Bioengineering

टीकाकरण प्रयोजनों के लिए एमआरएनए-लोडेड पॉली (बीटा अमीनोस्टर्स) नैनोकणों का संश्लेषण और लक्षण वर्णन

Published: August 13, 2021 doi: 10.3791/62889

Cristina Fornaguera¹, Marta Díaz-Caballero¹, Coral García-Fernandez¹, Laura Olmo¹, María Stampa-López Pinto¹, María Navalón-López¹, Marta Guerra-Rebollo¹, Salvador Borrós¹

¹Grup d’Enginyeria de Materials (Gemat), Institut Químic de Sarrià (IQS), Universitat Ramon Llull (URL)

Summary

यहां, पॉली (बीटा अमीनोस्टर) पॉलिमर के आधार पर एमआरएनए नैनोकणों के उत्पादन के लिए एक सरल प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है, जो एनकैप्सुलेटेड mRNA को बदलकर तैयार किया जाना आसान है। पॉलिमर, नैनोकणों और उनके इन विट्रो आवश्यक लक्षण वर्णन को संश्लेषित करने के लिए कार्यप्रवाह का भी वर्णन किया गया है। प्रतिरक्षण के संबंध में एक प्रमाण-अवधारणा भी जोड़ी गई है।

Abstract

टीकाकरण आधुनिक समाज की प्रमुख सफलताओं में से एक रहा है और रोग को नियंत्रित करने और रोकने में अपरिहार्य है । पारंपरिक टीके संक्रामक एजेंट के पूरे या अंशों से बने थे। हालांकि, चुनौतियां बनी हुई हैं, और नई वैक्सीन प्रौद्योगिकियां अनिवार्य हैं । इस संदर्भ में, प्रतिरक्षण प्रयोजनों के लिए एमआरएनए के उपयोग ने एक बढ़ाया प्रदर्शन दिखाया है, जैसा कि सार्स-सीओवी-2 संक्रमण को रोकने वाले दो एमआरएनए टीकों के त्वरित अनुमोदन से प्रदर्शित किया गया है । वायरल संक्रमण को रोकने में सफलता से परे, mRNA टीके भी चिकित्सकीय कैंसर अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

फिर भी, एमआरएनए की अस्थिरता और नाभिक की उपस्थिति के कारण शरीर से इसकी तेजी से निकासी इसकी नग्न डिलीवरी संभव नहीं बनाती है। इस संदर्भ में, नैनोमेडिसिन, और विशेष रूप से पॉलीमेरिक नैनोकण, महत्वपूर्ण एमआरएनए डिलीवरी सिस्टम हैं। इस प्रकार, इस लेख का उद्देश्य मालिकाना बहुलक नैनोकणों के आधार पर एक एमआरएनए वैक्सीन उम्मीदवार के निर्माण और परीक्षण के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करना है। पॉली (बीटा अमीनोएस्टर्स) पॉलिमर के संश्लेषण और रासायनिक लक्षण वर्णन, नैनोकण बनाने के लिए एमआरएनए के साथ उनकी जटिलता और उनकी लाइफिलाइजेशन पद्धति पर यहां चर्चा की जाएगी। यह भंडारण और वितरण लागत को कम करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है । अंत में, इन विट्रो ट्रांसफेक्ट और परिपक्व मॉडल डेंड्रिटिक कोशिकाओं के लिए अपनी क्षमता प्रदर्शित करने के लिए आवश्यक परीक्षणों का संकेत दिया जाएगा । इस प्रोटोकॉल से टीकाकरण पर काम कर रहे वैज्ञानिक समुदाय को इसकी उच्च बहुमुखी प्रतिभा का लाभ मिलेगा जो इन टीकों को विभिन्न प्रकार की बीमारियों को रोकने या ठीक करने में सक्षम बनाता है ।

Introduction

संक्रामक रोगों दुनिया भर के मनुष्यों के लाखों लोगों के लिए एक गंभीर खतरे का प्रतिनिधित्व किया है और अभी भी कुछ विकासशील देशों में मौत के प्रमुख कारणों में से एक हैं । रोगनिरोधी टीकाकरण संक्रामक रोगों को रोकने और नियंत्रित करने के लिए आधुनिक समाज के सबसे प्रभावी हस्तक्षेपों में से एक रहा है¹,²^. 20^वींशताब्दी की प्रासंगिकता में विज्ञान के ये महत्वपूर्ण मील के पत्थर हाल ही में दुनिया भर में कोविड-19 महामारी सार्स-सीओवी-2 वायरस 3 के कारण^हुएहैं। रोग के प्रसार में कटौती करने के लिए कुशल टीके होने के महत्व को समझते हुए, सभी जैव चिकित्सा समुदायों के सहकारी प्रयासों के परिणामस्वरूप एक वर्ष से भी कम समय में बाजार में कई रोगनिरोधी टीके^ोंका परिणाम हुआ है ।

परंपरागत रूप से, टीके तनु (रहते हैं, कम उग्रता) या निष्क्रिय (मौत के कणों) वायरस से बना थे । हालांकि, सुरक्षा त्रुटियों के लिए कोई मार्जिन के साथ कुछ रोगों के लिए, वायरल कणों संभव नहीं हैं, और प्रोटीन उपइकाइक्स के बजाय उपयोग किया जाता है । फिर भी, उपइकाइट्स आमतौर पर एक से अधिक एपिटोप/एंटीजन के संयोजन को सक्षम नहीं करते हैं, और टीकाकरण शक्ति^5,⁶को बढ़ाने के लिए एडजुवेंट्स की आवश्यकता होती है। इसलिए, उपन्यास वैक्सीन प्रकारों की आवश्यकता स्पष्ट है।

जैसा कि वर्तमान महामारी के दौरान प्रदर्शित किया गया है, न्यूक्लिक एसिड पर आधारित उपन्यास वैक्सीन उम्मीदवार लंबी विकास प्रक्रियाओं से बचने और उत्पादन करते समय उच्च बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करने के मामले में लाभप्रद हो सकते हैं, एक ही समय में, एक महत्वपूर्ण रोगी प्रतिरक्षण। यह एमआरएनए टीकों का मामला है, जिन्हें शुरू में प्रायोगिक कैंसर के टीके के रूप में डिजाइन किया गया था । एंटीजन-विशिष्ट टी-सेल प्रतिक्रियाओं का उत्पादन करने की उनकी प्राकृतिक क्षमता के लिए धन्यवाद^3,^5,^6,^7। एमआरएनए होने के कारण अणु जो एंटीजेनिक प्रोटीन को एन्कोड करता है, केवल उसी को बदलता है, टीका को एक ही सूक्ष्मजीव के अन्य रूपों, विभिन्न उपभेदों, अन्य संक्रामक सूक्ष्मजीवों को प्रतिरक्षित करने के लिए तेजी से सिलवाया जा सकता है, या यहां तक कि कैंसर इम्यूनोथेरपी उपचार भी बन सकता है। इसके अलावा, वे बड़े पैमाने पर उत्पादन लागत के मामले में लाभप्रद हैं । हालांकि, एमआरएनए में एक महत्वपूर्ण बाधा है जो उनके नग्न प्रशासन को बाधित करती है: इसकी स्थिरता और अखंडता शारीरिक मीडिया में समझौता किया जाता है, जो नाभिक से भरा होता है। इस कारण से, एक नैनोमेट्रिक वाहक का उपयोग जो इसकी रक्षा करता है और एंटीजन-पेश करने वाली कोशिकाओं को एमआरएनए को वेक्टराइज करता^है,^2,⁸आवश्यक है।

इस संदर्भ में, पॉली (बीटा अमीनोएस्टर) (पीबीई) जैव संगत और बायोडिग्रेडेबल पॉलिमर का एक वर्ग है जिसने नैनोमेट्रिक कणों में जटिल एमआरएनए की उल्लेखनीय क्षमता का प्रदर्शन किया, उनके cationic शुल्क^9,^10,¹¹के लिए धन्यवाद। ये पॉलिमर एस्टर बांड से बने होते हैं, जो शारीरिक परिस्थितियों में एस्टरस द्वारा उनके क्षरण को आसान बनाता है। पीबीएई पुस्तकालय उम्मीदवारों में, अंत cationic ओलिइगोपेप्टाइड्स के साथ कार्यात्मक लोगों ने एंडोसाइटोसिस के माध्यम से कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक प्रवेश करने और एनकैप्सुलेटेड जीन सामग्री को स्थानांतरित करने के लिए छोटे नैनोकणों को बनाने की उच्च क्षमता दिखाई। इसके अलावा, उनकी बफरिंग क्षमता के लिए धन्यवाद, एंडोसोम डिब्बे का अम्लीकरण एंडोसोमल^{एस्केप 12,}¹³की अनुमति देता है। अर्थात्, एक विशिष्ट प्रकार का पीबीएई, उनकी रीढ़ की हड्डी पर हाइड्रोफोबिक मोइटीज सहित (तथाकथित C6 pBAE) उनकी स्थिरता और अंत-ओलिगोपेप्टाइड संयोजन (60% बहुलक को त्रि-lysine और 40% के साथ संशोधित करने के लिए एक त्रिकोणीय हिस्टिडीन के साथ बहुलक) जो चुनिंदा रूप से पेरेंटल प्रशासन के बाद एंटीजन-पेश कोशिकाओं को स्थानांतरित करता है और चूहों प्रतिरक्षण के बाद एमआरएनए इनकोडेड एंटीजन प्रस्तुति का उत्पादन करता है, हाल ही में¹⁴ प्रकाशित किया गया है . इसके अलावा, यह भी प्रदर्शित किया गया है कि ये योग नैनोमेडिसिन फॉर्मूलेशन के मुख्य अड़चन चरणों में से एक को दरकिनार कर सकते हैं: उनकी कार्यक्षमता को खोने के बिना उन्हें फ्रीज-ड्राई करने की संभावना है, जो नरम शुष्क वातावरण^{15 में दीर्घकालिक स्थिरता}को सक्षम बनाता है।

