Summary
Her præsenteres en simpel protokol til fremstilling af mRNA nanopartikler baseret på poly (beta aminoester) polymerer, let at skræddersy ved at ændre den indkapslede mRNA. Arbejdsgangen for syntetisering af polymerer, nanopartikler, og deres in vitro væsentlige karakterisering er også beskrevet. Der tilføjes også et proof-of-concept vedrørende immunisering.
Abstract
Vaccination har været en af de største succeser i det moderne samfund og er uundværlig for at kontrollere og forebygge sygdomme. Traditionelle vacciner bestod af hele eller brøkdele af det smitsomme middel. Der er dog stadig udfordringer, og nye vaccineteknologier er obligatoriske. I den forbindelse har brugen af mRNA til immunisering vist en forbedret ydeevne, som det fremgår af den hurtige godkendelse af to mRNA-vacciner, der forhindrer SARS-CoV-2-infektion. Ud over succes med at forebygge virusinfektioner kan mRNA-vacciner også bruges til terapeutiske kræftapplikationer.
Ikke desto mindre gør ustabiliteten af mRNA og dens hurtige clearance fra kroppen på grund af tilstedeværelsen af nukleaser sin nøgne levering ikke mulig. I denne sammenhæng er nanomedicin, og specielt polymere nanopartikler, kritiske mRNA-leveringssystemer. Formålet med denne artikel er således at beskrive protokollen for formulering og test af en mRNA vaccine kandidat baseret på de proprietære polymere nanopartikler. Syntesen og kemisk karakterisering af poly (beta aminoesters) polymerer, deres complexation med mRNA til at danne nanopartikler, og deres lyophilization metode vil blive diskuteret her. Dette er et afgørende skridt for at reducere lager- og distributionsomkostningerne. Endelig vil de nødvendige test for at påvise deres evne til at in vitro transfect og modne model dendritiske celler blive angivet. Denne protokol vil gavne det videnskabelige samfund, der arbejder på vaccination på grund af sin høje alsidighed, der gør det muligt for disse vacciner at forebygge eller helbrede en bred vifte af sygdomme.
Introduction
Smitsomme sygdomme har været en alvorlig trussel mod millioner af mennesker verden over og er stadig en af de hyppigste dødsårsager i nogle udviklingslande. Profylaktisk vaccination har været en af de mest effektive interventioner i det moderne samfund til at forebygge og kontrollere smitsomme sygdomme1,2. Disse kritiske milepæle for videnskabeni det 20. århundredes relevans er blevet bemærket af den nylige verdensomspændende Covid-19-pandemi forårsaget af SARS-CoV-2-virus3. I erkendelse af vigtigheden af at have effektive vacciner til at begrænse spredningen af sygdommen, har samarbejdsindsatsen fra alle biomedicinske samfund med succes resulteret i mange profylaktiske vacciner på markedet på mindre end et år4.
Traditionelt blev vacciner sammensat af dæmper (levende, reduceret virulens) eller inaktiverede (dødspartikler) vira. Men for nogle sygdomme uden margen for sikkerhedsfejl er viruspartikler ikke mulige, og proteinunderenheder anvendes i stedet. Ikke desto mindre muliggør underenheder normalt ikke kombinationen af mere end én epitop /antigen, og adjuvanser er nødvendige for at øge vaccinationsstyrken5,6. Derfor står behovet for nye vaccinetyper klart.
Som det fremgår af den nuværende pandemi, kan nye vaccinekandidater baseret på nukleinsyrer være fordelagtige med hensyn til at undgå lange udviklingsprocesser og give høj alsidighed, samtidig med at der produceres en vital patientimmunalisering. Dette er tilfældet med mRNA-vacciner, som oprindeligt blev designet som eksperimentelle kræftvacciner. Takket være deres naturlige evne til at producere antigenspecifikke T-celleresponser3,5,6,7. At være mRNA det molekyle, der koder det antigene protein, kun ændre det samme, vaccinen kan hurtigt skræddersys til at immunisere andre varianter af samme mikroorganisme, forskellige stammer, andre smitsomme mikroorganismer, eller endda blive en kræft immunterapeutisk behandling. Derudover er de fordelagtige med hensyn til store produktionsomkostninger. MRNA har imidlertid en betydelig forhindring, der hæmmer deres nøgne administration: dens stabilitet og integritet er kompromitteret i fysiologiske medier, fuld af nukleaser. Af denne grund kræves brugen af en nanometrisk bærer, der beskytter den og vektoriserer mRNA til de antigenpræsentationsceller,2,8.
I denne sammenhæng er poly (beta aminoesters) (pBAE) en klasse af biokompatibile og biologisk nedbrydelige polymerer, der viste en bemærkelsesværdig evne til at komplekse mRNA i nanometriske partikler takket være deres kationiske ladninger9,10,11. Disse polymerer består af esterbindinger, hvilket gør deres nedbrydning let ved esterases under fysiologiske forhold. Blandt pBAE bibliotek kandidater, dem funktionaliseret med end kationiske oligopeptider viste en højere kapacitet til at danne små nanopartikler til effektivt at trænge ind i celler gennem endokytose og transfect den indkapslede genmateriale. Desuden, takket være deres bufferkapacitet, forsuring af endosome rum tillader endosomal undslippe12,13. Nemlig en bestemt form for pBAE, herunder hydrofobiske moieties på deres rygrad (den såkaldte C6 pBAE) for at øge deres stabilitet og end-oligopeptid kombination (60% af polymer modificeret med en tri-lysin og 40% af polymeren med en tri-histidin), der selektivt transfects antigen-præsentere celler efter parenteral administration og producere mRNA kodet antigen præsentation efterfulgt af mus immunisering er for nylig blevet offentliggjort14 . Derudover er det også blevet påvist, at disse formuleringer kunne omgå et af nanomedicinformuleringernes vigtigste flaskehalstrin: muligheden for at frysetørre dem uden at miste deres funktionalitet, hvilket muliggør langsigtet stabilitet i bløde tørre miljøer15.
I den forbindelse er formålet med den nuværende protokol at stille proceduren for dannelse af mRNA-nanopartiklerne til rådighed for det videnskabelige samfund ved at give en beskrivelse af de kritiske trin i protokollen og muliggøre produktion af effektive vacciner til forebyggelse af smitsomme sygdomme og anvendelse af tumorbehandling.
Følgende protokol beskriver den komplette træning for at syntetisere oligopeptid end-modificeret poly (beta aminoesters) - OM-pBAE polymerer, der yderligere vil blive brugt til nanopartikler syntese. I protokollen er nanopartikler formulering også inkluderet. Derudover er der også kritiske skridt til succes for proceduren og repræsentative resultater for at sikre, at de resulterende formuleringer udfører de nødvendige kvalitetskontrolkarakteriseringsfunktioner for at definere et positivt eller negativt resultat. Denne protokol er opsummeret i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Syntese af pBAE polymer med end oligopeptider (OM-pBAE)
- Polymerisering af C6-pBAE
- Tilsæt 5-amino-1-pentanol (38 mmol; MW = 103,16 Da) 1-hexylamin (38 mmol; MW = 101,19 Da) i en rundbundet glaskolbe (100 mL). Derefter tilsættes 1,4-butanediol diakrylat (82 mmol; MW = 198,22 Da).
