Summary
Für die Extraktion von Leberglykogen wurde mittels Saccharosedichtegradientenzentrifugation eine optimale Saccharosekonzentration bestimmt. Die Zugabe eines 10-minütigen Siedeschritts zur Hemmung von Glykogen-abbauenden Enzymen erwies sich als vorteilhaft.
Abstract
Leberglykogen ist ein hyperverzweigtes Glukosepolymer, das an der Aufrechterhaltung des Blutzuckerspiegels bei Tieren beteiligt ist. Die Eigenschaften von Glykogen werden durch seine Struktur beeinflusst. Daher ist eine geeignete Extraktionsmethode, die repräsentative Glykogenproben isoliert, für die Untersuchung dieses Makromoleküls von entscheidender Bedeutung. Im Vergleich zu anderen Extraktionsmethoden kann eine Methode, die einen Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugationsschritt verwendet, molekulare Schäden minimieren. Basierend auf dieser Methode wird in einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung beschrieben, wie die Dichte der während der Zentrifugation verwendeten Saccharoselösung variiert wurde (30 %, 50 %, 72,5 %), um die am besten geeignete Konzentration zur Extraktion von Glykogenpartikeln einer Vielzahl von Größen zu finden und den Verlust kleinerer Partikel zu begrenzen. Ein 10-minütiger Siedeschritt wurde eingeführt, um seine Fähigkeit zu testen, Glykogen abbauende Enzyme zu denaturieren und so Glykogen zu erhalten. Es wurde gezeigt, dass die niedrigste Saccharosekonzentration (30 %) und die Zugabe des Siedeschritts die repräsentativsten Glykogenproben extrahieren.
Introduction
Glykogen ist ein komplexes, hyperverzweigtes Glukosepolymer, das in Tieren, Pilzen und Bakterien vorkommt1. Bei Säugetieren fungiert das Glykogen der Leber als Blutzuckerpuffer und erhält die Homöostase, während das Muskelglykogen als kurzfristiges Glukosereservoir fungiert, um Energie direkt bereitzustellen2. Die Struktur von Glykogen wird häufig durch drei Ebenen beschrieben (siehe Abbildung 1): 1. Lineare Ketten werden von Glukosemonomeren über (1→4)-α glykosidische Bindungen gebildet, wobei Verzweigungspunkte über (1→6)-α glykosidische Bindungen verbunden sind; 2. stark verzweigte β Partikel (~20 nm Durchmesser), die, insbesondere in Geweben wie der Skelettmuskulatur, als unabhängige Glykogenmoleküle wirken 3,4; 3. Größere α Glykogenpartikel (bis zu 300 nm Durchmesser), die aus kleineren β Glykogeneinheiten bestehen, die in der Leber5, im Herzen6 und in einigen Nicht-Säugetierarten7 vorkommen. Leber-α-Partikel von diabetischen Mäusen sind molekular zerbrechlich und neigen dazu, zu β-Partikeln abgebaut zu werden, wenn sie in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst werden, während α Partikel von nicht-diabetischen Kontrollen im Allgemeinen unverändert bleiben. Eine Hypothese ist, dass diese Fragilität den schlechten Blutzuckerhaushalt bei Diabetes verschlimmern kann, wobei die empfindlichen α Partikel möglicherweise zu höheren Anteilen der schneller abbaubaren β Partikel 8,9,10,11 führen.
Herkömmliche Glykogenextraktionsmethoden nutzen die relativ rauen Bedingungen, bei denen das Lebergewebe heißer alkalischer Lösung12 oder sauren Lösungen wie Trichloressigsäure (TCA)13 oder Perchlorsäure (PCA)14 ausgesetzt wird. Diese Methoden sind zwar wirksam bei der Trennung des Glykogens von anderen Bestandteilen des Lebergewebes, bauen aber unweigerlich die Glykogenstruktur bis zu einem gewissen Grad ab15,16. Obwohl diese Methoden für die quantitative Messung des Glykogengehalts geeignet sind, sind sie aufgrund dieser strukturellen Schädigung nicht ideal für Studien, die sich auf die Gewinnung struktureller Informationen über das Glykogen konzentrieren. Seit der Entwicklung dieser Methoden wurde ein milderes Extraktionsverfahren entwickelt, bei dem kalter Tris-Puffer (der nachweislich den Glucosidaseabbau hemmt) mit Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation verwendetwird 17,18,19. Da der pH-Wert auf ~8 eingestellt ist, wird das Glykogen bei dieser Methode nicht der sauren oder alkalischen Hydrolyse ausgesetzt, die bei früheren Verfahren beobachtet wurde.