इस संदर्भ में, वर्तमान प्रोटोकॉल का उद्देश्य प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदमों का विवरण देकर और संक्रामक रोगों की रोकथाम और ट्यूमर उपचार अनुप्रयोगों के लिए कुशल टीकों के उत्पादन को सक्षम करके वैज्ञानिक समुदाय को एमआरएनए नैनोकणों के गठन की प्रक्रिया बनाना है ।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल ओलिगोपेप्टाइड एंड-संशोधित पॉली (बीटा अमीनोएस्टर) को संश्लेषित करने के लिए पूरी कसरत का वर्णन करता है - ओम-पीबीए पॉलीमर जिसका उपयोग नैनोपार्टिकल संश्लेषण के लिए आगे किया जाएगा। प्रोटोकॉल में नैनोपार्टिकल्स फॉर्मूलेशन को भी शामिल किया गया है। इसके अलावा, प्रक्रिया की सफलता के लिए महत्वपूर्ण कदम और प्रतिनिधि परिणाम भी यह सुनिश्चित करने के लिए प्रदान किए जाते हैं कि परिणामस्वरूप योगों एक सकारात्मक या नकारात्मक परिणाम को परिभाषित करने के लिए आवश्यक गुणवत्ता नियंत्रण लक्षण वर्णन सुविधाओं को पूरा करते हैं । इस प्रोटोकॉल को चित्र 1में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है ।

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Protocol

1. अंत ओलिगोपेप्टाइड्स (ओम-पीबीएई) के साथ पीबीएई बहुलक का संश्लेषण

C6-pBAE का बहुलककरण
1. 5-अमीनो-1-पेंटानोल (38 mmol; जोड़ें; मेगावाट = 103.16 डीए) 1-हेक्सिलमाइन (38 mmol; मेगावाट = 101.19 डीए) एक गोल-नीचे ग्लास फ्लास्क (100 एमएल) में। फिर, 1,4-ब्यूटेनियोल डायक्रिलेट (82 mmol; मेगावाट = 198.22 डीए) ।
2. सिलिकॉन तेल स्नान को 90 डिग्री सेल्सियस पर प्री-हीट करें, गोल-नीचे फ्लास्क को तेल स्नान में रखें और मिश्रण को रात भर (~ 18 एच) की सहायता से हिलाएं। फिर, गोल-नीचे फ्लास्क से उत्पाद लें और इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीजर में रखें।
  नोट: उत्पाद एक चिपचिपा पाउडर के रूप में है और एक स्पैटुला की मदद से फ्लास्क से बाहर निकाला जाता है। ¹एच-एनएमआर के माध्यम से प्राप्त बहुलक की संरचना को मान्य करना आवश्यक है। एनएमआर स्पेक्ट्रा को क्लोरोफॉर्म-डी और डी₂ओ को सॉल्वैंट्स के रूप में उपयोग करके 400 मेगाहर्ट्ज इंस्ट्रूमेंट (सामग्री की टेबलदेखें) में दर्ज किया गया था। प्रत्येक पॉली (β-अमीनो एस्टर) के लगभग 10 मिलीग्राम को लिया गया था और ड्यूटेरेटेड सॉल्वेंट के 1 एमएल में भंग कर दिया गया था।
ओम-पीबीई प्राप्त करने के लिए पेप्टाइड्स के साथ प्रतिक्रिया
1. चयनित पेप्टाइड्स में 0.1 एम एचसीएल के 25 एमएल जोड़ें, उदाहरण के लिए, पेप्टाइड सीवाई-उसकी-उसकी-ट्रिफ्लोरोएकेटिक एसिड (टीएफए, 200 मिलीग्राम) के साथ, पहले तौला 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में जो स्पष्ट समाधान प्राप्त करने के लिए रात भर फ्रीज-सुखाने और मैन्युअल रूप से हलचल कर सकता है।
2. समाधान को 1 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें और परिणामी पेप्टाइड हाइड्रोक्लोराइड को फ्रीज-सुखा लें।
  नोट: देखें कि अंतिम वजन सैद्धांतिक मूल्य से मेल खाता है या नहीं।
3. डाइमेथिल सल्फोक्साइड में C6-pBAE (0.031 mmol) का समाधान करें। इसके अलावा, डिमेथिल सल्फोक्साइड में पेप्टाइड हाइड्रोक्लोराइड (0.078 mmol) का समाधान करें।
4. एक स्क्रू कैप ट्यूब और स्क्रू में दो समाधानों को कैप पर मिलाएं। एक चुंबकीय हलचल बार के साथ 20 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस के नियंत्रित तापमान के साथ एक पानी के स्नान में मिश्रण समाधान हिलाओ ।
5. मिश्रण को 7:3 (v/v) डायथिल ईथर/एसीटोन में जोड़ें । सॉल्वेंट को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 25,000 एक्स ग्राम पर परिणामी निलंबन को सेंट्रलाइज करें। इसके बाद, ठोस को 7:3 (v/v) डाईथाइल ईथर/एसीटोन के साथ दो बार धोएं । फिर, एक वैक्यूम (<0.2 एटीएम) के नीचे उत्पाद को सुखा दें।
6. डिमेथाइल सल्फॉक्साइड में प्रोडक्ट के 100 मिलीग्राम/एमएल का घोल बनाएं। परिणामस्वरूप उत्पाद C6-पेप्टाइड-pBAE नाम दिया गया है। टर्मिनल एक्रिलेट्स से जुड़े ओलेफिन संकेतों के गायब होने की पुष्टि करने के लिए ¹एच-एनएमआर के माध्यम से प्राप्त बहुलक की संरचना को मान्य करना आवश्यक है। यदि उपयोग नहीं किया जाता है, तो बहुलक को -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज किया जा सकता है।

2. पॉलीप्लेक्स गठन

नोट: सभी प्रक्रियाओं को एक वातानुकूलित कमरे के अंदर किया जाना चाहिए ताकि निरंतर तापमान बनाए रखा जा सके।

पॉलिमर C6-पेप्टाइड-पीबीएई को पिघलाएं और समाधान भंवर करें।
पिपेट पॉलीमर मिश्रण ऊपर और नीचे और सोडियम एसीटेट (NaAc) में_12.5mm (V 1) का समाधान तैयार करते हैं। इसके बाद इस मिश्रण को भंवर से निकालकर 10 मिनट तक इंतजार करें।
एमआरएनए को 0.5 मिलीग्राम/एमएल पर तैयार करें और पिपटिंग (वी_{2) द्वारा मिलाएं।}
नोट: यह mRNA भंवर से बचने के लिए महत्वपूर्ण है ।
भंवर अंतिम एकाग्रता पर बहुलक मिश्रण DMSO में बहुलक स्टॉक और एसीटेट बफर के बीच एक सजातीय समाधान प्राप्त करने के लिए।
नोट: अंतिम बहुलक एकाग्रता एन/पी (नाइट्रोजन से फॉस्फेट समूहों) अनुपात का चयन पर निर्भर करता है । एन/पी अनुपात उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक विशिष्ट एमआरएनए पर निर्भर करता है । उदाहरण के लिए, ईजीएफपी एनकैप्सुलेशन के लिए, 25:1 अनुपात का उपयोग किया गया था, जैसा कि पहले¹⁴बताया गया था।
1:1 (V_i = V₁ + V 2) के अनुपात में आनुवंशिक सामग्री समाधान और C6-पेप्टिडेपबा समाधान (एमआरएनए एकाग्रता के_25x)मिलाएं।
नोट: C6-पेप्टाइड-पीबीएई को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में लोड किया जाता है जहां एमआरएनए को मिश्रण के लिए ऊपर और नीचे पाइपिंग करके जोड़ा जाता है। एक बार तैयार होने के बाद, पॉलीप्लेक्स, न्यूक्लिक एसिड, और C6-पेप्टाइड-पीबीएई सांद्रता आधा पतला हो जाती है।
थर्मोब्लॉक में 30 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। पानी के साथ एक पूर्व-लोडेड माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में नमूना जोड़कर 1:2 RNase मुफ्त पानी के साथ वर्षा करें।
एक्सपिएंट्स को शामिल करें। एचईपीई 20 एमएमएम में एमआरएनए और पीबीएई (वी_आई)के मिश्रण के समान मात्रा जोड़ें और ऊपर और नीचे पाइपिंग करके सुक्रोज 4% जोड़ें। इस बिंदु पर, नमूना 3x पतला किया गया है।

3. पॉलीप्लेक्स लियोफिलाइजेशन

तुरंत, 1 घंटे के लिए पिछले पॉलीप्लेक्स समाधान के -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर पर फ्रीज करें।
चरणों का पालन करके प्राथमिक सुखाने का प्रदर्शन करें: (1) 1 घंटे -60 डिग्री सेल्सियस और 0.001 एचपीए पर; (2) -40 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे और 0.0001 एचपीए; (3) -20 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे और 0.0001 एचपीए; (4) 12 घंटे 5 डिग्री सेल्सियस और 0.0001 एचपीए पर।
उपयोग होने तक रिहाइड्रेशन से बचने के लिए तुरंत -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. पॉलीप्लेक्स रिसोपन

