליפלקסים נחשב נכון כאשר הוא נע סביב 150-220 ננומטר. חוץ מזה, PDI חייב להיות קבוע, כ 0.2, אבל זה מקובל עד 0.3. לכן, לא גודל ולא PDI הראו הבדלים משמעותיים לפני ואחרי ליופיליזציה, כפי שמוצג כאן באמצעות תוצאות מייצגות. כמו כן, גודל ננו-חלקיקים בוצע עם NTA, כדי לאשר את התוצאות שהושגו בעבר. כל ערך מחוץ לטווחים שצוינו לעיל נחשב לתוצאה שלילית, ויש להשליך חלקיקים לשימוש נוסף.
במהלך האפיון הפיזיקוכימי של סוג זה של מדגם, זה נוח להשוות את התוצאות שהושגו על ידי DLS עם התוצאות שהושגו על ידי NTA. שתי הטכניקות קובעות את הרדיוס ההידרודינמי של החלקיקים על ידי מדידת מקדם הדיפוזיה. מספר הננו-חלקיקים הנספרים למסגרת ב- NTA הוא בין 80 ל -100 כדי לעקוב במדויק אחר החלקיקים. מטען פני השטח התאפיין גם כדי להבטיח את המטען החיובי של חלקיקים, להקל על אינטראקציה אלקטרוסטטית עם קרום התא. לבסוף, המורפולוגיה של הפוליפלקסים התאפיינה במיקרוסקופיה אלקטרונית שידור (TEM). איור 3 מאשר היווצרות של חלקיקים כדוריים ומונודיספרסים בגודל משוער של 50 ננומטר. קטרים קטנים יותר הושגו על ידי ניתוח תמונות TEM כמו הן NTA ו- DLS למדוד את הקטרים ההידרודינמיים. למרות גודל קטן יותר תמיד צפוי בעת ביצוע מדידות מיקרוסקופיה אלקטרונים16,17, בהשוואה למדידות פיזור, זה חיוני כדי להדגיש כאן כי ההבדל הוא כמעט 100 ננומטר, אשר בדרך כלל לא צפוי. זה מיוחס לדמות ההיגרוסקופית הגבוהה של חלקיקים אלה, שניתן הן על ידי mRNA אנקפסולציה והן על ידי אוליגופפטידים מסוף הקצה להרכיב את הפולימר.
קביעת יעילות אנקפסולציה של mRNA
פרמטר קריטי נוסף למדוד הוא היכולת של חלקיקים לתמצת את mRNA, שהוא העיקרון הפעיל ויש לעטוף כדי להשיג את ההגנה שלה מפני nucelases18,19,20. הפרוטוקול פותח כדי לנתח את יעילות אנקפסולציה (EE; ב %) של לכידת חומצת גרעין בעקבות הוראות הספק. הערך המתקבל נותן מושג על אחוז חומצת הגרעין כי הוא לכוד בהצלחה לתוך חלקיקים. צבע ריבוגרין, כתם חומצת גרעין פלואורסצנטית, משמש למטרה זו. הפרוטוקול מורכב לכמת כל RNA שנשאר נגיש לצבע הפלואורסצנטי. כדי לכמת את הרנ"א הכולל, יש לפרק את הננו-חלקיקים, והפרין משמש למטרה זו.
טבלה 4 מציגה את יעילות אנקפסולציה (EE%) של פוליפלקסים OM-pBAE encapsulating הן GFP והן mRNA OVA, כהוכחת רעיון. בדיקת פלואורסצנטיות RiboGreen מאפשרת לחשב את כמות ה- mRNA שנלכדה בננו-חלקיקים לאחר פירוק על ידי תוספת הפרין כדי לשחרר את התוכן שלהם. ערכי היעילות המתקבלים חייבים להיות גבוהים מ-80%, וכפי שניתן להוכיח כאן, אינם מראים הבדלים משמעותיים בהתאם לסוג ה- mRNA. ערכי יעילות אנקפסולציה נמוכים יותר מייצגים תוצאה שלילית ומהווים אות למחיקת ניסוחים אלה. תוצאות אלה מאשרות את יכולת אנקפסולציה גבוהה של mRNA של OM-pBAE, הרבגוניות שלה, ואת היישום המבטיח שלה באספקת גנים.
