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Biochemistry

ग्लाइकोजन संरचना निर्धारण के लिए यकृत ग्लाइकोजन अणुओं का निष्कर्षण

Published: February 8, 2022 doi: 10.3791/63088
Automatic Translation
1,2, 3,4, 3,5, 1,2,6, 7
1School of Chemistry and Molecular Biosciences, The University of Queensland, 2Centre for Nutrition and Food Sciences, Queensland Alliance for Agriculture and Food Innovation, The University of Queensland, 3Jiangsu Provincial Key Laboratory of New Drug Research and Clinical Pharmacy, School of Pharmacy, Xuzhou Medical University, 4Department of Pharmaceutical Analysis, School of Pharmacy, Xuzhou Medical University, 5Department of Bioinformatics, School of Medical Informatics and Engineering, Xuzhou Medical University, 6Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-Product Safety, College of Agriculture, Yangzhou University, 7Glycation and Diabetes Group, Mater Research Institute-The University of Queensland, Translational Research Institute

Summary

सुक्रोज घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके यकृत ग्लाइकोजन के निष्कर्षण के लिए एक इष्टतम सुक्रोज एकाग्रता निर्धारित की गई थी। ग्लाइकोजन-अपमानजनक एंजाइमों को बाधित करने के लिए 10 मिनट उबलते कदम के अलावा फायदेमंद साबित हुआ।

Abstract

लिवर ग्लाइकोजन एक हाइपरब्रांच्ड ग्लूकोज बहुलक है जो जानवरों में रक्त शर्करा के स्तर के रखरखाव में शामिल है। ग्लाइकोजन के गुण इसकी संरचना से प्रभावित होते हैं। इसलिए, एक उपयुक्त निष्कर्षण विधि जो ग्लाइकोजन के प्रतिनिधि नमूनों को अलग करती है, इस मैक्रोमोलेक्यूल के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है। अन्य निष्कर्षण विधियों की तुलना में, एक विधि जो सुक्रोज घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन चरण को नियोजित करती है, आणविक क्षति को कम कर सकती है। इस पद्धति के आधार पर, एक हालिया प्रकाशन बताता है कि कैसे सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान उपयोग किए जाने वाले सुक्रोज समाधान का घनत्व विविध (30%, 50%, 72.5%) था, जो विभिन्न प्रकार के आकारों के ग्लाइकोजन कणों को निकालने के लिए सबसे उपयुक्त एकाग्रता खोजने के लिए था, जिससे छोटे कणों का नुकसान सीमित हो गया। ग्लाइकोजन अपमानजनक एंजाइमों को विकृत करने की अपनी क्षमता का परीक्षण करने के लिए 10 मिनट का उबलते कदम पेश किया गया था, इस प्रकार ग्लाइकोजन का संरक्षण किया गया था। सबसे कम सुक्रोज एकाग्रता (30%) और उबलते कदम के अलावा ग्लाइकोजन के सबसे प्रतिनिधि नमूने निकालने के लिए दिखाए गए थे।

Introduction

ग्लाइकोजन जानवरों, कवक और बैक्टीरिया में पाए जाने वाले ग्लूकोज का एक जटिल, हाइपरब्रांच्ड बहुलकहै। स्तनधारियों में, यकृत ग्लाइकोजन रक्त ग्लूकोज बफर के रूप में कार्य करता है, होमियोस्टेसिस को संरक्षित करता है, जबकि मांसपेशी ग्लाइकोजन सीधे ऊर्जा प्रदान करने के लिए अल्पकालिक ग्लूकोज जलाशय के रूप में कार्य करता है2. ग्लाइकोजन की संरचना को अक्सर तीन स्तरों द्वारा वर्णित किया जाता है (चित्र 1 में दिखाया गया है): 1. रैखिक श्रृंखलाएं ग्लूकोज मोनोमर्स द्वारा (1→4) -α ग्लाइकोसिडिक बॉन्ड के माध्यम से बनाई जाती हैं, जिसमें शाखा बिंदु (1→6) -α ग्लाइकोसिडिक बॉन्ड के माध्यम से जुड़े होते हैं; 2. अत्यधिक शाखित β कण (~ 20 एनएम व्यास) जो, विशेष रूप से कंकाल की मांसपेशी जैसे ऊतकों में, स्वतंत्र ग्लाइकोजन अणुओं के रूप में कार्य करते हैं 3,4; 3. बड़े α ग्लाइकोजन कण (व्यास में 300 एनएम तक) जिसमें छोटी β ग्लाइकोजन इकाइयां होती हैं, जो यकृत5, हृदय6 और कुछ गैर-स्तनधारी प्रजातियों में पाए जाते हैं7. डायबिटिक चूहों से यकृत α कण आणविक रूप से नाजुक होते हैं, जिसमें डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ) में भंग होने पर β-कणों को नीचा दिखाने की प्रवृत्ति होती है, जबकि गैर-मधुमेह नियंत्रण से α कण आम तौर पर अपरिवर्तित रहते हैं। एक परिकल्पना यह है कि यह नाजुकता मधुमेह में देखे गए खराब रक्त शर्करा के संतुलन को बढ़ा सकती है, नाजुक α कणों के साथ संभावित रूप से अधिक तेजी से अपमानित β कण 8,9,10,11 के उच्च अनुपात में परिणाम होता है।

पारंपरिक ग्लाइकोजन निष्कर्षण विधियां यकृत ऊतक को गर्म क्षारीय समाधान12 या एसिड समाधान जैसे ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड (टीसीए)13 या पर्क्लोरिक एसिड (पीसीए)14को उजागर करने की अपेक्षाकृत कठोर परिस्थितियों का उपयोग करती हैं। जबकि जिगर के ऊतकों के अन्य घटकों से ग्लाइकोजन को अलग करने में प्रभावी, इन तरीकों अनिवार्य रूप से कुछ हद तक ग्लाइकोजन संरचना नीचा15,16. यद्यपि ये विधियां ग्लाइकोजन सामग्री के मात्रात्मक माप के लिए उपयुक्त हैं, लेकिन वे इस संरचनात्मक क्षति के कारण ग्लाइकोजन पर संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने पर केंद्रित अध्ययन के लिए आदर्श नहीं हैं। इन विधियों के विकास के बाद से, एक मामूली निष्कर्षण प्रक्रिया विकसित की गई है जो सुक्रोज घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूगेशन 17,18,19के साथ ठंड ट्रिस बफर (ग्लूकोसिडेस गिरावट को रोकने के लिए दिखाया गया है) का उपयोग करती है। ~ 8 पर नियंत्रित पीएच के साथ, यह विधि ग्लाइकोजन को पिछली प्रक्रियाओं में देखे गए एसिड या क्षारीय हाइड्रोलिसिस के अधीन नहीं करती है।