- Forvarm silikoneoliebadet ved 90 °C, læg den runde bundkolbe i oliebadet og rør blandingen ved hjælp af en magnetisk omrørbar natten over (~18 h). Tag derefter produktet fra den runde bundkolbe og læg det i fryseren ved -20 °C.
BEMÆRK: Produktet er i form af et klæbrigt pulver og tages ud af kolben ved hjælp af en spatel. Det er vigtigt at validere strukturen af den opnåede polymer gennem 1H-NMR. NMR-spektre blev registreret i et 400 MHz-instrument (se Materialetabel)ved hjælp af chloroform-d og D2O som opløsningsmidler. Omkring 10 mg af hver poly(β-amino ester) blev taget og opløst i 1 mL af det deutererede opløsningsmiddel.
- Reaktion med peptider for at opnå OM-pBAE
- Tilsæt 25 mL af 0,1 M HCl til udvalgte peptider, f.eks peptid Cys-His-His med Trifluoroacetic syre (TFA, 200 mg), i en tidligere vejede 50 mL centrifuge rør, der kan stå frysetørrende og manuelt røre natten over for at opnå en klar løsning.
- Opløsningen fryses ved -80 °C i 1 time, og tør det deraf følgende peptidhydrochlorid.
BEMÆRK: Kontroller, om den endelige vægt svarer til den teoretiske værdi. - Opløsning af C6-pBAE (0,031 mmol) i dimethylsulfoxid. Lav også en opløsning af peptidhydrochlorid (0,078 mmol) i dimethylsulfoxid.
- Bland de to opløsninger i et skruehætterør og skru på hætten. Rør blandingsopløsningen i et vandbad med en kontrolleret temperatur på 25 °C i 20 timer med en magnetisk omrøresstang.
- Tilsæt blandingen til 7:3 (v/v) diethyl ether/acetone. Centrifugere den resulterende suspension ved 25.000 x g ved 4 °C for at fjerne opløsningsmidlet. Vask derefter det faste stof med 7:3 (v/v) diethyl ether/acetone to gange. Tør derefter produktet under et vakuum (<0,2 atm).
- Der fremstilles en opløsning på 100 mg/mL af produktet i dimethylsulfoxid. Det resulterende produkt hedder C6-peptid-pBAE. Det er vigtigt at validere strukturen af den opnåede polymer gennem 1H-NMR for at bekræfte forsvinden af olefinsignalerne forbundet med terminale acrylater. Hvis polymeren ikke anvendes, kan den fryses ved -20 °C.
2. Polyplexes dannelse
BEMÆRK: Alle procedurer skal udføres inde i et konditioneret rum for at opretholde en konstant temperatur.
- Optø polymererne C6-peptid-pBAE og hvirvle opløsningen.
- Pipette polymeren blandes op og ned og forbereder en opløsning på 12,5 mM (V1) i natriumacetat (NaAc). Derefter hvirvle blandingen og vente i 10 minutter.
- mRNA til tilberedes ved 0,5 mg/mL og blandes ved pipettering (V2).
BEMÆRK: Det er vigtigt at undgå at hvirvler mRNA. - Vortex polymerblandingen ved den endelige koncentration for at opnå en homogen opløsning mellem polymerbestanden i DMSO og acetatbufferen.
BEMÆRK: Den endelige polymerkoncentration afhænger af det valgte N/P-forhold (nitrogen- til fosfatgrupper). N/P-forholdet afhænger af hvert enkelt mRNA, der skal anvendes. For eGFP-indkapsling blev der f.eks. - Bland den genetiske materialeopløsning og C6-peptidbaeopløsningen (25x af mRNA-koncentrationen) i et forhold på 1:1 (Vi = V1 + V2).
BEMÆRK: C6-peptid-pBAE er indlæst i et mikrocentrifugerør, hvor mRNA tilsættes ved pipetter op og ned til blanding. Når den er forberedt, fortyndes polyplexen, nukleinsyren og C6-peptid-pBAE-koncentrationerne halvt fortyndet. - Inkuberes ved 25 °C i 30 min i en termoblok. Bundfald med 1:2 RNasefrit vand ved at tilsætte prøven til et forindlæst mikrocentrifugerør med vand.
- Medtag hjælpestofferne. Der tilsættes samme volumen som blandingen af mRNA og pBAE (Vi) i HEPES 20 mM og saccharose 4% ved pipetter op og ned. På dette tidspunkt er prøven fortyndet 3x.
3. Polyplexes lyophilization
- Straks fryses ved -80 °C fryseren af den tidligere polyplexopløsning i 1 time.
- Den primære tørring udføres ved at følge trinene: (1) 1 h ved -60 °C og 0,001 hPa; 2) 1 h ved -40 °C og 0,0001 hPa 3) 4 timer ved -20 °C og 0,0001 hPa (4) 12 timer ved 5 °C og 0,0001 hPa.
- Opbevares ved -20 °C med det samme for at undgå rehydrering, indtil den er i brug.
4. Polyplex resuspension
BEMÆRK: Denne protokol beskriver den proces, der anvendes til at rekonstruere de lyophilized C6-peptid-pBAE nanopartikler til deres videre anvendelse enten til karakterisering, in vitro, eller in vivo analyse.
- Tag de lyophilized nanopartikler fra -20 °C lige i brugsøjeblikket og tilsæt hurtigt den tilsvarende mængde depyrogeniseret (DEPC) vand for at genisperse det faste for at opnå den ønskede koncentration.
BEMÆRK: Volumenet vil være det samme som nanopartiklernes oprindelige volumen, hvis der er planlagt den samme koncentration, men det vil blive angivet for hvert forsøg. - Pipette forsigtigt indtil total resuspension, der ledsager væsken med pipetten.
BEMÆRK: Sørg for, at der ikke er noget materiale tilbage på hætteglasets væg. - Når den er opløst, pipette op og ned kraftigt, undgå bobler.
BEMÆRK: Prøven bør have et gennemsigtigt til gennemsigtigt aspekt, hvilket er mere tydeligt ved højere koncentrationer - Prøverne opbevares på is eller ved 4 °C i en periode på højst 24 timer, når de er rekonstitueret. Undgå frysning.
5. Polyplex karakterisering
- Dynamisk lysspredning
BEMÆRK: Hydrodynamisk diameter (nm), polydispersitetsindeks (PDI) og overfladeladning af nanopartikler blev målt ved 25 °C, 633 nm laserbølgelængde og 173° signaldetektor ved hjælp af en potentiel Zeta-analysator (se Materialetabel).- Hydrodynamisk diameter (nm)
- Nanopartiklerne blander mRNA og pBAE grundigt ved at pipetter genmaterialet til polymerfraktionen til en endelig koncentration af mRNA på 0,25 mg/mL som tidligere beskrevet ovenfor (trin 2).
- Skyl et mikrocuvette med filtrerede fortyndingsmedier for helt at rense det fra urenheder. Fyld derefter cuvette med mindst 50 μL af prøveopløsningen og sæt den i. Derefter skal prøven indføres inde i DLS-instrumentet, sørg for, at cellen er korrekt indsat.
BEMÆRK: Fortyndingsmediet filtreres ved hjælp af et 0,22 μm sprøjtefilter. - Åbn den SOP-fil (Standard Operation Procedure), der er oprettet, og introducer det ønskede eksempelnavn. Vælg Størrelsesmåling.