Die Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation von homogenisiertem Lebergewebe kann Glykogenpartikel vom Großteil des Zellmaterials trennen. Falls erforderlich, kann eine zusätzliche Reinigung durch präparative Größenausschlusschromatographie durchgeführt werden, was zur Sammlung von gereinigtem Glykogen mit angehängten Glykogen-assoziierten Proteinenführt 20. Obwohl diese Methode unter milderen Bedingungen die Struktur des Glykogens eher bewahrt, ist es schwierig zu verhindern, dass ein Teil des Glykogens im Überstand verloren geht, insbesondere bei kleineren Glykogenpartikeln, die weniger dicht sind15. Eine weitere mögliche Ursache für den Glykogenverlust ist, dass die milderen Bedingungen einen gewissen enzymatischen Abbau ermöglichen, was im Vergleich zu härteren Extraktionsmethoden zu niedrigeren Glykogenausbeuten führt. Neuere Forschungen berichteten über die Optimierung der Leber-Glykogen-Extraktionsmethode, um die Struktur von Glykogen21 zu erhalten. Hier wurden verschiedene Saccharosekonzentrationen (30 %, 50 %, 72,5 %) getestet, um festzustellen, ob niedrigere Saccharosekonzentrationen den Verlust kleinerer Glykogenpartikel minimieren. Der Grundgedanke war, dass die geringere Dichte es kleineren, weniger dichten Partikeln ermöglichen würde, die Saccharoseschicht zu durchdringen und sich mit dem Rest des Glykogens im Pellet zu aggregieren.
In dieser Studie wurden die Extraktionsmethoden mit und ohne einen 10-minütigen Siedeschritt verglichen, um zu testen, ob Glykogenabbauenzyme denaturiert werden können, was zur Extraktion von mehr Glykogen führt, das auch frei von teilweisem Abbau ist. Zur Bestimmung der Struktur des extrahierten Glykogens wurden ganze Molekülgrößenverteilungen und die Längenverteilungen der Glykogenkette verwendet, ähnlich einer zuvor veröffentlichten Optimierung der Stärkeextraktion22. Die Größenausschlusschromatographie (SEC) mit differentiellem Brechungsindex (DRI) wurde verwendet, um die Größenverteilungen von Glykogen zu erhalten, die das Gesamtmolekulargewicht als Funktion der Molekülgröße beschreiben. Die Fluorophor-gestützte Kohlenhydratelektrophorese (FACE) wurde verwendet, um die Kettenlängenverteilungen zu analysieren, die die relative Anzahl der Glucosidketten jeder bestimmten Größe (oder jedes Polymerisationsgrades) beschreiben. In diesem Artikel wird die Methodik zur Extraktion von Glykogen aus Lebergewebe beschrieben, die auf der vorherigen Optimierungsstudie21 basiert. Die Daten deuten darauf hin, dass die Methode, die am besten geeignet ist, um die Glykogenstruktur zu erhalten, eine Saccharosekonzentration von 30 % mit einem 10-minütigen Siedeschritt ist.
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Protocol
Die zur Optimierung dieses Verfahrens verwendeten Mäuseleber21 stammten von 12 männlichen BKS-DB/Nju-Hintergrundmäusen (7,2 Wochen alt, siehe Materialtabelle). Die Verwendung von Tieren wurde vom Renmin Hospital of Wuhan University Animal Care and Ethics Committee, IACUC Issue No. WDRM 20181113.
1 Tierische Gewebe
- Mäuseleber wiegen (1-1,8 g ganze Leber von jeder Maus).
- Die Mäuseleber schnell in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern.
2. Herstellung von Puffer und Reagenzien
- Bereiten Sie einen Glykogenisolationspuffer mit 5 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF und 5 mM Natriumpyrophosphat mit deionisiertem Wasser vor und stellen Sie den pH-Wert auf 8 ein.
- Bereiten Sie 30%ige (w/w) Saccharoselösung vor (die sich als am optimalsten für Leberglykogen21 erwiesen hat).
- Natriumacetatpuffer (1 M, pH 4,5), Essigsäurepuffer (0,1 M, pH 3,5), Natronlauge (0,1 M) und Natriumcyanoborhydrid (1 M) herstellen.
- Bereiten Sie 8-Aminopyren-1,3,6-trisulfonat (APTS)-Lösung vor, indem Sie 5 mg APTS zu 50 μl 15%iger Eisessigsäure hinzufügen.
- Ammoniumnitratlösung mit 50 mM Ammoniumnitrat mit 0,02 % Natriumazid herstellen.