समरूप यकृत ऊतक के सुक्रोज घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन सेल सामग्री के बहुमत से ग्लाइकोजन कणों को अलग कर सकते हैं। यदि आवश्यक हो, अतिरिक्त शुद्धि तैयारी आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा किया जा सकता है, संलग्न ग्लाइकोजन-सहयोगी प्रोटीन20 के साथ शुद्ध ग्लाइकोजन के संग्रह में जिसके परिणामस्वरूप. हालांकि इस विधि, मामूली शर्तों के साथ, अधिक ग्लाइकोजन की संरचना को संरक्षित करने की संभावना है, यह सतह पर तैरनेवाला में खो जाने से ग्लाइकोजन के कुछ हिस्से को रोकने के लिए मुश्किल है, विशेष रूप से छोटे ग्लाइकोजन कणों है कि कम घने15. ग्लाइकोजन हानि का एक अन्य संभावित कारण यह है कि हल्की स्थितियां कुछ एंजाइमेटिक गिरावट की अनुमति देती हैं, जिसके परिणामस्वरूप कठोर निष्कर्षण विधियों की तुलना में ग्लाइकोजन पैदावार कम होती है। हाल के शोध ने ग्लाइकोजन21 की संरचना को संरक्षित करने के लिए यकृत-ग्लाइकोजन निष्कर्षण विधि के अनुकूलन की सूचना दी। यहां, विभिन्न सुक्रोज सांद्रता (30%, 50%, 72.5%) का परीक्षण यह निर्धारित करने के लिए किया गया था कि क्या कम सुक्रोज सांद्रता ने छोटे ग्लाइकोजन कणों के नुकसान को कम किया है। तर्क यह था कि कम घनत्व छोटे, कम घने कणों को सुक्रोज परत में घुसने और बाकी ग्लाइकोजन के साथ गोली में कुल करने की अनुमति देगा।

इस अध्ययन में, 10 मिनट के उबलते कदम के साथ और बिना निष्कर्षण विधियों की तुलना यह जांचने के लिए की गई थी कि क्या ग्लाइकोजन गिरावट एंजाइमों को विकृत किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप अधिक ग्लाइकोजन का निष्कर्षण होता है जो आंशिक गिरावट से भी मुक्त था। पूरे आणविक आकार वितरण और ग्लाइकोजन श्रृंखला लंबाई वितरण का उपयोग निकाले गए ग्लाइकोजन की संरचना को निर्धारित करने के लिए किया गया था, जो पहले22 प्रकाशित स्टार्च निष्कर्षण अनुकूलन के समान था। अंतर अपवर्तक सूचकांक (डीआरआई) का पता लगाने के साथ आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) का उपयोग ग्लाइकोजन के आकार वितरण को प्राप्त करने के लिए किया गया था, जो आणविक आकार के एक समारोह के रूप में कुल आणविक भार का वर्णन करता है। फ्लोरोफोर-असिस्टेड कार्बोहाइड्रेट वैद्युतकणसंचलन (एफएसीई) का उपयोग श्रृंखला-लंबाई वितरण का विश्लेषण करने के लिए किया गया था, जो प्रत्येक दिए गए आकार (या पोलीमराइजेशन की डिग्री) के ग्लूकोसाइड श्रृंखलाओं की सापेक्ष संख्या का वर्णन करता है। यह पत्र पिछले अनुकूलन अध्ययन21 के आधार पर जिगर के ऊतकों से ग्लाइकोजन निकालने की पद्धति का वर्णन करता है. आंकड़ों से पता चलता है कि ग्लाइकोजन संरचना को संरक्षित करने के लिए सबसे उपयुक्त विधि 10 मिनट उबलते कदम के साथ 30% की सुक्रोज एकाग्रता है।

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Protocol

माउस जिगर इस प्रक्रिया को अनुकूलित करने के लिए इस्तेमाल किया21 से थे 12 पुरुष BKS-DB/Nju पृष्ठभूमि चूहों (7.2 सप्ताह पुराना, सामग्री की तालिकादेखें). पशु उपयोग को वुहान विश्वविद्यालय पशु देखभाल और आचार समिति के रेनमिन अस्पताल द्वारा अनुमोदित किया गया था, आईएसीयूसी अंक सं। डब्ल्यूडीआरएम 20181113।

1 जानवरों के ऊतकों

  1. माउस जिगर (प्रत्येक माउस से पूरे जिगर के 1-1.8 ग्राम) वजन.
  2. तेजी से तरल नाइट्रोजन में माउस जिगर फ्रीज और -80 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान.

2. बफर और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. ग्लाइकोजन अलगाव बफर तैयार करें जिसमें 5 एमएम ट्रिस, 150 एमएम एनएसीएल, 2 एमएम ईडीटीए, 50 एमएम एनएएफ और 5 एमएम सोडियम पाइरोफॉस्फेट विआयनीकृत पानी के साथ शामिल हैं, और पीएच को 8 में समायोजित करें।
  2. 30% (w/w) सुक्रोज समाधान तैयार करें (यकृत ग्लाइकोजन21 के लिए सबसे इष्टतम पाया गया)।
  3. सोडियम एसीटेट बफर (1 एम, पीएच 4.5), एसिटिक एसिड बफर (0.1 एम, पीएच 3.5), सोडियम हाइड्रॉक्साइड समाधान (0.1 एम), और सोडियम साइनोबोरोहाइड्राइड (1 एम) तैयार करें।
  4. 15% ग्लेशियल एसिटिक एसिड के 50 माइक्रोन में 5 मिलीग्राम एपीटीएस जोड़कर 8-एमिनोपाइरीन-1,3,6-ट्राइसल्फोनेट (एपीटीएस) समाधान तैयार करें।
  5. 0.02% सोडियम एजाइड के साथ 50 एमएम अमोनियम नाइट्रेट युक्त अमोनियम नाइट्रेट समाधान तैयार करें।