תוצאות מייצגות במבחנה
זה חיוני כדי לקבוע את היכולת של pBAEs polyplexes. ראשית, כדי להעביר, ושנית, להפעיל את תאי החיסון14. יעילות טרנספקטו מוערכת על ידי שתי טכניקות שונות, תוך שימוש ב- eGFP ככתב mRNA: מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות כדי לקבוע חזותית את חלבון הכתב ואת ביטוי הציטומטריה של הזרימה כדי לכמת את יעילות הטרנס-זיהום. מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במצלמת CCD, 5x, 10x, 20x, ו 40x לייזרים UV, כחול וירוק מסנן שימשו כדי לקבוע באופן איכותי את הביטוי של חלבון eGFP בקו התא JAWSII, קו תא דנדריטי מורין. חלבון eGFP יש מקסימום עירור ב 488 ננומטר, המקביל לייזר כחול, ומקסימום פליטה סביב 510 ננומטר, המתאים לצבע ירוק. כדי לכמת את ביטוי יעילות הטרנספקט של חלבון היעד, ניתוח ציטומטריית הזרימה של התאים שהודבקו מתבצע לאחר 24 שעות של טרנספקטציה עם פוליפלקסים pBAEs עם mRNA eGFP. שלב קיבעון מועיל כאשר תאים הועברו עם כתבים פלואורסצנטיים כגון GFP או RFP.
איור 4 מציג את הניתוח האיכותי של ביטוי eGFP לאחר 24 שעות של טרנספקטציה בקו התא JAWSII. שוב, בהשוואה לשליטה השלילית, אות הכתב של eGFP גבוה יותר באופן בולט. כמו כן, טבלה 5 מציגה את יעילות ההדבקה המוצגת על-ידי חלקיקי OM-pBAE בקו התא JAWSII. שוב, ערכי היעילות דומים לשליטה חיובית המבוצעת עם ריאגנט טרנספקטי קלאסי.
הקיבולת של PBAEs NPs טעון עם mRNA OVA כדי להפעיל תאי מערכת החיסון מודל כבר מוערך transfecting קו התא JAWSII, קו תאים דנדריטי מורין לא בוגר. כדי לקבוע את ההפעלה של תאי החיסון, הועסקו שני סמנים שונים: CD11b ו- CD86. ראשית, בחר את הפלורופורים המתאימים לתצורת ציטומטר הזרימה. כאן, PerCP-Cy5.5 (CD11b) ו PE (CD86) משמשים. שורות תאים לא בשלות ולא מופעלות חייבות להציג פרופיל CD11b-/CD86, בעוד שתאים שהופעלו חייבים להציג פרופיל CD11b+/CD86+ . הלייזר הכחול ב 488 ננומטר משמש כדי לקבוע את ביטוי חלבון היעד, נוגדן אנטי OVA בתוספת נוגדן משני נגד עכבר-Alexa488 הועסק. טבלה 6 מציגה את הלוח האחרון המועסק בניסוי זה. איור 5 מראה את הקיבולת של חלקיקי OM-pBAE טעונים ב-OVA mRNA להפעלת מחשבים, מה שמעיד על הפעלת התגובה החיסונית התאית. תאים שאינם שהודבקו מציגים מספר נמוך של תאים המבטאים את סמני הממברנה CD11b ו- CD86, בעוד שהתאים שטופלו ב- mRNA OVA OM-pBAEs מציגים ביטוי מוגבר באופן משמעותי של סמני CD11b ו- CD86. תוצאה זו מצביעה על כך חלקיקי OM-pBAE לקדם התבגרות. בסך הכל, תוצאות אלה מאשרות את היכולת של חלקיקי OM-pBAEs לבצע ביעילות טרנספרציה של תאים דנדריטיים ולתווך את הפעלת התגובה החיסונית המקדמת את ההתבגרות של מחשבים במעגלים לא בוגרים.
