Summary
En optimal sukrosekonsentrasjon ble bestemt for ekstraksjon av leverglykogen ved bruk av sentrifugering av sukrosetetthetsgradient. Tilsetningen av et 10 minutters koketrinn for å hemme glykogennedbrytende enzymer viste seg å være gunstig.
Abstract
Leverglykogen er en hyperforgrenet glukosepolymer som er involvert i vedlikehold av blodsukkernivået hos dyr. Egenskapene til glykogen påvirkes av dens struktur. Derfor er en egnet ekstraksjonsmetode som isolerer representative prøver av glykogen avgjørende for studiet av dette makromolekylet. Sammenlignet med andre ekstraksjonsmetoder, kan en metode som benytter et sukrosetetthetsgradientsentrifugeringstrinn minimere molekylær skade. Basert på denne metoden beskriver en nylig publikasjon hvordan tettheten av sukroseoppløsningen som ble brukt under sentrifugering ble variert (30%, 50%, 72,5%) for å finne den mest passende konsentrasjonen for å trekke ut glykogenpartikler av en rekke størrelser, og begrense tapet av mindre partikler. Et koketrinn på 10 minutter ble introdusert for å teste dets evne til å denaturere glykogennedbrytende enzymer, og dermed bevare glykogen. Den laveste sukrosekonsentrasjonen (30%) og tilsetningen av koketrinnet ble vist å trekke ut de mest representative prøvene av glykogen.
Introduction
Glykogen er en kompleks, hyperforgrenet polymer av glukose som finnes i dyr, sopp og bakterier1. Hos pattedyr fungerer leverglykogen som en blodsukkerbuffer, og bevarer homeostase, mens muskelglykogen fungerer som et kortsiktig glukosereservoar for å gi energi direkte2. Strukturen av glykogen er ofte beskrevet av tre nivåer (vist i figur 1): 1. Lineære kjeder dannes av glukosemonomerer via (1→4)-α glykosidbindinger, med grenpunkter forbundet via (1→6)-α glykosidbindinger; 2. høyt forgrenede β partikler (~ 20 nm i diameter) som, spesielt i vev som skjelettmuskulatur, fungerer som uavhengige glykogenmolekyler 3,4; 3. Større α glykogenpartikler (opptil 300 nm i diameter) som består av mindre β glykogenenheter, som finnes i leveren5, hjerte6 og i noen ikke-pattedyrarter7. Hepatiske α partikler fra diabetiske mus er molekylært skjøre, med en tilbøyelighet til å nedbrytes til β-partikler når de oppløses i dimetylsulfoksid (DMSO), mens α partikler fra ikke-diabetiske kontroller generelt forblir uendret. En hypotese er at denne skjørheten kan forverre den dårlige blodsukkerbalansen man ser ved diabetes, med de skjøre α partiklene som potensielt kan resultere i høyere andeler av den raskere nedbrutte β partikkel 8,9,10,11.
Tradisjonelle glykogenekstraksjonsmetoder benytter de relativt tøffe forholdene for å utsette levervevet for varm alkalisk oppløsning12 eller syreoppløsninger som trikloreddiksyre (TCA)13 eller perklorsyre (PCA)14. Mens de er effektive til å separere glykogenet fra andre komponenter i levervevet, nedbryter disse metodene uunngåelig glykogenstrukturen til en viss grad15,16. Selv om disse metodene er egnet for kvantitativ måling av glykogeninnholdet, er de ikke ideelle for studier som fokuserer på å oppnå strukturell informasjon om glykogenet på grunn av denne strukturelle skaden. Siden utviklingen av disse metodene har det blitt utviklet en mildere ekstraksjonsprosedyre som benytter kald Tris-buffer (vist å hemme nedbrytning av glukosidase) med sukrosetetthetsgradient ultrasentrifugering 17,18,19. Med pH kontrollert ved ~ 8, utsetter denne metoden ikke glykogenet for syre eller alkalisk hydrolyse sett i tidligere prosedyrer.