3. ग्लाइकोजन निष्कर्षण (चित्रा 2)

  1. जमे हुए जिगर ऊतक (~ 1 ग्राम) को ग्लाइकोजन अलगाव बफर के 6 एमएल युक्त 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  2. इसे बर्फ पर रखते हुए, एक ऊतक होमोजेनाइज़र का उपयोग करके यकृत ऊतक को समरूप बनाएं।
  3. निलंबन (3 एमएल) के आधे हिस्से को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें और 10 मिनट के लिए उबालें (ग्लाइकोजन संरचनात्मक अध्ययन21 के लिए इष्टतम दिखाया गया है)। निलंबन के दूसरे आधे हिस्से (3 एमएल) को बर्फ पर रखें ताकि ग्लाइकोजन को निकाला जा सके जिसमें संबंधित प्रोटीन होते हैं जो विकृत नहीं होते हैं।
    नोट: बिना उबले नमूनों को हमेशा ग्लाइकोजन निष्कर्षण चरणों के दौरान बर्फ पर रखा जाना चाहिए। यदि ग्लाइकोजन प्रोटीन अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण नहीं हैं, तो पूरा नमूना 10 मिनट उबलते चरण से गुजर सकता है।
  4. प्रत्येक ट्यूब से एक 8 माइक्रोन विभाज्य निकालें, बर्फ पर aliquots रखने, और उन्हें ग्लाइकोजन सामग्री निर्धारण (अनुभाग 4 देखें) के लिए उपयोग करें.
  5. शेष निलंबन को 6,000 × ग्राम पर 10 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  6. सतह पर तैरनेवाला अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें, और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए 3.6 ×10 5 ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।
  7. शेष सतह पर तैरनेवाला त्यागें और ग्लाइकोजन अलगाव बफर के 1.5 एमएल में छर्रों को फिर से निलंबित करें।
  8. 4 एमएल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 30% सुक्रोज समाधान के 1.5 एमएल पर नमूने परत करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 3.6 × 105 ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।
  9. शेष सतह पर तैरनेवाला त्यागें और विआयनीकृत पानी के 200 माइक्रोन में छर्रों को फिर से निलंबित करें।
  10. निलंबन में पूर्ण इथेनॉल के 800 माइक्रोन जोड़ें और ग्लाइकोजन23,24 को तेज करने के लिए अच्छी तरह मिलाएं। वर्षा की अनुमति देने के लिए कम से कम 1 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण स्टोर करें।
  11. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 6,000 × ग्राम पर नमूने अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और विआयनीकृत पानी के 200 माइक्रोन में छर्रों को फिर से निलंबित करें।
  12. इस इथेनॉल वर्षा प्रक्रिया को 3x दोहराएं और विआयनीकृत पानी के 200 माइक्रोन में अंतिम ग्लाइकोजन गोली को फिर से निलंबित करें।
  13. ग्लाइकोजन सामग्री निर्धारण के लिए प्रत्येक ट्यूब से 8 माइक्रोन का एक विभाज्य निकालें (अनुभाग 4 देखें)।
  14. शेष सुपरनेटेंट को तरल नाइट्रोजन और फ्रीज-ड्राई (लियोफाइलाइज) में रात भर फ्रीज करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीजर में सूखे ग्लाइकोजन के नमूनों की दुकान.
    नोट: शुष्क ग्लाइकोजन नमूने -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर होना चाहिए; हालांकि, यह इंगित करने के लिए कोई डेटा नहीं है कि वे बिना किसी संरचनात्मक परिवर्तन के कितने समय तक चलते हैं।

4. ग्लाइकोजन सामग्री निर्धारण (चित्रा 3)

  1. ग्लाइकोजन सुपरनेटेंट के 8 माइक्रोन जोड़ें, (अनुभाग 3.13 और 3.4 देखें), एमाइलोग्लुकोसिडेस (3269 यू / एमएल) के 5 माइक्रोन, और सोडियम एसीटेट बफर (1 एम, पीएच 4.5) के 100 माइक्रोन को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जोड़ें और ट्यूब को 500 माइक्रोन के निशान तक भरें विआयनीकृत पानी के साथ।
  2. नियंत्रण है कि amyloglucosidase के बजाय विआयनीकृत पानी का उपयोग तैयार करें.
  3. बर्फ पर नियंत्रण रखते हुए, 30 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  4. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 6,000 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र, और ग्लूकोसिडेस ऑक्सीडेज / पेरोक्सीडेज (जीओपीओडी) अभिकर्मक के 1 एमएल के साथ प्रत्येक परिणामी सतह पर तैरनेवाला के 300 माइक्रोन मिलाएं।
  5. GOPOD अभिकर्मक के 1 एमएल के साथ 0, 10, 20, 30, 40, और डी-ग्लूकोज के 50 माइक्रोग्राम युक्त deionized पानी के 300 माइक्रोन को मिलाकर एक अंशांकन वक्र का निर्माण करें।
  6. एक और 30 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण सेते हैं.
  7. यूवी-विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 96-अच्छी प्लेटों (150 माइक्रोन प्रति कुआं) का उपयोग करके प्रत्येक नमूने के अवशोषण (510 एनएम) को पढ़ें।
  8. प्रयोगात्मक नमूनों के अवशोषण से नियंत्रण नमूनों (कोई एमाइलोग्लुकोसिडेस के साथ) के अवशोषण को घटाएं, फिर डी-ग्लूकोज मानक वक्र के आधार पर ग्लाइकोजन सामग्री की गणना करें।