3. Glykogenextraktion (Abbildung 2)
- Das gefrorene Lebergewebe (~1 g) wird in ein 15-ml-Röhrchen mit 6 ml Glykogenisolationspuffer überführt.
- Halten Sie es auf Eis und homogenisieren Sie das Lebergewebe mit einem Gewebehomogenisator.
- Die Hälfte der Suspension (3 ml) wird in ein neues Röhrchen überführt und 10 Minuten lang gekocht (was sich als optimal für Glykogenstrukturstudien erwiesen hat21). Bewahren Sie die andere Hälfte der Suspension (3 ml) auf Eis auf, um Glykogen zu extrahieren, das assoziierte Proteine enthält, die nicht denaturiert sind.
HINWEIS: Ungekochte Proben sollten während der Glykogenextraktion immer auf Eis gelegt werden. Wenn Glykogenproteine für die Untersuchung nicht wichtig sind, kann die gesamte Probe dem 10-minütigen Kochschritt unterzogen werden. - Entnehmen Sie ein 8-μl-Aliquot aus jedem Röhrchen, bewahren Sie die Aliquoten auf Eis auf und verwenden Sie sie für die Bestimmung des Glykogengehalts (siehe Abschnitt 4).
- Die restliche Suspension wird bei 6.000 × g 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
- Die Überstände werden in Ultrazentrifugenröhrchen überführt und bei 3,6 × 10,5g 90 min bei 4 °C zentrifugiert.
- Verwerfen Sie die verbleibenden Überstände und resuspendieren Sie die Pellets in 1,5 ml Glykogenisolationspuffer.
- Die Proben werden über 1,5 ml 30%ige Saccharoselösung in 4-ml-Ultrazentrifugenröhrchen geschichtet und bei 3,6 × 105 g für 2 h bei 4 °C zentrifugiert.
- Die verbleibenden Überstände werden verworfen und die Pellets in 200 μl deionisiertem Wasser resuspendiert.
- Den Suspensionen werden 800 μl absolutes Ethanol zugegeben und gut vermischt, um Glykogen23,24 auszufällen. Lagern Sie die Mischungen mindestens 1 h bei -20 °C, damit sie ausfällen können.
- Die Proben werden bei 6.000 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Verwerfen Sie die Überstände und resuspendieren Sie die Pellets in 200 μl deionisiertem Wasser.
- Wiederholen Sie diesen Ethanolfällungsprozess 3x und resuspendieren Sie das endgültige Glykogenpellet in 200 μl deionisiertem Wasser.
- Entnehmen Sie ein Aliquot von 8 μl aus jedem Röhrchen, um den Glykogengehalt zu bestimmen (siehe Abschnitt 4).
- Die restlichen Überstände in flüssigem Stickstoff einfrieren und über Nacht gefriertrocknen (gefriergetrocknet). Lagern Sie die trockenen Glykogenproben im Gefrierschrank bei -20 °C.
HINWEIS: Die trockenen Glykogenproben sollten bei -20 °C stabil sein. Es gibt jedoch keine Daten darüber, wie lange sie ohne strukturelle Veränderungen andauern.
4. Bestimmung des Glykogengehalts (Abbildung 3)
- 8 μl der Glykogenüberstände (siehe Abschnitte 3.13 und 3.4), 5 μl Amyloglucosidase (3269 U/ml) und 100 μl Natriumacetatpuffer (1 m, pH 4,5) werden in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und das Röhrchen bis zur 500-μl-Markierung mit deionisiertem Wasser gefüllt.
- Bereiten Sie Kontrollen vor, die deionisiertes Wasser anstelle von Amyloglucosidase verwenden.
- Die Proben werden 30 Minuten lang bei 50 °C inkubiert, während die Kontrollen auf Eis bleiben.
- Bei 6.000 × g bei 4 °C 10 min zentrifugieren und 300 μl jedes resultierenden Überstandes mit 1 ml Glucosidase-Oxidase/Peroxidase-Reagenz (GOPOD) mischen.
- Erstellen Sie eine Kalibrierungskurve, indem Sie 300 μl denionisiertes Wasser mit 0, 10, 20, 30, 40 und 50 μg D-Glucose mit 1 ml GOPOD-Reagenz mischen.
- Die Mischungen bei 50 °C weitere 30 min inkubieren.
- Lesen Sie die Absorption (510 nm) jeder Probe mit 96-Well-Platten (150 μl pro Well) mit einem UV-Vis-Spektralphotometer ab.
