Summary
Dit protocol is ontworpen om instructie-informatie te verstrekken voor de klonale vermeerdering van Cannabis sativa L. door aeroponische systemen te implementeren. De hier beschreven methode omvat alle noodzakelijke benodigdheden en protocollen om met succes gewenste morfologische en chemische eigenschappen in het geslacht Cannabis te reproduceren.
Abstract
Dit protocol beschrijft de standaardisatie van een efficiënte klonale vermeerderingstechniek van hennep door gebruik te maken van aeroponische systemen. Primaire scheutstekken werden weggesneden uit twee hennepvariëteiten, genaamd "Cherry Wine" en "Red Robin" (17-20% w / w CBD), die dienden als 'moederplant'. Een auxinevoorloper (indool-3-boterzuur) werd toegepast om de wortelontwikkeling in het basale deel van de weggesneden stekken te stimuleren voorafgaand aan plaatsing in het systeem. Stekken werden om de drie dagen licht beneveld met de voedingsneveloplossing om voedingsondersteuning te bieden, omdat de oplossing de essentiële macronutriënten bevat, waaronder stikstof, fosfor en kalium. Het waterreservoir van het aeroponische systeem handhaafde een pH-bereik tussen 5,0-6,0 en een watertemperatuur tussen 20-22 °C. Een dompelpomp werd gebruikt om water aan de stekken te leveren. De scheutpuntstekken werden gedurende 10 dagen voorzien van 24 uur licht per dag totdat de wortelontwikkeling plaatsvond, waarop de gewortelde stekken werden getransplanteerd voor onderzoeksdoeleinden. Deze aeroponische systemen hebben bewezen wenselijke resultaten te genereren voor cannabisvermeerdering. De hier beschreven methode verlicht potentiële tijdsdruk die voortvloeit uit traditionele methoden om een efficiënter middel voor de aseksuele verspreiding van cannabis mogelijk te maken.
Introduction
Cannabis sativa L. is een eenjarige, tweehuizige, bloeiende plant ingedeeld in de familie Cannabaceae. Cannabinoïden, voornamelijk geproduceerd in glandulaire trichomen op de buitenste epidermale laag van schutbladweefsels op vrouwelijke bloeiwijzen1, worden een steeds populairder onderzoeksonderwerp, voornamelijk vanwege hun geleidelijk erkende geneeskrachtige eigenschappen. Cannabidiol (CBD) is de op een na meest prominente cannabinoïde in cannabis na Δ9-tetrahydrocannabinol (THC) en wordt toegeschreven aan een groot aantal medicinale voordelen, waaronder pijnstillende eigenschappen2, anti-epileptische eigenschappen3, antidepressieve eigenschappen4, het verminderen van het risico op diabetes5 en de behandeling van verschillende slaapstoornissen6. Vanwege de vele gezondheidsvoordelen die gepaard gaan met de metabolieten van de cannabisplant, is er een groeiende vraag naar de productie op commerciële schaal7. Om aan deze vraag te voldoen, worden teeltmethoden voortdurend verbeterd en opnieuw uitgevonden om continu consistent, hoogwaardig plantmateriaal te leveren aan de opkomende cannabisindustrie.
De verspreiding van cannabis kan op twee manieren worden vergemakkelijkt: seksuele of ongeslachtelijke voortplanting. Een voorbeeld van seksuele voortplanting is het bestuiven van een vrouwelijke eicel met stuifmeel van de meeldraden van een mannetje, wat resulteert in een zaadje dat kan worden ontkiemd. Zaadkieming is een betrouwbare teeltmethode die is gebruikt voor veredelings- en teeltdoeleinden waarbij wenselijke fenotypische eigenschappen in ouderlijke lijnen worden geselecteerd om de kwaliteit van het nageslacht te verbeteren Cannabisplanten, inclusief eigenschappen zoals droogtetolerantie, insectenresistentie, verhoogde opbrengst en verhoogde potentie8 . Onbedoelde kruisbestuiving is echter een inherent risico bij het uitvoeren van seksuele voortplanting, waardoor ongewenste nakomelingen ontstaan, wat leidt tot het potentiële verlies van wenselijke eigenschappen of een introductie van ongewenste eigenschappen. Een voorbeeld van deze onbedoelde bestuiving wordt benadrukt door hennepkwekers die hennepzaad ontvangen dat is bestoven met THC-producerend stuifmeel, wat resulteert in aanzienlijk economisch verlies als gevolg van de niet-conforme planten (>0,3% totale THC w / w) 9. Bovendien, om een gewas te genereren dat alleen uit vrouwtjes bestaat, moet een gefeminiseerd zaad worden gezaaid in plaats van een niet-gefeminiseerd zaad, wat kan leiden tot hermafroditisme en andere ongewenste eigenschappen die leiden tot economisch verlies. Om de beperking van seksuele reproductie van cannabis te overwinnen, is aseksuele voortplanting op grote schaal toegepast in commerciële productiemodellen van de cannabisindustrie10.
