Summary
L’objectif de ce protocole est de détecter les métabolites phénoliques dans le plasma à l’aide d’une méthode de chromatographie-spectrométrie de masse semi-ciblée.
Abstract
Un groupe de 23 personnes âgées a reçu des repas fonctionnels (une boisson et un muffin) spécialement formulés pour la prévention de la sarcopénie (perte de masse musculaire liée à l’âge). Des échantillons de plasma ont été prélevés au début de l’intervention et après 30 jours de consommation des repas fonctionnels. Une chromatographie semi-ciblée à ultra-haute performance couplée à une analyse de masse en tandem (UPLC-MS/MS) a été réalisée pour identifier les composés phénoliques et leurs métabolites. Les protéines plasmatiques ont été précipitées avec de l’éthanol et les échantillons ont été concentrés et remis en suspension dans la phase mobile (acétonitrile 1:1 : eau) avant injection dans l’instrument UPLC-MS/MS. La séparation a été réalisée avec une colonne de phase inverse en C18 , et les composés ont été identifiés à l’aide de leur masse expérimentale, de leur distribution isotopique et de leur motif de fragment. Les composés d’intérêt ont été comparés à ceux des banques de données et de la bibliothèque interne semi-ciblée. Les résultats préliminaires ont montré que les principaux métabolites identifiés après l’intervention étaient l’acide phénylacétique, la glycitine, l’acide 3-hydroxyphénylvalérique et la gomisine M2.
Introduction
La sarcopénie est un trouble squelettique progressif lié à une perte musculaire accélérée chez la population âgée. Cette condition augmente le risque de chutes et conduit à des activités limitées de la vie quotidienne. La sarcopénie est présente chez environ 5 % à 10 % des personnes de plus de 65 ans et environ 50 % des personnes âgées de 80 ans ou plus1. Aucun médicament spécifique n’a été approuvé pour le traitement de la sarcopénie, il est donc important de prévenir par l’activité physique et une alimentation équilibrée1,2. Les interventions nutritionnelles avec des aliments spécialement formulés enrichis en protéines laitières et en acides aminés essentiels ont montré des résultats positifs dans la prévention de la sarcopénie2. Dans d’autres études, les auteurs ont inclus des vitamines et des antioxydants, comme la vitamine E et les isoflavones, dans l’alimentation, augmentant ainsi les avantages pour le gain musculaire à la taille et aux hanches3.
Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) est un arbre qui pousse dans les régions tropicales mexicaines; il a été consommé par les cultures mayas en raison de sa haute valeur nutritionnelle4. C’est une bonne source de protéines, de fibres, de minéraux et d’antioxydants phénoliques, tels que l’acide chlorogénique5. Comme elle peut être moulue en poudre et utilisée dans les produits de boulangerie ou consommée dans les boissons, des études récentes ont évalué l’incorporation de farine de graines de Ramón (RSF) dans différents aliments pour améliorer leur valeur nutritionnelle. Une boisson aromatisée au cappuccino supplémentée par RSF a été formulée, qui était riche en fibres alimentaires et contenait plus de 6 g de protéines par portion, et était très acceptée par les consommateurs; il a donc été considéré comme une solution de rechange potentielle pour répondre à des besoins alimentaires particuliers6. Dans une étude de suivi, RSF a également été utilisé pour formuler un muffin et une nouvelle boisson riche en protéines, fibres alimentaires, micronutriments et antioxydants phénoliques. Le muffin et la boisson ont été utilisés dans une intervention diététique pour les personnes âgées, qui ont consommé les deux produits deux fois par jour pendant 30 jours. Après cette période, l’état nutritionnel et sarcopénique des participants s’est amélioré et la teneur totale en phénol du plasma a augmenté7. Cependant, la détermination des composés phénoliques totaux dans le plasma a été effectuée par une méthode spectrophotométrique, de sorte qu’il n’a pas été possible d’identifier les composés phénoliques réels qui ont été absorbés; de plus, cette méthode n’est pas complètement spécifique pour les composés phénoliques, de sorte qu’une certaine surestimation peut se produire8.
L’identification et la quantification des composés phénoliques qui sont absorbés après la consommation d’aliments riches en ces antioxydants est une tâche difficile mais nécessaire pour démontrer l’activité biologique de ces composés phytochimiques. La biodisponibilité de la plupart des composés phénoliques est faible; moins de 5% d’entre eux peuvent être trouvés sans transformation structurelle dans le plasma. Les composés phénoliques subissent plusieurs biotransformations, telles que la méthylation, la sulfonation ou la glucuronidation, qui sont effectuées par les entérocytes et les hépatocytes9. Les composés phénoliques sont également biotransformés par le microbiote en catabolites bactériens qui peuvent exercer leurs effets bénéfiques dans le corps après avoir été absorbés dans le plasma10. Par exemple, l’acide phénylacétique est un produit de la transformation bactérienne des flavonoïdes et des proanthocyanidines oligomères, qui peuvent inhiber jusqu’à 40% de l’adhésion des bactéries (Escherichia coli) dans les voies urinaires après la consommation de canneberges11.