BEMÆRK: Alle parametre, der skal oprettes en SOP til størrelsesmålinger, findes i tabel 1. - Kør partikelstørrelsesmålingen ved hjælp af DLS ved at klikke på Afspil.
BEMÆRK: Efter de tredobbelte biplyde er analysen færdig. - Vælg de resultater, der svarer til prøven på målearket, for at opnå den gennemsnitlige partikelstørrelse, den gennemsnitlige PDI, standardafvigelse og grafik. Når det er gjort, skal du fjerne cellen fra DLS-udstyr.
- Fjern prøven, hold den til zeta-potentiel analyse, og rengør og skyl cellen med deioniseret vand. Til sidst tørres den rensede cuvette under en trykluftgasstrøm.
- Overfladeladning (mV)
- Nanopartiklerne blander mRNA og pBAE grundigt ved at pipetter genmaterialet til polymerfraktionen til en endelig koncentration af mRNA på 0,25 mg/mL som tidligere beskrevet ovenfor (trin 2, Polyplex-formation). Derefter fryses og tørres opløsningen.
BEMÆRK: I dette tilfælde anbefales det kraftigt at frysetørre prøven, før prøven udføres i en genudgivelse af prøven i den relevante buffer, og der simuleres kroppens forhold for pH- og elektrolytkoncentration. - Genbrug den lyfile prøve ved hjælp af vand. Prøven fortyndes 1/10 i vand (endelig koncentration 0,025 mg/mL).
- Skyl en engangsfoldet kapillær celle (zeta potentiel cuvette) med filtrerede fortyndingsmedier for helt at rense den fra urenheder. Fyld derefter cuvette med fortyndede nanopartikler ved hjælp af en 1 ML sprøjte og hætte begge sider af fyldstofferne.
BEMÆRK: Nanopartiklernes spredning skal fylde det volumen, der er tilgængeligt i cuvette (~ 1 mL), idet der lægges særlig vægt på boblens dannelse, som kan forstyrre foranstaltninger. - Indfør prøven inde i DLS; sikre, at cellen er korrekt indsat.
- Åbn den SOP-fil, der er oprettet til zeta-potentiel analyse, og introducere det ønskede eksempelnavn. Vælg Zeta-potentialmåling.
BEMÆRK: Parametre til oprettelse af en SOP til potentielle målinger af zeta er angivet i tabel 2. - Kør zeta-potential måling ved hjælp af DLS ved at klikke på Afspil.
BEMÆRK: Efter den tredobbelte biplyd er analysen færdig. - Vælg de resultater, der svarer til prøven på målearket, for at opnå det gennemsnitlige zetapotentiale, standardafvigelse og grafik. Når det er gjort, skal du fjerne cellen fra DLS-udstyret.
- Fjern prøven, og behold den, hvis det er nødvendigt. Dernæst rengøres og skylles cuvettecellen med deioniseret vand, efterfulgt af ethanol og vand igen. Til sidst tørres den rensede cuvette under en trykluftgasstrøm.
BEMÆRK: Hvis du vil analysere dataene, skal du bruge den anbefalede software.
- Nanopartiklerne blander mRNA og pBAE grundigt ved at pipetter genmaterialet til polymerfraktionen til en endelig koncentration af mRNA på 0,25 mg/mL som tidligere beskrevet ovenfor (trin 2, Polyplex-formation). Derefter fryses og tørres opløsningen.
- Hydrodynamisk diameter (nm)
- Nanopartikler Tracking Analysis (NTA)
BEMÆRK: Hydrodynamisk diameter (nm) og koncentrationen af nanopartikler blev målt ved 25 °C, 488 nm laserbølgelængde ved hjælp af en Nanoparticle Tracking Analyzer (se Materialetabel).- NTA og prøveforberedelse
- Tænd computeren og udstyret. Kontroller først, om alle komponenterne er tilsluttet korrekt. Åbn derefter den anbefalede software. Softwaren kontrollerer, om alt tilbehør er korrekt tilsluttet.
- Tilslut toppladen, her O-ringcellen, ind i lasermodulet.
BEMÆRK: Overscrew denne del. - Læg først kammeret med buffer og/eller deioniseret vand med en 1 mL-sprøjte. Gentag proceduren mindst to gange. Undgå at indføre bobler i kammeret.
- Prøven forberedes ved at fortynde 1/1000 i deioniseret vand fra den koncentration, der anvendes i måling af DLS-størrelse. Forbered mindst 1 mL og læg den i en 1 mL sprøjte, så du undgår at indføre bobler.
- Læg prøverne i kammeret med en sprøjte. Sæt derefter lasermodulet i NTA's store kammer.
BEMÆRK: Stort kammer angiver det rum, hvor kammeret er placeret til målingen.
- Billedoptimering
- Først skal du kontrollere, om kameraet og den korrekte laser er valgt i hardwaren.
BEMÆRK: Her er der kun ét kamera og Den Blå Laser 488 nm. - Start med kameraniveauet ved 0, og tryk på Start kamera på capturevinduet.
BEMÆRK: Juster på dette tidspunkt følgende parametre. Beam position (det kan flyttes op og ned på skærmen). Kameraniveau: Undgå overmættede pixel. Fokus (sidehjul): prøv at fokusere så bedre som muligt. Det er bedre at have partikler med en glorie i stedet for ufokuserede partikler. Koncentration: Juster koncentrationen til at have mellem 10 og 100 partikler pr. felt.
- Først skal du kontrollere, om kameraet og den korrekte laser er valgt i hardwaren.
- Videooptagelse
- Gå til vinduet Målingsvalg- SOP (ned til venstre) i softwaren, og vælg Standardmåling.
BEMÆRK: Program til at udføre tre mål på 30 s hver (for at gøre det muligt for softwaren at udføre middel- og standardafvigelsesberegninger). Angiv et navn og en mappesti (på basisfilnavn) for at gemme registreringerne i eksemplet. Tryk på Opret og kør script, når SOP-parametrene er konfigureret korrekt. Når den første replikering er målt, vil programmet bede om at tilføje en ny prøve. Derefter skal en anden brøkdel af prøven indføres i kammeret ved at skubbe sprøjtens stempel. Endelig gentages en tredje gang for at analysere den tredje replikation.
- Gå til vinduet Målingsvalg- SOP (ned til venstre) i softwaren, og vælg Standardmåling.
- Videobehandling
- Juster tærsklen for skærmforøgelse og detektion, når de tre mål er færdige med at analysere de målte partikler. I øjeblikket skal der forekomme omkring 100 partikler i hver ramme for at udføre analysen (høje røde kors og lave blå kors forventes).
- Eksporter resultaterne i en pdf-fil, når analysen er afsluttet. Derudover er det muligt at eksportere som videoer og Excel-filer.
- Rengøring af NTA
BEMÆRK: Luk alle de åbnede målinger, før du studerer følgende prøve. da de genererede filer er enorme, og afhængigt af computeren er det ikke let at opretholde mere end en åben.- Rengør NTA-kammeret ved gentagne gange at skylle vand, før den efterfølgende måling udføres, indtil der ikke observeres partikler. derefter skylles den anvendte buffer (PBS) for at fortsætte med foranstaltningerne.