Ongeslachtelijke reproductie van cannabis vereist slechts een enkele plant, wat de vermenigvuldiging van een enkel genotype mogelijk maakt dat commerciële productie van planten met wenselijke agronomische en farmaceutische eigenschappen mogelijk maakt. Een veel voorkomende vorm van ongeslachtelijke cannabisreproductie is het snijden en inbrengen van kleine delen van een vrouwelijke plant in een bodemloos substraat11 dat wordt bedekt door een vochtigheidskoepel om wortelvorming te induceren. Hoewel deze methode succesvol is gebleken, is een veel voorkomend nadeel de accumulatie van een hoge luchtvochtigheid (meestal 80% of hoger) in de koepel, waardoor een ideale groeiomgeving wordt geboden voor schimmelpathogenen, die schadelijk kunnen zijn voor nieuwe, gevoelige stekken. Een andere vorm van ongeslachtelijke vermeerdering is micropropagatie met behulp van weefselkweek, waarbij steriele technieken de voortplanting van insecten-, microbe- en virusvrij cannabisplantmateriaal in beperkte ruimte mogelijk maken12. Dit proces is echter duur, tijdrovend en vereist getrainde laboratoriumtechnici die over het algemeen niet toegankelijk zijn voor grootschalige cannabisfaciliteiten .
Er bestaan zeer weinig gepubliceerde onderzoeksrapporten over de klonale vermeerdering van cannabis. Om een basis te bieden voor het begrip van aseksuele reproductie van cannabis voor onderzoeksdoeleinden en industriële productie, was deze studie gericht op het aantonen van het gemak en de toegankelijkheid van het gebruik van aeroponische systemen voor de klonale vermeerdering van cannabis. Aeroponic-systemen zijn ideaal voor de ongeslachtelijke vermeerdering van cannabis, leveren consequent voedselrijk water aan de stekken, induceren vroege wortelvorming op een tijdige manier en zorgen ervoor dat een plant indien nodig voor onbepaalde tijd kan worden onderhouden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generatie van een moederplant voor klonale vermeerdering
- Selecteer een gezonde, vrouwelijke moederplant die wenselijke morfologische en chemische kenmerken vertoont die specifiek zijn voor het beoogde gebruik.
- Laat de moederplant de juiste grootte bereiken (ongeveer 25 volwassen scheuten) voor klonale vermeerdering (d.w.z. stekken).
- Laat de moederplanten in de vegetatieve groeifase (licht: donker = 18 h:6 h) blijven om de scheutgroei voor toekomstige vermeerdering te bevorderen.
2. Constructie en voorbereiding van een aeroponisch systeem
- Plaats eerst het deksel op de bovenkant van de container (38,1 cm x 25,4 cm x 30,48 cm). Boor het gewenste aantal gaten in het deksel en zorg voor voldoende ruimte (bij voorkeur 3 cm) tussen elk.
- Plaats de waterpomp (Tabel met materialen) in het midden van de container.
- Giet 7-8 L gedestilleerd water in de container zodat het pompmondstuk ongeveer 2,5 cm boven de waterlijn blijft.
OPMERKING: Dit zorgt ervoor dat de dompelpomp (Table of Materials) in staat is om water met voldoende kracht te duwen om zich over het deksel van de container te verspreiden. Gedestilleerd water wordt aanbevolen; er mag echter ook gewoon kraanwater worden gebruikt. - Plaats de juiste hoeveelheid Rockwool-kubussen (3,81 cm) (Materialentabel) of mediakubussen naar keuze in elke sleuf. Zet de pomp aan en laat hem 24 uur draaien.