5. क्रूड उपज, ग्लाइकोजन उपज, और शुद्धता निर्धारण

  1. कच्चे तेल की उपज के लिए, फ्रीज-सूखे ग्लाइकोजन नमूने का वजन करें और गीले यकृत ऊतक के प्रतिशत के रूप में उपज की गणना करें।
    नोट: इस उपज को प्रत्येक ग्लाइकोजन सामग्री चरण में लिए गए विभाज्य के लिए सही करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए।
  2. ग्लाइकोजन शुद्धता के लिए, अंतिम छर्रों में ग्लाइकोजन सामग्री का निर्धारण करें, जैसा कि धारा 4 में वर्णित है। कच्चे उपज के सापेक्ष निर्धारित ग्लाइकोजन सामग्री के प्रतिशत के रूप में शुद्धता की गणना करें (चरण 5.1 देखें)।
  3. ग्लाइकोजन उपज के लिए, उबलते बिना समरूप नमूनों की ग्लाइकोजन सामग्री का निर्धारण करें और किसी भी सेंट्रीफ्यूजेशन से पहले, जैसा कि धारा 4 में वर्णित है। प्रारंभिक समरूप में निर्धारित ग्लाइकोजन सामग्री के अंतिम छर्रों (चरण 5.2 देखें) में ग्लाइकोजन सामग्री के प्रतिशत के रूप में ग्लाइकोजन उपज की गणना करें।

6. श्रृंखला-लंबाई वितरण का विश्लेषण (चित्र 4)

  1. 1.5 एमएल ट्यूबों में 0.5 मिलीग्राम फ्रीज-सूखे ग्लाइकोजन का वजन।
  2. ट्यूबों में 90 माइक्रोन विआयनीकृत पानी और 1.5 माइक्रोन सोडियम एजाइड (0.04 ग्राम/एमएल) जोड़ें।
  3. ग्लाइकोजन को डिब्रांच करने के लिए ट्यूबों में एसिटिक एसिड बफर (0.1 एम, पीएच 3.5) के 5 माइक्रोन और आइसोमाइलेस समाधान (180 यू / मिलीग्राम) के 2 माइक्रोन जोड़ें।
  4. 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं.
  5. पीएच को 7.0 तक बढ़ाने के लिए नमूनों में सोडियम हाइड्रॉक्साइड समाधान (0.1 एम) के 5 माइक्रोन जोड़ें।
  6. तरल नाइट्रोजन और फ्रीज-सूखी (lyophilize) रात भर में नमूने फ्रीज.
  7. फ्रीज-सूखे विशालित ग्लाइकोजन में एपीटीएस समाधान के 2 माइक्रोन (15% ग्लेशियल एसिटिक एसिड के 50 माइक्रोन में एपीटीएस के 5 मिलीग्राम) और 2 माइक्रोन सोडियम साइनोबोरोहाइड्राइड (1 एम) जोड़ें।
  8. 2 मिनट के लिए 4,000 × ग्राम पर नमूने अपकेंद्रित्र.
  9. अंधेरे में 3 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं.
    नोट: सामग्री को प्रकाश से बचाने के लिए ट्यूब को एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर किया जा सकता है।
  10. नमूनों में 200 माइक्रोन विआयनीकृत पानी जोड़ें और उन्हें भंवर करें जब तक कि सभी अवक्षेप भंग न हो जाएं।
  11. 2 मिनट के लिए 4,000 × ग्राम पर नमूने अपकेंद्रित्र.
  12. विश्लेषण के लिए फ्लोरोफोरे-असिस्टेड कार्बोहाइड्रेट वैद्युतकणसंचलन (FACE) माइक्रो-शीशियों में 50 माइक्रोन के एलिकोट स्थानांतरित करें।
    नोट: डेटा को पोलीमराइजेशन (डीपी, प्रतीक एक्स) की प्रत्येक डिग्री के लिए (डीब्रांच्ड) चेन (एनडी (एक्स)) की सापेक्ष बहुतायत के रूप में दिखाया गया है।

7. आणविक आकार वितरण का विश्लेषण (चित्रा 5)

  1. 50 एमएम अमोनियम नाइट्रेट में 0.5 मिलीग्राम फ्रीज-सूखे ग्लाइकोजन और 1 मिलीग्राम / एमएल पर 0.02% सोडियम एज़ाइड भंग करें।
  2. 300 आरपीएम पर 3 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर थर्मोमिक्सर में नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  3. एक पूर्व स्तंभ और 1000 Å और 0.3 एमएल/मिनट की एक प्रवाह दर के साथ 80 डिग्री सेल्सियस पर 10,000 एक एसईसी स्तंभ का उपयोग कर एक एसईसी प्रणाली में नमूने इंजेक्षन ( सामग्री की तालिकादेखें). प्रत्येक क्षालन मात्रा पर अणुओं के सापेक्ष वजन को निर्धारित करने के लिए एक अपवर्तक सूचकांक डिटेक्टर का उपयोग करें।
  4. 342 से 1.22 × 106 तक के दाढ़ द्रव्यमान के साथ पुलुलन मानकों (पीएसएस) का उपयोग करते हुए, क्षालन समय को आरएच (हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या) में बदलने के लिए एक एसईसी सार्वभौमिक अंशांकन वक्र की साजिश करें। विभेदक अपवर्तक सूचकांक (डीआरआई) डिटेक्टर से डेटा को एसईसी वजन वितरण डब्ल्यू (लॉग आरएच) के रूप में आर एच के एक समारोह के रूप में व्यक्त करें।

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Representative Results

जबकि ऊपर वर्णित प्रक्रिया सबसे इष्टतम विधि (30% एक 10min उबलते कदम के अलावा के साथ sucrose) के लिए है, डेटा तीन sucrose सांद्रता (30%, 50%, 72.5%) के माध्यम से निकाले ग्लाइकोजन के लिए यहाँ प्रदान की जाती हैं, के साथ और एक उबलते कदम के बिना, के रूप में पहले वर्णित21. प्रोटोकॉल के बाद, शुद्धता, कच्चे उपज, और विभिन्न स्थितियों द्वारा निकाले गए सूखे ग्लाइकोजन की ग्लाइकोजन उपज तालिका 1 में दी गई है,21 से पुन: प्रस्तुत की जाती है। विभिन्न स्थितियों के साथ निकाले गए समूहों के बीच कच्चे उपज और ग्लाइकोजन उपज में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। इसके विपरीत, ग्लाइकोजन शुद्धता दोनों सुक्रोज सांद्रता (तालिका 1, पी < 0.001) और एक उबलते कदम (तालिका 1, पी < 0.0001) के अलावा से काफी प्रभावित थी। उच्चतम शुद्धता के साथ ग्लाइकोजन एक 10 मिनट उबलते कदम के साथ 30% सुक्रोज एकाग्रता का उपयोग कर निकाला गया था, यही कारण है कि यह परीक्षण की शर्तों से बाहर सबसे इष्टतम होने के लिए निर्धारित किया गया था.

