Summary
الهدف من هذا البروتوكول هو الكشف عن المستقلبات الفينولية في البلازما باستخدام طريقة قياس الطيف الكتلي الكروماتوغرافي شبه المستهدفة.
Abstract
أعطيت مجموعة من 23 شخصا من كبار السن وجبات وظيفية (مشروب وكعك) وضعت خصيصا للوقاية من ساركوبينيا (فقدان كتلة العضلات المرتبط بالعمر). تم أخذ عينات البلازما في بداية التدخل وبعد 30 يوما من استهلاك الوجبات الوظيفية. تم إجراء كروماتوغرافيا شبه مستهدفة فائقة الأداء مقترنة بتحليل الكتلة الترادفية (UPLC-MS/MS) لتحديد المركبات الفينولية ومستقلباتها. تم ترسيب بروتينات البلازما بالإيثانول وتم تركيز العينات وإعادة تعليقها في المرحلة المتنقلة (1: 1 acetonitrile: water) قبل الحقن في أداة UPLC-MS/MS. تم إجراء الفصل باستخدام عمود الطور العكسي C18 ، وتم تحديد المركبات باستخدام كتلتها التجريبية وتوزيعها النظيري ونمط الشظايا. وتمت مقارنة المركبات ذات الأهمية بمركبات بنوك البيانات والمكتبة الداخلية شبه المستهدفة. أظهرت النتائج الأولية أن المستقلبات الرئيسية التي تم تحديدها بعد التدخل كانت حمض الفينيلاسيتيك ، والجليسيتين ، وحمض 3-هيدروكسي فينيل فاليريك ، وغوميسين M2.
Introduction
ساركوبينيا هو اضطراب هيكلي تدريجي مرتبط بفقدان العضلات المتسارع لدى كبار السن. تزيد هذه الحالة من خطر السقوط وتؤدي إلى أنشطة محدودة للحياة اليومية. ساركوبينيا موجودة في حوالي 5٪ -10٪ من الأشخاص الذين تزيد أعمارهم عن 65 عاما وحوالي 50٪ من الأشخاص الذين تتراوح أعمارهم بين 80 عاما أو أكثر1. لم تتم الموافقة على أي أدوية محددة لعلاج ساركوبينيا ، لذلك من المهم الوقاية من خلال النشاط البدني واتباع نظام غذائي متوازن بشكل جيد1,2. أظهرت التدخلات الغذائية مع الأطعمة المصممة خصيصا والمخصبة ببروتين الألبان والأحماض الأمينية الأساسية نتائج إيجابية في الوقاية من ساركوبينيا2. في دراسات أخرى ، أدرج المؤلفون الفيتامينات ومضادات الأكسدة ، مثل فيتامين E والايسوفلافون ، في النظام الغذائي ، مما زاد من فوائد اكتساب العضلات على الخصر والوركين 3.
Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) هي شجرة تنمو في المناطق الاستوائية المكسيكية. وقد استهلكته ثقافات المايا بسبب قيمته الغذائية العالية4. وهو مصدر جيد للبروتين والألياف والمعادن ومضادات الأكسدة الفينولية ، مثل حمض الكلوروجينيك 5. نظرا لأنه يمكن طحنه إلى مسحوق واستخدامه في منتجات الخبز أو استهلاكه في المشروبات ، فقد قيمت الدراسات الحديثة دمج دقيق بذور رامون (RSF) في الأطعمة المختلفة لتحسين قيمتها الغذائية. تم صياغة مشروب بنكهة الكابتشينو المكمل من قبل مراسلون بلا حدود ، والذي كان يحتوي على نسبة عالية من الألياف الغذائية وكان يحتوي على أكثر من 6 غرامات من البروتين لكل حصة ، وكان مقبولا للغاية من قبل المستهلكين. وبالتالي، اعتبر بديلا محتملا لتلبية المتطلبات الغذائية الخاصة6. وفي دراسة متابعة، استخدمت مراسلون بلا حدود أيضا لصياغة الكعك ومشروب جديد غني بالبروتين والألياف الغذائية والمغذيات الدقيقة ومضادات الأكسدة الفينولية. تم استخدام الكعك والمشروبات في تدخل غذائي للأفراد المسنين ، الذين تناولوا كلا المنتجين مرتين في اليوم لمدة 30 يوما. بعد هذه الفترة ، تحسنت الحالة الغذائية والساركوبينية للمشاركين ، وزاد المحتوى الفينولي الكلي للبلازما7. ومع ذلك ، تم تحديد المركبات الفينولية الكلية في البلازما بطريقة الطيفية ، لذلك لم يكن من الممكن تحديد المركبات الفينولية الفعلية التي تم امتصاصها ؛ علاوة على ذلك ، هذه الطريقة ليست محددة تماما للمركبات الفينولية ، لذلك قد يحدث بعض المبالغة في التقدير8.
يعد تحديد المركبات الفينولية التي يتم امتصاصها بعد استهلاك الأطعمة الغنية بمضادات الأكسدة هذه مهمة صعبة ولكنها ضرورية لإثبات النشاط البيولوجي لهذه المواد الكيميائية النباتية. التوافر البيولوجي لمعظم المركبات الفينولية منخفض. يمكن العثور على أقل من 5٪ منها دون تحول هيكلي في البلازما. تخضع المركبات الفينولية للعديد من التحولات الحيوية ، مثل المثيلة أو السلفونات أو الجلوكورونايد ، والتي يتم تنفيذها بواسطة الخلايا المعوية وخلايا الكبد9. كما يتم تحويل المركبات الفينولية بيولوجيا بواسطة الميكروبات إلى هدم بكتيري قد يمارس آثاره المفيدة في الجسم بعد امتصاصه في البلازما10. على سبيل المثال ، حمض الفينيلاسيتيك هو نتاج التحول البكتيري للفلافونويد والبروانثوسيانيدينات قليلة القلة ، والتي يمكن أن تمنع ما يصل إلى 40 ٪ من التصاق البكتيريا (الإشريكية القولونية) في المسالك البولية بعد استهلاك التوت البري 11.