Sukrose tetthetsgradient ultracentrifugering av homogenisert levervev kan skille glykogenpartikler fra flertallet av cellemateriale. Om nødvendig kan ytterligere rensing utføres ved preparativ størrelsesekskluderingskromatografi, noe som resulterer i innsamling av renset glykogen med vedlagte glykogenassosierende proteiner20. Selv om denne metoden, med mildere forhold, er mer sannsynlig å bevare strukturen av glykogen, er det vanskelig å forhindre at en del av glykogenet går tapt i supernatanten, spesielt mindre glykogenpartikler som er mindre tette15. En annen potensiell årsak til glykogentap er at de mildere forholdene tillater noe enzymatisk nedbrytning, noe som resulterer i lavere glykogenutbytter sammenlignet med strengere ekstraksjonsmetoder. Nylig forskning rapporterte optimalisering av lever-glykogenekstraksjonsmetoden for å bevare strukturen av glykogen21. Her ble forskjellige sukrosekonsentrasjoner (30%, 50%, 72,5%) testet for å avgjøre om lavere sukrosekonsentrasjoner minimerte tapet av mindre glykogenpartikler. Begrunnelsen var at den lavere tettheten ville tillate mindre, mindre tette partikler å trenge inn i sukroselaget og aggregere i pelleten med resten av glykogenet.
I denne studien ble ekstraksjonsmetodene med og uten et koketrinn på 10 minutter sammenlignet for å teste om glykogennedbrytningsenzymer kunne denatureres, noe som resulterte i ekstraksjon av mer glykogen som også var fri for delvis nedbrytning. Hele molekylstørrelsesfordelinger og glykogenkjedelengdefordelingene ble brukt til å bestemme strukturen til det ekstraherte glykogenet, tilsvarende en optimalisering av stivelsesekstraksjon publisert tidligere22. Størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) med differensiell brytningsindeks (DRI) deteksjon ble brukt for å oppnå størrelsesfordelingene av glykogen, som beskriver den totale molekylvekten som en funksjon av molekylstørrelse. Fluoroforassistert karbohydratelektroforese (FACE) ble brukt til å analysere kjedelengdefordelingene, som beskriver det relative antall glukosidkjeder av hver gitt størrelse (eller polymerisasjonsgrad). Denne artikkelen beskriver metoden for å ekstrahere glykogen fra levervev basert på forrige optimaliseringsstudie21. Dataene tyder på at metoden som er best egnet til å bevare glykogenstrukturen er en sukrosekonsentrasjon på 30% med et koketrinn på 10 minutter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Muselever brukt til å optimalisere denne prosedyren21 var fra 12 mannlige BKS-DB / Nju bakgrunnsmus (7,2 uker gamle, se materialtabellen). Dyrebruk ble godkjent av Renmin Hospital of Wuhan University Animal Care and Ethics Committee, IACUC Issue nr. WDRM 20181113.
1 Animalsk vev
- Vei muselever (1-1,8 g hellever fra hver mus).
- Museleveren fryses raskt ned i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 °C.
2. Fremstilling av buffer og reagenser
- Forbered glykogenisolasjonsbuffer inneholdende 5 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF og 5 mM natriumpyrofosfat med avionisert vann, og juster pH til 8.
- Lag 30% (w / w) sukroseoppløsning (funnet å være mest optimal for leverglykogen21).
- Klargjør natriumacetattbuffer (1 M, pH 4,5), eddiksyrebuffer (0,1 M, pH 3,5), natriumhydroksidoppløsning (0,1 M) og natriumcyanoborhydrid (1 M).
- Forbered 8-aminopyren-1,3,6-trisulfonat (APTS) løsning ved å tilsette 5 mg APTS til 50 μL 15% iseddik.
- Fremstill ammoniumnitratoppløsning inneholdende 50 mM ammoniumnitrat med 0,02% natriumazid.
3. Glykogenekstraksjon (figur 2)
- Overfør det frosne levervevet (~1 g) til et 15 ml rør inneholdende 6 ml glykogenisolasjonsbuffer.
- Hold det på is, homogeniser levervevet ved hjelp av en vevshomogenisator.
- Overfør halvparten av suspensjonen (3 ml) til en ny tube og kok i 10 minutter (vist å være optimal for glykogenstrukturelle studier21). Hold den andre halvdelen av suspensjonen (3 ml) på is for å trekke ut glykogen som inneholder tilknyttede proteiner som ikke er denaturert.
MERK: Ukokte prøver skal alltid holdes på is under glykogenekstraksjonstrinn. Hvis glykogenproteiner ikke er viktige for studier, kan hele prøven gjennomgå koketrinnet på 10 minutter. - Fjern en 8 μl alikot fra hver tube, oppbevar alikotene på is og bruk dem til bestemmelse av glykogeninnhold (se avsnitt 4).
- Sentrifuger den gjenværende suspensjonen ved 6 000 × g i 10 minutter ved 4 °C.
- Overfør supernatantene til ultrasentrifugerør, og sentrifuger dem ved 3,6 × 105 g i 90 minutter ved 4 °C.