איור 1: ייצוג סכמטי של הפרוטוקול הסינתטי כולו. באיור זה מפורטים שלבי סינתזת החיסון של mRNA, כולל פרמטרי האפיון הקריטיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: סינתזה של C6-pBAE אוליגופפטיד שעבר שינוי קצה (OM-pBAE). (A)כימיקלים גולמיים לביצוע התוספת של מייקל. (B)pBAE + אוליגופפטיד. (C)OM-pBAE. R יכול להיות היסטידין (H) או ליסין (K). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תמונות TEM של MRNA GFP טרי אנקפסולציה ננו-חלקיקי OM-pBAE. פוליפלקסים הוכתמו לרעה באפיון מיקרוסקופיה אלקטרונית. חלקיקים חד-ממדיים בקוטר של כ-60 ננומטר מוצגים. (A) ו -( B) תמונות מייצגות שני מיקרוסקופיות שונות של אותה מדגם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הדמיית מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאים שהודבקו ב- JAWSII עם חלקיקי mRNA OM-pBAE/eGFP. (A)תמונת שדה בהירה. (B)פלואורסצנטיות GFP (בירוק). (C)מורכב משתי התמונות הקודמות. מוטות קנה מידה = 100 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הפעלת JAWSII לאחר טרנספקטציה עם חלקיקי OM-pBAE/OVA mRNA. ערכי פקד שלילי (CN) תואמים לתווית השחורה. תאים שהודבקו תואמים לתווית האפורה. פסים תואמים לסטיית התקן (SD) של שלושה שכפולים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| חומר | חומר | מיקרוווסיקלים |
| אינדקס שבירה | 1.4 | |
| הקליטה | 0.01 | |
| פיזור | פיזור | מים |
| טמפרטורה (°C) | 25 | |
| צמיגות (cP) | 0.8872 | |
| אינדקס שבירה | 1.33 | |
| טמפרטורה | טמפרטורה (°C) | 25 |
| זמן שיווי משקל (ים) | 10 | |
| תא | סוג תא | ZEN0040 |
טבלה 1: פרמטרים ליצירת SOP למדידות גודל.
| חומר | חומר | מיקרוווסיקלים |
| אינדקס שבירה | 1.4 | |
| הימנעות | 0.01 | |
| פיזור | פיזור | מים |
| טמפרטורה (°C) | 25 | |
| צמיגות (cP) | 0.8872 | |
| אינדקס שבירה | 1.33 | |
| טמפרטורה | טמפרטורה (°C) | 25 |
| זמן שפלילים | 10 | |
| תא | סוג תא | DTS1070 |
טבלה 2: פרמטרים ליצירת SOP עבור מדידות פוטנציאליות של זטה.
| GFP mRNA/OM-pBAE | T (oC) | קוטר הידרודמי (nm) | PDI | מטען פני השטח (mV) | |
| נת"ע | DLS | ||||
| טריים | 25 | 124 ± 32 | 134 ± 8 | 0.2 ± 0.04 | 32 ± 0.7 |
| ליופיליזציה | 25 | 135 ± 35 | 138 ± 2 | 0.17 ± 0.02 | 34 ± 0.7 |
טבלה 3: אפיון פיזיקוכימי של mRNA אנקפסולציה חלקיקי OM-pBAE. GFP mRNA אנקפסולציה פוליפלקסים OM-pBAE אופיינו מיד לאחר ההכנה - טרי - ולאחר תהליך ליופיליזציה כדי להבטיח את יציבות החלקיקים. שינוי גודל DLS ו- NTA, ונתונים של טעינת פני השטח מוצגים.
| EE% | |
| GFP mRNA/OM-pBAE | 82.3 ± 1.5 |
| OVA mRNA/OM-pBAE | 83.1 ± 1.5 |
טבלה 4: יעילות אנקפסולציה (EE%) נתונים של mRNA אנקפסולציה חלקיקי OM-pBAE. אחוזי יעילות אנקפסולציה של חלקיקי GFP ו- OVA mRNA אנקפסולציה ננו-חלקיקי OM-pBAE. בדיקת פלואורסצנטיות RiboGreenבוצעה על דגימות ליופילים כדי להעריך את כמות ה- mRNA לכוד בפוליפלקסים.
| לדוגמה | % תאים חיוביים של GFP | SD |
| שליטה שלילית | 1.85% | 0.21% |
| תאים שהודבקו ב-mRNA של OM-pBAE/eGFP | 57.79% | 5.28% |
טבלה 5: יעילות ההדבקה של חלקיקי mRNA OM-pBAE/eGFP בקו התא JAWSII. יעילות ההדבקה אותרה על ידי ציטומטריית זרימה.
| נוגדן | תאים מוכתמים | תווית פלואורסצנטית |
| CD11b | בקרי הפעלה מופעלים | PerCP-Cy 5.5 |
| CD86 | בקרי הפעלה מופעלים | PE |
| α-עכבר אלכסהFluor488 | תאים חיוביים של OVA | אלכסה פלור 488 |
טבלה 6: לוח ציטומטריה של זרימה. פאנל זה שימש למחקרי ציטומטריית זרימה כדי לקבוע את הפונקציונליות במבחנה של חיסון mRNA.