La diversité structurelle des composés phénoliques naturels, ajoutée à la diversité de leurs métabolites et à leur faible biodisponibilité, rend leur identification dans le plasma encore plus difficile. Le profilage métabolomique, utilisant des plateformes d’analyse spectroscopique comme la résonance magnétique nucléaire (RMN) et la spectroscopie de masse en tandem (MS/MS), est probablement la meilleure approche pour atteindre cet objectif; malheureusement, l’équipement n’est pas facilement accessible et le développement de protocoles d’analyse est encore limité12. Plusieurs études ont rapporté que la SEP/SEP couplée à un système de séparation (comme la chromatographie liquide) comme stratégie pour réduire la complexité des spectres de masse dans les études métabolomiques. L’introduction récente de méthodes de séparation par chromatographie liquide à ultra-haute performance (UPLC) a réduit le temps d’analyse et augmenté la résolution et la sensibilité par rapport aux protocoles liquides conventionnels à haute performance, de sorte que les systèmes UPLC-MS/MS ont rapidement été largement acceptés par la communauté de la métabolomique analytique13. De cette façon, certaines études ont étudié les métabolites phénoliques et détecté des dérivés glucuronidés de l’acide caféique, de la quercétine et de l’acide férulique, ainsi que des dérivés sulfonés de l’acide syringique et vanillique dans le plasma des individus après la consommation de canneberge14. Les protocoles précédents visaient à trouver des composés phénoliques et des métabolites phénoliques dans des biofluides tels que le plasma. Ces protocoles étaient basés sur l’identification et la quantification par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) couplée à un détecteur UV-vis15. Néanmoins, de tels protocoles exigent l’utilisation de normes authentiques pour évaluer l’identification absolue et la quantification précise. Un large éventail d’études ont identifié les métabolites les plus courants dans les biofluides (formes sulfonées, glucuronidées et méthylées) par UPLC-MS et UPLC-MS/MS; toutefois, une grande partie des métabolites bactériens n’a pas été signalée en raison du manque de bases de données contenant leurs informations complètes16. L’identification des métabolites est compliquée par le coût et la disponibilité commerciale des étalons de métabolites. Par conséquent, la meilleure stratégie peut être l’analyse non ciblée ou semi-ciblée des métabolites MS/MS, qui repose sur l’utilisation d’informations sur les caractéristiques moléculaires (m/z, masse exacte monoisotopique, distribution isotopique et modèle de fragmentation) pour déterminer l’identité chimique et la comparer à des bases de données en ligne disponibles gratuitement qui contiennent des métabolites polyphénoliques identifiés dans les biofluides après la consommation de polypolyphénols riches12 . Les bases de données les plus importantes utilisées dans les études UPLC-MS/MS pour l’identification des composés phénoliques et de leurs métabolites sont la human Metabolome Database (HMDB), la LipidBlast Library, la METLIN Library et d’autres bases de données complémentaires, telles que PubChem, ChemSpider et Phenol Explorer17.
Dans la présente étude, une méthode semi-ciblée UPLC-MS/MS a été mise au point pour analyser les échantillons de plasma du groupe de personnes âgées participant à l’étude sur la consommation de muffins et de boissons contenant du RSF7. Les données de différentes bases de données en ligne gratuites sur les métabolites plasmatiques ont été recueillies et intégrées dans une base de données spécialisée. Cette base de données est accessible automatiquement par le logiciel de l’équipement pour identifier les métabolites polyphénoliques dans les cinq échantillons de plasma avant et après l’intervention nutritionnelle de 30 jours. Ceci est fait pour identifier les principaux composés phénoliques, ou leurs métabolites, qui sont absorbés par les aliments fonctionnels spécialement formulés conçus pour la prévention de la sarcopénie.
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Protocol
Les échantillons de plasma utilisés dans ce protocole ont été prélevés dans une étude précédente suivant toutes les directives éthiques et approuvés par le Comité institutionnel d’éthique et de bioéthique (CIEB-2018-1-37) de l’Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. Le protocole complet pour l’extraction et l’identification des composés phénoliques et des métabolites dans le plasma par UPLC-MS/MS est représenté à la figure 1.
Figure 1 : Représentation schématique de l’extraction et de l’identification des composés phénoliques et des métabolites dans le plasma par la méthode semi-ciblée UPLC-MS/MS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
1. Préparation de l’échantillon
- Conserver les échantillons de plasma à -80 °C jusqu’à l’analyse.
- Décongeler les échantillons de plasma à température ambiante pendant 15 min.
REMARQUE: Les échantillons peuvent être placés dans un bain-marie à 37 ° C pour accélérer le processus (5 min). - Placer 200 μL d’échantillon de plasma dans un microtube de 2 mL et mélanger avec 1 000 μL d’éthanol pur. Vortex de l’échantillon de plasma pendant 30 s.
REMARQUE: Utilisez toujours des gants lorsque vous travaillez avec des échantillons de plasma. - Centrifuger l’échantillon à 6 580 x g pendant 5 min. Après centrifugation, recueillir le surnageant avec une micropipette ou une pipette Pasteur et le placer dans un nouveau microtube. Conserver le surnageant à 4 °C.
- Mélanger la pastille de l’étape précédente avec 1 000 μL d’éthanol à 100 %, vortex pendant 30 s, puis centrifuger à 6 580 x g pendant 5 min.