- Kast de resterende supernatantene og resuspender pelletsene i 1,5 ml glykogenisolasjonsbuffer.
- Legg prøvene over 1,5 ml 30 % sukroseoppløsning i 4 ml ultrasentrifugerør og sentrifuge ved 3,6 × 105 g i 2 timer ved 4 °C.
- Kast de gjenværende supernatantene og resuspender pellets i 200 μL avionisert vann.
- Tilsett 800 μL absolutt etanol til suspensjonene og bland godt for å utfelle glykogen23,24. Oppbevar blandingene ved -20 °C i minst 1 time for å tillate nedbør.
- Sentrifuger prøvene ved 6000 × g i 10 minutter ved 4 °C. Kast supernatantene og resuspender pellets i 200 μL avionisert vann.
- Gjenta denne etanolutfellingsprosessen 3x og resuspender den endelige glykogenpelleten i 200 μL avionisert vann.
- Fjern en alikot på 8 μl fra hver tube for bestemmelse av glykogeninnhold (se avsnitt 4).
- Frys de resterende supernatantene i flytende nitrogen og frysetørke (lyofilisere) over natten. Oppbevar tørrglykogenprøvene i fryseren ved -20 °C.
MERK: De tørre glykogenprøvene skal være stabile ved -20 °C; Det finnes imidlertid ikke data som sier noe om hvor lenge de varer uten strukturelle endringer.
4. Bestemmelse av glykogeninnhold (figur 3)
- Tilsett 8 μL av glykogensupernatantene (se pkt. 3.13 og 3.4), 5 μL amyloglukosidase (3269 U/ml) og 100 mikroliter natriumacetattbuffer (1 M, pH 4,5) til et mikrosentrifugerør og fyll røret til 500 μL-merket med avionisert vann.
- Forbered kontroller som bruker avionisert vann i stedet for amyloglucosidase.
- Inkuber prøvene ved 50 °C i 30 minutter, mens kontrollene holdes på is.
- Sentrifuge ved 6000 × g ved 4 °C i 10 minutter, og bland 300 mikrol av hver resulterende supernatant med 1 ml glukosidaseoksidase/peroksidase (GOPOD) reagens.
- Konstruer en kalibreringskurve ved å blande 300 μL denionisert vann inneholdende 0, 10, 20, 30, 40 og 50 μg D-glukose med 1 ml GOPOD-reagens.
- Inkuber blandingene ved 50 °C i ytterligere 30 minutter.
- Avlesning av absorbansen (510 nm) for hver prøve ved bruk av 96-brønnsplater (150 μL per brønn) ved hjelp av et UV-vis-spektrofotometer.
- Trekk absorbansene av kontrollprøver (uten amyloglucosidase) fra absorbansene i eksperimentelle prøver, og beregn deretter glykogeninnholdet basert på D-glukosestandardkurven.
5. Råutbytte, glykogenutbytte og renhetsbestemmelse
- For råutbyttet, vei den frysetørkede glykogenprøven og beregne utbyttet som en prosentandel av det våte levervevet.
MERK: Dette utbyttet bør justeres for å korrigere for alikotene som tas i hvert trinn i glykogeninnholdet. - For glykogenrenhet, bestem glykogeninnholdet i de endelige pellets, som beskrevet i avsnitt 4. Beregn renheten som en prosentandel av det bestemte glykogeninnholdet i forhold til råutbyttet (se trinn 5.1).
- For glykogenutbytte, bestem glykogeninnholdet i de homogeniserte prøvene uten koking og før sentrifugering, som beskrevet i avsnitt 4. Beregn glykogenutbyttet som en prosentandel av glykogeninnholdet i de endelige pellets (se trinn 5.2) til glykogeninnholdet bestemt i det opprinnelige homogenatet.
6. Analyse av kjedelengdefordelinger (figur 4)
- Vei 0,5 mg frysetørket glykogen i 1,5 ml rør.
- Tilsett 90 μL avionisert vann og 1,5 μL natriumazid (0,04 g / ml) til rørene.
- Tilsett 5 μL eddiksyrebuffer (0,1 M, pH 3,5) og 2 μL isoamylaseoppløsning (180 E / mg) til rørene for å debranchere glykogenet.
- Inkuber prøvene ved 37 °C i 3 timer.
- Tilsett 5 μL natriumhydroksidoppløsning (0,1 M) til prøvene for å øke pH til 7,0.
- Frys prøvene i flytende nitrogen og frysetørke (lyofilisere) over natten.