מידע משלים: עיין בקובץ המשלים הכולל את כל המידע המשלים הכלול. אנא לחץ כאן כדי להוריד מתחת לקבצים.
טבלה S1A: תקן RNA ריבוזומלי.
טבלה S1B: RNA:pBAE עם תקן הפרין.
טבלה S1C: תקן הפרין.
איור S2: ספקטרוםפרוטון H-NMR אחד של C6-pBAE ו- OM-pBAE. (א)1H-NMR מה- C6-pBAE. כלורופורם-d שימש ממס (δ = 7.25 ppm). (ב)1H-NMR מה- C6CH3. D2O שימש ממס (δ = 4.64 ppm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לאחר פרוץ מגפת Covid-19 בשנה שעברה, החשיבות של חיסונים במונחים של בקרת מחלות זיהומיות באה לידי ביטוי כמרכיב קריטי8. מאמצי מדענים ברחבי העולם אפשרו את שחרורם לשוק של חיסונים רבים. בפעם הראשונה בהיסטוריה, חיסוני mRNA הוכיחו את הצלחתם המשוערת בעבר, הודות לעיצוב המהיר שלהם בגלל יכולתם להסתגל לכל אנטיגן חדשני בתוך כמה חודשים5,6,21. mRNA, או חומצה ריבונוקלאית שליח, מתייחס חומצות גרעין המניעים סינתזת חלבון ממידע מקודד ב- DNA. כאן, למטרות חיסון, mRNA קודד חלבון אנטיגני השייך מיקרואורגניזם זיהומיות (או אנטיגן הגידול במקרה של חיסון גידול טיפולי)8,22. בהקשר זה, חיוני שלקהילה המדעית יהיה פרוטוקולים ברורים לסינתזה של חיסוני mRNA.
עם רעיון זה בחשבון, הליך פשוט עבור סינתזה חיסוני mRNA המבוססים על חלקיקים פולימריים קנייניים נועד להיותמתואר 24. כפי שתואר בסעיף הפרוטוקול, ראשית, הפולימרים מסונתזים באמצעות הליך דו-שלבי המבוסס על תוספת מיכאל של אמינים ראשוניים לקבוצות אקרילט לסנתז עמוד שדרה פולימרי, ואחריו תוספת של אוליגופפטידים סופניים כדי לתת את האופי הקטי המשופר ואת היכולת לברוח מן endosomes לפולימרים וכתוצאה מכך12,13,14 . לאחר מכן, בשלב נוסף, חלקיקים מוכנים על ידי ערבוב הפולימרים עם mRNA כדי להשיג את האינטראקציה האלקטרוסטקטית שלהם כדי ליצור חלקיקים ננומטריים קטנים.
למרות הסינתזה של הפולימרים הוא פרוטוקול פשוט, לא ניתן לומר את אותו הדבר על ניסוח ננו-חלקיקים. משתפי פעולה רבים ברחבי העולם השתמשו בפולימרים אלה ומצאו צעדים קריטיים נפוצים בהתייחסם להכנת החלקיקים והשימוש בהם. אם ניקח בחשבון כי הסינתזה היא על ידי ערבוב ידני, יכולות המשתמש לשחק תפקיד מכריע. הצעד המסובך ביותר הוא ערבוב הפולימר ואת mRNA, אשר חייב להתרחש בצורה מבוקרת, כפי שהוא חייב להיעשות עבור שלב המשקעים הנוסף של התערובת למים ואת תוספת המאגר. כל שינוי במכניקה של ערבוב שני הרכיבים יגרום למיקרו-חלקיקים (במקום חלקיקים), שלא ניתן להשתמש בהם לבני אדם. לכן, ערבוב הוא אחד משלבי פתרון הבעיות שצריך להשיג תרגול כלשהו כראוי.