REMARQUE: Le granulé est fortement emballé et doit être bien remis en suspension pour assurer le contact entre l’échantillon et l’éthanol pur. L’utilisation d’une micropipette pour rincer la pastille avec de l’éthanol est recommandée. - Après centrifugation, recueillir le surnageant et mélanger avec le surnageant précédemment obtenu à l’étape 1.4. dans un microtube de 2 mL.
- Retirer l’éthanol de l’échantillon en utilisant de l’azote pur (99,997 %) à 135 psi. Gardez l’aiguille à 1 cm du haut du microtube pour éviter la perte d’échantillon et rincez jusqu’à ce que l’échantillon soit sec. Aucune chaleur n’est nécessaire pour évaporer l’éthanol.
REMARQUE: Le débit d’azote doit être faible pour éviter la perte d’échantillon. Une fois l’éthanol séché, maintenir le débit d’azote pendant au moins 5 minutes pour assurer la sécheresse de l’échantillon. Le protocole peut être mis en pause à ce stade; les échantillons doivent être conservés à -20 °C. Évitez de conserver les échantillons pendant plus de 12 h. - Remettre en suspension les échantillons secs dans 100 μL d’un mélange d’acétonitrile : eau à une proportion de 50:50 (v:v).
- Filtrer l’échantillon à travers une membrane de seringue en nylon de 0,45 μm directement dans un micro-insert de flacon HPLC.
REMARQUE: Les échantillons dans le flacon peuvent être conservés à -20 ° C avant l’analyse. Conservez les échantillons pendant 8 h maximum. Il est recommandé d’injecter les échantillons dans le système UPLC juste après la filtration.
2. Analyse UPLC-MS/MS
- Injecter 3 μL d’échantillon sur un UPLC équipé d’une colonne en phase inverse C18 (50 mm x 2,1 mm; 1,8 μm). Réglez la température de l’échantillonneur automatique à 20 °C et le thermostat à colonne à 25 °C. Injecter chaque échantillon en trois exemplaires.
- Utilisez 0,1 % (v:v) d’acide formique dans l’eau comme solvant A et 100 % d’acétonitrile comme solvant B. Réglez le débit à 0,4 mL/min et un programme de gradient comme suit : 0-1 min 10 % B, 1-4 min 30 % B, 4-6 min 38 % B, 6-8 min 60 % B, 8-8,5 min 60 % B, 8,5-9 min 10 % B (tableau 1).
- Réglez le spectromètre de masse sur l’ionisation en mode négatif. Utiliser l’azote comme gaz de séchage à 340 °C et un débit de 13 L/min. Réglez la pression du nébuliseur à 60 psi. Réglez la tension capillaire à 4 000 V, la tension du fragmenteur à 175 V et la tension Skimmer à 65 V. Utilisez l’énergie de collision à 20 V (tableau 2).
- Scannez les masses comprises entre 100 et 1100 rapport masse/charge (m/z) et, pour MS/MS, entre 50 et 1000 m/z (tableau 2). Réglez l’acquisition de données sur le mode Auto MS/MS. Utilisez la masse de référence suivante : 119,036 et 966,0007.
| Temps (min) | Solvant A (0,1 % d’acide formique dans l’eau CLHP) | Solvant B (100 % acétonitrile) |
| 0 à 1 | 90 | 10 |
| 1 à 4 | 70 | 30 |
| 4 à 6 | 62 | 38 |
| 6 à 8 | 40 | 60 |
| 8 à 8,5 | 40 | 60 |
| 8,5 à 9 | 90 | 10 |
Tableau 1 : Gradient de phase mobile utilisé pour la séparation des composés phénoliques par UPLC.
| Mode d’ionisation | Négatif |
| Gaz de séchage | Azote à 340 °C, débit 13 L/min |
| Pression du nébuliseur | 60 psi |
| Tension capillaire | 175 V |
| Masses d’analyse MS | 100-1100 m/z |
| Masses d’analyse MS/MS | 50-1000 m/z |
Tableau 2 : Paramètres d’ionisation pour l’analyse MS/MS.
3. Construction de la base de données
- Recherchez des composés phénoliques, des métabolites phénoliques ou d’autres composés d’intérêt dans la littérature scientifique.
- Ouvrez le logiciel de gestion de base de données inclus dans le système UPLC. Sélectionnez | de fichier Nouvelle bibliothèque de composés de base de données personnelles (PCDL) | Créez un nouveau PCDL. Sélectionnez le type de PCDL : LC/MS Metabolomics. Définissez un nom pour le PCDL. Sélectionnez ensuite Créer.
- Dans la barre d’outils, sélectionnez PCDL , puis l’option Autoriser l’édition . Cliquez ensuite sur le bouton Rechercher des composés .
REMARQUE: Comme il s’agit d’un nouveau PCDL, les résultats de la table seront vides. Cela changera une fois que de nouveaux composés seront ajoutés dans le PCDL.- Ajoutez des composés à la bibliothèque de composés de la base de données personnelle spécialisée en les copiant à partir de la bibliothèque générale de l’instrument. Ouvrez la base de données existante de l’instrument incluse dans le logiciel de gestion de base de données. Cliquez sur le bouton Rechercher des composés. Dans l’option Recherche unique , entrez les critères de recherche composés pour trouver le composé d’intérêt.