आणविक आकार वितरण अंतिम निकालने में अणुओं के आकार पर विभिन्न स्थितियों के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया. ये एक जलीय एसईसी प्रणाली का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे, जैसा कि पहले25 वर्णित था। एक ही अधिकतम मूल्य के लिए प्रत्येक वितरण सामान्यीकरण α से β कणों के सापेक्ष अनुपात चित्रा 6 में दिखाया गया है,21 से पुन: प्रस्तुत प्रत्येक विधि से तुलना की जा करने की अनुमति दी. आरएच जिस पर अधिकतम होता है (आरएच, अधिकतम) और औसत आरएच (Equation 1) तालिका 2 में दिखाए जाते हैं,21 से पुन: प्रस्तुत किए जाते हैं। आरएच < 30 एनएम के साथ ग्लाइकोजन अणुओं को β कणों11 के रूप में परिभाषित किया गया था। β कण सामग्री की गणना वक्र (एयूसी) के तहत क्षेत्र के रूप में की गई थी (आरएच < 30 एनएम)/एयूसी (कुल आरएच)। उबले हुए नमूनों में कम औसत आरएच मान और बिना उबले नमूनों की तुलना में β कण सामग्री अधिक थी (तालिका 2, पी < 0.05)। कम सुक्रोज सांद्रता कम Equation 1 मूल्यों और उच्च β कण सामग्री (तालिका 2, पी <0.05) में हुई. उबलते कदम की शुरूआत भी कम आरएच, अधिकतम मूल्यों (तालिका 2, पी <0.05) का नेतृत्व किया, जबकि सुक्रोज एकाग्रता का कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं था।

चेन-लंबाई वितरण (सीएलडी) एफएसीई का उपयोग करके प्राप्त प्रत्येक दी गई लंबाई (कनेक्टेड ग्लूकोज इकाइयों की संख्या, या पोलीमराइजेशन की डिग्री) की श्रृंखलाओं की सापेक्ष संख्या प्रदान करते हैं। सीएलडी चित्रा 7 में दिखाए गए हैं,21 से डेटा का उपयोग करके पुन: प्रस्तुत किए गए हैं। संख्या-औसत श्रृंखला लंबाई (एसीएल) की गणना (ΣX X Nde(X))/ (ΣX Nde(X)) (तालिका 2) के रूप में की गई थी। बिना उबले नमूनों के एसीएल उबले हुए नमूनों की तुलना में काफी छोटे और अधिक विविध थे (तालिका 2, पी < 0.05)। हालांकि, सुक्रोज एकाग्रता ने एसीएल को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं किया। यह परिकल्पना है कि एक पूर्व निष्कर्षण कदम के रूप में 10 मिनट के लिए नमूने उबलते ग्लाइकोजन संरचना की रक्षा करेगा का समर्थन किया. प्रस्तावित तंत्र ग्लाइकोजन-अपमानजनक एंजाइमों का विकृतीकरण है।

Figure 1
चित्र 1: ग्लाइकोजन संरचना के तीन स्तर। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ग्लाइकोजन निष्कर्षण प्रक्रिया। माउस जिगर से ग्लाइकोजन निकालने और शुद्ध करने के लिए कदम। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ग्लाइकोजन सामग्री निर्धारण। यकृत समरूप में ग्लाइकोजन सामग्री निर्धारित करने के लिए कदम, शुद्ध शुष्क ग्लाइकोजन या ग्लाइकोजन समाधान। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: श्रृंखला-लंबाई वितरण का विश्लेषण। "फ्लोरोफोरे-सहायता प्राप्त कार्बोहाइड्रेट वैद्युतकणसंचलन प्रणाली द्वारा श्रृंखला-लंबाई वितरण का विश्लेषण करने के लिए कदम"। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: आणविक आकार वितरण का विश्लेषण। एक जलीय आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी प्रणाली द्वारा आणविक आकार वितरण का विश्लेषण करने के लिए कदम। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: पूरे (डिब्रांच्ड नहीं) माउस यकृत ग्लाइकोजन का एसईसी वजन वितरण। निष्कर्षण विभिन्न परिस्थितियों में किया गया था, डब्ल्यू (लॉग आरएच) में समान अधिकतम होने के लिए सामान्यीकृत। प्रत्येक यकृत समरूप को छह बराबर मात्राओं में विभाजित किया गया था, और ग्लाइकोजन को 30%, 50%, या 72.5% सुक्रोज, उबला हुआ या बिना उबला हुआ निकाला गया था। वक्र किसी दिए गए Rh पर माध्य का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसमें SD मुख्य रेखा के दोनों ओर प्रदान किया जाता है (n = 4-6 नमूनों के साथ शोर को हटाने के लिए अपर्याप्त संकेत होता है)। (ए) ग्लाइकोजन 30% सुक्रोज, उबला हुआ या बिना उबला हुआ द्वारा निकाला गया; (बी) ग्लाइकोजन 50% सुक्रोज, उबला हुआ या बिना उबला हुआ द्वारा निकाला गया; (सी) ग्लाइकोजन 72.5% सुक्रोज, उबला हुआ या बिना उबला हुआ द्वारा निकाला गया। यह आंकड़ा21 से अनुकूलित किया गया था। संक्षिप्ताक्षर: एसईसी = आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी; SD = मानक विचलन; आरएच = हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या; डब्ल्यू (लॉग आरएच) = एसईसी वजन वितरण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: श्रृंखला लंबाई वितरण, एनडी (एक्स), ग्लाइकोजन की। श्रृंखला लंबाई विश्लेषण उबला हुआ और unboiled दोनों के लिए छह जिगर पर प्रदर्शन किया गया था 30%, 50%, और ultracentrifugation कदम में 72.5% सुक्रोज सांद्रता का उपयोग कर. प्रत्येक DP के मान SD (N = 6) के माध्य ± दर्शाते हैं। (ए) ग्लाइकोजन 30% सुक्रोज, उबला हुआ या बिना उबला हुआ द्वारा निकाला गया; (बी) ग्लाइकोजन 50% सुक्रोज, उबला हुआ या बिना उबला हुआ द्वारा निकाला गया; (सी) ग्लाइकोजन 72.5% सुक्रोज, उबला हुआ या बिना उबला हुआ द्वारा निकाला गया। यह आंकड़ा21 से अनुकूलित किया गया था। संक्षिप्त: Nde(X) = श्रृंखला लंबाई वितरण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