נקודה בולטת נוספת היא ייבוש בהקפאה. כפי שהוא ידוע, הוא מייצג את אחד שלבי צוואר הבקבוק של nanoformulations. במקרה הספציפי הזה, לקח כמה שנים להתאים את כל הפרמטרים ולתאר פרוטוקול שהצליח15. גם לאחר התאמה זו, צעד קריטי נוסף של הפרוטוקול הוא חלוקה מחדש של ניסוחים, אשר, אם לא מבוצע כראוי, להביא צבירה של חלקיקים והם מאבדים את הפונקציונליות שלהם. במקרה זה, זה חובה למקם במהירות את הניסוחים בסביבה יבשה, מעט קרה, כדי למנוע rehydration בלתי מבוקר שלהם. בשל טבעם ההיגרוסקופי הגבוה, יש לשים תשומת לב מיוחדת כדי לייבש אותם בצורה מבוקרת על ידי צנרת בזהירות למעלה ולמטה כל האבקה הדביקה שנוצרה על ידי ליופיליזציה. אם הדגימות להתייבש באופן לא מבוקר, הם מיד לצבור יצירת translucid לפיזור אטום.
למרות השלבים הקריטיים מוזכרים כאן, הפרוטוקול עבור סינתזה pBAE polyplexes הוא קל ומהיר, וזה יתרון בין שיטות סינתזה אחרות של מערכות אספקת הגנים. כאן, היישום הספציפי של חיסון mRNA סופק בפירוט. עם זאת, הוא מייצג מתודולוגיה רב-תכליתית שניתן ליישם גם כדי לתמצת סוגים אחרים של חומצות גרעין ושימוש שאינו חיסון, כגון בתחומים אונקולוגיים וקרדיווסקולריים, כפי שפורסם בעבר13,23,24.
לסיכום, פרוטוקול זה יאפשר לפולימרים קנייניים אלה להיות זמינים לקהילה המדעית כדי לעצב חיסוני mRNA חדשניים תוך הימנעות מכל פתרון הבעיות הזה. פולימרים אלה הם יתרון לעומת ניסוחים שומנים אחרים mRNA לגבי האפשרות של ייבוש הקפאה, יציבות לטווח ארוך, וירידה של עלויות אחסון והפצה על ידי לא דורש טמפרטורות קרות במיוחד. לכן, צפוי כי חיסוני OM-pBAE ממלאים תפקיד חיוני בתחום החיסונים ליישומים מניעתיים וטיפוליים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף או כל ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
תמיכה כספית מ- MINECO /FEDER (מענקים SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22 ו- COV20/01100) מוכרת. CGF הודתה מלגת IQS הדוקטורט שלה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-butanediol diacrylate | Sigma Aldrich | 123048 | |
| 1-hexylamine | Sigma Aldrich | 219703 | |
| 5-amino-1-pentanol | Sigma Aldrich | 411744 | |
| Acetone | Panreac | 141007 | |
| CD11b antibody | BD | 550993 | |
| CD86 antibody | Bioligend | 105007 | |
| Chlor hydroxhyde | Panreac | 181023 | |
| Chloroform-d | Sigma Aldrich | 151823 | |
| Cys-His-His-His peptide | Ontores | Custom | |
| Cys-Lys-Lys-Lys peptide | Ontores | Custom | |
| D2O | Sigma Aldrich | 151882 | |
| DEPC reagent for Rnase free water | Sigma Aldrich | D5758 | This reagent is important to treat MilliQ water to remove any RNases of the buffers |
| Diethyl eter | Panreac | 212770 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| mRNA EGFP | TriLink Technologies | L-7601 | |
| mRNA OVA | TriLink Technologies | L-7610 | |
| RiboGreen kit | ThermoFisher | R11490 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | 71196 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 11570626 | |
| α-mouse AlexaFluor488 antibody | Abcam | Ab450105 | |
| Equipment | |||
| Nanoparticle Tracking Analyzer | Malvern Panalytical | NanoSight NS300 | |
| Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer | Varian | 400 MHz | |
| ZetaSizer | Malvern Panalytical | Nano ZS | For zeta potential and hydrodynamic size determination |
| Software | |||
| NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | MAN0515-02-EN-00 | |
| NovoExpress Software | Agilent | Not specified | |
| ZetaSizer software | Malvern Panalytical | DTS Application | To analyze surface charge and hydrodynamic sizes |
References
- Chumakov, K., Benn, C. S., Aaby, P., Kottilil, S., Gallo, R. Can existing live vaccines prevent COVID-19. Science. 368 (6496), 1187-1188 (2020).
- Zhang, C., Maruggi, G., Shan, H., Li, J. Advances in mRNA vaccines for infectious diseases. Frontiers in Immunology. 10, 1-13 (2019).