إن التنوع الهيكلي للمركبات الفينولية التي تحدث بشكل طبيعي ، بالإضافة إلى تنوع مستقلباتها وانخفاض توافرها البيولوجي ، يجعل تحديدها في البلازما أكثر تحديا. وربما يكون التنميط الأيضي، باستخدام منصات التحليل الطيفي مثل الرنين المغناطيسي النووي (NMR) والتحليل الطيفي الكتلي الترادفي (MS/MS)، أفضل نهج لتحقيق هذا الهدف؛ ولسوء الحظ، لا يمكن الوصول إلى المعدات بسهولة، ولا يزال تطوير بروتوكولات التحليل محدودا12. أبلغت العديد من الدراسات عن MS / MS إلى جانب نظام فصل (مثل الكروماتوغرافيا السائلة) كاستراتيجية للحد من تعقيد أطياف الكتلة في الدراسات الأيضية. أدى الإدخال الأخير لطرق فصل الكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء (UPLC) إلى تقليل وقت التحليل وزيادة الدقة والحساسية مقارنة بالبروتوكولات السائلة التقليدية عالية الأداء، لذلك سرعان ما تم قبول أنظمة UPLC-MS/MS على نطاق واسع من قبل مجتمع الأيض التحليلي13. وبهذه الطريقة ، حققت بعض الدراسات في مستقلبات الفينول واكتشفت مشتقات الجلوكورونيدات من حمض الكافيين والكيرسيتين وحمض الفيروليك ، وكذلك المشتقات الكبريتية من حمض المحاقن والفانيليك في بلازما الأفراد بعد تناول التوت البري14. كانت البروتوكولات السابقة تهدف إلى العثور على المركبات الفينولية والمستقلبات الفينولية في السوائل الحيوية مثل البلازما. وقد استندت هذه البروتوكولات إلى تحديد الهوية والقياس الكمي بواسطة كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC) مقترنة بكاشف الأشعة فوق البنفسجية15. ومع ذلك، تتطلب هذه البروتوكولات استخدام معايير أصيلة لتقييم التحديد المطلق والقياس الكمي الدقيق. وقد حددت مجموعة واسعة من الدراسات المستقلبات الأكثر شيوعا في السوائل الحيوية (الأشكال الكبريتية والجلوكورونيدات والميثيلية) بواسطة UPLC-MS و UPLC-MS/MS؛ ومع ذلك ، لم يتم الإبلاغ عن جزء كبير من المستقلبات البكتيرية بسبب عدم وجود قواعد بيانات تحتوي على معلوماتها الكاملة16. تحديد الأيض معقد بسبب التكلفة والتوافر التجاري لمعايير الأيض. لذلك ، قد تكون أفضل استراتيجية هي تحليل مستقلب MS / MS غير المستهدف أو شبه المستهدف ، والذي يعتمد على استخدام معلومات المعالم الجزيئية (m / z ، الكتلة الدقيقة أحادية النظائر ، توزيع النظائر ، ونمط التجزئة) لتحديد الهوية الكيميائية ومقارنتها بقواعد البيانات المتاحة مجانا عبر الإنترنت التي تحتوي على مستقلبات البوليفينول المحددة في الموائع الحيوية بعد استهلاك polypolyphenol-richts12 . أهم قواعد البيانات المستخدمة في دراسات UPLC-MS/MS لتحديد المركبات الفينولية ومستقلباتها هي قاعدة بيانات الأيض البشري (HMDB) ومكتبة LipidBlast ومكتبة METLIN وقواعد البيانات التكميلية الأخرى ، مثل PubChem و ChemSpider و Phenol Explorer17.
في هذه الدراسة، تم تطوير طريقة UPLC-MS/MS شبه المستهدفة لتحليل عينات البلازما لمجموعة كبار السن المشاركين في دراسة استهلاك الكعك والمشروبات المحتوية على مراسلون بلا حدود7. تم جمع البيانات من قواعد بيانات مجانية مختلفة على الإنترنت لمستقلبات البلازما ودمجها في قاعدة بيانات متخصصة. يمكن الوصول إلى قاعدة البيانات هذه تلقائيا بواسطة برنامج المعدات لتحديد مستقلبات البوليفينول في عينات البلازما الخمس قبل وبعد التدخل الغذائي لمدة 30 يوما. يتم ذلك لتحديد المركبات الفينولية الرئيسية ، أو مستقلباتها ، التي يتم امتصاصها من الأطعمة الوظيفية المصممة خصيصا للوقاية من ساركوبينيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم جمع عينات البلازما المستخدمة في هذا البروتوكول في دراسة سابقة باتباع جميع المبادئ التوجيهية الأخلاقية ووافقت عليها لجنة الأخلاقيات المؤسسية وأخلاقيات البيولوجيا (CIEB-2018-1-37) من جامعة سيوداد خواريز المستقلة. ويمثل الشكل 1 البروتوكول الكامل لاستخراج وتحديد المركبات الفينولية والمستقلبات في البلازما بواسطة UPLC-MS/MS.
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لاستخراج وتحديد المركبات الفينولية والمستقلبات في البلازما بواسطة طريقة UPLC-MS/MS شبه المستهدفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
1. إعداد العينات
- تخزين عينات البلازما في -80 درجة مئوية حتى التحليل.
- تذويب عينات البلازما في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: يمكن وضع العينات في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لتسريع العملية (5 دقائق). - ضع 200 ميكرولتر من عينة البلازما في أنبوب ميكروبي سعة 2 مل واخلطه مع 1000 ميكرولتر من الإيثانول النقي. دوامة عينة البلازما لمدة 30 ثانية.
ملاحظة: استخدم القفازات دائما عند العمل مع عينات البلازما. - الطرد المركزي للعينة عند 6,580 × g لمدة 5 دقائق. بعد الطرد المركزي ، قم بجمع supernatant باستخدام ماصة دقيقة أو ماصة باستور ووضعها في أنبوب دقيق جديد. تخزين supernatant في 4 درجة مئوية.
- امزج الكريات من الخطوة السابقة مع 1000 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ ، ودوامة لمدة 30 ثانية ، ثم جهاز طرد مركزي عند 6580 × جم لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: الكريات معبأة بقوة وتحتاج إلى إعادة تعليقها جيدا لضمان الاتصال بين العينة والإيثانول النقي. يوصى باستخدام ماصة دقيقة لطرد الكريات بالإيثانول. - بعد الطرد المركزي ، اجمع supernatant واخلطه مع supernatant الذي تم الحصول عليه مسبقا من الخطوة 1.4. في أنبوب دقيق 2 مل.
- قم بإزالة الإيثانول من العينة باستخدام النيتروجين النقي (99.997٪) عند 135 رطل لكل بوصة مربعة. احتفظ بالإبرة على بعد 1 سم من الجزء العلوي من الأنبوب الدقيق لمنع فقدان العينة وتدفقها حتى تجف العينة. ليست هناك حاجة إلى حرارة لتبخر الإيثانول.
ملاحظة: يجب أن يكون تدفق النيتروجين منخفضا لمنع فقدان العينة. بمجرد تجفيف الإيثانول ، حافظ على تدفق النيتروجين لمدة 5 دقائق على الأقل لضمان جفاف العينة. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا عند هذه النقطة. يجب تخزين العينات عند -20 درجة مئوية. تجنب تخزين العينات لأكثر من 12 ساعة. - أعد تعليق العينات الجافة في 100 ميكرولتر من خليط من الأسيتونيتريل: الماء بنسبة 50:50 (v:v).