क्रूड यील्ड (%) शुद्धता (%) ग्लाइकोजन उपज (%)
30% सुक्रोज-सी 2.1 ± 1.0ए 13.1 ± 12.0बी 10.7 ± 9.1ए
50% सुक्रोज-सी 1.2 ± 0.7ए 23.3 ± 20.1बी 10.2 ± 8.1ए
72.5% सुक्रोज-सी 1.9 ± 0.8ए 9.8 ± 9.0 बी 5.3 ± 2.4ए
30% सुक्रोज-बी 0.8 ± 0.4ए 67.9 ± 16.8ए 16.0 ± 5.1ए
50% सुक्रोज-बी 1.1 ± 0.6ए 48.6 ± 16.9ए 14.8 ± 7.6ए
72.5% सुक्रोज-बी 2.0 ± 0.9ए 14.7 ± 12.6बी 6.9 ± 3.7ए
दो-तरफा एनोवा सुक्रोज: पी = 0.053 सुक्रोज: पी < 0.001 सुक्रोज: पी = 0.034
तापमान: P = 0.108 तापमान: P < 0.0001 तापमान: P = 0.116
सहभागिता: पी = 0.11 सहभागिता: पी = 0.003 सहभागिता: पी = 0.801

तालिका 1: शुद्धता, कच्चे उपज, ग्लाइकोजन उपज। 30%, 50%, या 72.5% सुक्रोज, उबला हुआ या बिना उबला हुआ लीवर ग्लाइकोजन नमूनों के लिए क्रूड यील्ड, शुद्धता और ग्लाइकोजन उपज। -सी ठंडे बफर द्वारा निकाले गए नमूने थे; -बी नमूने 10 मिनट के लिए उबलते द्वारा निकाले गए थे. मान माध्य ± मानक विचलन (SD), n = 6 के रूप में दिए गए हैं। एक ही कॉलम में विभिन्न सुपरस्क्रिप्ट अक्षरों वाले मूल्यों में अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण हैं (पी < 0.05)। इस तालिकाको 21 से अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया था।

Equation 1 मीन आरएच, मैक्स β सामग्री मीन एसीएल
30% सुक्रोज-सी 29.4 ± 1.5बी 34.9 ± 0.6ए 40.9 ± 6.2% ए, बी 4.8 ± 0.5सी
50% सुक्रोज-सी 32.0 ± 1.1ए, बी 36.1 ± 0.5ए 28.5 ± 3.0% बी, सी 5.6 ± 1.1बी, सी
72.5% सुक्रोज-सी 34.3 ± 1.8ए 36.2 ± 0.4ए 23.7 ± 3.5% सी 4.7 ± 0.9सी
30% सुक्रोज-बी 29.4 ± 1.2बी 33.7 ± 3.1ए 43.1 ± 5.1%ए 8.6 ± 1.8ए
50% सुक्रोज-बी 30.1 ± 1.2बी 34.9 ± 0.7ए 36.0 ± 7.2% ए, बी, सी 8.8 ± 1.7ए
72.5% सुक्रोज-बी 30.9 ± 3.5ए, बी 33.6 ± 3.5ए 34.0 ± 13.1% ए, बी, सी 7.6 ± 1.9ए, बी
दो-तरफा एनोवा सुक्रोज: पी = 0.002 सुक्रोज: पी = 0.442 सुक्रोज: पी < 0.001 सुक्रोज: पी = 0.290
तापमान: P = 0.010 तापमान: P = 0.032 तापमान: P = 0.016 तापमान: P < 0.0001
सहभागिता: पी = 0.431 सहभागिता: पी = 0.640 सहभागिता: पी = 0.441 सहभागिता: पी = 0.750

तालिका 2: Equation 1 और आरएच जिस पर अधिकतम होता है (आरएच, अधिकतम) और औसत श्रृंखला लंबाई (एसीएल)। Equation 1 और आरएच जिस पर अधिकतम होता है (आरएच, अधिकतम), β कण सामग्री, और ग्लाइकोजन की औसत श्रृंखला लंबाई (एसीएल) या तो 30%, 50%, या 72.5% सुक्रोज, उबला हुआ या उबला हुआ द्वारा निकाला जाता है। -सी उबला हुआ; -बी में 10 मिनट का उबलने वाला कदम शामिल था। एक ही कॉलम में विभिन्न सुपरस्क्रिप्ट अक्षरों वाले मूल्यों में अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण हैं (पी < 0.05)। इस तालिका को 21 से अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया था। संक्षिप्ताक्षर: आरएच = हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या; Equation 1 = ; ACL = औसत श्रृंखला लंबाई; Rh, max = Rh जिस पर अधिकतम होता है।

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Discussion

पिछले अध्ययनों से पता चला है कि ग्लाइकोजन की संरचना इसके गुणों के लिए महत्वपूर्ण है; उदाहरण के लिए, आणविक आकार ग्लाइकोजन10 की गिरावट दर को प्रभावित करता है, और श्रृंखला लंबाई वितरण इसकी घुलनशीलता26 को प्रभावित करता है. इन रिश्तों को ठीक से समझने के लिए, ग्लाइकोजन को एक प्रक्रिया के साथ निकालना महत्वपूर्ण है जो जितना संभव हो, एक प्रतिनिधि और अप्रकाशित नमूना को अलग करता है। निष्कर्षण के पारंपरिक तरीकों ने या तो गर्म क्षारीय स्थितियों या ठंडे एसिड का उपयोग किया। अन्य ऊतक घटकों से ग्लाइकोजन को अलग करने में प्रभावी होने पर, ये विधियां रासायनिक रूप से कठोर हैं और ग्लाइकोजन27 की आणविक संरचना को नीचा दिखाने के लिए दिखाए गए हैं।