- Wherry, E. J., Jaffee, E. M., Warren, N., D'Souza, G., Ribas, A. How did we get a COVID-19 vaccine in less than 1 year. Clinical Cancer Research. 27 (8), 2136-2138 (2021).
- Folegatti, P. M., et al. Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial. The Lancet. 396 (10249), 467-478 (2020).
- Geall, A. J., Mandl, C. W., Ulmer, J. B. RNA: The new revolution in nucleic acid vaccines. Seminars in Immunology. 25 (2), 152-159 (2013).
- Ulmer, J. B., Geall, A. J.
- Kranz, L. M., et al. Systemic RNA delivery to dendritic cells exploits antiviral defence for cancer immunotherapy. Nature. 534 (7607), 396-401 (2016).
- Milane, L., Amiji, M. Clinical approval of nanotechnology-based SARS-CoV-2 mRNA vaccines: impact on translational nanomedicine. Drug Delivery and Translational Research. 1 (4), 3 (2020).
- Green, J. J., Langer, R., Anderson, D. G. A combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery. Accounts of Chemical Research. 41 (6), 749-759 (2008).
- Guerrero-Cázares, H., et al. Biodegradable polymeric nanoparticles show high efficacy and specificity at DNA delivery to human glioblastoma in vitro and in vivo. ACS Nano. 8 (5), 5141-5153 (2014).
- Kozielski, K. L., Tzeng, S. Y., Hurtado De Mendoza, B. A., Green, J. J. Bioreducible cationic polymer-based nanoparticles for efficient and environmentally triggered cytoplasmic siRNA delivery to primary human brain cancer cells. ACS Nano. 8 (4), 3232-3241 (2014).
- Segovia, N., Dosta, P., Cascante, A., Ramos, V., Borrós, S. Oligopeptide-terminated poly(β-amino ester)s for highly efficient gene delivery and intracellular localization. Acta Biomaterialia. 10 (5), 2147-2158 (2014).
- Dosta, P., Segovia, N., Cascante, A., Ramos, V., Borrós, S. Surface charge tunability as a powerful strategy to control electrostatic interaction for high efficiency silencing, using tailored oligopeptide- modified poly (beta-amino ester)s (PBAEs). Acta Biomaterialia. 20, 82-93 (2015).
- Fornaguera, C., et al. mRNA delivery system for targeting antigen-presenting cells in vivo. Advanced Healthcare Materials. 7 (17), 180033 (2018).
- Fornaguera, C., Castells-Sala, C., Lázaro, M. Á, Cascante, A., Borrós, S. Development of an optimized freeze-drying protocol for OM-PBAE nucleic acid polyplexes. International Journal Pharmaceutics. 569, (2019).
- Fornaguera, C., Solans, C. Analytical methods to characterize and purify polymeric nanoparticles. International Journal of Polymer Science. , (2018).
- Fornaguera, C., Solans, C. Characterization of polymeric nanoparticle dispersions for biomedical applications: size, surface charge and stability. Pharmaceutical Nanotechnology. 6 (3), 147-164 (2018).
- Sahin, U., Karikó, K., Türeci, Ö MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
- Fan, Y. N., et al. Cationic lipid-assisted nanoparticles for delivery of mRNA cancer vaccine. Biomaterials Science. 6 (11), 3009-3018 (2018).
- Le Moignic, A., et al. Preclinical evaluation of mRNA trimannosylated lipopolyplexes as therapeutic cancer vaccines targeting dendritic cells. Journal of Controlled Release. 278, 110-121 (2018).
- Banerji, A., et al. mRNA vaccines to prevent COVID-19 disease and reported allergic reactions: Current evidence and approach. Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 9 (4), 1423-1437 (2021).
- Kaczmarek, J. C., Kowalski, P. S., Anderson, D. G. Advances in the delivery of RNA therapeutics: from concept to clinical reality. Genome Medicine. 9 (1), 1-16 (2017).
- Dosta, P., et al. Delivery of anti-microRNA-712 to inflamed endothelial cells using poly(β-amino ester) nanoparticles conjugated with VCAM-1 targeting peptide. Advanced Healthcare Materials. , 1-11 (2021).
- Segovia, N., et al. Hydrogel doped with nanoparticles for local sustained release of siRNA in breast cancer. Advanced Healthcare Materials. 4 (2), 271-280 (2015).
