Summary
Определена оптимальная концентрация сахарозы для экстракции гликогена печени с помощью центрифугирования градиента плотности сахарозы. Добавление 10-минутной стадии кипячения для ингибирования ферментов, расщепляющих гликоген, оказалось полезным.
Abstract
Гликоген печени представляет собой гиперразветвленный полимер глюкозы, который участвует в поддержании уровня сахара в крови у животных. На свойства гликогена влияет его структура. Следовательно, подходящий метод экстракции, который выделяет репрезентативные образцы гликогена, имеет решающее значение для изучения этой макромолекулы. По сравнению с другими методами экстракции, метод, использующий стадию центрифугирования с градиентом плотности сахарозы, может свести к минимуму молекулярное повреждение. Основываясь на этом методе, в недавней публикации описывается, как изменялась плотность раствора сахарозы, используемого во время центрифугирования (30%, 50%, 72,5%), чтобы найти наиболее подходящую концентрацию для извлечения частиц гликогена самых разных размеров, ограничивая потери более мелких частиц. Была введена 10-минутная стадия кипячения, чтобы проверить его способность денатурировать ферменты, разрушающие гликоген, тем самым сохраняя гликоген. Было показано, что самая низкая концентрация сахарозы (30%) и добавление стадии кипячения позволяют извлечь наиболее репрезентативные образцы гликогена.
Introduction
Гликоген представляет собой сложный, гиперразветвленный полимер глюкозы, содержащийся в животных, грибах и бактериях1. У млекопитающих гликоген печени функционирует как буфер глюкозы в крови, сохраняя гомеостаз, в то время как мышечный гликоген действует как кратковременный резервуар глюкозы, обеспечиваяэнергию напрямую. Структуру гликогена часто описывают тремя уровнями (см. рис. 1): 1. Линейные цепи образуются мономерами глюкозы через гликозидные связи (1→4)-α, причем точки разветвления соединяются гликозидными связями (1→6)-α; 2. сильно разветвленные частицы β (~20 нм в диаметре), которые, особенно в таких тканях, как скелетные мышцы, действуют как независимые молекулы гликогена 3,4; 3. Более крупные частицы гликогена α (до 300 нм в диаметре), состоящие из более мелких β единиц гликогена, которые обнаруживаются в печени5, сердце6 и унекоторых видов, не относящихся к млекопитающим7. Частицы печеночных α от мышей с диабетом молекулярно хрупкие, со склонностью разлагаться до β-частиц при растворении в диметилсульфоксиде (ДМСО), в то время как частицы α из контрольной группы, не страдающей диабетом, обычно остаются неизменными. Одна из гипотез заключается в том, что эта хрупкость может усугубить плохой баланс глюкозы в крови, наблюдаемый при диабете, при этом хрупкие частицы α потенциально могут привести к более высоким долям более быстро разлагающихся частицβ 8,9,10,11.
Традиционные методы экстракции гликогена используют относительно жесткие условия воздействия на ткани печени горячего щелочного раствора12 или кислотных растворов, таких как трихлоруксусная кислота (ТСА)13 или хлорная кислота (РСА)14. Несмотря на то, что эти методы эффективны для отделения гликогена от других компонентов ткани печени, они неизбежно разрушают структуру гликогена в некоторойстепени. Хотя эти методы подходят для количественного измерения содержания гликогена, они не идеальны для исследований, ориентированных на получение структурной информации о гликогене из-за этого структурного повреждения. С момента разработки этих методов была разработана более мягкая процедура экстракции, в которой используется холодный буфер Tris (показано, что он ингибирует деградацию глюкозидазы) с ультрацентрифугированием градиента плотности сахарозы 17,18,19. При контролируемом pH ~8 этот метод не подвергает гликоген кислотному или щелочному гидролизу, наблюдаемому в предыдущих процедурах.