- Skyl luften inde i kammeret, og tør den med mikroskopisk papir, når dagens sidste måling er afsluttet.
- Karakterisere størrelsen og formen ved Transmission Electronic Microscopy (TEM). Forbered prøverne. 30 μL af det endelige volumen er nok til TEM-karakterisering.
BEMÆRK: Både friske og lyophilized - efter resuspension- nanopartikler kan måles. - Drop 10 μL prøve på et kulstofbelagt kobbergitter. Lad det tørre i 10 min. Fjern den overskydende væske, hvis det er nødvendigt, ved blødt at trykke på filterpapir.
- Drop 10 μL uranylacetatopløsning (2% w/v) til negativ farvning. Lad det tørre i 1 min. Fjern det flydende overskud, hvis det er nødvendigt, ved blødt at trykke på filterpapir.
- Indfør prøven i mikroskopet og scan (spændingsdrift 80 kV).
BEMÆRK: Passende software kan bruges til yderligere analyse af billederne.
- NTA og prøveforberedelse
- Indkapslingseffektivitet
- Prøveforberedelse
- Forbered nanopartiklerne i den ønskede koncentration og frys og tør dem. Derefter genbruges nanopartiklerne og fortyndes ved en endelig koncentration på 6 μg/mL.
- Forbered 1x TE-buffer fra 20x lagerløsningen.
BEMÆRK: Vt (Samlet volumen) = (antal prøver x 100 μL x 4) (antal prøver x 290 μL) + 2 mL. - Tilbered TE-bufferen med 3 μg/μL Heparin fra lageret på 100 μg/μL.
BEMÆRK: Vt = Antal prøver x 50 μL x 2. - Forbered standarderne
- Der fremstilles en RNA-standard fra 0,2 μg/mL til 0,025 μg/mL i 1x Tris-EDTA (TE) buffer (Tabel S1A).
BEMÆRK: Brug mRNA i RNA-standarden, hvis den adskiller sig fra ribosomal RNA. - Forbered RNA:pBAE-standard med Heparin (Tabel S1B). Forbered Heparin-standard (tabel S1C).
- Forbered en 96-brønd plade som følger.
- Læg 295 μL TE-buffer i den første vognbane på en 96-brønds plade (så mange brønde som prøver, der skal analyseres). Læg derefter 50 μL 1x TE-buffer i vognbane B og C (dubletter for hver prøve).
- Læg 50 μL 1x TBE-buffer med 3 μg/μL Heparin i vognbane D og E (dubletter for hver prøve). Derefter skal du indlæse 100 μL af hver standard i vognbane F, G og H (dubletter for hver standard).
- Læg 5 μL af hver prøve i vognbane A (koncentrationen i hver brønd er 0,1 μg/mL). Blandes korrekt ved pipettering, og 50 μL af hver prøve på de fire brønde nedenfor (to af dem indeholder 50 μL buffer 1x TE og yderligere to indeholdende 1x TE-buffer med 3 μg/μL Heparin).
- Prøven inkuberes i 30 min ved 37 °C. Forbered RiboGreen reagens i henhold til producentens protokol (se Materialetabel)i 1x TE-buffer.
BEMÆRK: Fortynd 1:200 og vortex. Beskyt mod lys. Vt = Antal hel brønde x 100 μL. - Læg 100 μL RiboGreen-opløsning i hver brønd. Detekter fluorescens ved hjælp af mikropladelæseren med en excitationsbølgelængde på 500 nm og en emissionsbølgelængde på 525 nm.
- Resultatanalyse
- Forbered de tre kalibreringskurver
BEMÆRK: Først Ribosomal RNA standard. Interpolere i denne kalibrering kurve prøver, der ikke indeholder Heparin. For det andet mRNA: pBAE med Heparin. Interpolere i denne kalibrering kurve prøven, der har Heparin. For det tredje, Heparin. Bruges til at sikre, at arbejdskoncentrationen er i det lineære område. - Beregn indkapslingseffektivitet (EE%) på følgende måde:
- Forbered de tre kalibreringskurver
- Prøveforberedelse
6. In vitro-karakterisering
- Fluorescensmikroskopi til kvalitativ vurdering
- Anbring 96-brøndspladen på mikroskopet efter 24 timers transfektion. Begynd at visualisere celler med 10x-målsætningen.
BEMÆRK: HeLa-celler bruges i dette tilfælde. Celler lokaliseres ved hjælp af transmissionstilstanden (det lyse felt), og fokus skal justeres på nuværende tidspunkt.- Først skal du anvende en hvidbalance til at henvise til softwaren om baggrunden for prøverne. Derefter erhverve et billede til at overlejre det med fluorescens billede under analysen.
- Skift mikroskoptilstand til refleksionstilstand (fluorescens), og flyt filterhjulet til den blå laser (488 nm) for at visualisere eGFP.
BEMÆRK: På dette tidspunkt skal eksponeringstiden og gevinsten justeres. Gain skal justeres i værdier mellem 3 og 5 for at undgå artefakter og overskydende på baggrundssignal. Justeringen af eksponeringstiden afhænger af transfectioneffektiviteten (fra ms til 1 s). - Erhverve billeder for alle de betingelser eller brønde beskæftiger den samme eksponering tid til at sammenligne alle prøverne.
- Anbring 96-brøndspladen på mikroskopet efter 24 timers transfektion. Begynd at visualisere celler med 10x-målsætningen.
- Flowcytometri (FC) til kvantitativ vurdering
- Brug en multikanal pipette til at forberede 96-brøndspladen til flowcytometrieksperimentet.
BEMÆRK: Når du arbejder med halv-klæbende celler, såsom i JAWSII cellelinjen, gendanne alle medier volumen og gemme det i en anden 96-brønd plade. Må ikke stræbe efter dette medie, da det kan indeholde et betydeligt antal transfected celler. - Rengør cellerne (HeLa celler bruges her) med 100 μL/brønd af 1x PBS og aspirere det. Derefter tilsættes 25 μL/brønd af trypsin og inkuberes ved 37 °C i 5 min.
- Når cellerne er løsrevet, tilsættes tidligere genvundne medier for at stoppe trypsinhandlingen og fastgøre cellerne og tilføje 31,25 μL/brønd formalin 10% i 20 min (endelig koncentration 2,5%).
BEMÆRK: På dette tidspunkt er det afgørende at visualisere cellernes tilstand ved mikroskopi for at sikre frigørelsen af cellerne. Det anbefales stærkt at pipette op og ned flere gange for at hjælpe cellerne løsne og undgå deres agglomeration. Dette vil give et pålideligt resultat. - Tænd flowcytometeret og softwaren. I softwaren skal du konfigurere de rette betingelser for eksperimentet (pladetype, prøvevolumen og andre parametre såsom rysten, skylning mellem prøver.
BEMÆRK: For trin 6.2.5 skal strømningshastighed være 120 μL/min. Bland en cyklus hvert 1 minut og skyl en cyklus hver eneste godt. Blanding er afgørende for at opretholde cellerne spredt i medierne og tillade en bedre analyse af de enkelte celler. Derudover er skylning nødvendig for at rense mikrofluidics af cytometeret mellem prøverne. Endelig skal du kontrollere, om der er nok buffere, og om alle komponenter er korrekt tilsluttet. - Konfigurer de relevante parametre til at kvantificere procentdelen af positivt transfected celler.