- قم بتصفية العينة من خلال غشاء حقنة نايلون 0.45 ميكرومتر مباشرة في إدراج قارورة HPLC الدقيقة.
ملاحظة: يمكن تخزين العينات الموجودة في القارورة عند -20 درجة مئوية قبل التحليل. تخزين العينات لمدة لا تزيد عن 8 ساعات. يوصى بحقن العينات في نظام UPLC بعد الترشيح مباشرة.
2. تحليل UPLC-MS / MS
- حقن 3 ميكرولتر من العينة على UPLC المجهز بعمود C18 الطور العكسي (50 مم × 2.1 مم ؛ 1.8 ميكرومتر). اضبط درجة حرارة جهاز أخذ العينات التلقائي على 20 درجة مئوية وترموستات العمود على 25 درجة مئوية. حقن كل عينة في ثلاثة أضعاف.
- استخدم 0.1٪ (v:v) حمض الفورميك في الماء كمذيب A ، و 100٪ acetonitrile كمذيب B. اضبط معدل التدفق عند 0.4 مل / دقيقة وبرنامج تدرج على النحو التالي: 0-1 دقيقة 10٪ B ، 1-4 دقيقة 30٪ B ، 4-6 دقيقة 38٪ B ، 6-8 دقيقة 60٪ B ، 8-8.5 دقيقة 60٪ B ، 8.5-9 دقيقة 10٪ B (الجدول 1).
- اضبط مطياف الكتلة على تأين الوضع السالب. استخدم النيتروجين كغاز تجفيف عند 340 درجة مئوية ومعدل تدفق 13 لتر / دقيقة. اضبط ضغط البخاخات عند 60 رطل لكل بوصة مربعة. اضبط الجهد الشعري على 4000 فولت، وجهد الشظايا على 175 فولت، وجهد القاشطة على 65 فولت.
- امسح الكتل ضوئيا بين 100-1100 كتلة إلى نسبة الشحنة (m/z)، وبالنسبة ل MS/MS، امسح الكتل ضوئيا بين 50-1000 m/z (الجدول 2). قم بتعيين الحصول على البيانات إلى وضع MS/MS التلقائي. استخدم الكتلة المرجعية التالية: 119.036 و 966.0007.
| الوقت (دقيقة) | المذيب A (0.1٪ حمض الفورميك في ماء HPLC) | المذيب B (100٪ الأسيتونيتريل) |
| 0 إلى 1 | 90 | 10 |
| 1 إلى 4 | 70 | 30 |
| 4 إلى 6 | 62 | 38 |
| 6 إلى 8 | 40 | 60 |
| 8 إلى 8.5 | 40 | 60 |
| 8.5 إلى 9 | 90 | 10 |
الجدول 1: تدرج الطور المتنقل المستخدم لفصل المركبات الفينولية بواسطة UPLC.
| وضع التأين | سالب |
| غاز التجفيف | النيتروجين عند 340 درجة مئوية، معدل التدفق 13 لتر/دقيقة |
| ضغط البخاخات | 60 رطل لكل بوصة مربعة |
| الجهد الشعري | 175 فولت |
| كتل فحص التصلب المتعدد | 100-1100 م / ز |
| MS / MS كتل المسح الضوئي | 50-1000 م / ز |
الجدول 2: بارامترات التأين لتحليل MS/MS.
3. بناء قاعدة البيانات
- ابحث عن المركبات الفينولية أو الأيضات الفينولية أو المركبات الأخرى ذات الأهمية في الأدبيات العلمية.
- افتح برنامج إدارة قواعد البيانات المضمن في نظام UPLC. حدد ملف | مكتبة مجمع قواعد البيانات الشخصية الجديدة (PCDL) | إنشاء PCDL جديد. حدد نوع PCDL: LC / MS METABOLOMICS. تعيين اسم ل PCDL. ثم حدد إنشاء.
- في شريط الأدوات، حدد PCDL ثم الخيار السماح بالتحرير . ثم انقر فوق الزر البحث عن مركبات .
ملاحظة: نظرا لأنه PCDL جديد ، ستكون نتائج الجدول فارغة. سيتغير هذا بمجرد إضافة مركبات جديدة إلى PCDL.- إضافة مركبات إلى مكتبة مجمع قاعدة البيانات الشخصية المتخصصة عن طريق نسخها من المكتبة العامة للأداة. افتح قاعدة البيانات الحالية للأداة المضمنة في برنامج إدارة قاعدة البيانات. انقر فوق الزر البحث عن المركبات. في خيار البحث الفردي ، أدخل معايير البحث المركب للعثور على مركب الاهتمام.
ملاحظة: يمكن العثور على المركبات بالاسم والصيغة الجزيئية والكتلة الدقيقة ووقت الاستبقاء. - في جدول النتائج المركبة، حدد مركب الاهتمام. لتحديد أكثر من مركب واحد، انقر فوق المركب الأول، واضغط باستمرار على المفتاح CTRL، ثم انقر فوق كل مركب ذي أهمية. ثم انقر بزر الماوس الأيمن فوق جميع المركبات المميزة وحدد إلحاق ب PCDL.
- في النافذة الجديدة ، ابحث عن ملف قاعدة البيانات الشخصية المتخصصة وحدده. ضع علامة على المربعات تضمين أطياف للمركبات إذا كانت موجودة وتضمين معلومات التنقل الأيوني للمركبات إن وجدت. انقر فوق الزر إلحاق . في مربع الحوار الجديد، حدد نعم للتحقق من المركبات الجديدة المضافة. حدد لا لمواصلة البحث عن المزيد من المركبات ذات الاهتمام.
- إضافة مركبات إلى مكتبة مجمع قاعدة البيانات الشخصية المتخصصة عن طريق نسخها من المكتبة العامة للأداة. افتح قاعدة البيانات الحالية للأداة المضمنة في برنامج إدارة قاعدة البيانات. انقر فوق الزر البحث عن المركبات. في خيار البحث الفردي ، أدخل معايير البحث المركب للعثور على مركب الاهتمام.
- إذا لم تكن المركبات ذات الأهمية متوفرة في المكتبة العامة للأداة، فأضف مركبات جديدة يدويا.
- افتح قاعدة البيانات الشخصية المتخصصة. بمجرد فتحه، اتبع الخطوة 3.3. حدد الخيار تحرير المركبات . انقر فوق الزر إضافة جديد .
- في القسم العلوي من النافذة ، أكمل المعلومات الخاصة بالمركب الجديد. املأ الصيغة والاسم واسم IUPAC ورقم CAS ومعرف Chemspider والمعرفات الأخرى.