Ультрацентрифугирование градиента плотности сахарозы гомогенизированной ткани печени может отделить частицы гликогена от большей части клеточного материала. При необходимости дополнительную очистку можно выполнить препаративной эксклюзионной хроматографией, в результате которой получается сбор очищенного гликогена с присоединенными гликогенассоциирующими белками20. Хотя этот метод, при более мягких условиях, с большей вероятностью сохраняет структуру гликогена, трудно предотвратить потерю некоторой части гликогена в надосадочной жидкости, особенно более мелких частиц гликогена, которыеменее плотны. Другая потенциальная причина потери гликогена заключается в том, что более мягкие условия допускают некоторую ферментативную деградацию, что приводит к более низкому выходу гликогена по сравнению с более жесткими методами экстракции. В недавних исследованиях сообщалось об оптимизации метода экстракции гликогена из печени для сохранения структуры гликогена21. Здесь были проверены различные концентрации сахарозы (30%, 50%, 72,5%), чтобы определить, минимизирует ли более низкая концентрация сахарозы потерю более мелких частиц гликогена. Обоснование заключалось в том, что более низкая плотность позволит более мелким, менее плотным частицам проникать в слой сахарозы и агрегировать в грануле с остальной частью гликогена.
В этом исследовании методы экстракции с 10-минутной стадией кипячения и без нее сравнивались, чтобы проверить, можно ли денатурировать ферменты деградации гликогена, что привело бы к извлечению большего количества гликогена, который также не подвергался частичному разложению. Для определения структуры экстрагированного гликогена использовали распределение целых молекул по размерам и распределение длины цепи гликогена, аналогично оптимизации экстракции крахмала, опубликованной ранее22. Методом размерной эксклюзионной хроматографии (SEC) с детектированием дифференциального показателя преломления (DRI) было получено распределение гликогена по размерам, которое описывает общую молекулярную массу в зависимости от размера молекулы. Для анализа распределений длины цепей, которые описывают относительное количество цепных цепей каждого заданного размера (или степени полимеризации), был использован электрофорез углеводов с помощью флуорофора (FACE). В данной работе описана методика извлечения гликогена из тканей печени на основе предыдущего оптимизационного исследования21. Полученные данные свидетельствуют о том, что наиболее подходящим методом для сохранения структуры гликогена является концентрация сахарозы 30% с 10-минутной стадией кипячения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Печень мышей, использованная для оптимизацииэтой процедуры, была взята у 12 самцов мышей BKS-DB/Nju (7,2 недели, см. таблицу материалов). Использование животных было одобрено Комитетом по уходу за животными и этике Народной больницы Уханьского университета, IACUC Issue No. WDRM 20181113.
1 Ткани животного происхождения
- Взвесьте печень мыши (1-1,8 г цельной печени от каждой мыши).
- Быстро заморозьте печень мыши в жидком азоте и храните ее при температуре -80 °C.
2. Приготовление буфера и реагентов
- Приготовьте буфер для выделения гликогена, содержащий 5 мМ Tris, 150 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 50 мМ NaF и 5 мМ пирофосфата натрия с деионизированной водой, и отрегулируйте pH до 8.
- Приготовьте 30% (по массе) раствор сахарозы (признан наиболее оптимальным для гликогена21 в печени).
- Готовят буфер ацетата натрия (1 М, рН 4,5), уксуснокислый буфер (0,1 М, рН 3,5), раствор гидроксида натрия (0,1 М) и цианоборогидрид натрия (1 М).
- Приготовьте раствор 8-аминопирена-1,3,6-трисульфоната (АПТС), добавив 5 мг АПТС к 50 мкл 15% ледяной уксусной кислоты.
- Приготовьте раствор аммиачной селитры, содержащий 50 мМ аммиачной селитры с 0,02% азидом натрия.
3. Экстракция гликогена (рисунок 2)
- Перенесите замороженную ткань печени (~1 г) в пробирку объемом 15 мл, содержащую 6 мл буфера для выделения гликогена.
- Держа его на льду, гомогенизируйте ткани печени с помощью тканевого гомогенизатора.
- Переложите половину суспензии (3 мл) в новую пробирку и кипятите в течение 10 мин (показано, что оптимально для структурных исследований гликогена21). Вторую половину суспензии (3 мл) держите на льду, чтобы извлечь гликоген, содержащий сопутствующие белки, которые не денатурированы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некипяченые образцы всегда следует держать на льду во время этапов экстракции гликогена. Если белки гликогена не важны для исследования, весь образец может пройти 10-минутную стадию кипячения. - Извлеките из каждой пробирки аликвоту объемом 8 мкл, держите ее на льду и используйте для определения содержания гликогена (см. раздел 4).
- Центрифугу оставшейся суспензии при 6 000 × г в течение 10 мин при 4 °C.
- Переложите надосадочную жидкость в ультрацентрифужные пробирки и центрифугируйте их при 3,6 × 105 г в течение 90 мин при 4 °С.
- Выбросьте оставшиеся надосадочные жидкости и повторно суспендируйте гранулы в 1,5 мл буфера для выделения гликогена.