OPMERKING: Steenwolblokjes hebben de voorkeur vanwege hun "verankeringsvermogen" op de nieuw gewortelde stekken die helpen planten rechtop te houden na transplantatie.
3. Selecteren en uitzoeken van geschikte scheuten
- Verzamel scheuten in de buurt van het apicale meristeem met behulp van een gesteriliseerd scalpel of schaar. Stekken zijn ~ 10 cm lang, idealiter met meerdere knopen.
OPMERKING: Knip de steel in een hoek van 45°. Snijden onder een hoek van 45° vergroot het oppervlak van het basale deel van de stek, waardoor er meer ruimte is voor wortelontwikkeling. Het is optioneel om een kleine spleet (1-2 cm) in het midden van de 45° snede te maken om het oppervlak verder te vergroten. - Verwijder al het gebladerte behalve het gebladerte dat aanwezig is op de bovenste drie knopen.
- Dompel de nieuw weggesneden stek in de worteloplossing met indool-3-boterzuur (IBA) (Materiaaltabel) ~ 2-5 cm omhoog vanaf de basis van de stengel gedurende ~ 5 s.
- Plaats de snede in het midden van een Rockwool-kubus die in het aeroponische systeem is geplaatst.
OPMERKING: De inbrengdiepte van het snijden moet ~ 1-2 cm van de bodem van de Rockwool-kubus blijven. - Spuit de onbewortelde stekken elke 3 dagen met de voedingsneveloplossing (Table of Materials).
- Kweek de stekken met 18-24 uur licht per dag met een fotosynthetische fotonenfluxdichtheid (PPFD) van 100 μmol/m2/s bij 24-29 °C en 40-60% relatieve vochtigheid.
4. Aeroponic systeem onderhoud en propagule gezondheid
- Vul het systeem elke 2-5 dagen aan met water met een pH tussen 5,0- 6,0.
- Vernevel de stekken (één nevel per snede) elke 3 dagen licht met de voedingsneveloplossing (Table of Materials).
- Voeg elke 3-5 dagen 5 ml van elke voedingsoplossing (tabel met materialen) toe aan het reservoir.
OPMERKING: De toevoeging van voedingsstoffen zorgt ervoor dat water bruin en troebel is. - Voeg elke 5 dagen 15 ml van de algen- en bacteriereinigingsoplossing toe die hypochloorzuur bevat (0,028%) per 10 l water (tabel met materialen).
5. Propagules verplanten
- Selecteer de stekken met lange, witte, vezelige wortels.
OPMERKING: Vermijd stekken met bruine, slijmerige en korte wortelsystemen, omdat dit een indicator is voor de aanwezigheid van wortelrot en het meestal langer duurt om te wennen aan het nieuwe groeimedium en ongewenste ziekten kan veroorzaken. - Maak de Rockwool-kubus voorzichtig los van het systeem en ontwar de wortels.
- Transplanteer de cannabispropagules in een kwekerijpot van 4 liter gevuld met een voedzame grondmix (tabel met materialen).
OPMERKING: Onmiddellijk water geven wordt aanbevolen om te voorkomen dat de wortels uitdrogen.
6. Reiniging en opslag van aeroponisch systeem
- Wanneer het systeem niet meer in gebruik is, was dan met water en reinig met 70% ethanol of een ander ontsmettingsmiddel.
- Verwijder het filter uit de waterpomp en spoel af met water om vuil te verwijderen.
- Droog het systeem af door het af te vegen met keukenpapier of een washandje.
- Plaats de pomp in het bad met het deksel erop en bewaar het totdat het nodig is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de efficiëntie van het beschreven aeroponische systeem te valideren, werden in totaal 10 en 12 gezonde scheuten van 14 cm lang weggesneden uit respectievelijk de moederplanten 'Cherry Wine' en 'Red Robin' (figuur 1A,B). Na het onderdompelen in rooting inductiemedia werden de klonen in het systeem geplaatst (figuur 2A). De constructie en werking van een aeroponisch systeem wordt weergegeven als een schematisch diagram in figuur 2A.