REMARQUE: Les composés peuvent être trouvés par nom, formule moléculaire, masse exacte et temps de rétention. - Dans le tableau des résultats composés, sélectionnez le composé d’intérêt. Pour sélectionner plusieurs composés, cliquez sur le premier composé, maintenez la touche CTRL enfoncée , puis cliquez sur chaque composé d’intérêt. Ensuite, faites un clic droit sur tous les composés en surbrillance et sélectionnez Ajouter à PCDL.
- Dans la nouvelle fenêtre, recherchez et sélectionnez le fichier de base de données personnel spécialisé. Cochez les cases Inclure les spectres pour les composés s’ils sont présents et Inclure les informations sur la mobilité ionique pour les composés s’ils sont présents. Cliquez sur le bouton Ajouter . Dans la nouvelle boîte de dialogue, sélectionnez Oui pour vérifier les nouveaux composés ajoutés. Sélectionnez Non pour continuer à rechercher d’autres composés d’intérêt.
- Ajoutez des composés à la bibliothèque de composés de la base de données personnelle spécialisée en les copiant à partir de la bibliothèque générale de l’instrument. Ouvrez la base de données existante de l’instrument incluse dans le logiciel de gestion de base de données. Cliquez sur le bouton Rechercher des composés. Dans l’option Recherche unique , entrez les critères de recherche composés pour trouver le composé d’intérêt.
- Si les composés d’intérêt ne sont pas disponibles dans la bibliothèque générale de l’instrument, ajoutez de nouveaux composés manuellement.
- Ouvrez la base de données personnelle spécialisée. Une fois ouvert, suivez l’étape 3.3. Sélectionnez l’option Modifier les composés . Cliquez sur le bouton Ajouter un nouveau .
- Dans la partie supérieure de la fenêtre, complétez les informations relatives au nouveau composé. Remplissez la formule, le nom, le nom IUPAC, le numéro CAS, l’ID Chemspider et d’autres identificateurs.
- Utilisez les informations disponibles dans les bibliothèques en ligne gratuites (Chemspider, PubChem et Phenol Explorer) pour remplir les informations relatives au nouveau composé d’intérêt. Une fois terminé, cliquez sur le bouton Enregistrer comme neuf pour enregistrer les nouvelles informations composées dans la base de données personnelle spécialisée.
REMARQUE: Lorsque vous ajoutez des informations provenant de bibliothèques libres, assurez-vous d’inclure les informations sur les composés sans la présence d’ions chlorure ou iodure. Cela peut modifier la masse exacte et la formule moléculaire du composé d’intérêt.
- Répétez le processus avec tous les composés d’intérêt pour compléter la base de données personnelle spécialisée.
4. Analyse des données
- Utilisez le logiciel de gestion qualitative de l’instrument pour identifier les composés phénoliques et les métabolites phénoliques présents dans les échantillons.
- Ouvrez le fichier d’exemple. Dans le panneau Chromatogramme, sélectionnez Définir les chromatogrammes et extrayez le chromatogramme ionique total (TIC), le chromatogramme ionique extrait de MS (EIC) et l’EIC de MS/MS. Sélectionnez l’option Intégrer le chromatogramme.
- Dans le panneau Rechercher des composés , sélectionnez Rechercher par options de formule. Dans la nouvelle fenêtre, sélectionnez Source de formule , puis l’option Base de données/Bibliothèque . Trouvez la base de données personnelle précédemment créée et cliquez sur Ouvrir.
- Sélectionnez l’option Correspondance de formule et définissez une tolérance de correspondance de masse de 5 parties par million (ppm).
REMARQUE: Une tolérance de correspondance différente des masses peut être réglée à 10 ppm; cette différence dépend du spectromètre de masse utilisé. - Sélectionnez l’option Ions négatifs et sélectionnez uniquement la boîte de dialogue -H . Dans l’option Résultats , cochez les boîtes de dialogue Extraire le EIC, Extraire le spectre nettoyé, Extraire le spectre brut et Inclure la structure .
- Sélectionnez l’option Filtres de résultats . Marquez Avertir si le score est et définissez la correspondance de score à 80,00%. Marquer Ne pas correspondre si le score est et définir le score à 75,00%.
REMARQUE: Les scores de correspondance / non de correspondance peuvent être modifiés en valeurs inférieures si nécessaire. Cela réduira la précision de l’identification. - Cliquez sur trouver des composés par formule pour identifier les composés d’intérêt dans l’échantillon.