- Subtrahieren Sie die Absorptionen von Kontrollproben (ohne Amyloglucosidase) von den Absorptionen der experimentellen Proben und berechnen Sie dann den Glykogengehalt auf der Grundlage der D-Glukose-Standardkurve.
5. Rohölausbeute, Glykogenausbeute und Reinheitsbestimmung
- Für die Rohausbeute wird die gefriergetrocknete Glykogenprobe gewogen und die Ausbeute als Prozentsatz des feuchten Lebergewebes berechnet.
HINWEIS: Diese Ausbeute sollte angepasst werden, um die Aliquoten zu korrigieren, die in jedem Glykogengehaltsschritt eingenommen werden. - Für die Glykogenreinheit ist der Glykogengehalt in den fertigen Pellets zu bestimmen, wie in Abschnitt 4 beschrieben. Berechnen Sie die Reinheit als Prozentsatz des ermittelten Glykogengehalts im Verhältnis zur Rohausbeute (siehe Schritt 5.1).
- Für die Glykogenausbeute ist der Glykogengehalt der homogenisierten Proben ohne Kochen und vor jeder Zentrifugation zu bestimmen, wie in Abschnitt 4 beschrieben. Die Glykogenausbeute wird als Prozentsatz des Glykogengehalts in den fertigen Pellets (siehe Schritt 5.2) zu dem im Ausgangshomogenat ermittelten Glykogengehalt berechnet.
6. Analyse der Kettenlängenverteilungen (Abbildung 4)
- Wiegen Sie 0,5 mg gefriergetrocknetes Glykogen in 1,5-ml-Röhrchen.
- 90 μl deionisiertes Wasser und 1,5 μl Natriumazid (0,04 g/ml) in die Röhrchen geben.
- Geben Sie 5 μl Essigsäurepuffer (0,1 m, pH 3,5) und 2 μl Isoamylase-Lösung (180 U/mg) in die Röhrchen, um das Glykogen zu entzweigen.
- Die Proben werden bei 37 °C für 3 h inkubiert.
- Geben Sie 5 μl Natronlauge (0,1 m) zu den Proben, um den pH-Wert auf 7,0 zu erhöhen.
- Die Proben werden in flüssigem Stickstoff eingefroren und über Nacht gefriergetrocknet (lyophilisiert).
- 2 μl APTS-Lösung (5 mg APTS in 50 μl 15%iger Eisessig) und 2 μl Natriumcyanoborhydrid (1 M) werden zum gefriergetrockneten entzweigten Glykogen gegeben.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 4.000 × g für 2 min.
- Die Proben werden bei 60 °C für 3 h im Dunkeln inkubiert.
HINWEIS: Die Tube kann mit Aluminiumfolie abgedeckt werden, um den Inhalt vor Licht zu schützen. - Geben Sie 200 μl deionisiertes Wasser zu den Proben und wirbeln Sie sie, bis sich der gesamte Niederschlag aufgelöst hat.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 4.000 × g für 2 min.
- Zur Analyse werden Aliquoten von 50 μl in Mikrofläschchen mit fluorophorunterstützter Kohlenhydratelektrophorese (FACE) überführt.
ANMERKUNG: Die Daten werden als relative Häufigkeit von (entzweigten) Ketten (Nde(X)) für jeden Polymerisationsgrad (DP, Symbol X) angezeigt.
7. Analyse von Molekülgrößenverteilungen (Abbildung 5)
- 0,5 mg gefriergetrocknetes Glykogen werden in 50 mM Ammoniumnitrat und 0,02 % Natriumazid bei 1 mg/ml gelöst.
- Die Proben werden in einem Thermomischer bei 80 °C für 3 h bei 300 U/min inkubiert.
- Injizieren Sie die Proben in ein SEC-System mit einer Vorsäule und 1000 Å und 10.000 Å Säulen bei 80 °C und einer Flussrate von 0,3 ml/min (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie einen Brechungsindexdetektor, um das relative Gewicht der Moleküle bei jedem Elutionsvolumen zu bestimmen.
- Unter Verwendung von Pullulan-Standards (PSS) mit molaren Massen im Bereich von 342 bis 1,22 × 106 wird eine universelle SEC-Kalibrierkurve aufgetragen, um die Elutionszeit in R h (hydrodynamischer Radius) umzurechnen. Drücken Sie die Daten des DRI-Detektors (Differential Refractive Index) als SEC-Gewichtsverteilung w (log Rh) als Funktion von Rh aus.