नोट: यह प्रोटोकॉल lyophilized C6-पेप्टाइड-पीबीए नैनोकणों को उनके आगे के उपयोग के लिए या तो लक्षण वर्णन, इन विट्रो, या वीवो विश्लेषण में पुनर्निर्माण के लिए उपयोग की जाने वाली प्रक्रिया का वर्णन करता है।

उपयोग के समय -20 डिग्री सेल्सियस से लियोफिलाइज्ड नैनोकणों को लें और वांछित एकाग्रता प्राप्त करने के लिए ठोस को फिर से तैयार करने के लिए डेपेरोजेनेटेड (डीईपीसी) पानी की संबंधित मात्रा को तेजी से जोड़ें।
नोट: मात्रा नैनोकणों की प्रारंभिक मात्रा के रूप में एक ही होगा अगर एक ही एकाग्रता की परिकल्पना की है, लेकिन यह प्रत्येक प्रयोग के लिए संकेत दिया जाएगा ।
पिपेट के साथ तरल के साथ, कुल पुन: निलंबन तक धीरे-धीरे पिपेट।
नोट: विश्वास दिलाता हूं कि कोई सामग्री शीशी की दीवार पर रहता है ।
एक बार भंग होने के बाद, बुलबुले से बचने के लिए, तेजी से ऊपर और नीचे पिपेट करें।
नोट: नमूना पारदर्शी पहलू है, जो उच्च सांद्रता पर अधिक स्पष्ट है करने के लिए एक पारदर्शी होना चाहिए
एक बार पुनर्गठन के बाद 24 घंटे की अधिकतम अवधि के लिए बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को स्टोर करें। ठंड से बचें।