- استخدم المعلومات المتوفرة في المكتبات المجانية عبر الإنترنت (Chemspider و PubChem و Phenol Explorer) لملء المعلومات الخاصة بالمركب الجديد محل الاهتمام. بمجرد الانتهاء، انقر فوق الزر حفظ كجديد لحفظ معلومات المركب الجديد في قاعدة البيانات الشخصية المتخصصة.
ملاحظة: عند إضافة معلومات من المكتبات المجانية ، تأكد من تضمين المعلومات المركبة دون وجود أيونات الكلوريد أو اليوديد. هذا قد يعدل الكتلة الدقيقة والصيغة الجزيئية للمركب محل الاهتمام.
- كرر العملية مع جميع المركبات التي تهمك لاستكمال قاعدة البيانات الشخصية المتخصصة.
4. تحليل البيانات
- استخدم برنامج المدير النوعي للأداة لتحديد المركبات الفينولية والمستقلبات الفينولية الموجودة في العينات.
- افتح نموذج الملف. في لوحة Chromatogram، حدد تعريف كروماتوغرام واستخراج كروماتوجرام الأيونات الكلي (TIC)، وكروماتوجرام الأيونات المستخرج من MS (EIC)، وEIC ل MS/MS. حدد خيار دمج الكروماتوغرام.
- في لوحة البحث عن مركبات ، حدد بحث حسب خيارات الصيغة. في النافذة الجديدة، حدد مصدر الصيغة ثم خيار قاعدة البيانات/المكتبة . ابحث عن قاعدة البيانات الشخصية التي تم إنشاؤها مسبقا وانقر على فتح.
- حدد خيار مطابقة الصيغة واضبط تسامحا مع مطابقة الكتلة بمقدار 5 أجزاء في المليون (جزء في المليون).
ملاحظة: يمكن تعيين تسامح مختلف للجماهير عند 10 أجزاء في المليون. يعتمد هذا الاختلاف على مطياف الكتلة المستخدم. - حدد خيار الأيونات السالبة وحدد مربع الحوار -H فقط. في خيار النتائج ، ضع علامة على مستخلص EIC، واستخراج الطيف النظيف، واستخراج الطيف الخام، وقم بتضمين مربعات الحوار هيكل .
- حدد خيار عوامل تصفية النتائج. ضع علامة تحذير إذا كانت النتيجة وقم بتعيين مطابقة النتيجة عند 80.00٪. علامة لا تتطابق إذا كانت النتيجة وتعيين النتيجة عند 75.00٪.
ملاحظة: يمكن تغيير درجات المطابقة/عدم المطابقة إلى قيم أقل إذا لزم الأمر. هذا سوف يقلل من دقة تحديد الهوية. - انقر على البحث عن المركبات حسب الصيغة لتحديد المركبات ذات الأهمية في العينة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 2 العملية خطوة بخطوة لتحديد المستقلبات الفينولية من خلال تحليل UPLC-MS/MS شبه المستهدف، في الوضع السلبي، لعينات البلازما. أولا ، تم الحصول على كروماتوجرام الأيونات الكلية (TIC) من مستخلص فينولات البلازما (تم الحصول عليه بعد ترسيب البروتين لعينة البلازما الكلية) من خلال البرنامج النوعي للأداة. بعد ذلك ، تم استخدام كروماتوجرام الأيون المستخرج ، وتمت مقارنة نمط الكتلة والتجزئة الدقيق (تحليل MS / MS) لكل إشارة (أو ميزة جزيئية) مع تلك الخاصة بقاعدة بيانات شخصية محددة تم إنشاؤها أيضا في برنامج الأداة. تم تعيين صيغة جزيئية للإشارات ذات التطابق الكتلي أقل من 5 جزء في المليون من قاعدة البيانات. وأخيرا، تمت مقارنة التوزيع النظيري لكل إشارة بالتوزيع النظيري للصيغة الجزيئية المخصصة لتحقيق التحديد النهائي المؤقت. المركبات التي تم تحديدها (أ) فقط في نسخة متماثلة واحدة أو ب) قدمت مساحة أقل من 10000 تم التعامل معها على أنها هويات خاطئة. من هذا التحليل ، تم تحديد ما مجموعه 25 مركبا فينوليا ومستقلبات في عينات البلازما (الجدول 3). في هذه القائمة ، تم العثور على كل من المركبات الفينولية ومستقلباتها ، مثل حمض 3-hidroxyphenylvaleric و isopropyl 3-(3,4-dihydroxyphenyl) -2-hydroxypropanoate. نظرا لأن وضع التأين السلبي هو الأنسب لجميع فئات المركبات الفينولية ، باستثناء الأنثوسيانين ، فلا يمكن اكتشاف هذه المركبات بالطريقة الحالية. إذا كانت الأنثوسيانين مكونات مهمة في مصفوفة الطعام ، فيجب أيضا استخدام الوضع الإيجابي.