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Representative Results
Während das oben beschriebene Verfahren für die optimalste Methode (30 % Saccharose unter Zugabe eines 10-minütigen Siedeschritts) gilt, werden hier Daten für Glykogen bereitgestellt, das über drei Saccharosekonzentrationen (30 %, 50 %, 72,5 %) mit und ohne Siedeschritt extrahiert wurde, wie zuvor beschrieben21. Gemäß dem Protokoll sind die Reinheit, die Rohausbeute und die Glykogenausbeute von trockenem Glykogen, das unter verschiedenen Bedingungen extrahiert wurde, in Tabelle 1 angegeben, die aus21 wiedergegeben ist. Es gab keine signifikanten Unterschiede in der Rohölausbeute und der Glykogenausbeute zwischen den Gruppen, die unter den verschiedenen Bedingungen extrahiert wurden. Im Gegensatz dazu wurde die Glykogenreinheit sowohl durch die Saccharosekonzentrationen (Tabelle 1, P < 0,001) als auch durch die Zugabe eines Siedeschritts (Tabelle 1, P < 0,0001) signifikant beeinflusst. Glykogen mit der höchsten Reinheit wurde unter Verwendung der 30%igen Saccharosekonzentration zusammen mit einem 10-minütigen Siedeschritt extrahiert, weshalb es unter den getesteten Bedingungen als das optimalste eingestuft wurde.
Molekulargrößenverteilungen wurden verwendet, um die Auswirkungen der verschiedenen Bedingungen auf die Größe der Moleküle im endgültigen Extrakt zu bewerten. Diese wurden unter Verwendung eines wässrigen SEC-Systems erhalten, wie zuvor beschrieben25. Die Normalisierung jeder Verteilung auf den gleichen Maximalwert ermöglichte es, den relativen Anteil von α zu β Partikeln aus jeder Methode zu vergleichen, wie in Abbildung 6 dargestellt, reproduziert aus21. Die Rh, bei der die Maxima auftreten (R h,max) und das mittlere Rh (
) sind in Tabelle 2 dargestellt, die aus21 wiedergegeben ist. Glykogenmoleküle mit Rh < 30 nm wurden als β Partikel definiert11. Der β Partikelgehalt wurde als Fläche unter der Kurve (AUC) von (Rh < 30 nm)/AUC (Gesamt-Rh) berechnet. Die gekochten Proben wiesen niedrigere mittlere Rh-Werte und einen höheren β Partikelgehalt auf als die ungekochten Proben (Tabelle 2, P < 0,05). Niedrigere Saccharosekonzentrationen führten zu niedrigeren Werten und höheren β Partikelgehalten (Tabelle 2, P <0,05). Die Einführung einer Siedestufe führte ebenfalls zu niedrigeren Rh,max-Werten (Tabelle 2, P<0,05), während die Saccharosekonzentration keinen signifikanten Einfluss hatte.
Kettenlängenverteilungen (CLDs) geben die relative Anzahl von Ketten jeder gegebenen Länge (Anzahl der verbundenen Glukoseeinheiten oder Polymerisationsgrad) an, die mit FACE erhalten werden. Die CLDs sind in Abbildung 7 dargestellt, die anhand von Daten aus21 reproduziert wurde. Die zahlengemittelte Kettenlänge (ACL) wurde wie folgt berechnet: (ΣX X Nde(X))/ (ΣX Nde(X)) (Tabelle 2). Die ACLs der ungekochten Proben waren signifikant kleiner und variierter als die der gekochten Proben (Tabelle 2, P < 0,05). Die Saccharosekonzentration hatte jedoch keinen signifikanten Einfluss auf die ACLs. Dies stützte die Hypothese, dass das Kochen der Proben für 10 Minuten als Vorextraktionsschritt die Glykogenstruktur erhalten würde. Der vorgeschlagene Mechanismus ist die Denaturierung von Glykogen-abbauenden Enzymen.