5. पॉलीप्लेक्स लक्षण वर्णन

गतिशील प्रकाश बिखरने
नोट: हाइड्रोडायनामिक व्यास (एनएम), पॉलीडिस्पिटी इंडेक्स (पीडीआई), और नैनोकणों के सतह प्रभारी को 25 डिग्री सेल्सियस, 633 एनएम लेजर तरंगदैर्ध्य और 173 डिग्री सिग्नल डिटेक्टर पर मापा गया था, एक जेटा संभावित विश्लेषक का उपयोग करके (सामग्री की तालिकादेखें)।
1. हाइड्रोडायनामिक व्यास (एनएम)
  1. 0.25 मिलीग्राम /एमएल के एमआरएनए की अंतिम एकाग्रता के लिए पॉलीमर अंश के लिए जीन सामग्री को पाइपिंग करके एमआरएनए और पीबीएई को अच्छी तरह से मिलाने वाले नैनोकणों को तैयार करें जैसा कि पहले ऊपर वर्णित (चरण 2)।
  2. अशुद्धियों से पूरी तरह से साफ करने के लिए फ़िल्टर किए गए कमजोर पड़ने वाले मीडिया के साथ एक माइक्रोक्यूवेट को प्री-कुल्ला करें। फिर, क्यूवेट को कम से कम 50 माइक्रोन के साथ नमूना समाधान भरें और इसे कैप करें। इसके बाद, डीएलएस उपकरण के अंदर नमूना पेश करें, सुनिश्चित करें कि सेल सही ढंग से डाला गया है।
    नोट: कमजोर पड़ने मीडिया एक 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर फ़िल्टर किया जाता है।
  3. मानक ऑपरेशन प्रक्रिया (एसओपी) फ़ाइल को खोलें और वांछित नमूना नाम पेश करें। आकार मापका चयन करें ।
    नोट: आकार मापन के लिए एसओपी बनाने के लिए सभी पैरामीटर तालिका 1में प्रदान किए गए हैं।
  4. प्ले पर क्लिक करके डीएलएस का उपयोग करके कण आकार माप चलाएं।
    नोट: ट्रिपल बीप लगता है के बाद, विश्लेषण पूरा हो गया है ।
  5. औसत कण आकार, औसत पीडीआई, मानक विचलन और ग्राफिक्स प्राप्त करने के लिए माप पत्रक पर नमूने के अनुरूप परिणामों का चयन करें। एक बार हो जाने के बाद, डीएलएस उपकरण से सेल निकाल दें।
  6. नमूना निकालें, इसे ज़ेटा-संभावित विश्लेषण के लिए रखें, और कोशिका को डिओनाइज्ड पानी से साफ और कुल्ला करें। अंत में, एक संकुचित वायु गैस धारा के तहत साफ क्यूवेट को सुखाएं।
2. सरफेस चार्ज (एमवी)
  1. 0.25 मिलीग्राम/एमएल के एमआरएनए की अंतिम एकाग्रता के लिए पॉलीमर अंश के लिए जीन सामग्री को पाइपिंग करके एमआरएनए और पीबीएई को अच्छी तरह से मिलाने वाले नैनोकणों को तैयार करें जैसा कि पहले ऊपर वर्णित (चरण 2, पॉलीप्लेक्स गठन)। इसके बाद, समाधान को फ्रीज और सुखा लें।
    नोट: इस मामले में, सतह चार्ज के माप के लिए, उचित बफर में नमूने को फिर से तैयार करने के उपायों को करने से पहले नमूने के फ्रीज-सुखाने की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है, पीएच और इलेक्ट्रोलाइट एकाग्रता की शरीर की स्थिति का अनुकरण किया जाता है।
  2. पानी का उपयोग करके ल्योफिलाइज्ड सैंपल को रीसुस्पेंड करें। पानी में नमूना 1/10 पतला (अंतिम एकाग्रता ०.०२५ मिलीग्राम/एमएल) ।
  3. अशुद्धियों से पूरी तरह से साफ करने के लिए फ़िल्टर किए गए कमजोर पड़ने वाले मीडिया के साथ एक डिस्पोजेबल फोल्डेड केशिका सेल (जीटा संभावित क्यूवेट) को प्री-कुल्ला करें। फिर, 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके, पतला नैनोकणों के साथ क्यूवेट भरें, और भराव के दोनों किनारों को कैप करें।
    नोट: नैनोपार्टिकल फैलाव को क्यूबेट (~ 1 एमएल) में उपलब्ध मात्रा को भरना पड़ता है, जो बुलबुले के गठन पर विशेष ध्यान देता है, जो उपायों को परेशान कर सकता है।
  4. डीएलएस के अंदर नमूना पेश करें; सुनिश्चित करें कि सेल सही ढंग से डाला गया है।
  5. जीटा संभावित विश्लेषण के लिए बनाई गई एसओपी फाइल खोलें और वांछित नमूना नाम पेश करें। जीटा-संभावित माप काचयन करें ।
    नोट: जीटा संभावित मापों के लिए एसओपी बनाने के पैरामीटर तालिका 2में दिए गए हैं।
  6. प्ले पर क्लिक करके डीएलएस का उपयोग करके जीटा-संभावित माप चलाएं।
    नोट: ट्रिपल बीप ध्वनि के बाद, विश्लेषण पूरा हो गया है।
  7. औसत जीटा-क्षमता, मानक विचलन और ग्राफिक्स प्राप्त करने के लिए माप पत्रक पर नमूने के अनुरूप परिणामों का चयन करें। एक बार हो जाने के बाद, डीएलएस उपकरण से सेल निकाल दें।
  8. सैंपल निकालकर जरूरी होने पर रख लें। इसके बाद, डीशनाइज्ड पानी के साथ क्यूवेट सेल को साफ और कुल्ला करें, इसके बाद इथेनॉल और पानी फिर से। अंत में, एक संकुचित वायु गैस धारा के तहत साफ क्यूवेट को सुखाएं।
    नोट: डेटा का विश्लेषण करने के लिए, अनुशंसित सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें।
नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए)
नोट: हाइड्रोडायनामिक व्यास (एनएम) और नैनोकणों की एकाग्रता को नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग एनालाइजर का उपयोग करके 25 डिग्री सेल्सियस, 488 एनएम लेजर तरंगदैर्ध्य पर मापा गया था (देखें सामग्री की तालिका).
1. एनटीए और नमूना तैयारी
  1. कंप्यूटर और उपकरण पर स्विच करें। सबसे पहले, जांचें कि क्या सभी घटकों को सही ढंग से प्लग किया गया है। इसके बाद, अनुशंसित सॉफ्टवेयर खोलें। सॉफ्टवेयर यह जांच करेगा कि सभी एक्सेसरीज सही तरीके से कनेक्ट हैं या नहीं।
  2. शीर्ष प्लेट कनेक्ट, यहां, ओ-रिंग सेल, लेजर मॉड्यूल में।
    नोट: इस हिस्से को ओवरक्रू न करें।
  3. सबसे पहले 1 एमएल सिरिंज के साथ बफर और/या डिवोनाइज्ड पानी के साथ चैंबर लोड करें । प्रक्रिया को कम से कम दो बार दोहराएं। कक्ष में बुलबुले शुरू करने से बचें।
  4. डीएलएस आकार माप में उपयोग की जाने वाली एकाग्रता से डिवोनाइज्ड पानी में 1/1000 को कमजोर करके नमूना तैयार करें। कम से कम 1 एमएल तैयार करें और बुलबुले पेश करने से बचते हुए इसे 1 एमएल सिरिंज में लोड करें।
  5. सिरिंज का उपयोग करके नमूनों को कक्ष में लोड करें। फिर, एनटीए बड़े कक्ष में लेजर मॉड्यूल प्लग।
    नोट: बड़ा चैंबर उस स्थान को दर्शाता है जहां कक्ष को माप के लिए रखा गया है।
2. छवि अनुकूलन
  1. सबसे पहले, हार्डवेयरमें, जांच करें कि कैमरा और उचित लेजर का चयन किया जाता है या नहीं।
    नोट: यहां, केवल एक कैमरा और ब्लू लेजर 488 एनएम है।
  2. 0 पर कैमरा स्तर के साथ शुरू करें और कैप्चर विंडो पर स्टार्ट कैमरा दबाएं।
    नोट: इस बिंदु पर, निम्नलिखित मापदंडों को समायोजित करें। बीम स्थिति (इसे स्क्रीन पर ऊपर और नीचे ले जाया जा सकता है)। कैमरा लेवल:ओवरसैचुरेटेड पिक्सल से बचें। फोकस (पार्श्व पहिया):जितना संभव हो उतना बेहतर ध्यान केंद्रित करने की कोशिश करें। बेहतर होगा कि अनफोकस्ड कणों की जगह प्रभामंडल वाले कण हों। एकाग्रता: प्रति क्षेत्र 10 से 100 कणों के बीच एकाग्रता को समायोजित करें।
3. वीडियो रिकॉर्डिंग
  1. सॉफ्टवेयर में, माप चयनपर जाएं - एसओपी विंडो (नीचे बाएं) और मानक मापका चयन करें।
    नोट: प्रत्येक 30 एस के तीन उपाय करने के लिए कार्यक्रम (सॉफ्टवेयर मतलब और मानक विचलन गणना करने के लिए सक्षम करने के लिए)। नमूने के रिकॉर्ड को सहेजने के लिए एक नाम और एक फ़ोल्डर पथ (आधार फाइलनेम पर) प्रदान करें। जब एसओपी पैरामीटर सही ढंग से स्थापित किए जाते हैं, तो क्रिएट एंड रन स्क्रिप्ट दबाएं। एक बार पहली दोहराने मापा जाता है, कार्यक्रम के लिए एक नया नमूना जोड़ने के लिए पूछना होगा । फिर, सिरिंज के प्लंजर को धक्का देकर नमूने का एक और अंश कक्ष में पेश किया जाना चाहिए। अंत में, तीसरी बार तीसरी बार दोहराएं तीसरी दोहराने का विश्लेषण करें।
4. वीडियो प्रोसेसिंग
  1. मापा कणों का विश्लेषण करने के लिए तीन उपायों को समाप्त करने के बाद स्क्रीन गेन और डिटेक्शन थ्रेसहोल्ड को फिर से समायोजित करें। इस समय, विश्लेषण करने के लिए प्रत्येक फ्रेम में लगभग 100 कण दिखाई देने चाहिए (उच्च लाल क्रॉस और कम नीले क्रॉस की उम्मीद है)।
  2. विश्लेषण पूरा होने के बाद परिणामों को पीडीएफ फाइल में निर्यात करें। इसके अलावा, वीडियो और एक्सेल फाइलों के रूप में निर्यात करना संभव है।
5. एनटीए की सफाई
  नोट: निम्नलिखित नमूने का अध्ययन करने से पहले सभी खोले गए मापों को बंद करें; चूंकि उत्पन्न फाइलें भारी हैं और कंप्यूटर के आधार पर, एक से अधिक खुले बनाए रखना आसान नहीं है।
  1. एनटीए कक्ष को बाद के माप करने से पहले बार-बार पानी फ्लश करके साफ करें जब तक कि कोई कण नहीं देखा जाता है; बाद में, उपायों को जारी रखने के लिए बफर (पीबीएस) का उपयोग किया फ्लश करें।
  2. कक्ष के अंदर हवा फ्लश और दिन के अंतिम माप पूरा हो गया है एक बार सूक्ष्म ग्रेड कागज के साथ सूखी।
  3. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी (TEM) द्वारा आकार और आकार की विशेषता है। नमूने तैयार करें। अंतिम मात्रा के 30 माइक्रोन TEM लक्षण वर्णन के लिए पर्याप्त है।
    नोट: ताजा और lyophilized दोनों - पुनर्पौण के बाद- नैनोकणों को मापा जा सकता है।
  4. कार्बन-लेपित कॉपर ग्रिड पर नमूने के 10 माइक्रोन ड्रॉप करें। इसे 10 मिनट तक सूखने दें। फिल्टर पेपर पर धीरे-धीरे टैप करके, यदि आवश्यक हो, तो अतिरिक्त तरल निकालें।
  5. नकारात्मक धुंधला के लिए यूरेबिल एसीटेट (2% w/v) समाधान के 10 μL ड्रॉप । इसे 1 मिनट तक सूखने दें। फिल्टर पेपर पर धीरे-धीरे टैप करके, यदि आवश्यक हो तो तरल अतिरिक्त निकालें।
  6. माइक्रोस्कोप और स्कैन (वोल्टेज ऑपरेशन 80 केवी) में नमूना पेश करें।
    नोट: छवियों के आगे विश्लेषण के लिए उपयुक्त सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है।
एनकैप्सुलेशन दक्षता
1. नमूना तैयार करना
  1. नैनोकणों को वांछित एकाग्रता पर तैयार करें और उन्हें फ्रीज करें और सुखा लें। फिर, नैनोकणों को फिर से खर्च करें और उन्हें 6 μg/mL की अंतिम एकाग्रता पर पतला करें ।
  2. 20x स्टॉक सॉल्यूशन से 1x TE बफर तैयार करें।
    नोट: वीटी (कुल मात्रा) = (नमूनों की संख्या x 100 माइक्रोन x 4) (नमूनों की संख्या x 290 μL) + 2 एमएल।
  3. 100 μg/μL के स्टॉक से हेपरिन के 3 μg/μL के साथ ते बफर तैयार करें।
    नोट: Vt = नमूनों की संख्या x 50 μL x 2.
  4. मानक तैयार करें
  5. 1x Tris-EDTA (TE) बफर(टेबल S1A)में 0.2 μg/mL से 0.025 μg/mL तक एक आरएनए मानक तैयार करें।
    नोट: राइबोसोमल आरएनए से अलग होने की स्थिति में आरएनए मानक में एमआरएनए का उपयोग करें।
  6. हेपरिन(टेबल S1B)के साथ आरएनए: पीबीए मानक तैयार करें। हेपरिन मानक(टेबल एस 1 सी)तैयार करें।
  7. इस प्रकार 96-अच्छी प्लेट तैयार करें।
    1. लोड २९५ एक ९६ अच्छी तरह से थाली की पहली लेन में ते बफर के μL (नमूनों के रूप में कई कुओं का विश्लेषण करने के लिए) । फिर, लेन बी और सी (प्रत्येक नमूने के लिए डुप्लिकेट) में 1x TE बफर के 50 माइक्रोन लोड करें।
    2. लेन डी और ई (प्रत्येक नमूने के लिए डुप्लिकेट) में हेपरिन के 3 μg/μL के साथ 1x TBE बफर के 50 माइक्रोन लोड करें। इसके बाद, लेन एफ, जी और एच (प्रत्येक मानक के लिए डुप्लिकेट) में प्रत्येक मानक के 100 माइक्रोल लोड करें।
    3. लेन ए में प्रत्येक नमूने का लोड 5 माइक्रोन (प्रत्येक कुएं में एकाग्रता 0.1 μg/mL है)। नीचे दिए गए चार कुओं पर प्रत्येक नमूने के 50 माइक्रोन को पाइपिंग और लोड करके ठीक से मिलाएं (उनमें से दो में बफर 1x ते के 50 माइक्रोन और दो और हेपरिन के 3 माइक्रोग्राम/माइक्रोन के साथ 1x TE बफर युक्त हैं)।
  8. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए नमूना इनक्यूबेट। 1x TE बफर में निर्माता के प्रोटोकॉल (सामग्री की तालिकादेखें) के अनुसार रिबोग्रीन रिएजेंट तैयार करें।
    नोट: तनु 1:200 और भंवर। प्रकाश से रक्षा करें। Vt = पूर्ण कुओं की संख्या x 100 μL।
  9. प्रत्येक कुएं में रिबोग्रीन समाधान के 100 माइक्रोन लोड करें। 500 एनएम की उत्तेजन तरंगदैर्ध्य और 525 एनएम की उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के साथ माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके फ्लोरेसेंस का पता लगाएं।
2. परिणाम विश्लेषण
  1. तीन अंशांकन घटता तैयार
    नोट: सबसे पहले, रिबोसोमल आरएनए मानक। इस अंशांकन वक्र में उन नमूनों को इंटरपोलेट करें जिनमें हेपरिन नहीं होता है। दूसरा, mRNA: Heparin के साथ pBAE । इस अंशांकन वक्र में इंटरपोलेट नमूना है कि Heparin है। तीसरा, हेपरिन । काम एकाग्रता को आश्वस्त करने के लिए इस्तेमाल रैखिक रेंज में है।
  2. एनकैप्सुलेशन दक्षता (ईई%) की गणना इस प्रकार करें:

6. इन विट्रो लक्षण वर्णन

गुणात्मक मूल्यांकन के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी
1. 24 घंटे के ट्रांसफेक्शन के बाद माइक्रोस्कोप पर 96-वेल प्लेट रखें। 10x उद्देश्य के साथ कोशिकाओं की कल्पना शुरू करें।
  नोट: इस मामले में हेला कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है। कोशिकाओं को ट्रांसमिशन मोड (उज्ज्वल क्षेत्र) का उपयोग करके स्थानीयकृत किया जाता है, और इस समय ध्यान समायोजित किया जाना चाहिए।
  1. सबसे पहले, नमूनों की पृष्ठभूमि के बारे में सॉफ्टवेयर संदर्भ के लिए एक सफेद संतुलन लागू करें। फिर, विश्लेषण के दौरान फ्लोरेसेंस छवि के साथ इसे ओवरले करने के लिए एक छवि प्राप्त करें।
2. माइक्रोस्कोप मोड को प्रतिबिंब मोड (फ्लोरेसेंस) में बदलें और ईजीएफपी की कल्पना करने के लिए फिल्टर व्हील को नीले लेजर (488 एनएम) में ले जाएं।
  नोट: इस बिंदु पर, एक्सपोजर समय और लाभ समायोजित किया जाना चाहिए। लाभ 3 और 5 के बीच मूल्यों में समायोजित किया जाना चाहिए कलाकृतियों और पृष्ठभूमि संकेत पर अतिरिक्त से बचने के लिए । एक्सपोजर समय का समायोजन ट्रांसफैक्शन दक्षता (एमएस से 1 एस) पर निर्भर करता है।
3. सभी नमूनों की तुलना करने के लिए एक ही जोखिम समय को नियोजित करने वाली सभी स्थितियों या कुओं के लिए छवियां प्राप्त करें।
मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए फ्लो साइटोमेट्री (एफसी)
1. फ्लो साइटोमेट्री प्रयोग के लिए 96-वेल प्लेट तैयार करने के लिए मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें।
  नोट: जब अर्ध-अनुयायी कोशिकाओं के साथ काम करते हैं, जैसे कि JAWSII सेल लाइन में, सभी मीडिया वॉल्यूम को ठीक करें और इसे एक और 96-अच्छी प्लेट में स्टोर करें। इस मीडिया की आकांक्षा न करें क्योंकि इसमें काफी संख्या में संक्रमित कोशिकाएं हो सकती हैं।
2. कोशिकाओं को साफ (HeLa कोशिकाओं यहां इस्तेमाल कर रहे हैं) १०० μL के साथ/ इसके बाद, ट्राइप्सिन के 25 μL/well जोड़ें और इसे 5 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें ।
3. एक बार कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं, पहले बरामद मीडिया जोड़ने के लिए trypsin कार्रवाई को रोकने और कोशिकाओं को ठीक, 31.25 μL जोड़ने/
  नोट: इस बिंदु पर, कोशिकाओं की टुकड़ी सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिकाओं की स्थिति की कल्पना करना महत्वपूर्ण है। कोशिकाओं को अलग करने और उनके समूह से बचने में मदद करने के लिए कई बार ऊपर और नीचे पिपेट करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है। यह एक विश्वसनीय परिणाम का उत्पादन करेगा।
4. फ्लो साइटोमीटर और सॉफ्टवेयर चालू करें। सॉफ्टवेयर में, प्रयोग के लिए उचित शर्तें सेट करें (प्लेट का प्रकार, नमूना मात्रा, और अन्य पैरामीटर जैसे मिलाते हुए, नमूनों के बीच कुल्ला करना।
  नोट: चरण 6.2.5 के लिए, प्रवाह दर 120 μL/ हर 1 मिनट में एक चक्र मिलाएं और हर एक को अच्छी तरह से एक चक्र कुल्ला करें। मीडिया में फैले कोशिकाओं को बनाए रखने और व्यक्तिगत कोशिकाओं के बेहतर विश्लेषण की अनुमति देने के लिए मिश्रण आवश्यक है। इसके अलावा, नमूनों के बीच साइटोमीटर के माइक्रोफ्लुइडिक्स को साफ करने के लिए रिंसिंग आवश्यक है। अंत में, जांचें कि क्या पर्याप्त बफ़र्स हैं और क्या सभी घटक सही ढंग से जुड़े हुए हैं।
5. सकारात्मक रूप से संक्रमित कोशिकाओं के प्रतिशत की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयुक्त मापदंडों की स्थापना करें।
  1. सबसे पहले, मलबे से कोशिकाओं को अलग करने के लिए (फॉरवर्ड बिखरे हुए प्रकाश) एफएससी बनाम एससीसी (साइड बिते हुए प्रकाश) स्कैटर प्लॉट पर प्रवाह डेटा देखें। फिर, आयाम (एफएससी-ए) बनाम ऊंचाई (एफएससी-एच) की तुलना करने वाली एक और स्कैटर प्लॉट को व्यक्तिगत कोशिकाओं को गेट और भेदभाव करने के लिए प्लॉट किया जाता है।
    नोट: अनुपचारित आबादी सकारात्मक रूप से संक्रमित कोशिकाओं के अनुरूप आबादी को गेट करने की अनुमति देती है। फिर, सकारात्मक रूप से संक्रमित कोशिकाओं का मात्राकरण एक हिस्टोग्राम भूखंड पर उचित चैनल पर किया जाता है। इसलिए, सकारात्मक रूप से संक्रमित कोशिकाओं को हिस्टोग्राम पर घटनाओं के सातत्य के रूप में दर्शाया जाना चाहिए।

7. इन विट्रो कार्यक्षमता परीक्षण: एंटीजेनिक मॉडल एमआरएनए के रूप में ओवलबुमिन (ओवी) का उपयोग करके मॉडल प्रतिरक्षा कोशिकाओं को सक्रिय करने की क्षमता

प्लेट १०,००० कोशिकाओं/अच्छी तरह से (JAWSII कोशिकाओं यहां इस्तेमाल कर रहे हैं) एक ९६ में अच्छी तरह से थाली में एक दिन पहले ट्रांसफैक्शन ।
नोट: प्रत्येक स्थिति के लिए ट्रिप्लिकेट करने के लिए आवश्यक कई कुओं के रूप में प्लेट करें। कोशिकाओं को कम से कम 12 घंटे (एक रात इनक्यूबेशन की सिफारिश की जाती है) के लिए प्लेट से जुड़ने दें।
नीचे दिए गए नोट में वर्णित पीबीएईएनपी तैयार करें ताकि प्रति अच्छी तरह से 0.6 माइक्रोग्राम एमआरएनए को पार किया जा सके।
नोट: एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, एक ट्रांसफैक्शन रिएजेंट का उपयोग करके कोशिकाओं को स्थानांतरित करें। यहां, हमने प्रति अच्छी तरह से 0.1 माइक्रोन एमआरएनए और ट्रांसफैक्शन रीएजेंट के 0.25 माइक्रोन का उपयोग किया। ओवी के लिए एमआरएनए को संहिताबद्ध किया गया था (सामग्री की तालिकादेखें)। यह पॉलीडेनेलेटेड, 5-मेथोक्सीयूरिडीन के साथ संशोधित किया गया है, और स्तनधारी प्रणालियों के लिए अनुकूलित है, और कैप 1 संरचना के साथ एक अंत-कैपिंग के माध्यम से संरक्षित है, आपूर्तिकर्ता से एक मालिकाना विधि।
37 डिग्री सेल्सियस और 5%_सीओ2 पर सूखी हवा इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए 96-वेल प्लेट को इनक्यूबेट करें।
नोट: इस समय के बाद, मीडिया की ख्वाहिश नहीं है क्योंकि यह कोशिकाओं की एक निश्चित संख्या में शामिल हो सकता है । कोशिकाओं को ठीक करें और उन्हें किसी अन्य कुएं या प्लेट में बचाएं।
1x पीबीएस के 25 माइक्रोन के साथ अच्छी तरह से शेष कोशिकाओं को धोएं। इसके बाद, इसकी आकांक्षा करें और 25 माइक्रोन ट्राइपसिन जोड़ें और कोशिकाओं को अलग करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें। संवाददाता पर पहले से बरामद मीडिया को अच्छी तरह से जोड़कर ट्राइपसिन प्रतिक्रिया बंद करो ।
4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर प्लेट को सेंट्रलाइज करें। मीडिया की ख्वाहिश है। एक 1x PBS के 50 μL/well और फॉर्मेलिन का 2.5% जोड़ें। कोशिकाओं को ठीक करने के लिए इसे 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
चरण 7.5 और 7.5.1 दोहराएं। इसके बाद 1x पीबीएस का 50 माइक्रोल/वेल और 3% बीएसए (ब्लॉकिंग बफर) डालें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। फिर, कदम 7.5 और 7.5.1 दोहराएं, और फिर 1x पीबीएस में प्राथमिक एंटीबॉडी (माउस α-ओवी) के 50 माइक्रोन/वेल जोड़ें और 3% बीएसए और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
कदम 7.5 और 7.5.1 दोहराएं, और फिर 1x PBS के 50 μL/ मीडिया की ख्वाहिश है, और फिर माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान (α माउस-AlexaFluor488/PerCP और Cy5.5-CD11b/APC-CD86) 1x PBS और 3% बीएसए में जोड़ें । इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर प्लेट को सेंट्रलाइज करें। फिर, 1x पीबीएस के 50 माइक्रोन/वेल से कोशिकाओं को धोएं। इसके बाद, सेंट्रलाइज (5 मिनट के लिए 400 x ग्राम), आकांक्षा, और फिर 1x पीबीएस और 2.5% फॉर्मेलिन के 100 μL/well में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें।
प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा इसका विश्लेषण करें, जैसा कि ऊपर वर्णित है (चरण 6.2)।