- Образцы наслаивают на 1,5 мл 30% раствора сахарозы в ультрацентрифужных пробирках по 4 мл и центрифуге при 3,6 × 10,5г в течение 2 ч при 4 °C.
- Выбросьте оставшиеся надосадочные жидкости и повторно суспендируйте гранулы в 200 мкл деионизированной воды.
- Добавьте к суспензиям 800 мкл абсолютного этанола и хорошо перемешайте до осаждения гликогена23,24. Храните смеси при температуре -20 °C не менее 1 ч для выпадения осадков.
- Центрифугируют образцы при 6 000 × г в течение 10 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулы в 200 мкл деионизированной воды.
- Повторите этот процесс осаждения этанола 3 раза и повторно суспендируйте конечную гранулу гликогена в 200 мкл деионизированной воды.
- Удалите аликвоту 8 мкл из каждой пробирки для определения содержания гликогена (см. раздел 4).
- Остальные надосадочные жидкости заморозить в жидком азоте и сублимировать (лиофилизировать) на ночь. Храните сухие образцы гликогена в морозильной камере при температуре -20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сухие образцы гликогена должны быть стабильны при -20 °C; Однако нет данных, указывающих на то, как долго они сохраняются без каких-либо структурных изменений.
4. Определение содержания гликогена (рисунок 3)
- Добавьте 8 мкл гликогенной надосадочной жидкости (см. разделы 3.13 и 3.4), 5 мкл амилоглюкозидазы (3269 Ед/мл) и 100 мкл буфера ацетата натрия (1 М, рН 4,5) в микроцентрифужную пробирку и заполните пробирку до отметки 500 мкл деионизированной водой.
- Подготовьте контрольные средства, в которых вместо амилоглюкозидазы используется деионизированная вода.
- Инкубируют образцы при 50 °C в течение 30 мин, держа контрольные элементы на льду.
- Центрифугу при 6 000 × г при 4 °C в течение 10 мин и смешайте 300 мкл каждого полученного надосадочной жидкости с 1 мл реагента глюкозидоксидазы/пероксидазы (GOPOD).
- Постройте градуировочную кривую, смешав 300 мкл денионизированной воды, содержащей 0, 10, 20, 30, 40 и 50 мкг D-глюкозы, с 1 мл реагента GOPOD.
- Выдерживают смеси при температуре 50 °C еще 30 мин.
- Считывание поглощения (510 нм) каждого образца с помощью 96-луночных планшетов (150 мкл на лунку) с помощью спектрофотометра УФ-видимого диапазона.
- Вычтите абсорбцию контрольных образцов (без амилоглюкозидазы) из абсорбции экспериментальных образцов, затем рассчитайте содержание гликогена на основе стандартной кривой D-глюкозы.
5. Определение выхода сырой нефти, выхода гликогена и чистоты
- Чтобы получить сырой выход, взвесьте образец лиофилизированного гликогена и рассчитайте выход в процентах от влажной ткани печени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот выход должен быть скорректирован с поправкой на аликвоты, взятые на каждом этапе содержания гликогена. - Для чистоты гликогена определите содержание гликогена в конечных гранулах, как описано в разделе 4. Рассчитайте чистоту в процентах от определенного содержания гликогена по отношению к выходу сырой нефти (см. шаг 5.1).
- Для получения гликогена определяют содержание гликогена в гомогенизированных образцах без кипячения и перед центрифугированием, как описано в разделе 4. Рассчитайте выход гликогена в процентах от содержания гликогена в конечных гранулах (см. шаг 5.2) к проценту содержания гликогена, определенного в исходном гомогенате.
6. Анализ распределений по длине цепи (рис. 4)
- Взвесьте 0,5 мг лиофилизированного гликогена в пробирках по 1,5 мл.
- Добавьте в пробирки 90 мкл деионизированной воды и 1,5 мкл азида натрия (0,04 г/мл).
- Добавьте 5 мкл уксуснокислого буфера (0,1 М, рН 3,5) и 2 мкл раствора изоамилазы (180 ЕД/мг) в пробирки для расщепления гликогена.
- Инкубируют образцы при 37 °C в течение 3 ч.
- Добавьте к образцам 5 мкл раствора гидроксида натрия (0,1 М) для повышения рН до 7,0.
- Заморозьте образцы в жидком азоте и высушите (лиофилизируют) в течение ночи.