Abbildung 1: Die drei Ebenen der Glykogenstruktur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Glykogen-Extraktionsprozess. Schritte zur Extraktion und Reinigung des Glykogens aus der Leber von Mäusen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Bestimmung des Glykogengehalts. Schritte zur Bestimmung des Glykogengehalts in Leberhomogenat, gereinigtem Trockenglykogen oder Glykogenlösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Analyse der Kettenlängenverteilungen. Schritte zur Analyse von Kettenlängenverteilungen durch ein Fluorophor-gestütztes Kohlenhydratelektrophorese-System. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Analyse von Molekülgrößenverteilungen. Schritte zur Analyse der molekularen Größenverteilungen mit einem wässrigen Größenausschlusschromatographiesystem. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: SEC-Gewichtsverteilungen des gesamten (nicht entzweigten) Leberglykogens der Maus. Die Extraktion wurde unter verschiedenen Bedingungen durchgeführt, die normalisiert wurden, um das gleiche Maximum in w(log Rh) zu erreichen. Jedes Leberhomogenat wurde in sechs gleiche Volumina unterteilt, und Glykogen wurde entweder durch 30%, 50% oder 72,5% Saccharose, gekocht oder ungekocht, extrahiert. Die Kurven stellen den Mittelwert bei einer gegebenen Rh dar, wobei die SD auf beiden Seiten der Hauptleitung bereitgestellt wird (n = 4-6, wobei Proben mit unzureichendem Signal-Rausch-Verhältnis entfernt werden). (A) Glykogen, extrahiert aus 30 % Saccharose, gekocht oder ungekocht; (B) Glykogen, extrahiert aus 50 % Saccharose, gekocht oder ungekocht; (C) Glykogen, extrahiert aus 72,5 % Saccharose, gekocht oder ungekocht. Diese Zahl wurde von21 übernommen. Abkürzungen: SEC = Größenausschlusschromatographie; SD = Standardabweichung; Rh = hydrodynamischer Radius; w(log Rh) = SEC-Gewichtsverteilung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Kettenlängenverteilungen, Nde(X), von Glykogen. Die Kettenlängenanalyse wurde an sechs Lebern sowohl für gekochte als auch für ungekochte Lebern unter Verwendung von 30 %, 50 % und 72,5 % Saccharosekonzentrationen im Ultrazentrifugationsschritt durchgeführt. Die Werte für jeden DP stellen den Mittelwert ± SD dar (N = 6). (A) Glykogen, extrahiert aus 30 % Saccharose, gekocht oder ungekocht; (B) Glykogen, extrahiert aus 50 % Saccharose, gekocht oder ungekocht; (C) Glykogen, extrahiert aus 72,5 % Saccharose, gekocht oder ungekocht. Diese Zahl wurde von21 übernommen. Abkürzung: Nde(X) = Kettenlängenverteilung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Rohölausbeute (%) | Reinheit (%) | Glykogenausbeute (%) | |
| 30% Saccharose-c | 2,1 ± 1,0A | 13,1 ± 12,0Mrd | 10,7 ± 9,1A |
| 50% Saccharose-c | 1,2 ± 0,7A | 23,3 ± 20,1Mrd | 10,2 ± 8,1A |
| 72,5% Saccharose-c | 1,9 ± 0,8A | 9,8 ± 9,0 Mrd | 5,3 ± 2,4A |
| 30% Saccharose-b | 0,8 ± 0,4A | 67,9 ± 16,8A | 16,0 ± 5,1A |
| 50% Saccharose-b | 1,1 ± 0,6A | 48,6 ± 16,9A | 14,8 ± 7,6A |
| 72,5% Saccharose-b | 2,0 ± 0,9A | 14,7 ± 12,6Mrd | 6,9 ± 3,7A |
| Zwei-Wege-ANOVA | Saccharose: P = 0,053 | Saccharose: P < 0,001 | Saccharose: p = 0,034 |
| Temperatur: P = 0,108 | Temperatur: P < 0,0001 | Temperatur: P = 0,116 | |
| Wechselwirkung: P = 0,11 | Wechselwirkung: P = 0,003 | Wechselwirkung: P = 0,801 |
Tabelle 1: Reinheit, Rohölausbeute, Glykogenausbeute. Rohausbeute, Reinheit und Glykogenausbeute für Leberglykogenproben, extrahiert aus 30 %, 50 % oder 72,5 % Saccharose, gekocht oder ungekocht. -c wurden Proben mit kaltem Puffer extrahiert; -b wurden Proben durch 10-minütiges Kochen extrahiert. Die Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) n = 6 angegeben. Unterschiede in den Werten mit unterschiedlichen hochgestellten Buchstaben in derselben Spalte sind statistisch signifikant (P < 0,05). Diese Tabelle wurde mit freundlicher Genehmigung von21.