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Representative Results

बहुलक संश्लेषण और लक्षण वर्णन
ओएम-पीबीएई संश्लेषण प्रक्रिया चित्र 2में दी गई है । जैसा कि चित्रा 2 ए से पता चलता है, ओम-पीबीएई प्राप्त करने का पहला कदम एमिन्स (1-हेक्सामाइन और 5-अमीनो-1-पेंटानोल, अनुपात 1:1) को डायल्रिलेट (1,4-ब्यूटेनडिओल डाय्रिलेट) में जोड़कर C6-pBAE को संश्लेषित करना है। यह प्रतिक्रिया 20 घंटे के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर और निरंतर सरगर्मी के साथ की जाती है। इसके बाद, पिछली प्रतिक्रिया(चित्रा 2B)से प्राप्त C6 बहुलक के समाधान में ओलिगोपेप्टाइड्स का समाधान जोड़ा जाता है। अंत में, संश्लेषण 20 घंटे के लिए निरंतर सरगर्मी के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर एक विलायक के रूप में DMSO का उपयोग किया जाता है । चित्रा 2C ओम-पीबीएई की संरचना को दर्शाता है, जो बहुलीकरण का परिणामी उत्पाद है । परिणामस्वरूप पॉलिमर ¹एच-एनएमआर (पूरक चित्रा S2देखें) की विशेषता है। लक्षण वर्णन में, एक सकारात्मक परिणाम कई मोनोमर इकाइयों (आंकड़ों में एन + एम) के साथ एक है जिसमें 7-10 के बीच शामिल है; आधा एक इकाई प्रकार और आधा अन्य वितरित; जबकि इस सीमा के बाहर किसी भी अन्य संख्या एक नकारात्मक परिणाम है।

नैनोपार्टिकल संश्लेषण और भौतिक रसायन लक्षण वर्णन
तालिका 3 जीएफपी एमआरएनए के भौतिक रसायन लक्षण वर्णन के परिणामों को अवधारणा के प्रमाण के रूप में नैनोकणों को समाहित करता है। पहले यह दर्शाया गया था कि आकार और सतह आवेश में महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाई देता है चाहे वह एमआरएनए प्रकार की परवाह किए बिना¹⁴को समझाया गया हो । लक्षण वर्णन हौसले से तैयार है और lyophilized नैनोकणों में किया गया है उनके भौतिक रसायन गुणों की स्थिरता साबित करने के लिए और प्रदर्शित करने के लिए कि, जैसा कि पहले प्रकाशित, फ्रीज सुखाने की प्रक्रिया इन योगों के लिए समायोजित किया गया था¹⁵। पॉलीप्लेक्स का हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या तब सही माना जाता है जब यह 150-220 एनएम के आसपास होता है। इसके अलावा, पीडीआई स्थिर होना चाहिए, लगभग 0.2, लेकिन इसे 0.3 तक स्वीकार किया जाता है। इसलिए, न तो आकार और न ही पीडीआई ने लियोफिलाइजेशन से पहले और बाद में महत्वपूर्ण अंतर दिखाया, जैसा कि यहां प्रतिनिधि परिणामों का उपयोग करके दिखाया गया है। इसके अलावा, नैनोपार्टिकल आकार एनटीए के साथ किया गया था, पहले प्राप्त परिणामों की पुष्टि करने के लिए । ऊपर निर्दिष्ट श्रेणियों के बाहर किसी भी मूल्य को नकारात्मक परिणाम माना जाता है, और कणों को आगे के उपयोग के लिए छोड़ दिया जाना चाहिए।

इस प्रकार के नमूने के भौतिक रसायन लक्षण वर्णन के दौरान, एनटीए द्वारा प्राप्त परिणामों के साथ डीएलएस द्वारा प्राप्त परिणामों की तुलना करना सुविधाजनक है। दोनों तकनीकें प्रसार गुणांक को मापकर कणों के हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या का निर्धारण करती हैं। कणों को सही तरीके से ट्रैक करने के लिए एनटीए में प्रति फ्रेम गिने जाने वाले नैनोकणों की संख्या ८० और १०० के बीच है । सतह प्रभारी भी नैनोकणों के सकारात्मक प्रभार सुनिश्चित करने के लिए विशेषता थी, कोशिका झिल्ली के साथ इलेक्ट्रोस्टैटिक बातचीत की सुविधा । अंत में, पॉलीप्लेक्स की आकृति विज्ञान को ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी (TEM) की विशेषता थी। चित्र 3 50 एनएम व्यास के अनुमानित आकार के गोलाकार और मोनोडिस्पर्स नैनोकणों के गठन की पुष्टि करता है। एनटीए और डीएलएस दोनों हाइड्रोडायनामिक व्यास को मापते हुए TEM छवियों का विश्लेषण करके छोटे व्यास प्राप्त किए गए थे। हालांकि एक छोटे आकार हमेशा जब इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी माप^{16, 17}प्रदर्शन करते समय की उम्मीद है, के रूप में माप बिखरने की तुलना में, यहां पर प्रकाश डाला है कि अंतर लगभग १०० एनएम है, जो आमतौर पर उंमीद नहीं है आवश्यक है । यह इन नैनोकणों के उच्च हाइग्रोस्कोपिक चरित्र के लिए जिम्मेदार है, जो एनकैप्सुलेटेड mRNA और अंत टर्मिनल ओलिगोपेप्टिड्स दोनों द्वारा दिया गया है जो बहुलक की रचना करते हैं।

एमआरएनए एनकैप्सुलेशन दक्षता निर्धारण
मापने के लिए एक अन्य महत्वपूर्ण पैरामीटर नैनोकणों की एमआरएनए को समझाने की क्षमता है,जो सक्रिय सिद्धांत है और^{18, 19,}²⁰से इसकी सुरक्षा प्राप्त करने के लिए समझाया जाना चाहिए। आपूर्तिकर्ता के निर्देशों का पालन करने वाले न्यूक्लिक एसिड फंसाने के एनकैप्सुलेशन दक्षता (ईई;% में%) का विश्लेषण करने के लिए प्रोटोकॉल विकसित किया गया है। प्राप्त मूल्य नाभिक एसिड प्रतिशत है कि सफलतापूर्वक नैनोकणों में फंस गया है के बारे में एक विचार देता है । रिबोग्रीन डाई, एक फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग, इस उद्देश्य के लिए प्रयोग किया जाता है। प्रोटोकॉल में किसी भी आरएनए की मात्रा होती है जो फ्लोरोसेंट डाई के लिए सुलभ रहती है। कुल आरएनए की मात्रा निर्धारित करने के लिए, नैनोकणों को अलग करने की आवश्यकता होती है, और हेपरिन का उपयोग इस उद्देश्य के लिए किया जाता है।

तालिका 4 अवधारणा के सबूत के रूप में जीएफपी और ओवी एमआरएनए दोनों को समाहित करने वाले ओम-पीबीए पॉलीप्लेक्स की एनकैप्सुलेशन दक्षता (ईई%) दिखाती है। रिबोग्रीन फ्लोरेसेंस परख अपनी सामग्री को जारी करने के अलावा हेपरिन द्वारा अलग होने के बाद नैनोकणों में फंसे एमआरएनए की मात्रा की गणना करने की अनुमति देता है। प्राप्त दक्षता मूल्यों को 80% से अधिक होना चाहिए और जैसा कि यहां प्रदर्शित किया गया है, एमआरएनए के प्रकार के आधार पर महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाते हैं। कम एनकैप्सुलेशन दक्षता मूल्य एक नकारात्मक परिणाम का प्रतिनिधित्व करते हैं और इन योगों को त्यागने के लिए एक संकेत का गठन करते हैं। ये परिणाम ओम-पीबीई के एमआरएनए की उच्च एनकैप्सुलेशन क्षमता, इसकी बहुमुखी प्रतिभा और जीन डिलीवरी में इसके आशाजनक अनुप्रयोग की पुष्टि करते हैं।

इन विट्रो प्रतिनिधि परिणाम
पीबीएई पॉलीप्लेक्स की क्षमता निर्धारित करना आवश्यक है। पहला,¹⁴प्रतिरक्षा कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए और दूसरा, पारंफेक्ट करने के लिए । ट्रांसफेक्शन दक्षता का मूल्यांकन दो अलग-अलग तकनीकों द्वारा किया जाता है, रिपोर्टर एमआरएनए के रूप में ईजीएफपी का उपयोग करके: फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी नेत्रहीन रिपोर्टर प्रोटीन निर्धारित करने के लिए और ट्रांसफेक्शन दक्षता की मात्रा निर्धारित करने के लिए साइटोमेट्री अभिव्यक्ति प्रवाह। सीसीडी कैमरा, 5x, 10x, 20x, और 40x उद्देश्यों और यूवी, नीले और हरे फिल्टर लेजर से लैस फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप को JAWSII सेल लाइन, एक मुरीन डेंड्रिटिक सेल लाइन में ईजीएफपी प्रोटीन की अभिव्यक्ति को गुणात्मक रूप से निर्धारित करने के लिए नियोजित किया गया था। ईजीएफपी प्रोटीन में अधिकतम 488 एनएम पर एक उत्तेजन होता है, जो नीले लेजर के अनुरूप होता है, और हरे रंग के अनुरूप 510 एनएम के आसपास उत्सर्जन अधिकतम होता है। लक्ष्य प्रोटीन की ट्रांसफैक्शन दक्षता अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करने के लिए, संक्रमित कोशिकाओं का प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण ईजीएफपी एमआरएनए के साथ पीबीएईएस पॉलीप्लेक्स के साथ ट्रांसफैक्शन के 24 घंटे के बाद किया जाता है। एक निर्धारण कदम उपयोगी है जब कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स जैसे जीएफपी या आरएफपी से संक्रमित किया गया है।