Na 2 dagen acclimatisatie begonnen alle klonen wortels te ontwikkelen in 3-7 dagen en volledig ontwikkelde wortels van 37 cm lang na 10-14 dagen op het systeem, wat voldoende was om te worden geplant in een met aarde gevulde pot (figuur 2B, D). Figuur 3 toont de gemiddelde lengte van scheuten en wortels van elke variëteit. De scheutlengte en wortellengte werden gemeten voordat ze naar de grond werden overgebracht. De gemiddelde lengte van scheuten en wortels was 24,8 cm ± 2,4 cm en 37,8 cm ± 2,5 cm voor 'Cherry Wine' en 21,4 cm ± respectievelijk 2,1 cm en 39,7 cm ± 5,9 cm voor 'Red Robin' (figuur 3A,B). De verschillen tussen de twee variëteiten werden geanalyseerd door tweerichtings-ANOVA, gevolgd door Tukey's multiple compassions-test, die geen significante verschillen in scheut- en wortellengtes tussen de twee variëteiten liet zien (n = 10-12, p < 0,05).
Figuur 1: Een gezonde moederplant die meerdere scheuten genereert voor klonale vermeerdering. (A) Volwassen moederplanten, "Cherry Wine" (voorkant) en "Red Robin" (achterkant) bij ~ 4 maanden vegetatieve groei, met talrijke scheuten die ideaal zijn voor vermeerdering. (B) Geschatte lengte (14 cm) voor een goede scheutexcisie voor het klonen van cannabis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Invoering van het aeroponische systeem voor de klonale vermeerdering van cannabis. (A) Schematisch diagram ter illustratie van de componenten van het aeroponische systeem (38,1 cm x 25,4 cm x 30,48 cm). B) Aeroponic-systeem dat volledig wordt ingenomen door "Cherry Wine"-klonen. (C) In het aeroponische systeem met klonen die wortelgroei vertonen. (D) Gezonde wortelgroei in Rockwool cube na 10 dagen in het aeroponische systeem. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Schiet- en wortellengtemetingen voor "Cherry Wine" en "Red Robin" na 10 dagen in het aeroponische kloonsysteem. (A) Een staafdiagram en (B) tabel die de lengte van de scheut en wortel in de twee hennepvariëteiten weergeeft. De verschillen in scheut/wortellengtes tussen twee variëteiten werden geanalyseerd door tweerichtings-ANOVA, gevolgd door Tukey's meervoudige vergelijkingstest. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met de toenemende vraag naar cannabisplanten met een consistent cannabinoïdegehalte, zijn verschillende klonale vermeerderingsmethoden gebruikt in de cannabisindustrie . De aseksuele vermeerdering vertoont verschillende voordelen ten opzichte van seksuele methoden voor grootschalige, consistente productie. Een aeroponisch voortplantingssysteem is een aangepaste versie van een hydroponisch systeem dat gebruik maakt van een beluchte voedselrijke watermist om een snelle wortelontwikkeling te bieden. Het beschreven aeroponische systeem bestaat uit drie kritische stappen, 1) het genereren van een gezonde vrouwelijke Cannabis 'moederplant' als genetische bron voor een gewenste fysische / chemische eigenschap, 2) het snijden van scheuten (apicale meristeem) en het behandelen met wortelinductiemedia die de auxinevoorloper, IBA, bevatten, en 3) acclimatisatie van het propagule in de gewenste kwekerijpot.
Het aeroponische vermeerderingssysteem maakt de efficiënte productie van hennepklonen mogelijk met duidelijke voordelen ten opzichte van verschillende vermeerderingsmethoden. Het omvat 1) tijd- en kostenbesparing door minder arbeidsintensieve gezonde, volwassen wortelvorming zodra 5 dagen; 2) genetische homogeniteit - waardoor genetisch identieke klonen kunnen worden geproduceerd, met uitzondering van genetische variaties, om reproduceerbaar cannabisonderzoek en industriële toepassingen mogelijk te maken; 3) uniformiteit bij grootschalige operaties; en 4) minder kwetsbaarheid voor microbiële pathogenen - het handhaven van een relatief lage luchtvochtigheid in het bovenste bladerdak van planten dan de vochtigheidsgraad die is gebouwd in de container waar wortelontwikkeling plaatsvindt.