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Representative Results
Le processus étape par étape d’identification des métabolites phénoliques par l’analyse semi-ciblée UPLC-MS/MS, en mode négatif, d’échantillons de plasma est illustré à la figure 2. Tout d’abord, le chromatogramme ionique total (TIC) de l’extrait de phénol plasmatique (obtenu après précipitation protéique de l’échantillon plasmatique total) a été obtenu grâce au logiciel qualitatif de l’instrument. Ensuite, le chromatogramme ionique extrait a été utilisé, et la masse exacte et le modèle de fragmentation (analyse MS / MS) de chaque signal (ou caractéristique moléculaire) ont été comparés à ceux d’une base de données personnelle spécifique créée également dans le logiciel de l’instrument. Les signaux dont la masse correspond à moins de 5 ppm ont reçu une formule moléculaire de la base de données. Enfin, la distribution isotopique de chaque signal a été comparée à celle de la formule moléculaire assignée pour obtenir l’identification finale provisoire. Les composés qui a) n’ont été identifiés que dans une seule réplique ou b) présentaient une superficie inférieure à 10 000 ont été traités comme de fausses identifications. À partir de cette analyse, un total de 25 composés phénoliques et métabolites ont été identifiés dans les échantillons de plasma (tableau 3). Dans cette liste, des composés phénoliques et leurs métabolites, tels que l’acide 3-hidroxyphénylvalérique et l’isopropyle 3-(3,4-dihydroxyphényl)-2-hydroxypropanoate, ont été trouvés. Étant donné que le mode d’ionisation négative convient mieux à toutes les classes de composés phénoliques, à l’exception des anthocyanes, ces composés n’ont pas pu être détectés avec la présente méthode. Si les anthocyanes sont des composants importants de la matrice alimentaire, le mode positif doit également être utilisé.
| Métabolites phénoliques | R.T. (min. | Formule | Précurseur | Masse expérimentale | Masse théorique | Différence (ppm) | |
| Acide 2,3-dihydroxybenzoïque | 0.622 | C7H6O4 | 153.0203 | 154.0273 | 154.0266 | 4.2 | |
| Acide 2-hydroxyhippurique | 8.631 | C18H33NO4 | 410.1648 | 411.1725 | 411.1717 | 1.8 | |
| 3,4-Dihydroxytoluène | 2.239 | C7H8O2 | 123.0451 | 124.0524 | 124.0524 | -0.25 | |
| Acide 3-hydroxyphénylvalérique | 6.717 | C11H14O3 | 193.0874 | 194.0947 | 194.0943 | 2.12 | |
| Acide 5-(3',4'-dihydroxyphényl)-valérique | 4.293 | C11H14O4 | 209.0823 | 210.0894 | 210.0892 | 0.68 | |
| 6-Hydroxyentérodol | 9.201 | C18H22O5 | 317.1387 | 318.1465 | 318.1467 | -0.65 | |
| Ajugol | 3.889 | C15H24O9 | 347.134 | 348.1418 | 348.142 | -0.59 | |
| Acide benzoïque | 3.915 | C7H6O2 | 121.0296 | 122.0367 | 122.0368 | -0.28 | |
| Acide carnosique | 6.785 | C20H28O4 | 331.1905 | 332.1979 | 332.1988 | -2.58 | |
| Carnosol | 6.347 | C20H26O4 | 329.1764 | 330.1842 | 330.1831 | 3.43 | |
| Catéchol | 0.892 | C6H6O2 | 109.0297 | 110.037 | 110.0368 | 1.91 | |
| Glycitine | 6.01 | C22H22O10 | 445.1155 | 446.1228 | 446.1213 | 3.4 | |
| Hespérétine | 6.01 | C16H14O6 | 301.0718 | 302.0796 | 302.079 | -1.81 | |
| Acide hippurique | 1.396 | C9H9NO3 | 178.051 | 179.058 | 179.0582 | -1.16 | |
| Acide homovanillique | 0.823 | C9H10O4 | 181.0503 | 182.0576 | 182.0579 | -1.88 | |
| Isopropyl 3-(3,4-Dihydroxyphényl)-2-hydroxypropanoate | 6.177 | C12H16O5 | 239.0926 | 240.0999 | 240.0998 | 0.48 | |
| Acide phénylacétique | 5.666 | C8H8O2 | 135.0444 | 136.0518 | 136.0524 | -4.92 | |
| Acide phlorétique | 2.811 | C9H10O3 | 165.0556 | 166.0626 | 166.063 | -2.41 | |
| Aldéhyde protocatéchuique | 1.094 | C7H6O3 | 137.0247 | 138.0311 | 138.0317 | -4.5 | |
| Secoisolariciresinol | 8.837 | C20H26O6 | 361.1656 | 362.1729 | 362.1729 | -0.23 | |
| Vanilline | 2.508 | C8H8O3 | 151.04 | 152.0471 | 152.0473 | -1.82 | |
| Épicatéchine 3'-O-glucuronide | 9.342 | C21H22O12 | 465.1024 | 466.109 | 466.1111 | -4.64 | |
| Gomisin M2 | 5.234 | C22H26O6 | 385.1676 | 386.1746 | 386.1729 | 4.38 | |
| Irisolidone | 6.145 | C17H14O6 | 313.0727 | 314.0798 | 314.079 | 2.33 | |
| Urolithine C | 6.753 | C13H8O5 | 243.0294 | 244.0368 | 244.0372 | -1.69 | |
Tableau 3 : Identification provisoire des composés phénoliques et des métabolites dans les échantillons de plasma par la méthode semi-ciblée UPLC-MS/MS.