- К лиофилизированному разветвленному гликогену добавляют 2 мкл раствора APTS (5 мг APTS в 50 мкл 15% ледяной уксусной кислоты) и 2 мкл цианоборогидрида натрия (1 М).
- Центрифугируют образцы при 4 000 × г в течение 2 мин.
- Инкубируют образцы при 60 °C в течение 3 ч в темноте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тюбик можно накрыть алюминиевой фольгой, чтобы защитить содержимое от света. - Добавьте 200 мкл деионизированной воды к образцам и встряхните их до тех пор, пока весь осадок не растворится.
- Центрифугируют образцы при 4 000 × г в течение 2 мин.
- Перенесите аликвоты по 50 мкл в микрофлаконы с флуорофорным электрофорезом (FACE) для анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Данные представлены в виде относительного количества (разветвленных) цепей (Nde(X)) для каждой степени полимеризации (DP, символ X).
7. Анализ молекулярных распределений по размерам (рис. 5)
- Растворяют 0,5 мг лиофилизированного гликогена в 50 мМ аммиачной селитре и 0,02% азида натрия в дозе 1 мг/мл.
- Инкубируют образцы в термомиксере при 80 °C в течение 3 ч при 300 об/мин.
- Вводят образцы в систему SEC с помощью предварительной колонны и колонок 1000 Å и 10 000 Å при 80 °C с расходом 0,3 мл/мин (см. таблицу материалов). Используйте детектор показателя преломления для определения относительного веса молекул в каждом объеме элюирования.
- Используя пуллулановые стандарты (PSS) с молярными массами в диапазоне от 342 до 1,22 × 106, постройте универсальную калибровочную кривую SEC для преобразования времени элюирования в Rh (гидродинамический радиус). Выразите данные детектора дифференциального показателя преломления (DRI) в виде распределения веса SEC w (log Rh) в зависимости от Rh.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В то время как описанная выше процедура является наиболее оптимальным методом (30% сахарозы с добавлением 10-минутной стадии кипячения), здесь приведены данные для гликогена, экстрагированного с помощью трех концентраций сахарозы (30%, 50%, 72,5%), со стадией кипячения и без нее, как описано ранее21. В соответствии с протоколом чистота, выход сырой нефти и выход гликогена сухого гликогена, экстрагированного в различных условиях, приведены в таблице 1, воспроизведенной из21. Существенных различий в выходе сырой нефти и гликогена между группами, извлеченными в различных условиях, не выявлено. Напротив, на чистоту гликогена существенное влияние оказывали как концентрации сахарозы (Таблица 1, P < 0,001), так и добавление стадии кипячения (Таблица 1, P < 0,0001). Гликоген с высочайшей чистотой экстрагировали с использованием 30%-ной концентрации сахарозы вместе с 10-минутной стадией кипячения, поэтому он был определен как наиболее оптимальный из тестируемых условий.
Распределение молекул по размерам было использовано для оценки влияния различных условий на размер молекул в конечном экстракте. Они были получены с помощью водной системы SEC, как описано ранее25. Нормализация каждого распределения до одного и того же максимального значения позволила сравнить относительную долю частиц α и β из каждого метода, показанного на рисунке 6 и воспроизведенном из21. ЗначениеR h , при котором возникают максимумы (Rh,max), и среднее значение Rh (
) приведены в таблице 2, воспроизведенной из21. Молекулы гликогена с Rh < 30 нм были определены как β частиц11. Содержание β частиц рассчитывалось как площадь под кривой (AUC) (Rh < 30 нм)/AUC (общая Rh). Кипяченые образцы имели более низкие средние значения Rh и более высокое содержание частиц β, чем некипяченые образцы (табл. 2, P < 0,05). Более низкие концентрации сахарозы приводили к более низким значениям и более высокому содержанию частиц β (табл. 2, P <0,05). Введение стадии кипячения также привело к снижению значений Rh,max (табл. 2, Р<0,05), в то время как концентрация сахарозы не оказала существенного влияния.
Распределения длины цепи (CLD) представляют относительное число цепей каждой заданной длины (число соединенных единиц глюкозы или степень полимеризации), полученное с помощью FACE. CLD показаны на рисунке 7 и воспроизведены с использованием данныхиз 21. Среднечисленная длина цепи (ACL) рассчитывалась по формуле (ΣX X Nde(X))/ (ΣX Nde(X)) (табл. 2). ACL некипяченых образцов были значительно меньше и вариабельнее, чем у вареных образцов (табл. 2, стр. < 0,05). Тем не менее, концентрация сахарозы не оказывала существенного влияния на ACL. Это подтвердило гипотезу о том, что кипячение образцов в течение 10 мин в качестве стадии предварительной экстракции сохранит структуру гликогена. Предложенный механизм заключается в денатурации гликогенрасщепляющих ферменты.