- Tilsett 2 μL APTS-oppløsning (5 mg APTS i 50 μL 15% iseddik) og 2 μL natriumcyanoborhydrid (1 M) til det frysetørkede forgrenede glykogenet.
- Sentrifuger prøvene ved 4000 × g i 2 minutter.
- Inkuber prøvene ved 60 °C i 3 timer i mørket.
NOTAT: Røret kan dekkes med aluminiumsfolie for å beskytte innholdet mot lys. - Tilsett 200 μL avionisert vann til prøvene og virv dem til alt bunnfall er oppløst.
- Sentrifuger prøvene ved 4000 × g i 2 minutter.
- Overfør alikoter på 50 μL til fluoroforassistert karbohydratelektroforese (FACE) mikrohetteglass for analyse.
MERK: Dataene vises som den relative mengden av (forgrenede) kjeder (Nde(X)) for hver polymerisasjonsgrad (DP, symbol X).
7. Analyse av molekylære størrelsesfordelinger (figur 5)
- Løs opp 0,5 mg frysetørket glykogen i 50 mM ammoniumnitrat og 0,02 % natriumazid ved 1 mg/ml.
- Inkuber prøvene i en termomixer ved 80 °C i 3 timer ved 300 o / min.
- Injiser prøvene i et SEC-system ved hjelp av en forkolonne og 1000 Å kolonner ved 80 °C med en strømningshastighet på 0,3 ml/min (se materialfortegnelsen). Bruk en brytningsindeksdetektor for å bestemme den relative vekten av molekyler ved hvert elueringsvolum.
- Ved å bruke pullulan-standarder (PSS) med molare masser fra 342 til 1,22 × 106, plotter du en SEC universell kalibreringskurve for å konvertere elueringstiden til Rh (hydrodynamisk radius). Uttrykk dataene fra differensialbrytningsindeksdetektoren (DRI) som en SEC-vektfordeling w (log Rh) som en funksjon av Rh.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mens prosedyren beskrevet ovenfor er for den mest optimale metoden (30% sukrose med tilsetning av et 10 minutters koketrinn), er data gitt her for glykogen ekstrahert via tre sukrosekonsentrasjoner (30%, 50%, 72,5%), med og uten koketrinn, som tidligere beskrevet21. Etter protokollen er renhet, råutbytte og glykogenutbytte av tørrglykogen ekstrahert ved forskjellige forhold gitt i tabell 1, gjengitt fra21. Det var ingen signifikante forskjeller i råutbytte og glykogenutbytte mellom gruppene ekstrahert med de ulike betingelsene. I motsetning til dette ble glykogenrenheten signifikant påvirket av både sukrosekonsentrasjonene (tabell 1, P < 0,001) og ved tilsetning av et kokende trinn (tabell 1, P < 0,0001). Glykogen med høyeste renhet ble ekstrahert ved hjelp av 30% sukrosekonsentrasjonen sammen med et koketrinn på 10 minutter, og derfor ble det bestemt å være det mest optimale ut av de testede forholdene.
Molekylære størrelsesfordelinger ble brukt til å vurdere effekten av de forskjellige forholdene på størrelsen av molekyler i det endelige ekstraktet. Disse ble oppnådd ved hjelp av et vandig SEC-system, som beskrevet tidligere25. Ved å normalisere hver fordeling til samme maksimumsverdi kunne den relative andelen α til β partikler sammenlignes fra hver metode, vist i figur 6, gjengitt fra21. Rh der maksima forekommer (Rh,maks) og gjennomsnittlig Rh (
) er vist i tabell 2, gjengitt fra21. Glykogenmolekyler med Rh < 30 nm ble definert som β partikler11. Det β partikkelinnholdet ble beregnet som arealet under kurven (AUC) på (Rh < 30 nm)/AUC (total Rh). De kokte prøvene hadde lavere gjennomsnittlige Rh-verdier og et høyere β partikkelinnhold enn de ukokte prøvene (tabell 2, P < 0,05). Lavere sukrosekonsentrasjoner resulterte i lavere verdier og høyere β partikkelinnhold (tabell 2, P <0,05). Innføringen av koketrinn førte også til lavere Rh,max-verdier (tab 2, P<0,05), mens sukrosekonsentrasjonen ikke hadde signifikant effekt.