Pour évaluer l’efficacité de la méthode conçue pour l’identification des principaux composés phénoliques, ou de leurs métabolites, qui ont été absorbés par le muffin et la boisson contenant du RSF, cinq échantillons aléatoires des participants à l’étude, obtenus avant et après l’intervention de 30 jours, ont été analysés. L’abondance relative de chaque composé a été calculée en divisant l’aire sous la courbe (ASC) après traitement par l’ASC avant traitement. À partir de cette analyse, il a été possible d’observer que certains composés n’apparaissaient que dans les échantillons obtenus avant le traitement, d’autres restaient inchangés, tandis que certains d’entre eux augmentaient après la consommation des aliments fonctionnels. Le tableau 4 présente la liste des 12 composés phénoliques qui ont montré une augmentation du plasma après la consommation de 30 jours des aliments contenant du RSF. L’acide phénylacétique était le seul métabolite trouvé systématiquement à des concentrations plus élevées après le traitement. La glycitine, une isoflavone glycosylée, et l’acide 3-hydroxyphénylvalérique (un métabolite phénolique) ont augmenté dans trois des cinq échantillons, mais ont diminué dans les deux autres. La gomisine M2, un lignan, n’a été détectée dans trois des cinq échantillons qu’après l’intervention nutritionnelle. Les autres composés phénoliques (tels que l’hespéretine, le sésiolaricirésinol et la vanilline) et les métabolites (tels que l’acide 2-hydroxyhippurique) n’ont été trouvés que dans un seul échantillon et seulement après le traitement.
| Échantillon (ASC après traitement/ASC avant traitement) | |||||||
| Composé | Formule | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| Acide 2-hydroxyhippurique | C18H33NO4 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Acide 3-hydroxyphénylvalérique | C11H14O3 | 1.30 | 2.69 | 2.69 | 0.62 | 0.62 | |
| 6-Hydroxyentérodol | C18H22O5 | Nd | Nd | T | Nd | Nd | |
| Glycitine | C22H22O10 | 1.88 | 1.07 | 1.07 | 0.43 | 0.45 | |
| Hespérétine | C16H14O6 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Acide phénylacétique | C8H8O2 | 4.06 | T | T | T | 1.28 | |
| Acide phlorétique | C9H10O3 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Aldéhyde protocatéchuique | C7H6O3 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Secoisolariciresinol | C20H26O6 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Vanilline | C8H8O3 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Gomisin M2 | C22H26O6 | Nd | T | T | T | Nd | |
Tableau 4 : Liste des composés phénoliques qui ont augmenté dans le plasma des personnes âgées après 30 jours de consommation d’aliments contenant du RSF. Les données sont les rapports de l’abondance (ASC) de chaque composé après traitement par rapport à leur abondance avant le traitement. T indique que le composé n’a été identifié dans l’échantillon qu’après le traitement. Nd : non détecté.
Figure 2 : Protocole d’identification des métabolites des composés phénoliques par UPLC-MS/MS semi-ciblés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
L’identification et la quantification des composés phytochimiques bioactifs qui sont absorbés après la consommation d’un aliment ou d’un complément alimentaire sont cruciales pour démontrer et comprendre les bienfaits pour la santé de ces composés et des aliments qui en contiennent. Dans le présent travail, la méthode UPLC-MS/MS a été développée, visant uniquement à identifier les principaux composés phénoliques et leurs métabolites qui ont augmenté en concentration dans le plasma après une intervention nutritionnelle de 30 jours avec deux produits alimentaires spécialement formulés pour les personnes âgées. On a supposé que, si un composé augmentait ou apparaissait dans le plasma seulement après la période d’intervention, ce composé avait été absorbé et/ou biotransformé à partir des aliments utilisés dans l’intervention.
UPLC-MS/MS est l’une des technologies préférées pour les études métabolomiques dans lesquelles de nombreux composés de faible poids moléculaire sont analysés simultanément dans des échantillons complexes afin d’évaluer l’effet d’un traitement ou d’une altération de l’environnement13. Cela peut être fait par le biais de méthodes ciblées et non ciblées (ou globales). Les analyses ciblées se concentrent sur un petit nombre connu de métabolites d’intérêt. Ils sont la meilleure option pour quantifier les composés avec les normes disponibles, offrant la meilleure spécificité et sensibilité; toutefois, ces méthodes doivent être soigneusement optimisées pour les métabolites sélectionnés et sont incapables de détecter des composés inattendus dans les échantillons12. Dans d’autres études, la CLHP couplée à un détecteur UV-vis a été utilisée pour identifier les acides phénoliques et les métabolites dans le plasma, mais ce type d’étude a utilisé des étalons analytiques pour identifier et quantifier le composé d’intérêt15. Dans une autre étude, l’ajout d’une norme interne a été proposé18; cependant, seuls les acides férulique et caféique et leurs métabolites ont été analysés dans ce travail. D’autre part, la synthèse d’étalons internes de métabolites phénoliques a été proposée comme alternative à l’absence de normes analytiques commerciales19. Néanmoins, la synthèse d’une grande variété de composés phénoliques est difficile, longue et coûteuse. Les méthodes non ciblées tentent de détecter et d’identifier autant de composés moléculaires que possible et génèrent principalement des hypothèses12. Ils peuvent identifier plusieurs centaines de composés dans un échantillon en attribuant des formules à des signaux chromatographiques détectables présentant des caractéristiques caractéristiques, telles que m/z ou masse précise mesurée, temps de rétention chromatographique, empreinte isotopique, etc., de sorte que les données générées par ces analyses sont très abondantes et peuvent être difficiles à interpréter20 . Étant donné que l’objectif de la présente méthode n’était pas d’obtenir un profil métabolique complet des échantillons de plasma (ce qui serait une approche non ciblée) mais d’identifier les principaux composés phénoliques et métabolites phénoliques (jusqu’alors inconnus), une approche semi-ciblée a été conçue. Pour cela, tous les signaux identifiés ont été extraits automatiquement avec le logiciel de l’instrument, puis comparés à une base de données auto-créée contenant 645 composés phénoliques et leurs métabolites, qui ont été obtenus à partir de bases de données en ligne gratuites. La base de données comprenait des modèles de fragmentation MS/MS de référence des composés utilisés pour l’attribution du nom et de la formule du composé, ce qui permet une identification plus précise des composés dans l’échantillon12.