चित्रा 4 JAWSII सेल लाइन में ट्रांसफैक्शन के 24 घंटे के बाद ईजीएफपी अभिव्यक्ति के गुणात्मक विश्लेषण को दर्शाता है। फिर, नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में, eGFP रिपोर्टर संकेत सांकेतिक रूप से अधिक है । इसके अलावा, टेबल 5 JAWSII सेल लाइन में ओम-पीबीए नैनोकणों द्वारा प्रदर्शित ट्रांसफैक्शन दक्षता दिखाता है। फिर, दक्षता मूल्यों को शास्त्रीय ट्रांसफैक्शन रिएजेंट के साथ किए गए सकारात्मक नियंत्रण के बराबर किया जाता है।

मॉडल प्रतिरक्षा कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए ओवीए एमआरएनए से भरे पीबीएएस एनपीएस की क्षमता का आकलन JAWSII सेल लाइन, एक मुरीन अपरिपक्व डेंड्रिटिक सेल लाइन को ट्रांसफेक्टिंग किया गया है । प्रतिरक्षा कोशिकाओं की सक्रियता निर्धारित करने के लिए, दो अलग-अलग मार्कर: सीडी 11बी और सीडी 86 कार्यरत थे। सबसे पहले, प्रवाह साइटोमीटर विन्यास के लिए उचित फ्लोरोफोरस का चयन करें। यहां, PerCP-Cy5.5 (CD11b) और पीई (CD86) का उपयोग किया जाता है । अपरिपक्व और गैर सक्रिय सेल लाइनों एक CD11b-/CD86-प्रोफ़ाइल दिखाना चाहिए, जबकि सक्रिय कोशिकाओं को एक CD11b +/CD86 + प्रोफ़ाइल पेश करना होगा । 488 एनएम पर नीले लेजर का उपयोग लक्षित प्रोटीन अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए किया जाता है, और एक एंटी-ओवा एंटीबॉडी प्लस एक माध्यमिक एंटी-माउस-एलेक्सा488 एंटीबॉडी नियोजित किया गया था। तालिका 6 इस प्रयोग में नियोजित अंतिम पैनल को दर्शाता है। चित्रा 5 डीसी को सक्रिय करने के लिए ओवीए एमआरएनए-लोडेड ओम-पीबीए नैनोकणों की क्षमता दिखाता है, जो सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के सक्रियण का संकेत है। गैर-संक्रमित कोशिकाएं CD11b और सीडी 86 झिल्ली मार्कर व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की कम संख्या दिखाती हैं, जबकि एमआरएनए ओवा ओम-पीबीईस इलाज कोशिकाएं CD11b और सीडी 86 मार्कर की एक सांकेतिक रूप से बढ़ी हुई अभिव्यक्ति दिखाती हैं। इस परिणाम से पता चलता है कि ओम-पीबीए नैनोकण परिपक्वता को बढ़ावा देते हैं। कुल मिलाकर, ये परिणाम ओएम-पीबीईई नैनोकणों की क्षमता की पुष्टि करते हैं ताकि वे डेंड्रिटिक कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक स्थानांतरित कर सकें और अपरिपक्व डीसी की परिपक्वता को बढ़ावा देने वाली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की सक्रियता में मध्यस्थता करें।

चित्रा 1:पूरे सिंथेटिक प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। इस आंकड़े में, एमआरएनए वैक्सीन संश्लेषण चरणों को विस्तृत किया गया है, जिसमें महत्वपूर्ण लक्षण वर्णन पैरामीटर शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 2:C6-pBAE ओलिगोपेप्टाइड एंड-मोडिफाइड (ओम-पीबीएई) का संश्लेषण। (ए)माइकल इसके अलावा प्रदर्शन करने के लिए कच्चे रसायन। (B)pBAE + ओलिगोपेप्टाइड। (ग)ओम-पीबीएई । आर हस्टिडीन (एच) या Lysine (कश्मीर) हो सकता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 3:ताजा GFP mRNA की TEM छवियां ओम-pBAE नैनोकणों encapsulating । इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी लक्षण वर्णन के लिए पॉलीप्लेक्स नकारात्मक रूप से दाग दिए गए थे। लगभग 60 एनएम व्यास के मोनोडिस्पर्स कण दिखाए जाते हैं। (A)और(ख)छवियां एक ही नमूने की दो अलग-अलग माइक्रोस्कोपी का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 4:OM-pBAE/eGFP mRNA नैनोकणों के साथ JAWSII संक्रमित कोशिकाओं की फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी इमेजिंग । (A)उज्ज्वल क्षेत्र छवि । (ख)जीएफपी फ्लोरेसेंस (हरे रंग में) । (ग)पिछली दो छवियों का समग्र । स्केल बार = 100 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5:ओम-पीबीएई/ओवीए एमएनए नैनोकणों के साथ ट्रांसफैक्शन के बाद JAWSII की सक्रियता । नकारात्मक नियंत्रण (सीएन) मान ब्लैक लेबल के अनुरूप होते हैं। संक्रमित कोशिकाएं ग्रे लेबल के अनुरूप होती हैं। बार तीन प्रतिकृति के मानक विचलन (एसडी) के अनुरूप हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

भौतिक	भौतिक	माइक्रोवेसिकल्स
	अपवर्तक सूचकांक	1.4
	अवशोषण	0.01
फैलाव	फैलाव	पानी
	तापमान (डिग्री सेल्सियस)	25
	चिपचिपाहट (सीपी)	0.8872
	अपवर्तक सूचकांक	1.33
तापमान	तापमान (डिग्री सेल्सियस)	25
तापमान	समतुल्यता समय (एस)	10
कोशिका	सेल प्रकार	ज़ेन0040

तालिका 1: आकार मापन के लिए एक एसओपी बनाने के लिए पैरामीटर।

भौतिक	भौतिक	माइक्रोवेसिकल्स
	अपवर्तक सूचकांक	1.4
	अप्सरा	0.01
फैलाव	फैलाव	पानी
	तापमान (डिग्री सेल्सियस)	25
	चिपचिपाहट (सीपी)	0.8872
	अपवर्तक सूचकांक	1.33
तापमान	तापमान (डिग्री सेल्सियस)	25
तापमान	संतुलन का समय	10
कोशिका	सेल प्रकार	डीटीएस1070

तालिका 2: जीटा संभावित मापों के लिए एसओपी बनाने के लिए पैरामीटर।

जीएफपी एमआरएनए/ओम-पीबीएई	टी^(ओसी)	हाइड्रोडिनेमिक व्यास (एनएम)		पीडीआई	सरफेस चार्ज (एमवी)
जीएफपी एमआरएनए/ओम-पीबीएई	टी^(ओसी)	एनटीए	डीएलएस	पीडीआई	सरफेस चार्ज (एमवी)
ताजा	25	124 ± 32	134 ± 8	0.2 ± 0.04	32 ± 0.7
लियोफिलाइज्ड	25	135 ± 35	138 ± 2	0.17 ± 0.02	34 ± 0.7

तालिका 3: MRNA के भौतिक रसायन लक्षण वर्णन ओम-pBAE नैनोकणों encapsulating । जीएफपी एमआरएनए ने तैयार करने के तुरंत बाद ओम-पीबीए पॉलीप्लेक्स को चिह्नित किया - ताजा और लियोफिलाइजेशन प्रक्रिया के बाद कणों की स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए। डीएलएस और एनटीए आकार, और सतह चार्ज डेटा दिखाया जाता है।

	ईई%
जीएफपी एमआरएनए/ओम-पीबीएई	82.3 ± 1.5
OVA mRNA/OM-pBAE	83.1 ± 1.5

तालिका 4: एमआरएनए के एनकैप्सुलेशन दक्षता (ईई%) डेटा ओम-पीबीए नैनोकणों को एनकैप्सुलेट करते हैं। जीएफपी और ओडब्ल्यूए एमएनए के एनकैप्सुलेशन दक्षता प्रतिशत ओम-पीबीए नैनोकणों को एनकैप्सुलेट करते हैं। रिबोग्रीन^{फ्लोरेसेंस परख पॉलीप्लेक्स में फंसे एमआरएनए की मात्रा का आकलन करने के लिए लियोफिलाइज्ड नमूनों पर किया गया था।}

नमूना	% जीएफपी सकारात्मक कोशिकाएं	एसडी
नकारात्मक नियंत्रण	1.85%	0.21%
OM-pBAE/eGFP mRNA संक्रमित कोशिकाओं	57.79%	5.28%

तालिका 5: JAWSII सेल लाइन में ओम-पीबीएई/ईजीएफपी एमआरएनए नैनोकणों की ट्रांसफेक्शन दक्षता। ट्रांसफेक्शन दक्षता को फ्लो साइटोमेट्री द्वारा ट्रैक किया गया था।

रोग-प्रतिकारक	कोशिकाओं दाग	फ्लोरोसेंट लेबल
सीडी11बी	सक्रिय डीसी	PerCP-Cy 5.5
सीडी86	सक्रिय डीसी	पीई
α माउस AlexaFluor488	ओवीए पॉजिटिव कोशिकाएं	एलेक्साफ्लूर 488

तालिका 6: फ्लो साइटोमेट्री पैनल। इस पैनल का उपयोग एमआरएनए वैक्सीन की इन विट्रो कार्यक्षमता निर्धारित करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री अध्ययनों के लिए किया गया था।

अनुपूरक जानकारी: सभी पूरक जानकारी शामिल के साथ पूरक फ़ाइल देखें। फ़ाइलों के नीचे डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

टेबल S1A:रिबोसोमल आरएनए मानक।

टेबल S1B:आरएनए: हेपरिन मानक के साथ पीबीएई।

तालिका S1C: हेपरिन मानक।

चित्रा S2: C6-pBAE और OM-pBAE के ¹एच-एनएमआर प्रोटॉन स्पेक्ट्रा । (A)C6-pBAE से 1H-NMR । क्लोरोफॉर्म-डी का उपयोग सॉल्वेंट (δ = 7.25 पीपीएम) के रूप में किया जाता था। (B)C6CH3 से 1H-NMR । D2O को सॉल्वेंट (δ = 4.64 पीपीएम) के रूप में इस्तेमाल किया गया था।