|
Mittelwert Rh,max | β Inhalt | Mittlere ACL | |
| 30% Saccharose-c | 29,4 ± 1,5Mrd | 34,9 ± 0,6A | 40,9 ± 6,2%A,B | 4,8 ± 0,5C |
| 50% Saccharose-c | 32,0 ± 1,1a,b | 36,1 ± 0,5A | 28,5 ± 3,0 % b,c | 5,6 ± 1,1v. Chr. |
| 72,5% Saccharose-c | 34,3 ± 1,8A | 36,2 ± 0,4A | 23,7 ± 3,5%C | 4,7 ± 0,9C |
| 30% Saccharose-b | 29,4 ± 1,2Mrd | 33,7 ± 3,1A | 43,1 ± 5,1 %a | 8,6 ± 1,8A |
| 50% Saccharose-b | 30,1 ± 1,2Mrd | 34,9 ± 0,7A | 36,0 ± 7,2%A,B,C | 8,8 ± 1,7A |
| 72,5% Saccharose-b | 30,9 ± 3,5a,b | 33,6 ± 3,5A | 34,0 ± 13,1%A,B,C | 7,6 ± 1,9a,b |
| Zwei-Wege-ANOVA | Saccharose: p = 0,002 | Saccharose: p = 0,442 | Saccharose: P < 0,001 | Saccharose: p = 0,290 |
| Temperatur: P = 0,010 | Temperatur: P = 0,032 | Temperatur: P = 0,016 | Temperatur: P < 0,0001 | |
| Wechselwirkung: P = 0,431 | Wechselwirkung: P = 0,640 | Wechselwirkung: P = 0,441 | Wechselwirkung: p = 0,750 |
Tabelle 2: und Rh, bei dem die Maxima auftreten (Rh,max) und die durchschnittliche Kettenlänge (ACL). und Rh, bei dem die Maxima auftreten (Rh,max), β Partikelgehalt und die durchschnittliche Kettenlänge (ACL) von Glykogen, das entweder durch 30 %, 50 % oder 72,5 % Saccharose extrahiert wird, gekocht oder ungekocht. -c ungekocht; -b erforderte einen 10-minütigen Siedeschritt. Unterschiede in den Werten mit unterschiedlichen hochgestellten Buchstaben in derselben Spalte sind statistisch signifikant (P < 0,05). Diese Tabelle wurde mit freundlicher Genehmigung von 21. Abkürzungen: Rh = hydrodynamischer Radius; = ; ACL = durchschnittliche Kettenlänge; Rh,max = Rh , bei dem Maxima auftreten.
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Discussion
Frühere Studien haben gezeigt, dass die Struktur von Glykogen wichtig für seine Eigenschaften ist; Zum Beispiel beeinflusst die Molekülgröße die Abbaurate von Glykogen10 und die Verteilung der Kettenlänge seine Löslichkeit26. Um diese Zusammenhänge richtig zu verstehen, ist es wichtig, Glykogen mit einem Verfahren zu extrahieren, das so weit wie möglich eine repräsentative und unbeschädigte Probe isoliert. Traditionelle Extraktionsmethoden verwendeten entweder heiße alkalische Bedingungen oder kalte Säure. Diese Methoden sind zwar wirksam bei der Trennung des Glykogens von anderen Gewebebestandteilen, aber chemisch aggressiv und bauen nachweislich die molekulare Struktur von Glykogen27 ab.
Seitdem wurde eine relativ schonende Methode entwickelt, bei der die Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation17,18 verwendet wird, bei der sich Glykogen im Pellet bilden kann, während der größte Teil des Zellmaterials im Überstand verbleibt. Diese Methode ist besonders nützlich für Lebergewebe, da die Glykogen- α Partikel empfindlich auf Säurehydrolyse reagieren28. Diese mildere Methode hat jedoch mindestens zwei potenzielle Mechanismen für die Isolierung von Glykogen, die in ihrer Struktur von der in vivo beobachteten abweichen: 1) kleinere, weniger dichte Glykogenpartikel sind anfälliger dafür, während der Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation im Überstand zu verbleiben17,18, da sie möglicherweise nicht in der Lage sind, das Pellet zu erreichen; 2) Die milderen Bedingungen können es Glykogenabbauenzymen, die unter den härteren alkalischen/sauren Extraktionsbedingungen denaturiert würden, ermöglichen, während der Extraktion weiterhin Glykogenpartikel abzubauen.