- Først skal du se flowdata på (Fremad spredt lys) FSC versus SCC (Side spredt lys) scatter plot for at skelne cellerne fra snavs. Derefter plotte et andet scatter plot, der sammenligner amplituden (FSC-A) versus højde (FSC-H), til gate og diskriminerer individuelle celler.
BEMÆRK: Den ubehandlede population gør det muligt at gate de populationer, der svarer til positivt transfected celler. Derefter udføres kvantificering af de positivt transfected celler på den rigtige kanal på et histogramplot. Derfor skal de positivt transfected celler være repræsenteret som et kontinuum af begivenheder på histogrammet.
- Først skal du se flowdata på (Fremad spredt lys) FSC versus SCC (Side spredt lys) scatter plot for at skelne cellerne fra snavs. Derefter plotte et andet scatter plot, der sammenligner amplituden (FSC-A) versus højde (FSC-H), til gate og diskriminerer individuelle celler.
- Brug en multikanal pipette til at forberede 96-brøndspladen til flowcytometrieksperimentet.
7. In vitro-funktionalitetstest: kapacitet til at aktivere modelimmunceller ved hjælp af ovalbumin (OVA) som antigen model mRNA
- Plade 10.000 celler / brønd (JAWSII celler anvendes her) i en 96-brønd plade dagen før transfection.
BEMÆRK: Plade så mange brønde som kræves for at have triplikater for hver betingelse. Lad cellerne fastgøres til pladen mindst i 12 timer (en inkubation fra natten anbefales). - De NSP'er, der er beskrevet i NOTEN nedenfor, forberedes til at transfect 0,6 μg mRNA pr. brønd.
BEMÆRK: Som en positiv kontrol skal du transfect cellerne ved hjælp af et transfektionsreagens. Her brugte vi 0,1 μg mRNA pr. brønd og 0,25 μL af transfection reagenset pr. Brønd. mRNA-kodificering for OVA blev købt (se Materialetabel). Det er polyadenyleret, modificeret med 5-methoxyuridin og optimeret til pattedyrsystemer og er beskyttet gennem en slut-capping med Cap1 struktur, en proprietær metode fra leverandøren. - Inkuberes 96-brøndspladen i 24 timer i en tørluftinkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
BEMÆRK: Efter dette tidspunkt, ikke aspirere medierne, da det kan indeholde et vist antal celler. Gendan cellerne og gem dem i en anden brønd eller plade. - Vask de celler, der er tilbage på brønden, med 25 μL 1x PBS. Derefter stræbes det og tilsættes 25 μL trypsin og inkuberes pladen i 5 min ved 37 °C for at løsne cellerne. Stop trypsinreaktionen ved at tilføje de tidligere gendannede medier på korrespondenten godt.
- Centrifugere pladen ved 400 x g i 5 min ved 4 °C. Aspire medierne. Der tilsættes 50 μL/brønd af en 1x PBS og 2,5% af formalin. Inkuberes ved 4 °C i 20 min for at fastgøre celler.
- Gentag trin 7.5 og 7.5.1. Derefter tilsættes 50 μL/brønd af 1x PBS og 3% BSA (Blokeringsbuffer) og inkuberes i 30 min ved 4 °C. Gentag igen trin 7,5 og 7,5,1, og der tilsættes derefter 50 μL/brønd af det primære antistof (mus α-OVA) i 1x PBS og 3% BSA og inkuberes i 30 min ved 4 °C.
- Gentag trin 7.5 og 7.5.1, og vask derefter cellerne med 50 μL/brønd på 1x PBS. Aspire medier, og derefter tilføje sekundære antistoffer løsning (α-mus-AlexaFluor488/PerCP og Cy5.5-CD11b/APC-CD86) i 1x PBS og 3% BSA. Inkuberes i 1 time ved 4 °C.
- Centrifuge pladen ved 400 x g i 5 min. Vask derefter cellerne med 50 μL/brønd på 1x PBS. Dernæst stræber centrifuge (400 x g i 5 min), og genbruger derefter cellerne i 100 μL/brønd på 1x PBS og 2,5% Formalin.
- Analyser det ved flowcytometri som beskrevet ovenfor (trin 6.2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Polymersyntese og karakterisering
OM-pBAE-synteseproceduren er angivet i figur 2. Som figur 2A viser, er det første skridt til at opnå OM-pBAE at syntetisere C6-pBAE ved at tilføje aminer (1-hexylamin og 5-amino-1-pentanol, forholdet 1:1) til diakrylat (1,4-butanediol diacrylat). Denne reaktion udføres ved 90 °C i 20 timer og under konstant omrøring. Derefter tilsættes en opløsning af oligopeptider til en opløsning af C6 polymer fremstillet af den tidligere reaktion (Figur 2B). Endelig udføres syntesen ved hjælp af DMSO som opløsningsmiddel ved 25 °C med kontinuerlig omrøring i 20 timer. Figur 2C viser om-pBAE'ens struktur, som er det resulterende produkt af polymerisering. De resulterende polymerer er karakteriseret ved 1H-NMR (se supplerende figur S2). I karakteriseringen er et positivt resultat det med flere monomerenheder (n + m i tallene), der består mellem 7-10; fordelt halv enhedstype og halvdelen af den anden; mens ethvert andet tal uden for dette interval er et negativt resultat.
Nanopartikler syntese og fysisk kemisk karakterisering
Tabel 3 viser resultaterne af den fysisk-kemiske karakterisering af GFP mRNA indkapsling nanopartikler som et proof of concept. Det blev tidligere påvist , at størrelse og overfladeladning ikke viser væsentlige forskelle uanset mRNA-typen indkapslet14. Karakterisering er blevet udført både i frisklavede og lyophilized nanopartikler for at bevise stabiliteten af deres fysisk-kemiske egenskaber og for at påvise, at, som tidligere offentliggjort, frysetørringsprocessen blev justeret til disse formuleringer15. Polyplexes hydrodynamiske radius anses for korrekt, når den varierer omkring 150-220 nm. Desuden skal PDI være konstant, ca. 0,2, men den accepteres op til 0,3. Derfor viste hverken størrelse eller PDI signifikante forskelle før og efter lyophilization, som vist her ved hjælp af repræsentative resultater. Nanopartiklernes dimensionering blev også udført med NTA for at bekræfte de tidligere opnåede resultater. Enhver værdi uden for ovennævnte områder betragtes som et negativt resultat, og partikler bør kasseres til videre brug.