Kjedelengdefordelinger (CLD) gir det relative antall kjeder av hver gitt lengde (antall tilkoblede glukoseenheter eller polymerisasjonsgrad), oppnådd ved bruk av FACE. CLDene er vist i figur 7, gjengitt med data fra21. Gjennomsnittlig kjedelengde (ACL) ble beregnet som (ΣX X Nde(X))/ (ΣX Nde(X)) (tabell 2). ACLene i ukokte prøver var signifikant mindre og mer varierte enn de kokte prøvene (tabell 2, P < 0,05). Sukrosekonsentrasjonen påvirket imidlertid ikke ACLene signifikant. Dette støttet hypotesen om at å koke prøvene i 10 minutter som et pre-ekstraksjonstrinn ville bevare glykogenstrukturen. Den foreslåtte mekanismen er denaturering av glykogennedbrytende enzymer.
Figur 1: De tre nivåene av glykogenstruktur. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Glykogenekstraksjonsprosess. Trinn for å trekke ut og rense glykogenet fra museleveren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Bestemmelse av glykogeninnhold. Trinn for å bestemme glykogeninnholdet i leverhomogenat, renset tørr glykogen eller glykogenoppløsning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Analyse av kjedelengdefordelinger. Trinn for å analysere kjedelengdefordelinger ved hjelp av et fluoroforassistert karbohydratelektroforesesystem. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Analyse av molekylstørrelsesfordelinger. Trinn for å analysere molekylstørrelsesfordelingene ved hjelp av et kromatografisystem med vandig størrelse-ekskludering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: SEC-vektfordelinger av hele (ikke forgrenede) leverglykogen fra mus. Ekstraksjon ble utført under forskjellige forhold, normalisert til å ha samme maksimum i w (log Rh). Hvert leverhomogenat ble delt inn i seks like store volumer, og glykogen ble ekstrahert med enten 30%, 50% eller 72,5% sukrose, kokt eller ukokt. Kurver representerer gjennomsnittet ved en gitt Rh med SD som er gitt på hver side av hovedlinjen (n = 4-6 med prøver som ikke har tilstrekkelig signal til støy blir fjernet). (A) Glykogen ekstrahert med 30% sukrose, kokt eller ukokt; (B) glykogen ekstrahert av 50% sukrose, kokt eller ukokt; (C) glykogen ekstrahert med 72,5% sukrose, kokt eller ukokt. Dette tallet ble tilpasset fra21. Forkortelser: SEC = størrelse ekskluderingskromatografi; SD = standardavvik; Rh = hydrodynamisk radius; w(log Rh) = SEC vektfordeling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Kjedelengdefordelinger, Nde(X), av glykogen. Kjedelengdeanalyse ble utført på seks lever for både kokt og ukokt ved bruk av 30%, 50% og 72,5% sukrosekonsentrasjoner i ultrasentrifugeringstrinnet. Verdier for hver DP representerer gjennomsnittet ± SD (N = 6). (A) Glykogen ekstrahert med 30% sukrose, kokt eller ukokt; (B) glykogen ekstrahert av 50% sukrose, kokt eller ukokt; (C) glykogen ekstrahert med 72,5% sukrose, kokt eller ukokt. Dette tallet ble tilpasset fra21. Forkortelse: Nde(X) = kjedelengdefordeling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Råutbytte (%) | Renhet (%) | Glykogenutbytte (%) | |
| 30% sukrose-c | 2.1 ± 1.0a | 13.1 ± 12.0b | 10,7 ± 9,1a |
| 50% sukrose-c | 1,2 ± 0,7A | 23.3 ± 20.1b | 10,2 ± 8,1a |
| 72,5% sukrose-c | 1,9 ± 0,8A | 9,8 ± 9,0 b | 5,3 ± 2,4a |
| 30% sukrose-b | 0,8 ± 0,4a | 67,9 ± 16,8a | 16,0 ± 5,1a |
| 50% Sukrose-b | 1,1 ± 0,6A | 48,6 ± 16,9a | 14,8 ± 7,6a |
| 72,5% Sukrose-b | 2,0 ± 0,9a | 14,7 ± 12,6b | 6,9 ± 3,7a |
| Toveis ANOVA | Sukrose: P = 0,053 | Sukrose: P < 0,001 | Sukrose: P = 0,034 |
| Temperatur: P = 0,108 | Temperatur: P < 0.0001 | Temperatur: P = 0,116 | |
| Interaksjon: P = 0,11 | Interaksjon: P = 0,003 | Interaksjon: P = 0,801 |
Tabell 1: Renhet, råutbytte, glykogenutbytte. Råutbytte, renhet og glykogenutbytte for leverglykogenprøver ekstrahert med 30%, 50% eller 72,5% sukrose, kokt eller ukokt. -c var prøver ekstrahert av kaldbuffer; -b var prøver ekstrahert ved koking i 10 min. Verdiene er angitt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD), n = 6. Forskjeller i verdier med forskjellige hevede bokstaver i samme kolonne er statistisk signifikante (P < 0,05). Denne tabellen er gjengitt med tillatelse fra21.