एक अपेक्षाकृत कोमल विधि के बाद से विकसित किया गया है कि सुक्रोज घनत्व ढाल centrifugation17,18 का उपयोग करता है, ग्लाइकोजन गोली में फार्म करने के लिए अनुमति देता है, जबकि सेल सामग्री के अधिकांश सतह पर तैरनेवाला में रहता है. यह विधि यकृत ऊतक के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, ग्लाइकोजन α कणों एसिड हाइड्रोलिसिस28 के प्रति संवेदनशील होने के साथ। इस मामूली विधि करता है, तथापि, विवो में देखा है कि संरचना में glycogen विचलन के अलगाव के लिए कम से कम दो संभावित तंत्र है: 1) छोटे, कम घने ग्लाइकोजन कणों सुक्रोज घनत्व ढाल centrifugation17,18 के दौरान सतह पर तैरनेवाला में छोड़ दिया जा रहा करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, के रूप में वे गोली तक पहुँचने में असमर्थ हो सकता है; 2) हल्की स्थितियां ग्लाइकोजन क्षरण एंजाइमों की अनुमति दे सकती हैं, जो निष्कर्षण के दौरान ग्लाइकोजन कणों को नीचा दिखाना जारी रखने के लिए कठोर क्षारीय / एसिड निष्कर्षण स्थितियों में विकृत हो जाएंगी।

हाल ही में एक प्रकाशन21 का उद्देश्य सुक्रोज सांद्रता (और इसलिए घनत्व) की एक श्रृंखला का परीक्षण करके इन संभावित मुद्दों को हल करने में मदद करना है, यह पता लगाना कि पारंपरिक रूप से उपयोग किए जाने वाले 72.5% के विपरीत, 30% की एकाग्रता का उपयोग करके, छोटे ग्लाइकोजन कणों के नुकसान को कम करने में मदद मिली। भविष्य के प्रयोगों भी कम सांद्रता परीक्षण करने के लिए अगर कुछ छोटे कणों अभी भी सतह पर तैरनेवाला में अधिमानतया खो रहे हैं अपकेंद्रित्र के दौरान परीक्षण कर सकते हैं. इस प्रकाशन ने ग्लाइकोजन क्षरण एंजाइमों को विकृत करने के लिए ऊतक समरूपता के बाद सीधे 10 मिनट उबलते कदम को शुरू करने की प्रभावकारिता का परीक्षण किया, जिससे ग्लाइकोजन की संरचना को संरक्षित किया जा सके। यह दिखाया गया था कि इस कदम ने ग्लाइकोजन क्षरण को रोकने में मदद की, ग्लाइकोजन श्रृंखला की लंबाई काफी संरक्षित थी। इस अध्ययन में आगे के प्रयोगों ने सबूत दिए कि यह 10 मिनट उबलते कदम ग्लाइकोजन संरचना को महत्वपूर्ण नुकसान पहुंचाने की संभावना नहीं थी। हालांकि, यह उबलते कदम ग्लाइकोजन से जुड़े प्रोटीन की संरचना को प्रभावित कर सकता है, संभावित रूप से ग्लाइकोजन से प्रोटीन के विकृतीकरण और बाद में पृथक्करण के परिणामस्वरूप। इसलिए, यदि प्रोटिओमिक्स रुचि का है, तो उबलते बिना कम सुक्रोज एकाग्रता (30%) का उपयोग करना बेहतर हो सकता है (बर्फ पर रखे गए नमूने) बेहतर हो सकता है, इस चेतावनी के साथ कि ग्लाइकोजन थोड़ा नीचा हो सकता है।

आगे अनुकूलन प्रयोगों के बिना सुक्रोज घनत्व ढाल centrifugation का उपयोग करते समय, सबसे उपयुक्त विधि ऊतक homogenization के बाद सीधे एक 10 मिनट उबलते कदम की शुरूआत के साथ sucrose (30%) की एक अपेक्षाकृत कम एकाग्रता का उपयोग करने के लिए है. इस तकनीक की कुछ सीमाएँ हैं। सबसे पहले, यह यकृत ग्लाइकोजन के लिए अनुकूलित किया गया था, और यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यह अन्य ऊतकों से ग्लाइकोजन के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है। दूसरा, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, परीक्षण की गई सबसे कम सुक्रोज एकाग्रता 30% थी, और यह संभव है कि कम सांद्रता बेहतर हो सकती है। तीसरा, एक अनुकूलित तकनीक जो संबंधित प्रोटिओम को संरक्षित करते हुए ग्लाइकोजन के एंजाइमेटिक क्षरण को रोकती है, अभी तक उपलब्ध नहीं है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक एसईसी के साथ तकनीकी सहायता के लिए फेस और श्री झेंक्सिया हू और श्री डेंगबिन के साथ तकनीकी सहायता के लिए श्री गाओशेंग वू और मिस युनवेन झू के आभारी हैं। एमएएस एक एडवांस क्वींसलैंड इंडस्ट्री रिसर्च फेलोशिप, मेटर फाउंडेशन, इक्विटी ट्रस्टीज और एलजी मैकलम एस्ट और जॉर्ज वीबर ट्रस्ट द्वारा समर्थित है। इस काम को जिआंगसु उच्च शिक्षा संस्थानों के प्राथमिकता शैक्षणिक कार्यक्रम, चीन अनुदान C1304013151101138 के एक प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन और 2017 जियांग्सू नवाचार और उद्यमिता प्रतिभा कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था। चित्र 1-5 BioRender का उपयोग करके बनाए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate (APTS) SIGMA Aldrich 9341 0.1 M solution
Acetic acid SIGMA Aldrich 695092 0.1 M, pH 3.5 solution
Agilent 1260 Infinity SEC system Agilent, Santa Clara, CA, USA Size-exclusion chromatography (SEC)
BKS-DB/Nju background mice Nanjing Biomedical Research Institution of Nanjing University
D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format) Megazyme K-GLUC
Ethylenedinitrilotetraacetic acid (EDTA) SIGMA Aldrich 431788
Homogenizer IKA T 25
Hydrochloric acid SIGMA Aldrich 2104 0.1 M solution
Hydrochloric acid SIGMA Aldrich 2104 0.1 M solution
P/ACE MDQ plus system Ab Sciex, US Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE)
Refractive index detector Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA) Size-exclusion chromatography (SEC)
Sodium acetate SIGMA Aldrich 241245 1 M, pH 4.5 solution
Sodium azide SIGMA Aldrich S2002
Sodium chloride SIGMA Aldrich S9888
Sodium cyanoborohydride SIGMA Aldrich 156159 1 M solution
Sodium fluoride SIGMA Aldrich 201154
Sodium hydroxide SIGMA Aldrich 43617 0.1 M solution
Sodium nitrate SIGMA Aldrich NISTRM8569
Sodium pyrophosphate SIGMA Aldrich 221368
Sucrose SIGMA Aldrich V90016
SUPREMA pre-column, 1,000 and 10,000 columns Polymer Standards Services, Mainz, Germany Size-exclusion chromatography (SEC)
Trizma SIGMA Aldrich T 1503
Ultracentrifuge tubes Beckman 4 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 11 x 60 mm