Under den fysisk-kemiske karakterisering af denne type prøve er det praktisk at sammenligne de resultater, dls har opnået, med de resultater, som NTA har opnået. Begge teknikker bestemmer partiklernes hydrodynamiske radius ved at måle diffusionskoefficienten. Antallet af nanopartikler, der tælles pr. ramme i NTA, er mellem 80 og 100 for nøjagtigt at spore partiklerne. Overfladeladning var også karakteriseret for at sikre den positive ladning af nanopartiklerne, hvilket letter elektrostatisk interaktion med cellemembranen. Endelig var polyplexernes morfologi karakteriseret ved Transmission Electronic Microscopy (TEM). Figur 3 bekræfter dannelsen af sfæriske og monodisperse nanopartikler af en omtrentlig størrelse på 50 nm diameter. Mindre diametre blev opnået ved at analysere TEM-billeder, da både NTA og DLS måler de hydrodynamiske diametre. Selvom der altid forventes en mindre størrelse, når der udføres elektronmikroskopimålinger16,17, sammenlignet med spredningsmålinger, er det vigtigt at fremhæve her, at forskellen er næsten 100 nm, hvilket normalt ikke forventes. Dette tilskrives den høje hygroskopiske karakter af disse nanopartikler, givet af både den indkapslede mRNA og endeterminalen oligopeptider komponere polymeren.
mRNA-fastsættelse af indkapslingseffektivitet
En anden kritisk parameter at måle er nanopartiklernes evne til at indkapsle mRNA' et, som er det aktive princip og skal indkapsles for at opnå sin beskyttelse mod nucelaser18,19,20. Protokollen er udviklet til analyse af indkapslingseffektiviteten (EE; i %) af nukleinsyreindfangning efter leverandørens anvisninger. Den opnåede værdi giver en idé om nukleinsyreprocenten, der med succes er fanget i nanopartiklerne. RiboGreen farvestof, en fluorescerende nukleinsyre plet, anvendes til dette formål. Protokollen består i at kvantificere ethvert RNA, der forbliver tilgængeligt for fluorescerende farvestof. For at kvantificere det samlede RNA skal nanopartiklerne adskilles, og Heparin anvendes til dette formål.
Tabel 4 viser indkapslingseffektiviteten (EE%) af OM-pBAE-polyplexerne, der indkapsler både GFP og OVA mRNA, som proof of concept. RiboGreen fluorescens assay gør det muligt at beregne mængden af mRNA fanget i nanopartikler efter demontering af heparin ud over at frigive deres indhold. De opnåede effektivitetsværdier skal være højere end 80 % og viser som vist her ikke væsentlige forskelle afhængigt af typen af mRNA. Lavere encapsulation effektivitetsværdier repræsenterer et negativt resultat og udgør et signal til at kassere disse formuleringer. Disse resultater bekræfter den høje indkapslingskapacitet af mRNA af OM-pBAE, dens alsidighed og dens lovende anvendelse i genlevering.
In vitro repræsentative resultater
Det er vigtigt at bestemme kapaciteten af pBAEs polyplexes. For det første at transfect og for det andet at aktivere immunceller14. Transfection effektivitet vurderes ved hjælp af to forskellige teknikker, ved hjælp af eGFP som reporter mRNA: fluorescens mikroskopi til visuelt at bestemme reporter protein og flow cytometri udtryk til at kvantificere transfection effektivitet. Et fluorescerende mikroskop udstyret med et CCD-kamera, 5x, 10x, 20x og 40x mål og UV, blå og grønne filterlasere blev anvendt til kvalitativt at bestemme udtrykket af eGFP-protein i JAWSII cellelinje, en murin dendritisk cellelinje. eGFP-protein har et excitations maksimum ved 488 nm, svarende til blå laser, og et emissionsmål på omkring 510 nm, svarende til grøn farve. For at kvantificere transfefekteffektivitetsekspressionen for målproteinet udføres flowcytometrianalysen af de transfected celler efter 24 timer af transfektionen med pBAEs polyplexer med eGFP mRNA. Et fikseringstrin er nyttigt, når celler er blevet transfinteresset med fluorescerende journalister som GFP eller RFP.
Figur 4 viser den kvalitative analyse af eGFP-udtrykket efter 24 timers transinfektion i JAWSII-cellelinjen. Igen, sammenlignet med den negative kontrol, eGFP reporter signal er significatively højere. Tabel 5 viser også den transfection effektivitet, der vises af OM-pBAE nanopartikler i JAWSII cellelinje. Igen kan effektivitetsværdierne sammenlignes med positiv kontrol udført med et klassisk transfection reagens.
Kapaciteten af pBAEs NPs lastet med OVA mRNA til at aktivere model immunceller er blevet vurderet transfecting JAWSII celle linje, en murine umodne dendritiske celle linje. For at bestemme aktiveringen af immuncellerne blev der anvendt to forskellige markører: CD11b og CD86. Først skal du vælge de rigtige fluorophorer til flowcytometerkonfigurationen. Her bruges PerCP-Cy5.5 (CD11b) og PE (CD86). Umodne og ikke-aktiverede cellelinjer skal vise en CD11b-/CD86-profil, mens aktiverede celler skal præsentere en CD11b+/CD86+-profil. Den blå laser ved 488 nm bruges til at bestemme målproteinudtrykket, og der blev anvendt et anti-OVA antistof plus et sekundært anti-mus-Alexa488 antistof. Tabel 6 viser det endelige panel, der anvendes i dette eksperiment. Figur 5 viser kapaciteten af OVA mRNA-loaded OM-pBAE nanopartikler til at aktivere DC'er, hvilket er tegn på aktivering af det cellulære immunrespons. Ikke-transfected celler viser et lavt antal celler, der udtrykker CD11b og CD86 membran markører, mens mRNA OVA OM-pBAEs behandlede celler viser et markant øget udtryk af CD11b og CD86 markører. Dette resultat tyder på, at OM-pBAE nanopartikler fremmer modning. Alt i alt bekræfter disse resultater om OM-pBAEs nanopartiklers evne til effektivt at transfect dendritiske celler og mægle aktiveringen af immunresponset, der fremmer modningen af umodne DCs.
Figur 1: Skematisk repræsentation af hele den syntetiske protokol. I dette tal er mRNA-vaccinesyntesetrinnene detaljerede, herunder de kritiske karakteriseringsparametre. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Syntese af C6-pBAE oligopeptid end-modified (OM-pBAE). (A) Rå kemikalier til at udføre Michael tilsætning. (B) pBAE + oligopeptid. (C) OM-pBAE. R kan være Histidin (H) eller Lysin (K). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: TEM-billeder af friske GFP mRNA, der indkapsler OM-pBAE nanopartikler. Polyplexer var negativt plettet til elektronisk mikroskopi karakterisering. Monodisperse partikler på ca 60 nm diameter er vist. (A) og( B) billeder repræsenterer to forskellige mikroskopier af samme prøve. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Fluorescensmikroskopibilleddannelse af JAWSII-transfected celler med OM-pBAE/eGFP mRNA nanopartikler. (A) Lyst feltbillede. (B) GFP fluorescens (i grønt). (C) Sammensat af de to foregående billeder. Skalalinjer = 100 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Aktivering af JAWSII efter transfekt med OM-pBAE/OVA mRNA nanopartikler. CN-værdier (Negative Control) svarer til den sorte etiket. Transfected celler svarer til den grå etiket. Søjler svarer til standardafvigelsen (SD) for tre gentagelser. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Materiale | Materiale | Mikrovesicles |
| Brydningsindeks | 1.4 | |
| Absorption | 0.01 | |
| Dispersant | Dispersant | Vand |
| Temperatur (°C) | 25 | |
| Viskositet (cP) | 0.8872 | |
| Brydningsindeks | 1.33 | |
| Temperatur | Temperatur (°C) | 25 |
| Ekvilibreringstid (r) | 10 | |
| Celle | Celletype | ZEN0040 |
Tabel 1: Parametre til oprettelse af en SOP til størrelsesmålinger.