Рисунок 1: Три уровня структуры гликогена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Процесс экстракции гликогена. Этапы извлечения и очистки гликогена из печени мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Определение содержания гликогена. Этапы определения содержания гликогена в гомогенате печени, очищенном сухом гликогене или растворе гликогена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Анализ распределений по длине цепи. Этапы анализа распределения длины цепи с помощью системы электрофореза углеводов с флуорофором. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Анализ молекулярных распределений по размерам. Этапы анализа молекулярного распределения по размерам с помощью системы водной исключающей хроматографии по размеру. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Распределение SEC по весу цельного (не разветвленного) гликогена печени мыши. Экстракцию проводили в различных условиях, нормированных так, чтобы иметь один и тот же максимум в w(log Rh). Каждый гомогенат печени делили на шесть равных объемов, а гликоген извлекали из 30%, 50% или 72,5% сахарозы, вареной или некипяченой. Кривые представляют собой среднее значение при заданном Rh с SD, расположенным по обе стороны от основной линии (n = 4-6 при удалении выборок с недостаточным сигнал-шум). А) гликоген, экстрагированный 30%-ной сахарозой, кипяченый или некипяченый; (Б) гликоген, экстрагированный 50% сахарозы, кипяченый или некипяченый; (C) гликоген, экстрагированный 72,5% сахарозы, в кипяченом или некипяченом виде. Эта цифра была адаптирована из21. Сокращения: SEC = эксклюзионная хроматография; SD = стандартное отклонение; Rh = гидродинамический радиус; w(log Rh) = распределение веса SEC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Распределение длины цепи, Nde(X) гликогена. Анализ длины цепи был проведен на шести печени как для вареной, так и для некипяченой печени с использованием концентраций сахарозы 30%, 50% и 72,5% на стадии ультрацентрифугирования. Значения для каждого DP представляют собой среднее значение ± SD (N = 6). А) гликоген, экстрагированный 30%-ной сахарозой, кипяченый или некипяченый; (Б) гликоген, экстрагированный 50% сахарозы, кипяченый или некипяченый; (C) гликоген, экстрагированный 72,5% сахарозы, в кипяченом или некипяченом виде. Эта цифра была адаптирована из21. Аббревиатура: Nde(X) = распределение длины цепи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Выход сырой нефти (%) | Чистота (%) | Выход гликогена (%) | |
| 30% Сахароза-С | 2,1 ± 1,0А | 13,1 ± 12,0млрд | 10,7 ± 9,1А |
| 50% Сахароза-С | 1,2 ± 0,7А | 23.3 ± 20.1млрд | 10,2 ± 8,1А |
| 72,5% Сахароза-С | 1,9 ± 0,8А | 9,8 ± 9,0 млрд | 5,3 ± 2,4А |
| 30% Сахароза-b | 0,8 ± 0,4А | 67,9 ± 16,8А | 16,0 ± 5,1А |
| 50% Сахароза-b | 1,1 ± 0,6А | 48,6 ± 16,9А | 14,8 ± 7,6А |
| 72,5% Сахароза-b | 2,0 ± 0,9А | 14,7 ± 12,6млрд | 6,9 ± 3,7А |
| Двусторонний ANOVA | Сахароза: P = 0,053 | Сахароза: P < 0,001 | Сахароза: P = 0,034 |
| Температура: P = 0,108 | Температура: P < 0,0001 | Температура: P = 0,116 | |
| Взаимодействие: P = 0,11 | Взаимодействие: P = 0,003 | Взаимодействие: P = 0,801 |
Таблица 1: Чистота, выход сырца, выход гликогена. Выход сырой нефти, чистота и выход гликогена для образцов гликогена печени, экстрагированных 30%, 50% или 72,5% сахарозы, кипяченой или некипяченой. -c - образцы, извлеченные холодным буфером; -б образцы экстрагировали кипячением в течение 10 мин. Значения задаются в виде среднего ± стандартного отклонения (SD), n = 6. Различия в значениях с разными надстрочными буквами в одном столбце статистически значимы (P < 0,05). Эта таблица была воспроизведена с разрешения21.