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References

  1. Hills, D. M., Heller, H. C., Hacker, S. D., Hall, D. W., Sadava, D., Laskowski, M. Life: the science of biology. 12th edn. Freeeman, W. H. , (2020).
  2. Calder, P. C., Geddes, R. Glycogen of high molecular weight from mammalian muscle. Carbohydrate Research. 135 (2), 249-256 (1985).
  3. Rybicka, K. K. Glycosomes - The organelles of glycogen metabolism. Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).
  4. Takeuchi, T., Iwamasa, T., Miyayama, H. Ultrafine structure of glycogen macromolecules in mammalian-tissues. Journal of Electron Microscopy. 27 (1), 31-38 (1978).
  5. Drochmans, P. Morphologie du glycogene - etude au microscope electronique de colorations negatives du glycogene particulaire. Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).
  6. Besford, Q. A., et al. The structure of cardiac glycogen in healthy mice. International Journal of Biological Macromolecules. 51 (5), 887-891 (2012).
  7. Lumsden, R. D. Macromolecular structure of glycogen in some cyclophyllidean and trypanorhynch cestodes. Journal of Parasitology. 51 (4), 501-515 (1965).
  8. Deng, B., et al. Molecular structure of glycogen in diabetic liver. Glycoconjugate Journal. 32 (3-4), 113-118 (2015).
  9. Deng, B., et al. The mechanism for stopping chain and total-molecule growth in complex branched polymers, exemplified by glycogen. Biomacromolecules. 16 (6), 1870-1872 (2015).
  10. Jiang, X., et al. The molecular-size dependence of glycogen enzymatic degradation rate and its importance for diabetes. European Polymer Journal. 82 (1), 175-180 (2016).
  11. Hu, Z., et al. Glycogen structure in type 1 diabetic mice: towards understanding the origin of diabetic glycogen molecular fragility. International Journal of Biological Macromolecules. 128, 665-672 (2019).
  12. Suzuki, Y., et al. Insulin control of glycogen metabolism in knockout mice lacking the muscle-specific protein phosphatase PP1G/R-GL. Molecular and Cellular Biology. 21 (8), 2683-2694 (2001).
  13. Stetten, M. R., Katzen, H. M., Stetten, D. Metabolic inhomogeneity of glycogen as a function of molecular weight. Journal of Biological Chemistry. 122 (2), 587-599 (1956).
  14. Nahorski, S. R., Rogers, K. J. An enzymic fluorometric micro method for determination of glycogen. Analytical Biochemistry. 49 (2), 492-497 (1972).
  15. Wang, Z., et al. Molecular structural features of glycogen in the kidneys of diabetic rats. Carbohydrate Polymers. 229, 115526 (2020).
  16. Wang, L., et al. Molecular structure of glycogen in Escherichia coli. Biomacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).
  17. Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362, 811-815 (2007).
  18. Ryu, J. -H., et al. Comparative structural analyses of purified glycogen particles from rat liver, human skeletal muscle and commercial preparations. International Journal of Biological Macromolecules. 45 (5), 478-482 (2009).
  19. Sullivan, M. A., et al. Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions. Biomacromolecules. 11 (4), 1094-1100 (2010).
  20. Tan, X., et al. A new non-degradative method to purify glycogen. Carbohydrate Polymers. 147 (1), 165-170 (2016).
  21. Wang, Z., Liu, Q., Wang, L., Gilbert, R. G., Sullivan, M. A. Optimization of liver glycogen extraction when considering molecular fine structure. Carbohydrate Polymers. 261, 117887 (2020).
  22. Zhao, Y., Tan, X., Wu, G., Gilbert, R. G. Using molecular fine structure to identify optimal methods of extracting starch. Starch - Starke. 72, 1900214 (2020).
  23. Shokri-Afra, H., Ostovar-Ravari, A., Rasouli, M. Improvement of the classical assay method for liver glycogen fractions: ASG is the main and metabolic active fraction. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 20, 4328-4336 (2016).
  24. Kerly, M. The solubility of glycogen. The Biochemical Journal. 24, 67-76 (1930).
  25. Sullivan, M. A., et al. Improving size-exclusion chromatography for glycogen. Journal of Chromatography A. 1332 (1), 21-29 (2014).
  26. Sullivan, M. A., et al. Skeletal muscle glycogen chain length correlates with insolubility in mouse models of polyglucosan-associated neurodegenerative diseases. Cell Reports. 27 (5), 1334-1344 (2019).
  27. Orrell, S. A., Bueding, E. A comparison of products obtained by various procedures used for the extraction of glycogen. Journal of Biological Chemistry. 239 (12), 4021-4026 (1964).
  28. Sullivan, M. A., et al. Molecular insights into glycogen alpha-particle formation. Biomacromolecules. 13 (11), 3805-3813 (2012).

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ग्लाइकोजन संरचना निर्धारण के लिए यकृत ग्लाइकोजन अणुओं का निष्कर्षण
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Wang, Z., Liu, Q., Wang, L., Gilbert, R. G., Sullivan, M. A. The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination. J. Vis. Exp. (180), e63088, doi:10.3791/63088 (2022).

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