| المستقلبات الفينولية | ر. ت. (دقيقة) | صيغة | السلائف | الكتلة التجريبية | الكتلة النظرية | الفرق (جزء في المليون) | |
| 2,3-حمض ثنائي هيدروكسي بنزويك | 0.622 | C7H6O4 | 153.0203 | 154.0273 | 154.0266 | 4.2 | |
| 2-حمض هيدروكسي هيبوريك | 8.631 | C18H33NO4 | 410.1648 | 411.1725 | 411.1717 | 1.8 | |
| 3,4-ثنائي هيدروكسي تولوين | 2.239 | C7H8O2 | 123.0451 | 124.0524 | 124.0524 | -0.25 | |
| 3-حمض هيدروكسي فينيل فاليريك | 6.717 | C11H14O3 | 193.0874 | 194.0947 | 194.0943 | 2.12 | |
| 5-(3',4'-ثنائي هيدروكسي فينيل)-حمض فاليريك | 4.293 | C11H14O4 | 209.0823 | 210.0894 | 210.0892 | 0.68 | |
| 6-هيدروكسي إنتيروديول | 9.201 | C18H22O5 | 317.1387 | 318.1465 | 318.1467 | -0.65 | |
| أجوغول | 3.889 | C15H24O9 | 347.134 | 348.1418 | 348.142 | -0.59 | |
| حمض البنزويك | 3.915 | C7H6O2 | 121.0296 | 122.0367 | 122.0368 | -0.28 | |
| حمض الكارنوزيك | 6.785 | C20H28O4 | 331.1905 | 332.1979 | 332.1988 | -2.58 | |
| كارنوسول | 6.347 | C20H26O4 | 329.1764 | 330.1842 | 330.1831 | 3.43 | |
| الكاتيكول | 0.892 | C6H6O2 | 109.0297 | 110.037 | 110.0368 | 1.91 | |
| الجليكيتين | 6.01 | C22H22O10 | 445.1155 | 446.1228 | 446.1213 | 3.4 | |
| هيسبيريتين | 6.01 | C16H14O6 | 301.0718 | 302.0796 | 302.079 | -1.81 | |
| حمض الهيبوريك | 1.396 | C9H9NO3 | 178.051 | 179.058 | 179.0582 | -1.16 | |
| حمض الهوموفانيليك | 0.823 | C9H10O4 | 181.0503 | 182.0576 | 182.0579 | -1.88 | |
| الأيزوبروبيل 3-(3,4-ثنائي هيدروكسي فينيل)-2-هيدروكسي بروبانوات | 6.177 | C12H16O5 | 239.0926 | 240.0999 | 240.0998 | 0.48 | |
| حمض الفينيلاسيتيك | 5.666 | C8H8O2 | 135.0444 | 136.0518 | 136.0524 | -4.92 | |
| حمض الفلورتيك | 2.811 | C9H10O3 | 165.0556 | 166.0626 | 166.063 | -2.41 | |
| الألدهيد البروتوكاتيشوي | 1.094 | C7H6O3 | 137.0247 | 138.0311 | 138.0317 | -4.5 | |
| سيكويزولاريسينول | 8.837 | C20H26O6 | 361.1656 | 362.1729 | 362.1729 | -0.23 | |
| الفانيلين | 2.508 | C8H8O3 | 151.04 | 152.0471 | 152.0473 | -1.82 | |
| Epicatechin 3'-O-glucuronide | 9.342 | C21H22O12 | 465.1024 | 466.109 | 466.1111 | -4.64 | |
| غوميسين M2 | 5.234 | C22H26O6 | 385.1676 | 386.1746 | 386.1729 | 4.38 | |
| إيريسولدون | 6.145 | C17H14O6 | 313.0727 | 314.0798 | 314.079 | 2.33 | |
| أوروليثين سي | 6.753 | C13H8O5 | 243.0294 | 244.0368 | 244.0372 | -1.69 | |
الجدول 3: التحديد المؤقت للمركبات الفينولية والمستقلبات في عينات البلازما بطريقة UPLC-MS/MS شبه المستهدفة.
لتقييم فعالية الطريقة المصممة لتحديد المركبات الفينولية الرئيسية ، أو مستقلباتها ، التي تم امتصاصها من الكعك والمشروبات المحتوية على RSF ، تم تحليل خمس عينات أليتورية من المشاركين في الدراسة ، تم الحصول عليها قبل وبعد التدخل لمدة 30 يوما. تم حساب الوفرة النسبية لكل مركب بقسمة المساحة تحت المنحنى (AUC) بعد المعالجة من قبل AUC قبل المعالجة. من هذا التحليل ، كان من الممكن ملاحظة أن بعض المركبات ظهرت فقط في العينات التي تم الحصول عليها قبل العلاج ، والبعض الآخر بقي دون تغيير ، في حين زاد بعضها بعد استهلاك الأطعمة الوظيفية. ويبين الجدول 4 قائمة ب 12 مركبا فينوليا أظهرت زيادة في البلازما بعد استهلاك الأغذية المحتوية على قوات الدعم السريع لمدة 30 يوما. كان حمض Phenylacetic هو المستقلب الوحيد الموجود باستمرار بتركيزات أعلى بعد العلاج. زاد الجليسيتين ، وهو ايسوفلافون جليكوزيل ، وحمض 3-هيدروكسي فينيل فاليريك (مستقلب فينولي) في ثلاث من العينات الخمس ولكنه انخفض في العينتين الأخريين. تم اكتشاف Gomisin M2 ، وهو قشور ، في ثلاث من العينات الخمس فقط بعد التدخل الغذائي. تم العثور على المركبات الفينولية الأخرى (مثل هيسبيريتين ، سيكويزولاريسينول ، والفانيلين) والمستقلبات (مثل حمض 2-هيدروكسي هيبوريك) فقط في عينة واحدة وفقط بعد العلاج.
| عينة (الجامعة الأمريكية بالقاهرة بعد العلاج / الجامعة الأمريكية بالقاهرة قبل العلاج) | |||||||
| مركب | صيغة | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| 2-حمض هيدروكسي هيبوريك | C18H33NO4 | T | ثانيا | ثانيا | ثانيا | ثانيا | |
| 3-حمض هيدروكسي فينيل فاليريك | C11H14O3 | 1.30 | 2.69 | 2.69 | 0.62 | 0.62 | |
| 6-هيدروكسي إنتيروديول | C18H22O5 | ثانيا | ثانيا | T | ثانيا | ثانيا | |
| الجليكيتين | C22H22O10 | 1.88 | 1.07 | 1.07 | 0.43 | 0.45 | |
| هيسبيريتين | C16H14O6 | T | ثانيا | ثانيا | ثانيا | ثانيا | |
| حمض الفينيلاسيتيك | C8H8O2 | 4.06 | T | T | T | 1.28 | |
| حمض الفلورتيك | C9H10O3 | T | ثانيا | ثانيا | ثانيا | ثانيا | |
| الألدهيد البروتوكاتيشوي | C7H6O3 | T | ثانيا | ثانيا | ثانيا | ثانيا | |
| سيكويزولاريسينول | C20H26O6 | T | ثانيا | ثانيا | ثانيا | ثانيا | |
| الفانيلين | C8H8O3 | T | ثانيا | ثانيا | ثانيا | ثانيا | |
| غوميسين M2 | C22H26O6 | ثانيا | T | T | T | ثانيا | |
الجدول 4: قائمة المركبات الفينولية التي زادت في بلازما الأفراد المسنين بعد استهلاك الأطعمة المحتوية على الدعم السريع لمدة 30 يوما. البيانات هي نسب وفرة (AUC) لكل مركب بعد العلاج مقارنة بوفرتها قبل العلاج. يشير T إلى أنه تم تحديد المركب فقط في العينة بعد العلاج. Nd: لم يتم اكتشافه.
الشكل 2: بروتوكول لتحديد مستقلبات المركبات الفينولية بواسطة UPLC-MS/MS شبه المستهدفة، يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعد تحديد وقياس المواد الكيميائية النباتية النشطة بيولوجيا التي يتم امتصاصها بعد استهلاك طعام أو مكمل غذائي أمرا بالغ الأهمية لإظهار وفهم الفوائد الصحية لهذه المركبات والأطعمة التي تحتوي عليها. في هذا العمل ، تم تطوير طريقة UPLC-MS / MS ، التي تهدف فقط إلى تحديد المركبات الفينولية الرئيسية ومستقلباتها التي زاد تركيزها في البلازما بعد تدخل غذائي لمدة 30 يوما مع منتجين غذائيين تم إعدادهما خصيصا لكبار السن. وافترض أنه إذا زاد مركب واحد أو ظهر في البلازما فقط بعد فترة التدخل، فإن هذا المركب قد تم امتصاصه و/أو تحويله بيولوجيا من الأغذية المستخدمة في التدخل.