| Materiale | Materiale | Mikrovesicles |
| Brydningsindeks | 1.4 | |
| Absortion | 0.01 | |
| Dispersant | Dispersant | Vand |
| Temperatur (°C) | 25 | |
| Viskositet (cP) | 0.8872 | |
| Brydningsindeks | 1.33 | |
| Temperatur | Temperatur (°C) | 25 |
| Ekvilibreringstid | 10 | |
| Celle | Celletype | DTS1070 |
Tabel 2: Parametre til oprettelse af en SOP til potentielle målinger af Zeta.
| GFP mRNA/OM-pBAE | T (oC) | Hydrodinamisk diameter (nm) | PDI | Overfladeladning (mV) | |
| NTA | DLS | ||||
| Frisk | 25 | 124 ± 32 | 134 ± 8 | 0,2 ± 0,04 | 32 ± 0,7 |
| Frysetørret | 25 | 135 ± 35 | 138 ± 2 | 0.17 ± 0.02 | 34 ± 0,7 |
Tabel 3: Fysisk-kemisk karakterisering af mRNA indkapsling om-pBAE nanopartikler. GFP mRNA indkapsling OM-pBAE polyplexes blev karakteriseret umiddelbart efter forberedelse - frisk- og efter lyophilization proces for at sikre stabiliteten af partiklerne. DLS- og NTA-dimensionering og overfladeladningsdata vises.
| EE% | |
| GFP mRNA/OM-pBAE | 82.3 ± 1.5 |
| OVA mRNA/OM-pBAE | 83.1 ± 1.5 |
Tabel 4: Indkapslingseffektivitet (EE%) data om mRNA, der indkapsler OM-pBAE nanopartikler. Indkapsling effektivitetsprocenter af GFP og OVA mRNA indkapsle OM-pBAE nanopartikler. RiboGreenfluorescens assay blev udført på lyophilized prøver til at vurdere mængden af mRNA fanget i polyplexes.
| Prøve | % GFP-positive celler | SD |
| Negativ kontrol | 1.85% | 0.21% |
| OM-pBAE/eGFP mRNA transfected celler | 57.79% | 5.28% |
Tabel 5: Om-pBAE/eGFP mRNA nanopartiklers omskæringseffektivitet i JAWSII-cellelinjen. Transfection effektivitet blev sporet af flow cytometri.
| Antistof | Celler farves | Fluorescerende etiket |
| CD11b | Aktiverede PC'er | PerCP-Cy 5,5 |
| CD86 | Aktiverede PC'er | PE |
| α-mus AlexaFluor488 | OVA positive celler | AlexaFluor 488 |
Tabel 6: Flowcytometripanel. Dette panel blev brugt til flowcytometriundersøgelser til bestemmelse af mRNA-vaccinens in vitro-funktionalitet.
Supplerende oplysninger: Se den supplerende fil med alle supplerende oplysninger inkluderet. Klik her for at downloade nedenstående filer.
Tabel S1A: Ribosomal RNA standard.
Tabel S1B: RNA:pBAE med heparin standard.
Tabel S1C: Heparin standard.
Figur S2: 1H-NMR protonspektre af C6-pBAE og OM-pBAE. (A) 1H-NMR fra C6-pBAE. Chloroform-d blev anvendt som opløsningsmiddel (δ = 7,25 ppm). (B) 1H-NMR fra C6CH3. D2O blev brugt som opløsningsmiddel (δ = 4,64 ppm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Efter udbruddet af Covid-19-pandemien sidste år har vaccinernes betydning i form af infektionssygdomsbekæmpelse manifesteret sig som en kritisk komponent8. Bestræbelser fra forskere verden over har gjort det muligt at frigive mange vacciner til markedet. For første gang i historien har mRNA-vacciner demonstreret deres tidligere hypotese succes takket være deres hurtige design på grund af deres evne til at tilpasse sig ethvert nyt antigen inden for nogle måneder5,6,21. mRNA, eller messenger ribonukleinsyre, refererer til de nukleinsyrer, der driver proteinsyntese fra kodede oplysninger i DNA'et. Herinde kodificerer mRNA til vaccinationsformål for et antigent protein, der tilhører den smitsomme mikroorganisme (eller et tumorantigen i tilfælde af terapeutisk tumorvaccination)8,22. I denne sammenhæng er det afgørende for det videnskabelige samfund at have klare protokoller for syntetisering af mRNA-vacciner.
Med denne idé i tankerne, en enkel procedure for syntetisering mRNA vacciner baseret på de proprietære polymere nanopartikler var rettet mod at blive beskrevet24. Som beskrevet i protokolafsnittet syntetiseres polymererne for det første ved hjælp af en totrinsprocedure baseret på en Michael-tilføjelse af primære aminer til at acrylatere grupper for at syntetisere polymerens rygrad, efterfulgt af tilsætning af terminale oligopeptider for at give den forbedrede kationiske karakter og evne til at flygte fra endoomer til de resulterende polymerer12,13,14 . Derefter fremstilles nanopartikler i et yderligere trin ved at blande polymererne med mRNA for at opnå deres elektrostatiske interaktion for at danne små nanometriske partikler.
Selv om syntesen af polymererne er en ligetil protokol, kan det samme ikke siges om nanopartikler formulering. Mange samarbejdspartnere over hele verden har brugt disse polymerer og har fundet fælles kritiske skridt, når der henvises til forberedelse og brug af partiklerne. Under hensyntagen til, at syntesen er ved manuel blanding, spiller brugerevner en afgørende rolle. Det vanskeligste trin er at blande polymeren og mRNA, som skal finde sted på en kontrolleret måde, da det skal gøres for blandingens videre nedbørstrin til vandet og buffertilsætningen. Enhver ændring på mekanikken i at blande de to komponenter vil resultere i mikropartikler (i stedet for nanopartikler), som ikke kan bruges til mennesker. Derfor er blanding et af de fejlfindingstrin, der kræver en vis øvelse, der skal opnås korrekt.
Et andet slående punkt er frysetørring. Som det er almindeligt kendt, repræsenterer det et af de flaskehalstrin af nanoformuleringer. I dette specifikke tilfælde tog det nogle år at justere alle parametre og beskrive en protokol, der lykkedes15. Selv at have det justeret, et andet kritisk skridt i protokollen er redispersion af formuleringer, som, hvis ikke udføres korrekt, bringe nanopartikler 'sammenlægning, og de mister deres funktionalitet. I dette tilfælde er det et must hurtigt at placere formuleringerne i et tørt, lidt koldt miljø for at undgå deres ukontrollerede rehydrering. På grund af deres høje hygroskopiske natur skal der lægges særlig vægt på at rehydrere dem på en kontrolleret måde ved omhyggeligt at pipetter op og ned alt det klæbrige pulver dannet af lyophilization. Hvis prøverne rehydrerer på en ikke-kontrolleret måde, vil de straks samle danner en translucid til uigennemsigtig spredning.
Selvom de kritiske trin er nævnt her, er protokollen til syntetisering af pBAE polyplexes let og hurtig, hvilket er fordelagtigt blandt andre syntesemetoder i genleveringssystemerne. Her er den specifikke anvendelse af mRNA-vaccination blevet givet i detaljer. Det repræsenterer dog en alsidig metode, der også kan anvendes til at indkapsle andre typer nukleinsyrer og ikke-vaccinebrug, såsom i onkologi og kardiovaskulære områder, som tidligere er offentliggjort13,23,24.