|
Среднее значение Rh,max | β контент | Среднее значение ACL | |
| 30% Сахароза-С | 29,4 ± 1,5млрд | 34,9 ± 0,6А | 40,9 ± 6,2%a,b | 4,8 ± 0,5С |
| 50% Сахароза-С | 32,0 ± 1,1а,б | 36,1 ± 0,5А | 28,5 ± 3,0%b,c | 5,6 ± 1,1г. до н.э. |
| 72,5% Сахароза-С | 34,3 ± 1,8А | 36,2 ± 0,4А | 23,7 ± 3,5%c | 4,7 ± 0,9с |
| 30% Сахароза-b | 29,4 ± 1,2млрд | 33,7 ± 3,1А | 43,1 ± 5,1%А | 8,6 ± 1,8А |
| 50% Сахароза-b | 30,1 ± 1,2млрд | 34,9 ± 0,7А | 36,0 ± 7,2%a,b,c | 8,8 ± 1,7А |
| 72,5% Сахароза-b | 30,9 ± 3,5А,Б | 33,6 ± 3,5А | 34,0 ± 13,1%a,b,c | 7,6 ± 1,9А,Б |
| Двусторонний ANOVA | Сахароза: P = 0,002 | Сахароза: P = 0,442 | Сахароза: P < 0,001 | Сахароза: P = 0,290 |
| Температура: P = 0,010 | Температура: P = 0,032 | Температура: P = 0,016 | Температура: P < 0,0001 | |
| Взаимодействие: P = 0,431 | Взаимодействие: P = 0,640 | Взаимодействие: P = 0,441 | Взаимодействие: P = 0,750 |
Таблица 2: и Rh , при котором возникают максимумы (Rh,max) и средняя длина цепи (ACL). и Rh , при котором возникают максимумы (Rh,max), содержание частиц β и средняя длина цепи (ACL) гликогена, извлеченного из 30%, 50% или 72,5% сахарозы, кипяченой или некипяченой. -с некипяченый; -b включал в себя 10-минутную стадию кипячения. Различия в значениях с разными надстрочными буквами в одном столбце статистически значимы (P < 0,05). Эта таблица была воспроизведена с разрешения 21. Сокращения: Rh = гидродинамический радиус; = ; ACL = средняя длина цепи; Rh,max = Rh , при котором возникают максимумы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Предыдущие исследования показали, что структура гликогена важна для его свойств; Например, размер молекулы влияет на скорость деградации гликогена10, а распределение длины цепи влияет на его растворимость26. Чтобы правильно понять эти взаимосвязи, важно экстрагировать гликоген с помощью процедуры, которая изолирует, насколько это возможно, репрезентативный и неповрежденный образец. В традиционных методах экстракции использовались либо горячие щелочные условия, либо холодная кислота. Несмотря на то, что эти методы эффективны для отделения гликогена от других тканевых компонентов, они химически агрессивны и, как было показано, разрушают молекулярную структуру гликогена27.
С тех пор был разработан относительно щадящий метод, который использует центрифугирование с градиентом плотности сахарозы17,18, что позволяет гликогену образовываться в грануле, в то время как большая часть клеточного материала остается в надосадочной жидкости. Этот метод особенно полезен для тканей печени, так как частицы гликогена α чувствительны к кислотному гидролизу28. Этот более мягкий метод, однако, имеет, по крайней мере, два потенциальных механизма выделения гликогена, отличающихся по структуре от наблюдаемой in vivo: 1) более мелкие, менее плотные частицы гликогена более восприимчивы к оставлению в надосадочной жидкости во время центрифугирования градиента плотности сахарозы17,18, поскольку они могут не достичь гранулы; 2) Более мягкие условия могут позволить ферментам деградации гликогена, которые были бы денатурированы в более жестких щелочных/кислотных условиях экстракции, продолжать разрушать частицы гликогена во время экстракции.