UPLC-MS/MS هي واحدة من التقنيات المفضلة للدراسات الأيضية التي يتم فيها تحليل العديد من المركبات منخفضة الوزن الجزيئي في وقت واحد في عينات معقدة لتقييم تأثير بعض العلاج أو التغيير البيئي13. ويمكن القيام بذلك من خلال أساليب مستهدفة وغير مستهدفة (أو عالمية). تركز التحليلات المستهدفة على عدد صغير معروف من المستقلبات ذات الاهتمام. وهي الخيار الأفضل لتحديد كمية المركبات بالمعايير المتاحة، مما يوفر أفضل خصوصية وحساسية؛ ومع ذلك ، يجب تحسين هذه الطرق تماما للمستقلبات المختارة وغير قادرة على اكتشاف المركبات غير المتوقعة في العينات12. في دراسات أخرى ، تم استخدام HPLC إلى جانب كاشف الأشعة فوق البنفسجية لتحديد الأحماض الفينولية والمستقلبات في البلازما ، ولكن هذا النوع من الدراسات استخدم معايير تحليلية لتحديد وقياس المركب محل الاهتمام 15. وفي دراسة أخرى، اقترح إضافة معيار داخلي(18)؛ ومع ذلك ، تم تحليل الأحماض الفيرولية والكافيين فقط ومستقلباتها في هذا العمل. ومن ناحية أخرى، اقترح توليف المعايير الداخلية للمستقلبات الفينولية كبديل لعدم وجود معايير تحليلية تجارية(19). ومع ذلك ، فإن تخليق مجموعة كبيرة ومتنوعة من المركبات الفينولية أمر صعب ويستغرق وقتا طويلا ومكلفا. تحاول الطرق غير المستهدفة اكتشاف وتحديد أكبر عدد ممكن من المركبات الجزيئية وهي في المقام الأول تولد فرضيات12. ويمكنهم تحديد عدة مئات من المركبات في عينة واحدة عن طريق تعيين صيغ لإشارات كروماتوغرافية يمكن اكتشافها ذات سمات مميزة، مثل m/z أو الكتلة الدقيقة المقاسة، ووقت الاحتفاظ الكروماتوغرافي، وبصمة النظائر، وما إلى ذلك، وبالتالي فإن البيانات الناتجة عن هذه التحليلات وفيرة جدا ويمكن أن يكون من الصعب تفسيرها20 . وبما أن الهدف من هذه الطريقة لم يكن الحصول على صورة استقلابية كاملة لعينات البلازما (التي ستكون نهجا غير مستهدف) ولكن لتحديد المركبات الفينولية الرئيسية والمستقلبات الفينولية (التي لم تكن معروفة سابقا) فيها، فقد تم تصميم نهج شبه مستهدف. لهذا ، تم استخراج جميع الإشارات المحددة تلقائيا باستخدام برنامج الأداة ثم مقارنتها بقاعدة بيانات تم إنشاؤها ذاتيا تحتوي على 645 مركبا فينوليا ومستقلباتها ، والتي تم الحصول عليها من قواعد بيانات مجانية عبر الإنترنت. وتضمنت قاعدة البيانات أنماطا مرجعية لتجزئة MS/MS للمركبات التي استخدمت لتعيين اسم المركب وصيغته، مما يسمح بتحديد المركبات في العينة بمزيد من الدقة12.
وكانت أهم الخطوات في البروتوكول هي: 1) المعالجة المسبقة للعينات (استخراج وتركيز المركبات الفينولية والمستقلبات من عينات البلازما)؛ و (ب) المعالجة المسبقة للعينات (استخراج وتركيز المركبات الفينولية والمستقلبات من عينات البلازما)؛ و (ج) المعالجة المسبقة للعينات (استخراج وتركيز المركبات الفينولية والمستقلبات من عينات البلازما)؛ و (ج) المعالجة المسبقة للعينات (استخراج وتركيز المركبات الفينولية والمستقلبات 2) بناء قاعدة بيانات كاملة ومحددة للتحليل شبه المستهدف للعينات وتحديد جميع المركبات المحتملة التي تنتمي إلى فئة مركبة محددة ؛ و 3) اختيار المعلمات المستخدمة من قبل البرنامج النوعي للأداة (تحمل التطابق الشامل جزء في المليون، والنتيجة٪) لتحديد المركبات في العينة بدقة. في المعالجة المسبقة للعينة ، يجب توخي الحذر لتجنب فقدان المركبات ذات الأهمية ، واستعادتها بتركيز نهائي عال ، والقدرة على القضاء على المركبات المتداخلة. عند إنشاء قاعدة بيانات محددة ، من الأهمية بمكان إجراء بحث شامل في الأدبيات ثم استخدام قواعد بيانات مجانية عبر الإنترنت للحصول على بيانات كيميائية محددة سيتم استخدامها لتحديد المركبات في العينة. يتطلب اختيار أفضل القيم لمطابقة الكتلة والنتيجة التحقق المسبق من صحة الطريقة التحليلية باستخدام المعايير والعينات المعروفة21,22.
بمجرد تنفيذ البروتوكول ، كانت المشاكل الشائعة والحلول الموصى بها هي التالية: 1) لم يتم تحديد أي مركبات في العينات. ويرجع ذلك إلى انخفاض تركيز المركبات ويمكن حلها عن طريق تجفيف العينة وإعادة إذابتها في حجم أصغر. 2) ظهرت إشارات في TIC ، ولكن لم يتم تحديد المركبات. قد يكون هذا بسبب فشل في معايرة الكتلة ، لذلك كان الفرق بين الكتل التجريبية والنظرية مرتفعا. في هذه الحالة ، يجب إجراء معايرة كتلة الجهاز وفقا للشركة المصنعة وطراز المعدات. قد يكون السبب الثاني هو قاعدة بيانات شخصية غير مكتملة ، لذلك من الأهمية بمكان التحقق من قاعدة البيانات وصيانتها باستمرار. يمكن التحقق من كتل المركبات التي يشتبه في أنها ذات أهمية ومقارنتها بقواعد البيانات المتاحة مجانا على الإنترنت أو الأدبيات العلمية الجديدة. 3) ظهرت الإشارات في أشواط فارغة. هذا يشير إلى التلوث ويمكن حله عن طريق تنظيف إبرة وعمود أخذ العينات التلقائي. بروتوكول التنظيف القياسي هو إجراء بعض العمليات باستخدام الميثانول ، ثم الأيزوبروبانول ، وأخيرا الأسيتونيتريل كمرحلة متنقلة. ثم يتم إعادة توازن العمود ، وتشغيل المرحلة المتنقلة لمدة 30 دقيقة على الأقل.