|
Gjennomsnitt Rh,maks | β innhold | Gjennomsnittlig ACL | |
| 30% sukrose-c | 29,4 ± 1,5b | 34,9 ± 0,6A | 40,9 ± 6,2 % a,b | 4,8 ± 0,5c |
| 50% sukrose-c | 32,0 ± 1,1a,b | 36,1 ± 0,5a | 28,5 ± 3,0 % b,c | 5,6 ± 1,1b,c |
| 72,5% sukrose-c | 34,3 ± 1,8a | 36,2 ± 0,4a | 23,7 ± 3,5 %C | 4,7 ± 0,9c |
| 30% sukrose-b | 29,4 ± 1,2b | 33,7 ± 3,1a | 43,1 ± 5,1 % a | 8,6 ± 1,8a |
| 50% Sukrose-b | 30,1 ± 1,2b | 34,9 ± 0,7a | 36,0 ± 7,2 % a,b,c | 8,8 ± 1,7a |
| 72,5% Sukrose-b | 30,9 ± 3,5a,b | 33,6 ± 3,5a | 34,0 ± 13,1 % a,b,c | 7,6 ± 1,9a,b |
| Toveis ANOVA | Sukrose: P = 0,002 | Sukrose: P = 0,442 | Sukrose: P < 0,001 | Sukrose: P = 0,290 |
| Temperatur: P = 0,010 | Temperatur: P = 0,032 | Temperatur: P = 0,016 | Temperatur: P < 0.0001 | |
| Interaksjon: P = 0,431 | Interaksjon: P = 0,640 | Interaksjon: P = 0,441 | Interaksjon: P = 0,750 |
Tabell 2: og Rh der maksima forekommer (Rh, maks) og gjennomsnittlig kjedelengde (ACL). og Rh hvor maksima forekommer (Rh, maks), β partikkelinnhold og gjennomsnittlig kjedelengde (ACL) av glykogen ekstrahert med enten 30%, 50% eller 72,5% sukrose, kokt eller ukokt. -c ukokt; -B innebar et koketrinn på 10 minutter. Forskjeller i verdier med forskjellige hevede bokstaver i samme kolonne er statistisk signifikante (P < 0,05). Denne tabellen er gjengitt med tillatelse fra 21. Forkortelser: Rh = hydrodynamisk radius; = ; ACL = gjennomsnittlig kjedelengde; Rh,maks = Rh der maxima forekommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidligere studier har vist at strukturen av glykogen er viktig for dens egenskaper; For eksempel påvirker molekylstørrelsen nedbrytningshastigheten til glykogen10, og kjedelengdefordelingen påvirker dens løselighet26. For å forstå disse forholdene riktig er det viktig å trekke ut glykogen med en prosedyre som isolerer, så mye som mulig, en representativ og ubeskadiget prøve. Tradisjonelle ekstraksjonsmetoder benyttet enten varme alkaliske forhold eller kald syre. Mens de er effektive for å separere glykogenet fra andre vevskomponenter, er disse metodene kjemisk harde og har vist seg å nedbryte molekylstrukturen til glykogen27.
En relativt skånsom metode har siden blitt utviklet som bruker sukrose tetthet gradient sentrifugering17,18, slik at glykogen kan dannes i pelleten mens det meste av cellematerialet forblir i supernatanten. Denne metoden er spesielt nyttig for levervev, med glykogen α partikler som er følsomme for syrehydrolyse28. Denne mildere metoden har imidlertid minst to potensielle mekanismer for isolering av glykogendivergerende struktur fra den som er sett in vivo: 1) mindre, mindre tette glykogenpartikler er mer utsatt for å bli igjen i supernatanten under sentrifugering av sukrosetetthetsgradient17,18, da de kanskje ikke kan nå pelleten; 2) De mildere forholdene kan tillate glykogennedbrytningsenzymer, som ville bli denaturert i de tøffere alkaliske / syreekstraksjonsbetingelsene, å fortsette å nedbryte glykogenpartikler under ekstraksjon.