Недавняя публикация21 была направлена на то, чтобы помочь решить эти потенциальные проблемы, путем тестирования ряда концентраций сахарозы (и, следовательно, плотностей), обнаружив, что использование концентрации 30%, в отличие от традиционно используемых 72,5%, помогает свести к минимуму потерю более мелких частиц гликогена. В будущих экспериментах можно было бы проверить еще более низкие концентрации, чтобы увидеть, не теряются ли некоторые более мелкие частицы в надосадочной жидкости во время центрифугирования. В этой публикации также проверялась эффективность введения 10-минутной стадии кипячения непосредственно после гомогенизации тканей для денатурации ферментов деградации гликогена, тем самым сохраняя структуру гликогена. Было показано, что этот шаг помогает ингибировать деградацию гликогена, при этом длина гликогеновой цепи значительно сохраняется. Дальнейшие эксперименты в этом исследовании предоставили доказательства того, что этот 10-минутный этап кипячения вряд ли приведет к значительному повреждению структуры гликогена. Однако эта стадия кипения может влиять на структуру гликоген-ассоциированных белков, потенциально приводя к денатурации и последующей диссоциации белков от гликогена. Поэтому, если протеомика представляет интерес, использование низкой концентрации сахарозы (30%) без кипячения (образцы, хранящиеся на льду) может быть предпочтительнее, с оговоркой, что гликоген может быть немного деградирован.
При использовании центрифугирования с градиентом плотности сахарозы без дальнейших экспериментов по оптимизации наиболее подходящим методом является использование относительно низкой концентрации сахарозы (30%) с введением 10-минутной стадии кипячения непосредственно после гомогенизации ткани. У этого метода есть некоторые ограничения. Во-первых, это было оптимизировано для гликогена печени, и важно отметить, что это может быть не так хорошо для гликогена из других тканей. Во-вторых, как упоминалось выше, самая низкая концентрация сахарозы составила 30%, и вполне возможно, что более низкие концентрации могут быть предпочтительнее. В-третьих, оптимизированного метода, предотвращающего ферментативную деградацию гликогена при сохранении связанного с ним протеома, пока не существует.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность г-ну Гаошэн Ву и г-же Юньвэнь Чжу за техническую помощь в работе с FACE, а также г-ну Чжэнься Ху и г-ну Дэнбиню за техническую помощь в работе с Комиссией по ценным бумагам и биржам. MAS поддерживается стипендией Advance Queensland Industry Research Fellowship, Mater Foundation, Equity Trustees и Фондами Л. Г. МакКаллама Эста и Джорджа Уибера. Эта работа была поддержана Приоритетной академической программой высших учебных заведений провинции Цзянсу, грантом Фонда естественных наук Китая C1304013151101138 и Программой талантов инноваций и предпринимательства провинции Цзянсу 2017 года. Рисунки 1-5 были созданы с помощью BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate (APTS) | SIGMA Aldrich | 9341 | 0.1 M solution |
| Acetic acid | SIGMA Aldrich | 695092 | 0.1 M, pH 3.5 solution |
| Agilent 1260 Infinity SEC system | Agilent, Santa Clara, CA, USA | Size-exclusion chromatography (SEC) | |
| BKS-DB/Nju background mice | Nanjing Biomedical Research Institution of Nanjing University | ||
| D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format) | Megazyme | K-GLUC | |
| Ethylenedinitrilotetraacetic acid (EDTA) | SIGMA Aldrich | 431788 | |
| Homogenizer | IKA | T 25 | |
| Hydrochloric acid | SIGMA Aldrich | 2104 | 0.1 M solution |
| Hydrochloric acid | SIGMA Aldrich | 2104 | 0.1 M solution |
| P/ACE MDQ plus system | Ab Sciex, US | Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE) | |
| Refractive index detector | Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA) | Size-exclusion chromatography (SEC) | |
| Sodium acetate | SIGMA Aldrich | 241245 | 1 M, pH 4.5 solution |
| Sodium azide | SIGMA Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | SIGMA Aldrich | S9888 | |
| Sodium cyanoborohydride | SIGMA Aldrich | 156159 | 1 M solution |
| Sodium fluoride | SIGMA Aldrich | 201154 | |
| Sodium hydroxide | SIGMA Aldrich | 43617 | 0.1 M solution |
| Sodium nitrate | SIGMA Aldrich | NISTRM8569 | |
| Sodium pyrophosphate | SIGMA Aldrich | 221368 | |
| Sucrose | SIGMA Aldrich | V90016 | |
| SUPREMA pre-column, 1,000 and 10,000 columns | Polymer Standards Services, Mainz, Germany | Size-exclusion chromatography (SEC) | |
| Trizma | SIGMA Aldrich | T 1503 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | 4 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 11 x 60 mm |
References
- Hills, D. M., Heller, H. C., Hacker, S. D., Hall, D. W., Sadava, D., Laskowski, M. Life: the science of biology. 12th edn. Freeeman, W. H. , (2020).