Les étapes les plus critiques du protocole étaient 1) le prétraitement de l’échantillon (extraction et concentration de composés phénoliques et de métabolites à partir d’échantillons de plasma); 2) la construction d’une base de données complète et spécifique pour l’analyse semi-ciblée des échantillons et l’identification de tous les composés possibles appartenant à une classe de composés spécifique; et 3) la sélection des paramètres utilisés par le logiciel qualitatif de l’instrument (tolérance de correspondance de masse ppm et score%) pour identifier avec précision les composés de l’échantillon. Lors du prétraitement des échantillons, il faut faire preuve de prudence pour éviter la perte des composés d’intérêt, les récupérer à une concentration finale élevée et être en mesure d’éliminer les composés interférents. Lors de la création de la base de données spécifique, il est essentiel d’effectuer une recherche documentaire approfondie, puis d’utiliser des bases de données en ligne gratuites pour obtenir des données chimiques spécifiques qui seront utilisées pour l’identification des composés dans l’échantillon. La sélection des meilleures valeurs pour la correspondance de masse et le score nécessitait une validation préalable de la méthode d’analyse à l’aide d’étalons et d’échantillons connus21,22.
Une fois le protocole mis en œuvre, les problèmes courants et les solutions recommandées étaient les suivants : 1) Aucun composé n’a été identifié dans les échantillons. Cela était dû à la faible concentration des composés et pouvait être résolu en séchant l’échantillon et en le dissolvant à nouveau dans un volume plus petit. 2) Des signaux sont apparus dans le TIC, mais les composés n’ont pas été identifiés. Cela pouvait être dû à un échec de l’étalonnage de la masse, de sorte que la différence entre les masses expérimentales et théoriques était élevée. Dans ce cas, l’étalonnage de masse de l’instrument doit être effectué en fonction du fabricant et du modèle de l’équipement. Une deuxième raison pourrait être une base de données personnelle incomplète, il est donc essentiel de vérifier et de maintenir constamment la base de données. Les masses de composés soupçonnés d’être d’intérêt peuvent être vérifiées et comparées à des bases de données en ligne librement disponibles ou à de la nouvelle littérature scientifique. 3) Les signaux sont apparus dans des séries vides. Cela indique une contamination et peut être résolu en nettoyant l’aiguille et la colonne de l’échantillonneur automatique. Le protocole de nettoyage standard consiste à effectuer certaines séries en utilisant du méthanol, puis de l’isopropanol et enfin de l’acétonitrile comme phase mobile. Ensuite, la colonne est rééquilibrée, exécutant la phase mobile pendant au moins 30 minutes.
Les principales difficultés dans le développement de ce type de méthode sont 1) la faible biodisponibilité, en termes généraux, de tous les composés phytochimiques, y compris les composés phénoliques, ce qui se traduit par de très faibles concentrations plasmatiques16; 2) la grande diversité des composés phénoliques présents dans les aliments, qui est augmentée par leur métabolisme et leur biotransformation qui se produisent dans les entérocytes et les hépatocytes humains et le microbiote colique23; 3) l’absence d’étalons (certains étalons existent mais sont très difficiles à obtenir) pour de nombreux composés, en particulier pour les métabolites, et l’existence de certains composés inconnus ou non caractérisés23; et 4) des réponses variables chez les individus, tant dans l’absorption que dans le métabolisme des composés phytochimiques14. Pour surmonter le problème des faibles concentrations plasmatiques de métabolites phénoliques, ils doivent être extraits et concentrés. Ceci peut être réalisé par micro extraction en phase solide14 ou, comme dans les travaux actuels, par l’ajout de solvants qui précipitent les protéines et dissolvent les composés phénoliques et les métabolites, suivie de l’évaporation et de la remise en suspension des solvants dans un volume plus petit19. Cette technique est simple, économique et adéquate pour un petit nombre d’échantillons. Cependant, la récupération des composés d’intérêt pourrait être facilement améliorée en utilisant des volumes plasmatiques plus importants, de sorte que la concentration finale de tous les composés serait plus élevée. La grande diversité des métabolites phénoliques et l’absence d’étalons sont la raison pour laquelle une approche semi-ciblée a été utilisée pour identifier les composés augmentés par l’intervention avant de tenter de les quantifier. En utilisant une base de données spécialement créée au lieu d’une analyse complètement non ciblée, il a été possible d’ignorer les nombreux métabolites primaires dans le plasma, en se concentrant uniquement sur les composés phénoliques et leurs métabolites. Une limitation importante de cette base de données, spécifique aux composés phénoliques et à leurs métabolites humains, était le manque d’informations spectrales de masse pour de nombreux composés et leurs métabolites, ce qui réduit la précision de l’identification des composés.