En nylig publikasjon21 hadde som mål å bidra til å løse disse potensielle problemene ved å teste en rekke sukrosekonsentrasjoner (og derfor tettheter), og fant at bruk av en konsentrasjon på 30%, i motsetning til de tradisjonelt brukte 72,5%, bidro til å minimere tapet av mindre glykogenpartikler. Fremtidige eksperimenter kan teste enda lavere konsentrasjoner for å se om noen mindre partikler fortsatt fortrinnsvis går tapt i supernatanten under sentrifugering. Denne publikasjonen testet også effekten av å introdusere et 10 minutters koketrinn rett etter vevshomogenisering for å denaturere glykogennedbrytningsenzymer, og dermed bevare strukturen av glykogen. Det ble vist at dette trinnet bidro til å hemme nedbrytning av glykogen, med glykogenkjedelengdene som ble betydelig bevart. Ytterligere eksperimenter i denne studien ga bevis på at dette koketrinnet på 10 minutter sannsynligvis ikke ville forårsake betydelig skade på glykogenstrukturen. Imidlertid kan dette kokende trinnet påvirke strukturen av glykogenassosierte proteiner, noe som potensielt resulterer i denaturering og påfølgende dissosiasjon av proteiner fra glykogenet. Derfor, hvis proteomikk er av interesse, kan det være å foretrekke å bruke den lave sukrosekonsentrasjonen (30%) uten koking (prøver holdt på is), med forbehold om at glykogenet kan brytes litt ned.
Ved bruk av sukrosetetthetsgradientsentrifugering uten ytterligere optimaliseringseksperimenter er den mest egnede metoden å benytte en relativt lav konsentrasjon av sukrose (30%) med innføring av et 10 minutters koketrinn rett etter vevshomogenisering. Det er noen begrensninger for denne teknikken. For det første ble dette optimalisert for leverglykogen, og det er viktig å merke seg at det kanskje ikke er like hensiktsmessig for glykogen fra andre vev. For det andre, som nevnt ovenfor, var den laveste sukrosekonsentrasjonen som ble testet 30%, og det er mulig at lavere konsentrasjoner kan være å foretrekke. For det tredje er en optimalisert teknikk som forhindrer enzymatisk nedbrytning av glykogen mens den tilhørende proteomet opprettholdes, ennå ikke tilgjengelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Forfatterne er takknemlige for Mr. Gaosheng Wu og Miss Yunwen Zhu for teknisk assistanse med FACE og Mr. Zhenxia Hu og Mr. Dengbin for teknisk assistanse med SEC. MAS støttes av et Advance Queensland Industry Research Fellowship, Mater Foundation, Equity Trustees, og LG McCallam Est og George Weaber Trusts. Dette arbeidet ble støttet av Priority Academic Program of Jiangsu Higher Education Institutions, en Natural Science Foundation of China grant C1304013151101138, og 2017 Jiangsu Innovation and Entrepreneurship talents program. Figur 1-5 ble laget ved hjelp av BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate (APTS) | SIGMA Aldrich | 9341 | 0.1 M solution |
| Acetic acid | SIGMA Aldrich | 695092 | 0.1 M, pH 3.5 solution |
| Agilent 1260 Infinity SEC system | Agilent, Santa Clara, CA, USA | Size-exclusion chromatography (SEC) | |
| BKS-DB/Nju background mice | Nanjing Biomedical Research Institution of Nanjing University | ||
| D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format) | Megazyme | K-GLUC | |
| Ethylenedinitrilotetraacetic acid (EDTA) | SIGMA Aldrich | 431788 | |
| Homogenizer | IKA | T 25 | |
| Hydrochloric acid | SIGMA Aldrich | 2104 | 0.1 M solution |
| Hydrochloric acid | SIGMA Aldrich | 2104 | 0.1 M solution |
| P/ACE MDQ plus system | Ab Sciex, US | Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE) | |
| Refractive index detector | Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA) | Size-exclusion chromatography (SEC) | |
| Sodium acetate | SIGMA Aldrich | 241245 | 1 M, pH 4.5 solution |
| Sodium azide | SIGMA Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | SIGMA Aldrich | S9888 | |
| Sodium cyanoborohydride | SIGMA Aldrich | 156159 | 1 M solution |
| Sodium fluoride | SIGMA Aldrich | 201154 | |
| Sodium hydroxide | SIGMA Aldrich | 43617 | 0.1 M solution |
| Sodium nitrate | SIGMA Aldrich | NISTRM8569 | |
| Sodium pyrophosphate | SIGMA Aldrich | 221368 | |
| Sucrose | SIGMA Aldrich | V90016 | |
| SUPREMA pre-column, 1,000 and 10,000 columns | Polymer Standards Services, Mainz, Germany | Size-exclusion chromatography (SEC) | |
| Trizma | SIGMA Aldrich | T 1503 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | 4 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 11 x 60 mm |
References
- Hills, D. M., Heller, H. C., Hacker, S. D., Hall, D. W., Sadava, D., Laskowski, M. Life: the science of biology. 12th edn. Freeeman, W. H. , (2020).