Afslutningsvis vil denne protokol gøre det muligt for disse proprietære polymerer at være tilgængelige for det videnskabelige samfund til at designe nye mRNA-vacciner og samtidig undgå al denne fejlfinding. Disse polymerer er fordelagtige i forhold til andre mRNA lipid formuleringer vedrørende muligheden for frysetørring, langsigtet stabilitet, og fald i opbevarings-og distributionsomkostninger ved ikke at kræve ultra-kolde temperaturer. Det forventes derfor, at OM-pBAE-vacciner spiller en afgørende rolle på vaccinationsområdet til profylaktiske og terapeutiske anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har intet at afsløre eller nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Finansiel støtte fra MINECO/FEDER (tilskud SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22 og COV20/01100) anerkendes. CGF anerkendte hendes IQS Ph.d.-stipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-butanediol diacrylate | Sigma Aldrich | 123048 | |
| 1-hexylamine | Sigma Aldrich | 219703 | |
| 5-amino-1-pentanol | Sigma Aldrich | 411744 | |
| Acetone | Panreac | 141007 | |
| CD11b antibody | BD | 550993 | |
| CD86 antibody | Bioligend | 105007 | |
| Chlor hydroxhyde | Panreac | 181023 | |
| Chloroform-d | Sigma Aldrich | 151823 | |
| Cys-His-His-His peptide | Ontores | Custom | |
| Cys-Lys-Lys-Lys peptide | Ontores | Custom | |
| D2O | Sigma Aldrich | 151882 | |
| DEPC reagent for Rnase free water | Sigma Aldrich | D5758 | This reagent is important to treat MilliQ water to remove any RNases of the buffers |
| Diethyl eter | Panreac | 212770 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| mRNA EGFP | TriLink Technologies | L-7601 | |
| mRNA OVA | TriLink Technologies | L-7610 | |
| RiboGreen kit | ThermoFisher | R11490 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | 71196 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 11570626 | |
| α-mouse AlexaFluor488 antibody | Abcam | Ab450105 | |
| Equipment | |||
| Nanoparticle Tracking Analyzer | Malvern Panalytical | NanoSight NS300 | |
| Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer | Varian | 400 MHz | |
| ZetaSizer | Malvern Panalytical | Nano ZS | For zeta potential and hydrodynamic size determination |
| Software | |||
| NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | MAN0515-02-EN-00 | |
| NovoExpress Software | Agilent | Not specified | |
| ZetaSizer software | Malvern Panalytical | DTS Application | To analyze surface charge and hydrodynamic sizes |
References
- Chumakov, K., Benn, C. S., Aaby, P., Kottilil, S., Gallo, R. Can existing live vaccines prevent COVID-19. Science. 368 (6496), 1187-1188 (2020).
- Zhang, C., Maruggi, G., Shan, H., Li, J. Advances in mRNA vaccines for infectious diseases. Frontiers in Immunology. 10, 1-13 (2019).
- Wherry, E. J., Jaffee, E. M., Warren, N., D'Souza, G., Ribas, A. How did we get a COVID-19 vaccine in less than 1 year. Clinical Cancer Research. 27 (8), 2136-2138 (2021).
- Folegatti, P. M., et al. Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial. The Lancet. 396 (10249), 467-478 (2020).
- Geall, A. J., Mandl, C. W., Ulmer, J. B. RNA: The new revolution in nucleic acid vaccines. Seminars in Immunology. 25 (2), 152-159 (2013).
- Ulmer, J. B., Geall, A. J.
- Kranz, L. M., et al. Systemic RNA delivery to dendritic cells exploits antiviral defence for cancer immunotherapy. Nature. 534 (7607), 396-401 (2016).
- Milane, L., Amiji, M. Clinical approval of nanotechnology-based SARS-CoV-2 mRNA vaccines: impact on translational nanomedicine. Drug Delivery and Translational Research. 1 (4), 3 (2020).
- Green, J. J., Langer, R., Anderson, D. G. A combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery. Accounts of Chemical Research. 41 (6), 749-759 (2008).
- Guerrero-Cázares, H., et al. Biodegradable polymeric nanoparticles show high efficacy and specificity at DNA delivery to human glioblastoma in vitro and in vivo. ACS Nano. 8 (5), 5141-5153 (2014).
- Kozielski, K. L., Tzeng, S. Y., Hurtado De Mendoza, B. A., Green, J. J. Bioreducible cationic polymer-based nanoparticles for efficient and environmentally triggered cytoplasmic siRNA delivery to primary human brain cancer cells. ACS Nano. 8 (4), 3232-3241 (2014).
- Segovia, N., Dosta, P., Cascante, A., Ramos, V., Borrós, S. Oligopeptide-terminated poly(β-amino ester)s for highly efficient gene delivery and intracellular localization. Acta Biomaterialia. 10 (5), 2147-2158 (2014).
- Dosta, P., Segovia, N., Cascante, A., Ramos, V., Borrós, S. Surface charge tunability as a powerful strategy to control electrostatic interaction for high efficiency silencing, using tailored oligopeptide- modified poly (beta-amino ester)s (PBAEs). Acta Biomaterialia. 20, 82-93 (2015).
- Fornaguera, C., et al. mRNA delivery system for targeting antigen-presenting cells in vivo. Advanced Healthcare Materials. 7 (17), 180033 (2018).
- Fornaguera, C., Castells-Sala, C., Lázaro, M. Á, Cascante, A., Borrós, S. Development of an optimized freeze-drying protocol for OM-PBAE nucleic acid polyplexes. International Journal Pharmaceutics. 569, (2019).
- Fornaguera, C., Solans, C. Analytical methods to characterize and purify polymeric nanoparticles. International Journal of Polymer Science. , (2018).
- Fornaguera, C., Solans, C. Characterization of polymeric nanoparticle dispersions for biomedical applications: size, surface charge and stability. Pharmaceutical Nanotechnology. 6 (3), 147-164 (2018).
- Sahin, U., Karikó, K., Türeci, Ö MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
- Fan, Y. N., et al. Cationic lipid-assisted nanoparticles for delivery of mRNA cancer vaccine. Biomaterials Science. 6 (11), 3009-3018 (2018).
- Le Moignic, A., et al. Preclinical evaluation of mRNA trimannosylated lipopolyplexes as therapeutic cancer vaccines targeting dendritic cells. Journal of Controlled Release. 278, 110-121 (2018).
- Banerji, A., et al. mRNA vaccines to prevent COVID-19 disease and reported allergic reactions: Current evidence and approach. Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 9 (4), 1423-1437 (2021).
- Kaczmarek, J. C., Kowalski, P. S., Anderson, D. G. Advances in the delivery of RNA therapeutics: from concept to clinical reality. Genome Medicine. 9 (1), 1-16 (2017).
- Dosta, P., et al. Delivery of anti-microRNA-712 to inflamed endothelial cells using poly(β-amino ester) nanoparticles conjugated with VCAM-1 targeting peptide. Advanced Healthcare Materials. , 1-11 (2021).
- Segovia, N., et al. Hydrogel doped with nanoparticles for local sustained release of siRNA in breast cancer. Advanced Healthcare Materials. 4 (2), 271-280 (2015).