- Calder, P. C., Geddes, R. Glycogen of high molecular weight from mammalian muscle. Carbohydrate Research. 135 (2), 249-256 (1985).
- Rybicka, K. K. Glycosomes - The organelles of glycogen metabolism. Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).
- Takeuchi, T., Iwamasa, T., Miyayama, H. Ultrafine structure of glycogen macromolecules in mammalian-tissues. Journal of Electron Microscopy. 27 (1), 31-38 (1978).
- Drochmans, P. Morphologie du glycogene - etude au microscope electronique de colorations negatives du glycogene particulaire. Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).
- Besford, Q. A., et al. The structure of cardiac glycogen in healthy mice. International Journal of Biological Macromolecules. 51 (5), 887-891 (2012).
- Lumsden, R. D. Macromolecular structure of glycogen in some cyclophyllidean and trypanorhynch cestodes. Journal of Parasitology. 51 (4), 501-515 (1965).
- Deng, B., et al. Molecular structure of glycogen in diabetic liver. Glycoconjugate Journal. 32 (3-4), 113-118 (2015).
- Deng, B., et al. The mechanism for stopping chain and total-molecule growth in complex branched polymers, exemplified by glycogen. Biomacromolecules. 16 (6), 1870-1872 (2015).
- Jiang, X., et al. The molecular-size dependence of glycogen enzymatic degradation rate and its importance for diabetes. European Polymer Journal. 82 (1), 175-180 (2016).
- Hu, Z., et al. Glycogen structure in type 1 diabetic mice: towards understanding the origin of diabetic glycogen molecular fragility. International Journal of Biological Macromolecules. 128, 665-672 (2019).
- Suzuki, Y., et al. Insulin control of glycogen metabolism in knockout mice lacking the muscle-specific protein phosphatase PP1G/R-GL. Molecular and Cellular Biology. 21 (8), 2683-2694 (2001).
- Stetten, M. R., Katzen, H. M., Stetten, D. Metabolic inhomogeneity of glycogen as a function of molecular weight. Journal of Biological Chemistry. 122 (2), 587-599 (1956).
- Nahorski, S. R., Rogers, K. J. An enzymic fluorometric micro method for determination of glycogen. Analytical Biochemistry. 49 (2), 492-497 (1972).
- Wang, Z., et al. Molecular structural features of glycogen in the kidneys of diabetic rats. Carbohydrate Polymers. 229, 115526 (2020).
- Wang, L., et al. Molecular structure of glycogen in Escherichia coli. Biomacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).
- Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362, 811-815 (2007).
- Ryu, J. -H., et al. Comparative structural analyses of purified glycogen particles from rat liver, human skeletal muscle and commercial preparations. International Journal of Biological Macromolecules. 45 (5), 478-482 (2009).
- Sullivan, M. A., et al. Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions. Biomacromolecules. 11 (4), 1094-1100 (2010).
- Tan, X., et al. A new non-degradative method to purify glycogen. Carbohydrate Polymers. 147 (1), 165-170 (2016).
- Wang, Z., Liu, Q., Wang, L., Gilbert, R. G., Sullivan, M. A. Optimization of liver glycogen extraction when considering molecular fine structure. Carbohydrate Polymers. 261, 117887 (2020).
- Zhao, Y., Tan, X., Wu, G., Gilbert, R. G. Using molecular fine structure to identify optimal methods of extracting starch. Starch - Starke. 72, 1900214 (2020).
- Shokri-Afra, H., Ostovar-Ravari, A., Rasouli, M. Improvement of the classical assay method for liver glycogen fractions: ASG is the main and metabolic active fraction. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 20, 4328-4336 (2016).
- Kerly, M.
- Sullivan, M. A., et al. Improving size-exclusion chromatography for glycogen. Journal of Chromatography A. 1332 (1), 21-29 (2014).
- Sullivan, M. A., et al. Skeletal muscle glycogen chain length correlates with insolubility in mouse models of polyglucosan-associated neurodegenerative diseases. Cell Reports. 27 (5), 1334-1344 (2019).
- Orrell, S. A., Bueding, E. A comparison of products obtained by various procedures used for the extraction of glycogen. Journal of Biological Chemistry. 239 (12), 4021-4026 (1964).
- Sullivan, M. A., et al. Molecular insights into glycogen alpha-particle formation. Biomacromolecules. 13 (11), 3805-3813 (2012).