- Calder, P. C., Geddes, R. Glycogen of high molecular weight from mammalian muscle. Carbohydrate Research. 135 (2), 249-256 (1985).
- Rybicka, K. K. Glycosomes - The organelles of glycogen metabolism. Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).
- Takeuchi, T., Iwamasa, T., Miyayama, H. Ultrafine structure of glycogen macromolecules in mammalian-tissues. Journal of Electron Microscopy. 27 (1), 31-38 (1978).
- Drochmans, P. Morphologie du glycogene - etude au microscope electronique de colorations negatives du glycogene particulaire. Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).
- Besford, Q. A., et al. The structure of cardiac glycogen in healthy mice. International Journal of Biological Macromolecules. 51 (5), 887-891 (2012).
- Lumsden, R. D. Macromolecular structure of glycogen in some cyclophyllidean and trypanorhynch cestodes. Journal of Parasitology. 51 (4), 501-515 (1965).
- Deng, B., et al. Molecular structure of glycogen in diabetic liver. Glycoconjugate Journal. 32 (3-4), 113-118 (2015).
- Deng, B., et al. The mechanism for stopping chain and total-molecule growth in complex branched polymers, exemplified by glycogen. Biomacromolecules. 16 (6), 1870-1872 (2015).
- Jiang, X., et al. The molecular-size dependence of glycogen enzymatic degradation rate and its importance for diabetes. European Polymer Journal. 82 (1), 175-180 (2016).
- Hu, Z., et al. Glycogen structure in type 1 diabetic mice: towards understanding the origin of diabetic glycogen molecular fragility. International Journal of Biological Macromolecules. 128, 665-672 (2019).
- Suzuki, Y., et al. Insulin control of glycogen metabolism in knockout mice lacking the muscle-specific protein phosphatase PP1G/R-GL. Molecular and Cellular Biology. 21 (8), 2683-2694 (2001).
- Stetten, M. R., Katzen, H. M., Stetten, D. Metabolic inhomogeneity of glycogen as a function of molecular weight. Journal of Biological Chemistry. 122 (2), 587-599 (1956).
- Nahorski, S. R., Rogers, K. J. An enzymic fluorometric micro method for determination of glycogen. Analytical Biochemistry. 49 (2), 492-497 (1972).
- Wang, Z., et al. Molecular structural features of glycogen in the kidneys of diabetic rats. Carbohydrate Polymers. 229, 115526 (2020).
- Wang, L., et al. Molecular structure of glycogen in Escherichia coli. Biomacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).
- Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362, 811-815 (2007).
- Ryu, J. -H., et al. Comparative structural analyses of purified glycogen particles from rat liver, human skeletal muscle and commercial preparations. International Journal of Biological Macromolecules. 45 (5), 478-482 (2009).
- Sullivan, M. A., et al. Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions. Biomacromolecules. 11 (4), 1094-1100 (2010).
- Tan, X., et al. A new non-degradative method to purify glycogen. Carbohydrate Polymers. 147 (1), 165-170 (2016).
- Wang, Z., Liu, Q., Wang, L., Gilbert, R. G., Sullivan, M. A. Optimization of liver glycogen extraction when considering molecular fine structure. Carbohydrate Polymers. 261, 117887 (2020).
- Zhao, Y., Tan, X., Wu, G., Gilbert, R. G. Using molecular fine structure to identify optimal methods of extracting starch. Starch - Starke. 72, 1900214 (2020).
- Shokri-Afra, H., Ostovar-Ravari, A., Rasouli, M. Improvement of the classical assay method for liver glycogen fractions: ASG is the main and metabolic active fraction. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 20, 4328-4336 (2016).
- Kerly, M.
- Sullivan, M. A., et al. Improving size-exclusion chromatography for glycogen. Journal of Chromatography A. 1332 (1), 21-29 (2014).
- Sullivan, M. A., et al. Skeletal muscle glycogen chain length correlates with insolubility in mouse models of polyglucosan-associated neurodegenerative diseases. Cell Reports. 27 (5), 1334-1344 (2019).
- Orrell, S. A., Bueding, E. A comparison of products obtained by various procedures used for the extraction of glycogen. Journal of Biological Chemistry. 239 (12), 4021-4026 (1964).
- Sullivan, M. A., et al. Molecular insights into glycogen alpha-particle formation. Biomacromolecules. 13 (11), 3805-3813 (2012).