Une grande variabilité entre les individus est régulièrement observée dans les études évaluant l’absorption et le métabolisme des composés phénoliques, à la fois quantitativement et qualitativement. Dans les résultats actuels, une personne a présenté 18 composés dans l’échantillon de plasma prélevé après l’intervention, tandis que les autres n’en ont montré que 9 ou 10. De plus, de nombreux composés phénoliques et métabolites n’ont été trouvés que dans les échantillons de base (avant l’intervention), et ils variaient également d’un individu à l’autre. Dans l’ensemble, plus de la moitié des composés identifiés présentaient des concentrations plus élevées (ASC) avant qu’après l’intervention ou n’ont été trouvés que dans les échantillons pré-intervention. Par conséquent, il était nécessaire de comparer des échantillons individuels prélevés avant et après l’intervention pour comprendre quels composés étaient réellement augmentés par celle-ci. Le seul métabolite qui a constamment augmenté après le traitement était l’acide phénylacétique, un catabolite microbien du flavan-3-ols24 qui a été trouvé dans le plasma des individus dans des études aiguës de la consommation d’aliments riches en phénols14,25. La plupart des études qui ont identifié et quantifié les métabolites phénoliques dans le plasma étaient des études aiguës, dans lesquelles les concentrations de composés ont été surveillées pendant les 24 heures suivant la consommation du repas riche en phénols, en observant que, après 24 heures, leurs concentrations étaient proches de la valeur basale19,25. Par conséquent, il est compréhensible que les échantillons analysés dans le présent travail aient montré de faibles nombres et concentrations de métabolites phénoliques. Récemment, Zhang et al.25 ont évalué la consommation de framboise rouge, à la fois dans des études aiguës et après 4 semaines de supplémentation. Ils ont observé que les interventions aiguës et chroniques augmentaient les composés phénoliques et leurs métabolites, tandis qu’après la supplémentation de 4 semaines, la concentration plasmatique basale de certains métabolites augmentait (urolithines, acides cinnamiques, phénylpropioniques et hippuriques) et d’autres diminuait (dérivés conjugués des anthocyanes).
Un examen final de la méthode développée dans le présent document montre que, dans la plupart des cas, elle était bien adaptée à l’objectif pour lequel elle a été créée. Le prétraitement de l’échantillon a été simple et efficace, et la séparation UPLC et l’identification semi-ciblée des métabolites phénoliques ont été réalisées. Cette méthode semi-ciblée peut être utile comme première approche de criblage pour identifier les composés phénoliques qui peuvent être absorbés par différentes matrices alimentaires, ainsi que les métabolites phénoliques présents dans le plasma humain. De plus, le protocole est utile car il permet d’identifier lorsqu’aucun étalon de composés phénoliques ou de métabolites n’est disponible. Enfin, la méthode utilise une petite quantité de plasma, ce qui est essentiel dans la plupart des études in vivo où les échantillons de plasma sont rares. Cependant, il est recommandé que, pour les études futures, une étude aiguë soit effectuée avant l’intervention chronique afin de mieux identifier les principaux composés phénoliques et métabolites absorbés par les aliments spécialement formulés.
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Disclosures
Tous les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Les auteurs sont reconnaissants du soutien financier de CONACYT, Mexique (CB- 2016-01-286449), et UACJ-PIVA (Projets 313-17-16 et 335-18-13). L’OAMB tient à remercier CONACYT pour sa bourse de doctorat. Le soutien technique du bureau de production multimédia de l’UACJ est reconnu avec gratitude.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Tedia | Al1129-001 | LC Mass spectrometry |
| Autosampler | Agilent Technologies | G4226A | 1290 Infinity series |
| C18 reverse phase column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse plus C18 2.1x50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD |
| Centrifuge | Eppendorf | 5452000018 | Mini Spin; Rotor F-45-12-11 |
| Column compartment with thermostat | Agilent Technologies | G1316C | 1290 Infinity series |
| Diode Array Detector (UV-Vis) | Agilent Technologies | G4212B | 1260 Infinity series |
| Electrospray ionnization source | Agilent Technologies | G3251B | Dual sprayer ESI source |
| Formic acid | J.T. Baker | 0128-02 | Baker reagent, ACS |
| Mass Hunter Data Acquisition | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Qualitative Analysis | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Microcentrifuge tube | Brand | BR780546 | Microcentrifuge tube, 2 mL with lid |
| Pure ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-1L | 200 proof, for molecular biology |
| Q-TOF LC/MS | Agilent Technologies | G6530B | 6530 Accurate Mass |
| Quaternary pump | Agilent Technologies | G4204A | 1290 Infinity series |
| Syringe filter | Thermo Scientific | 44514-NN | 17 mm, 0.45 μm, nylon membrane |
| Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | 1290 Infinity series |
| Vial | Agilent Technologies | 8010-0199 | Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps |
| Vial insert | Agilent Technologies | 5183-2089 | Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical |
| Water | Tedia | WL2212-001 | LC Mass spectrometry |
References
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