وتتمثل الصعوبات الرئيسية في تطوير هذا النوع من الأساليب في ما يلي: 1) انخفاض التوافر الأحيائي، بصفة عامة، لجميع المواد الكيميائية النباتية، بما في ذلك المركبات الفينولية، مما يترجم إلى تركيزات منخفضة جدا من البلازما(16)؛ 2) التنوع العالي للمركبات الفينولية الموجودة في الأطعمة ، والتي تزداد من خلال عملية التمثيل الغذائي والتحول البيولوجي التي تحدث في الخلايا المعوية البشرية وخلايا الكبد والميكروبات القولونية 23 ؛ 3) عدم وجود معايير (توجد بعض المعايير ولكن من الصعب جدا الحصول عليها) للعديد من المركبات ، وخاصة بالنسبة للمستقلبات ، ووجود بعض المركبات غير المعروفة أو غير المميزة 23 ؛ و 4) الاستجابات المتغيرة بين الأفراد ، سواء في امتصاص واستقلاب المواد الكيميائية النباتية 14. للتغلب على مشكلة انخفاض تركيزات البلازما من الأيضات الفينولية ، يجب استخراجها وتركيزها. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق استخراج الطور الصلب الدقيق14 أو، كما هو الحال في العمل الحالي، عن طريق إضافة المذيبات التي ترسب البروتينات وتذوب المركبات الفينولية والأيضات، يليها تبخر المذيبات وإعادة التعليق في حجم أصغر19. هذه التقنية بسيطة واقتصادية وكافية لعدد صغير من العينات. ومع ذلك ، يمكن بسهولة تحسين استعادة المركبات ذات الأهمية باستخدام أحجام بلازما أكبر ، وبالتالي فإن التركيز النهائي لجميع المركبات سيكون أعلى. التنوع الكبير في المستقلبات الفينولية وعدم وجود معايير هو السبب في استخدام نهج شبه مستهدف لتحديد المركبات التي زاد منها التدخل قبل محاولة تحديدها كميا. باستخدام قاعدة بيانات تم إنشاؤها خصيصا بدلا من تحليل غير مستهدف تماما ، كان من الممكن تجاهل العديد من المستقلبات الأولية في البلازما ، مع التركيز فقط على المركبات الفينولية ومستقلباتها. ومن القيود الهامة في قاعدة البيانات هذه، الخاصة بالمركبات الفينولية ومستقلباتها البشرية، الافتقار إلى المعلومات الطيفية الكتلية للعديد من المركبات ومستقلباتها، مما يقلل من دقة تحديد هوية المركب.
لوحظ بانتظام تباين كبير بين الأفراد في الدراسات التي تقيم امتصاص واستقلاب المركبات الفينولية ، كما ونوعا. في النتائج الحالية ، قدم فرد واحد 18 مركبا في عينة البلازما المأخوذة بعد التدخل ، بينما أظهر الآخرون 9 أو 10 مركبات فقط. علاوة على ذلك ، تم العثور على العديد من المركبات الفينولية والمستقلبات فقط في عينات خط الأساس (قبل التدخل) ، كما أنها تختلف بين الأفراد. وعموما، أظهر أكثر من نصف المركبات المحددة تركيزات أعلى (AUC) قبل التدخل منه بعدها أو تم العثور عليها فقط في عينات ما قبل التدخل. لذلك ، كان من الضروري مقارنة العينات الفردية المأخوذة قبل وبعد التدخل لفهم المركبات التي زادت بالفعل من خلاله. كان المستقلب الوحيد الذي زاد باستمرار بعد العلاج هو حمض الفينيلاسيتيك ، وهو هدم ميكروبي من flavan-3-ols24 تم العثور عليه في بلازما الأفراد في الدراسات الحادة لاستهلاك الأطعمة الغنية بالفينوليك14,25. معظم الدراسات التي حددت وحددت كميا المستقلبات الفينولية في البلازما كانت دراسات حادة ، حيث تم رصد تركيزات المركبات خلال 24 ساعة بعد استهلاك الوجبة الغنية بالفينول ، مع ملاحظة أنه بعد 24 ساعة ، كانت تركيزاتها قريبة من القيمة القاعدية 19,25. لذلك ، من المفهوم أن العينات التي تم تحليلها في هذا العمل أظهرت أعدادا وتركيزات منخفضة من الأيضات الفينولية. في الآونة الأخيرة ، قام Zhang et al.25 بتقييم استهلاك التوت الأحمر ، سواء في الدراسات الحادة أو بعد 4 أسابيع من المكملات. ولاحظوا أن كلا من التدخلات الحادة والمزمنة زادت من المركبات الفينولية ومستقلباتها ، بينما بعد المكملات الغذائية لمدة 4 أسابيع ، زاد تركيز البلازما القاعدية لبعض المستقلبات (اليوروليثين ، والسيناميك ، والفينيل بروبيونيك ، والهيبوريك) والبعض الآخر انخفض (مشتقات الأنثوسيانين المترافقة).
ويتبين من الفحص النهائي للطريقة التي وضعت في هذه الورقة أنها كانت في معظم أجزائها مناسبة تماما للهدف الذي أنشئت من أجله. كانت المعالجة المسبقة للعينة بسيطة وفعالة ، وتم تحقيق فصل UPLC وتحديد MS / MS شبه المستهدف للمستقلبات الفينولية. يمكن أن تكون هذه الطريقة شبه المستهدفة مفيدة كنهج فحص أول لتحديد المركبات الفينولية التي يمكن امتصاصها من مصفوفات غذائية مختلفة ، وكذلك المستقلبات الفينولية الموجودة في البلازما البشرية. علاوة على ذلك ، فإن البروتوكول مفيد لأنه يسمح بتحديد الهوية عندما لا تتوفر معايير من المركبات الفينولية أو المستقلبات . وأخيرا، تستخدم هذه الطريقة كمية صغيرة من البلازما، وهو أمر بالغ الأهمية في معظم الدراسات في الجسم الحي حيث تكون عينات البلازما نادرة. ومع ذلك ، يوصى ، بالنسبة للدراسات المستقبلية ، بإجراء دراسة حادة قبل التدخل المزمن لتحديد المركبات الفينولية الرئيسية والمستقلبات التي يتم امتصاصها من الأطعمة المصممة خصيصا بشكل أفضل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن جميع المؤلفين عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يشعر المؤلفون بالامتنان للدعم المالي المقدم من CONACYT ، المكسيك (CB- 2016-01-286449) ، و UACJ-PIVA (المشروعان 313-17-16 و 335-18-13). يود OAMB أن يشكر CONACYT على منحة الدكتوراه الخاصة به. يتم الاعتراف بالدعم الفني من مكتب إنتاج الوسائط المتعددة من UACJ بامتنان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Tedia | Al1129-001 | LC Mass spectrometry |
| Autosampler | Agilent Technologies | G4226A | 1290 Infinity series |
| C18 reverse phase column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse plus C18 2.1x50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD |
| Centrifuge | Eppendorf | 5452000018 | Mini Spin; Rotor F-45-12-11 |
| Column compartment with thermostat | Agilent Technologies | G1316C | 1290 Infinity series |
| Diode Array Detector (UV-Vis) | Agilent Technologies | G4212B | 1260 Infinity series |
| Electrospray ionnization source | Agilent Technologies | G3251B | Dual sprayer ESI source |
| Formic acid | J.T. Baker | 0128-02 | Baker reagent, ACS |
| Mass Hunter Data Acquisition | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Qualitative Analysis | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Microcentrifuge tube | Brand | BR780546 | Microcentrifuge tube, 2 mL with lid |
| Pure ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-1L | 200 proof, for molecular biology |
| Q-TOF LC/MS | Agilent Technologies | G6530B | 6530 Accurate Mass |
| Quaternary pump | Agilent Technologies | G4204A | 1290 Infinity series |
| Syringe filter | Thermo Scientific | 44514-NN | 17 mm, 0.45 μm, nylon membrane |
| Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | 1290 Infinity series |
| Vial | Agilent Technologies | 8010-0199 | Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps |
| Vial insert | Agilent Technologies | 5183-2089 | Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical |
| Water | Tedia | WL2212-001 | LC Mass spectrometry |
References
- Morley, J. E., Anker, S. D., von Haehling, S. Prevalence, incidence, and clinical impact of sarcopenia: facts, numbers, and epidemiology-update 2014. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 5 (4), 253-259 (2014).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A.