Eine kürzlich erschienene Veröffentlichung21 zielte darauf ab, diese potenziellen Probleme zu lösen, indem sie eine Reihe von Saccharosekonzentrationen (und damit Dichten) testete und feststellte, dass die Verwendung einer Konzentration von 30 % im Gegensatz zu den traditionell verwendeten 72,5 % dazu beitrug, den Verlust kleinerer Glykogenpartikel zu minimieren. In zukünftigen Experimenten könnten noch niedrigere Konzentrationen getestet werden, um zu sehen, ob einige kleinere Partikel während der Zentrifugation noch bevorzugt im Überstand verloren gehen. In dieser Veröffentlichung wurde auch die Wirksamkeit der Einführung eines 10-minütigen Siedeschritts direkt nach der Gewebehomogenisierung getestet, um die Glykogenabbauenzyme zu denaturieren und dadurch die Struktur des Glykogens zu erhalten. Es konnte gezeigt werden, dass dieser Schritt dazu beitrug, den Glykogenabbau zu hemmen, wobei die Glykogenkettenlängen signifikant erhalten blieben. Weitere Experimente in dieser Studie lieferten Hinweise darauf, dass dieser 10-minütige Siedeschritt wahrscheinlich keine signifikanten Schäden an der Glykogenstruktur verursachen würde. Dieser Siedeschritt kann jedoch die Struktur von Glykogen-assoziierten Proteinen beeinflussen, was möglicherweise zur Denaturierung und anschließenden Dissoziation von Proteinen vom Glykogen führt. Wenn also die Proteomik von Interesse ist, könnte die Verwendung der niedrigen Saccharosekonzentration (30 %) ohne Kochen (Proben auf Eis aufbewahrt) vorzuziehen sein, mit dem Vorbehalt, dass das Glykogen leicht abgebaut werden kann.
Bei der Verwendung der Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation ohne weitere Optimierungsexperimente ist die Verwendung einer relativ niedrigen Konzentration von Saccharose (30 %) mit der Einführung eines 10-minütigen Siedeschritts direkt nach der Gewebehomogenisierung die am besten geeignete Methode. Es gibt einige Einschränkungen bei dieser Technik. Erstens wurde dies für Leberglykogen optimiert, und es ist wichtig zu beachten, dass es für Glykogen aus anderen Geweben möglicherweise nicht so geeignet ist. Zweitens betrug die niedrigste getestete Saccharosekonzentration, wie bereits erwähnt, 30 %, und es ist möglich, dass niedrigere Konzentrationen vorzuziehen sind. Drittens gibt es noch keine optimierte Technik, die den enzymatischen Abbau von Glykogen verhindert und gleichzeitig das damit verbundene Proteom erhält.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Die Autoren danken Herrn Gaosheng Wu und Frau Yunwen Zhu für die technische Unterstützung bei FACE und Herrn Zhenxia Hu und Herrn Dengbin für die technische Unterstützung bei der SEC. MAS wird durch ein Advance Queensland Industry Research Fellowship, die Mater Foundation, Equity Trustees und die L G McCallam Est und George Weaber Trusts unterstützt. Diese Arbeit wurde durch das Priority Academic Program of Jiangsu Higher Education Institutions, ein Stipendium der Natural Science Foundation of China C1304013151101138 und das Jiangsu Innovation and Entrepreneurship Talents Program 2017 unterstützt. Die Abbildungen 1-5 wurden mit BioRender erstellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate (APTS) | SIGMA Aldrich | 9341 | 0.1 M solution |
| Acetic acid | SIGMA Aldrich | 695092 | 0.1 M, pH 3.5 solution |
| Agilent 1260 Infinity SEC system | Agilent, Santa Clara, CA, USA | Size-exclusion chromatography (SEC) | |
| BKS-DB/Nju background mice | Nanjing Biomedical Research Institution of Nanjing University | ||
| D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format) | Megazyme | K-GLUC | |
| Ethylenedinitrilotetraacetic acid (EDTA) | SIGMA Aldrich | 431788 | |
| Homogenizer | IKA | T 25 | |
| Hydrochloric acid | SIGMA Aldrich | 2104 | 0.1 M solution |
| Hydrochloric acid | SIGMA Aldrich | 2104 | 0.1 M solution |
| P/ACE MDQ plus system | Ab Sciex, US | Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE) | |
| Refractive index detector | Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA) | Size-exclusion chromatography (SEC) | |
| Sodium acetate | SIGMA Aldrich | 241245 | 1 M, pH 4.5 solution |
| Sodium azide | SIGMA Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | SIGMA Aldrich | S9888 | |
| Sodium cyanoborohydride | SIGMA Aldrich | 156159 | 1 M solution |
| Sodium fluoride | SIGMA Aldrich | 201154 | |
| Sodium hydroxide | SIGMA Aldrich | 43617 | 0.1 M solution |
| Sodium nitrate | SIGMA Aldrich | NISTRM8569 | |
| Sodium pyrophosphate | SIGMA Aldrich | 221368 | |
| Sucrose | SIGMA Aldrich | V90016 | |
| SUPREMA pre-column, 1,000 and 10,000 columns | Polymer Standards Services, Mainz, Germany | Size-exclusion chromatography (SEC) | |
| Trizma | SIGMA Aldrich | T 1503 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | 4 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 11 x 60 mm |
References
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