Hoewel het aeroponische systeem een aantal voordelen biedt, zijn er een paar beperkingen die tijdens de oefeningen zorgvuldig moeten worden aangepakt. Ten eerste, omdat alle voedingsstoffen hydroponisch worden verstrekt, kan het gemakkelijk worden besmet met algen-, schimmel- en virale (bijv. Hop latente viroïde) pathogenen die leiden tot de misvorming van het wortelstelsel die wordt verzacht door regelmatige behandeling van antimicrobiële / schimmel / virale agent (en). Ten tweede kan het wijdverbreide gebruik van een eenmoederinstallatie problematisch zijn voor productiefaciliteiten. Het hebben van één genotype kloonlijn als enige plant in een productiemodel leidt tot een risico op volledig gewasverlies als dat genotype vatbaar is voor een bepaald plaagorganisme of pathogeen dat in die teeltfaciliteit aanwezig is; daarom wordt aanbevolen om meerdere moederplanten uit verschillende afstammingslijnen te onderhouden die worden gebruikt om productieklonen te vermeerderen met dit aeroponische kloonsysteem om economisch verlies van een bepaalde plaag of ziekteverwekker te beperken13. Het wordt geadviseerd om een moederplant slechts 6 maanden vegetatief te laten groeien voordat een nieuwe moederplant wordt gekloond om te gebruiken als de toekomstige bron voor productieklonen. Dit voorkomt overwoekerde wortels die kunnen leiden tot ongezonde moederplanten en lagere slagingspercentages voor klonen, evenals overwoekerde luifels die ongedierte en ziekteverwekkers kunnen herbergen, die kunnen worden overgedragen op de vermeerderde klonen.
Het aeroponic systeem is industrieel schaalbaar op een kosteneffectieve manier. Figuur 1 laat zien dat minimaal 20 plantaardige materialen in één container kunnen worden ondergebracht (38,1 cm x 25,4 cm x 30,48 cm). Het systeem kan eenvoudig worden opgeschaald om meer dan 50 planten per eenheid te bevatten zonder de kosten voor water, voedingsstoffen en elektriciteit te verhogen. De hier beschreven voordelen voor de huidige methode bieden een reden om het aeroponische kloonsysteem te implementeren in industriële praktijken en onderzoekslaboratoria voor de tijdsefficiënte en uniforme verspreiding van cannabis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door het Institute of Cannabis Research aan de Colorado State University-Pueblo en het ministerie van Wetenschap en ICT (2021-DD-UP-0379) en Chuncheon city (Hemp R & D and industrialization, 2020-2021), De auteurs willen ook Justin Henderson op Summit CBD bedanken voor de genereuze donatie voor "Cherry Wine" -zaden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-part Fox Farm | Fox Farm | Soil Mix | |
| 1-part Promix | Promix | Soil Mix | |
| 1-part Roots Organic Original | Auora Innovations | Soil Mix | |
| 1-part Wiggle Worm Earth Worm Castings | UNCO Industries | Soil Mix | |
| Algae and Bacterial Cleaning Solution (Clear Rez) | EZ Clone | SKU#: 225 | 8 fl. Oz. |
| Artificial Lighting | AgroBrite | SKU#: 1399 | T5 324W 4' 6-Tube Fixture with Lamps |
| Cannabis Mother plant 1 (Cherry Wine) | Summit CBD | N/A | Donated material |
| Cannabis Mother Plant 2 (Red Wine) | Trilogene | SKU: 0101RR | |
| Corresponding Plastic Lid | Office Depot | N/A | 38.1 cm x 25.4 cm |
| Drill Bit 1 | Dewalt | DW1586 | 38.1 mm spade drill bit |
| Drill Bit 2 | Dewalt | DW1308 | 3.175 mm drill bit |
| Flora/Bloom (Nutrient Solution)-5 mL | General Hydroponics | SKU#: 726 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) (Available Phosphate 5.0%, Soluble Potash 4.0%, Magnesium 1.5%, Sulfur 1.0%) |