- Beaudart, C., et al. Nutrition and physical activity in the prevention and treatment of sarcopenia: systematic review. Osteoporosis International. 28 (6), 1817-1833 (2017).
- Ozer, H. K. Phenolic compositions and antioxidant activities of Maya nut (Brosimum alicastrum): Comparison with commercial nuts. International Journal of Food Properties. 20 (11), 2772-2781 (2017).
- Subiria-Cueto, R., et al. Brosimum alicastrum Sw. (Ramón): An alternative to improve the nutritional properties and functional potential of the wheat flour tortilla. Foods. 8 (12), 1-18 (2019).
- Martínez-Ruiz, N., Torres, L. E. J., del Hierro-Ochoa, J. C., Larqué-Saavedra, A. Bebida adicionada con Brosimum alicastrum sw.: Una alternativa para requerimientos dietarios especiales. Revista Salud Pública y Nutrición. 18 (3), 1-10 (2019).
- Rodríguez-Tadeo, A., et al. Functionality of bread and beverage added with brosimum alicastrum sw. Seed flour on the nutritional and health status of the elderly. Foods. 10 (8), 1-21 (2021).
- Muñoz-Bernal, ÓA., et al. Nuevo acercamiento a la interacción del reactivo de Folin-Ciocalteu con azúcares durante la cuantificación de polifenoles totales. TIP Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas. 20 (2), 28-33 (2017).
- Luca, S. V., et al. Bioactivity of dietary polyphenols: The role of metabolites. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 60 (4), 626-659 (2020).
- Kawabata, K., Yoshioka, Y., Terao, J. Role of intestinal microbiota in the bioavailability and physiological functions of dietary polyphenols. Molecules. 24 (2), (2019).
- de Llano, D. G., Moreno-Arribas, M. V., Bartolomé, B. Cranberry polyphenols and prevention against urinary tract Infections: Relevant considerations. Molecules. 25 (15), (2020).
- Alsaleh, M., et al. Mass spectrometry: A guide for the clinician. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 9 (5), 597-606 (2019).
- Wang, X., Sun, H., Zhang, A., Wang, P., Han, Y. Ultra-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry as a sensitive and powerful technology for metabolomic studies. Journal of Separation Science. 34 (24), 3451-3459 (2011).
- Feliciano, R. P., Mills, C. E., Istas, G., Heiss, C., Rodriguez-Mateos, A. Absorption, metabolism and excretion of cranberry (poly)phenols in humans: A dose response study and assessment of inter-individual variability. Nutrients. 9 (3), (2017).
- Mateos, R., Goya, L., Bravo, L. Uptake and metabolism of hydroxycinnamic acids (chlorogenic, caffeic, and ferulic acids) by HepG2 cells as a model of the human liver. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (23), 8724-8732 (2006).
- Rodriguez Lanzi,, Perdicaro, C., Antoniolli, D. J., Piccoli, A., Vazquez Prieto, M. A., Fontana, A. Phenolic metabolites in plasma and tissues of rats fed with a grape pomace extract as assessed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Archives of Biochemistry and Biophysics. , 28-33 (2018).
- Hou, Y., He, D., Ye, L., Wang, G., Zheng, Q., Hao, H. An improved detection and identification strategy for untargeted metabolomics based on UPLC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113531 (2020).
- Nagy, K., et al. First identification of dimethoxycinnamic acids in human plasma after coffee intake by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1218 (3), 491-497 (2011).
- Marmet, C., Actis-Goretta, L., Renouf, M., Giuffrida, F. Quantification of phenolic acids and their methylates, glucuronides, sulfates and lactones metabolites in human plasma by LC-MS/MS after oral ingestion of soluble coffee. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 617-625 (2014).
- McCord, J., Strynar, M. Identifying per-and polyfluorinated chemical species with a combined targeted and non-targeted-screening high-resolution mass spectrometry workflow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (146), 1-15 (2019).
- Muñoz-Bernal, ÓA., et al. Phytochemical characterization and antiplatelet activity of Mexican red wines and their by-products. South African Journal of Enology and Viticulture. 42 (1), 77-90 (2021).
- Muñoz-Bernal, ÓA. Enriquecimiento de un vino tinto con un extracto de compuestos fenólicos provenientes de orujo de uva: bioaccesibilidad, análisis sensorial y respuesta biológica. Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. , (2021).
- Low, D. Y., et al. Data sharing in PredRet for accurate prediction of retention time: Application to plant food bioactive compounds. Food Chemistry. , 357 (2021).
- Sánchez-Patán, F., et al. Gut microbial catabolism of grape seed flavan-3-ols by human faecal microbiota. Targeted analysis of precursor compounds, intermediate metabolites and end-products. Food Chemistry. 131 (1), 337-347 (2012).
- Zhang, X., Sandhu, A., Edirisinghe, I., Burton-Freeman, B. M. Plasma and urinary (poly)phenolic profiles after 4-week red raspberry (Rubus idaeus L.) intake with or without fructo-oligosaccharide supplementation. Molecules. 25 (20), (2020).