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Discussion

पिछले साल कोविड-19 महामारी के फैलने के बाद, संक्रामक रोग नियंत्रण के मामले में टीकों का महत्व एक महत्वपूर्ण घटक⁸के रूप में प्रकट हुआ है । दुनिया भर के वैज्ञानिकों के प्रयासों ने कई टीकों के बाजार में रिहाई को सक्षम बनाया है । इतिहास में पहली बार, एमआरएनए टीकों ने अपनी पहले की परिकल्पना की सफलता का प्रदर्शन किया है, उनके तेजी से डिजाइन के लिए धन्यवाद क्योंकि उनकी क्षमता कुछ महीनों के भीतर किसी भी उपन्यास एंटीजन के अनुकूल होने के लिए^5,^6,^21। एमआरएनए, या मैसेंजर राइबोन्यूक्लिक एसिड, न्यूक्लिक एसिड को संदर्भित करता है जो डीएनए में एन्कोडेड जानकारी से प्रोटीन संश्लेषण को चलाता है। यहां, टीकाकरण उद्देश्यों के लिए, एमआरएनए संक्रामक सूक्ष्मजीव (या चिकित्सीय ट्यूमर टीकाकरण के मामले में ट्यूमर एंटीजन) से संबंधित एंटीजेनिक प्रोटीन के लिए कोडिफास करता है)^8,^22। इस संदर्भ में, वैज्ञानिक समुदाय के लिए यह महत्वपूर्ण है कि एमआरएनए टीकों के संश्लेषण के लिए स्पष्ट प्रोटोकॉल हों ।

इस विचार को ध्यान में रखते हुए, मालिकाना बहुलक नैनोकणों के आधार पर एमआरएनए टीकों के संश्लेषण के लिए एक सीधी प्रक्रिया का उद्देश्य²⁴वर्णित किया गया था। जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित है, सबसे पहले, पॉलीमर को पॉलीमर बैकबोन को संश्लेषित करने के लिए एक्रिलेट समूहों के लिए प्राथमिक अमीनों के माइकल जोड़ के आधार पर दो-चरण प्रक्रिया का उपयोग करके संश्लेषित किया जाता है, जिसके बाद टर्मिनल ओलिगोपेप्टिड्स के अलावा एंडोसोम्स से परिणामस्वरूपपॉलीमर^12,^{13, 144}तक बचने के लिए बढ़ाया जाता है। . फिर, एक और कदम में, नैनोकणों को छोटे नैनोमेट्रिक कणों के रूप में अपने इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन को प्राप्त करने के लिए एमआरएनए के साथ बहुलकों को मिलाकर तैयार किया जाता है।

हालांकि बहुलक का संश्लेषण एक सीधा प्रोटोकॉल है, लेकिन नैनोपार्टिकल फॉर्मूल बनाने के लिए ऐसा नहीं कहा जा सकता । दुनिया भर में कई सहयोगियों ने इन बहुलकों का उपयोग किया है और कणों की तैयारी और उपयोग का जिक्र करते समय आम महत्वपूर्ण कदम पाए हैं। इस बात को ध्यान में रखते हुए कि संश्लेषण मैनुअल मिश्रण से है, उपयोगकर्ता क्षमताएं एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। सबसे पेचीदा कदम बहुलक और mRNA, जो एक नियंत्रित तरीके से जगह ले जाना चाहिए मिश्रण है, क्योंकि यह पानी और बफर इसके अलावा मिश्रण के आगे वर्षा कदम के लिए किया जाना चाहिए । दो घटकों को मिलाने के यांत्रिकी पर किसी भी संशोधन के परिणामस्वरूप सूक्ष्मकण (नैनोकणों के बजाय) होंगे, जिनका उपयोग मनुष्यों के लिए नहीं किया जा सकता है। इसलिए, मिश्रण समस्या निवारण चरणों में से एक है जिसे सही ढंग से प्राप्त करने के लिए कुछ अभ्यास की आवश्यकता होती है।

एक और हड़ताली बिंदु फ्रीज सुखाने है । जैसा कि यह व्यापक रूप से जाना जाता है, यह नैनोफॉर्मेशन के अड़चन चरणों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है। इस विशिष्ट मामले में, सभी मापदंडों को समायोजित करने और¹⁵सफल रहे प्रोटोकॉल का वर्णन करने में कुछ साल लग गए। यहां तक कि समायोजित होने, प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण कदम योगों का पुनर्निर्पात है, जो, अगर सही ढंग से प्रदर्शन नहीं किया, नैनोकणों के एकत्रीकरण लाने और वे अपनी कार्यक्षमता खो देते हैं । इस मामले में, उनके अनियंत्रित रिहाइड्रेशन से बचने के लिए फॉर्मूलों को सूखे, थोड़ा ठंडे वातावरण में तेजी से रखना बहुत जरूरी है। उनकी उच्च हाइग्रोस्कोपिक प्रकृति के कारण, लिओफिलाइजेशन द्वारा गठित सभी चिपचिपा पाउडर को ध्यान से ऊपर और नीचे करके उन्हें नियंत्रित तरीके से फिर से हाइड्रेट करने के लिए विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए। यदि नमूने एक गैर नियंत्रित तरीके से फिर से हाइड्रेट, वे तुरंत अपारदर्शी फैलाव के लिए एक पारदर्शी बनाने कुल होगा ।

यद्यपि यहां महत्वपूर्ण चरणों का उल्लेख किया गया है, लेकिन पीबीएई पॉलीप्लेक्स को संश्लेषित करने का प्रोटोकॉल आसान और तेजी से है, जो जीन वितरण प्रणालियों के अन्य संश्लेषण तरीकों के बीच लाभप्रद है। इधर, एमआरएनए टीकाकरण के विशिष्ट आवेदन की विस्तार से जानकारी दी गई है। हालांकि, यह एक बहुमुखी पद्धति का प्रतिनिधित्व करता है जिसे अन्य प्रकार के न्यूक्लिक एसिड और गैर-वैक्सीन उपयोग को समाहित करने के लिए भी लागू किया जा सकता है, जैसे ऑन्कोलॉजी और हृदय क्षेत्रों में, जैसा कि पहले^{13, 23,}²⁴प्रकाशित किया गया था।

अंत में, यह प्रोटोकॉल इन मालिकाना बहुलकों को वैज्ञानिक समुदाय के लिए उपलब्ध होने में सक्षम बनाएगा ताकि इस सभी समस्या निवारण से बचते हुए उपन्यास एमआरएनए टीके डिजाइन किए जा सकें। ये पॉलिमर फ्रीज-सुखाने, दीर्घकालिक स्थिरता, और अल्ट्रा-कोल्ड तापमान की आवश्यकता नहीं होने से भंडारण और वितरण लागत में कमी की संभावना के बारे में अन्य mRNA लिपिड योगों की तुलना में लाभप्रद हैं। इसलिए, यह उम्मीद की जाती है कि ओम-पीबीए टीके रोगनिरोधी और चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए टीकाकरण के क्षेत्र में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास न तो खुलासा करने के लिए कुछ है और न ही हितों का कोई टकराव ।

Acknowledgments

MINECO/FEDER से वित्तीय सहायता (अनुदान SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22, और COV20/01100) स्वीकार किया है । सीजीएफ ने उसे आईक्यूएस पीएचडी फेलोशिप स्वीकार किया ।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-butanediol diacrylate	Sigma Aldrich	123048
1-hexylamine	Sigma Aldrich	219703
5-amino-1-pentanol	Sigma Aldrich	411744
Acetone	Panreac	141007
CD11b antibody	BD	550993
CD86 antibody	Bioligend	105007
Chlor hydroxhyde	Panreac	181023
Chloroform-d	Sigma Aldrich	151823
Cys-His-His-His peptide	Ontores	Custom
Cys-Lys-Lys-Lys peptide	Ontores	Custom
D₂O	Sigma Aldrich	151882
DEPC reagent for Rnase free water	Sigma Aldrich	D5758	This reagent is important to treat MilliQ water to remove any RNases of the buffers
Diethyl eter	Panreac	212770
dimethyl sulfoxide	Sigma Aldrich	276855
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
mRNA EGFP	TriLink Technologies	L-7601
mRNA OVA	TriLink Technologies	L-7610
RiboGreen kit	ThermoFisher	R11490
sodium acetate	Sigma Aldrich	71196
sucrose	Sigma Aldrich	S0389
Trifluoroacetic acid	Sigma Aldrich	302031
Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	11570626
α-mouse AlexaFluor488 antibody	Abcam	Ab450105
Equipment
Nanoparticle Tracking Analyzer	Malvern Panalytical	NanoSight NS300
Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer	Varian	400 MHz
ZetaSizer	Malvern Panalytical	Nano ZS	For zeta potential and hydrodynamic size determination
Software
NanoSight NTA software	Malvern Panalytical	MAN0515-02-EN-00
NovoExpress Software	Agilent	Not specified
ZetaSizer software	Malvern Panalytical	DTS Application	To analyze surface charge and hydrodynamic sizes

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References

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Bioengineering

टीकाकरण प्रयोजनों के लिए एमआरएनए-लोडेड पॉली (बीटा अमीनोस्टर्स) नैनोकणों का संश्लेषण और लक्षण वर्णन

Summary

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Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

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Acknowledgments

Materials

References

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