| FloraGrow (Nutrient Solution)- 5 mL | General Hydroponics | SKU#: 724 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 2.0% (0.25% Ammoniacal Nitrogen, 1.75% Nitrate Nitrogen), Available Phosphate 1.0%, Soluble Potash 6.0%, Magnesium 0.5%)) |
| FloraMicro (Nutrient Solution)- 5 mL | General Hydroponics | SKU#: 759 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 5.0% (0.3% Ammoniacal Nitrogen, 4.7% Nitrate Nitrogen), Soluble Potash 1.0%, Calcium 5.0%, Boron 0.01%, Cobalt 0.0005%, Copper 0.01%, Iron 0.1%, Manganese 0.05%, Molybdenum 0.0008%, Zinc 0.015%)) |
| Horticultural Scissors | Shear Perfection | SKU#: 12620 | Platinum Stainless Steel Bonsai Scissors (2.4") |
| Isopropyl Alcohol | Equate | Walmart # 574133562 | 70% concentration |
| Nutrient Mist Solution (Clonex Mist) | Growth Technology | SKU#: 4889 | 10.14 fl. Oz (300 ml) (Total Nitrogen: 5.9 × 10-4 %, Available Phosphate: 4.0 × 10-4 %, Soluble Potash: 5.0 × 10-4 %) |
| pH Down | General Hydroponics | SKU#: 733 | 946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) |
| pH Up | General Hydroponics | SKU#: 730 | 946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) |
| Plastic Container | Office Depot | N/A | 38.1 cm x 25.4 cm x 30.48 cm |
| Power Drill | Dewalt | DCD709B | 20-Volt Max ½” Drill |
| Rockwool Cubes | Grodan | SKU#: 830 | 38.1 mm |
| Rooting Solution (Clonex Rooting Gel) | Growth Technology | SKU#: 939 | 3.4 fl. Oz. (100 ml) (Indolebutyric Acid - 0.31%) |
| Statistic Software (Prism) | GraphPad Inc. | ||
| Submersible Water Pump | ActiveAQUA | SKU: AAPW250 | Model: AAPW250, Voltage 120V, Power 16W |
References
- ElSohly, M. A., Radwan, M. M., Gul, W., Chandra, S., Galal, A.
- Cunetti, L., et al. Chronic pain treatment with cannabidiol in kidney transplant patients in Uruguay. Transplantation Proceedings. 50 (2), 461-464 (2018).
- Hausman-Kedem, M., Menascu, S., Kramer, U. Efficacy of CBD-enriched medical cannabis for treatment of refractory epilepsy in children and adolescents - An observational, longitudinal study. Brain & Development. 40 (7), 544-551 (2018).
- Linge, R., et al. Cannabidiol induces rapid-acting antidepressant-like effects and enhances cortical 5-HT/glutamate neurotransmission: role of 5-HT1A receptors. Neuropharmacology. 103, 16-26 (2016).
- Lehmann, C., et al. Experimental cannabidiol treatment reduces early pancreatic inflammation in type 1 diabetes. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (4), 655-662 (2016).
- Shannon, S., Lewis, N., Lee, H., Hughes, S. Cannabidiol in anxiety and sleep: A large case series. The Permanente Journal. 23, 18-41 (2019).
- Russo, E. B. History of cannabis and its preparations in saga, science, and sobriquet. Chemistry & Biodiversity. 4 (8), 1614-1648 (2007).
- Vera, C. L., Hanks, A.
- Deventer, M. V. Hot hemp: How high THC levels can ruin a legal hemp harvest. , Available from: https://www.westword.com/marijuana/hot-hemp-how-high-thc-levels-can-ruin-a-legal-hemp-harvest-9963683 (2018).
- Lata, H., Chandra, S., Techen, N., Khan, I. A., ElSohly, M. A. Assessment of the genetic stability of micropropagated plants of Cannabis sativa by ISSR markers. Planta Medica. 76 (1), 97-100 (2010).
- Caplan, D., Dixon, M., Zheng, Y. Optimal rate of organic fertilizer during the flowering stage for Cannabis grown in two coir-based substrates. HortScience. 52 (12), 1796 (2017).
- Monthony, A. S., Page, S. R., Hesami, M., Jones, A. M. P. The past, present and future of Cannabis sativa tissue culture. Plants (Basel). 10 (1), 185 (2021).
- Clarke, R. C., Merlin, M. D. Cannabis domestication, breeding history, present-day genetic diversity, and future prospects. Critical Reviews in Plant Sciences. 35 (5-6), 293-327 (2016).
