Summary
L'obiettivo di questo protocollo è quello di rilevare metaboliti fenolici nel plasma utilizzando un metodo di cromatografia-spettrometria di massa semi-mirato.
Abstract
A un gruppo di 23 persone anziane sono stati somministrati pasti funzionali (una bevanda e un muffin) appositamente formulati per la prevenzione della sarcopenia (perdita di massa muscolare legata all'età). I campioni di plasma sono stati prelevati all'inizio dell'intervento e dopo 30 giorni di consumo dei pasti funzionali. È stata effettuata una cromatografia semi-mirata ad altissime prestazioni abbinata all'analisi di massa tandem (UPLC-MS/MS) per identificare i composti fenolici e i loro metaboliti. Le proteine plasmatiche sono state precipitate con etanolo e i campioni sono stati concentrati e risospesi nella fase mobile (acetonitrile 1:1: acqua) prima dell'iniezione nello strumento UPLC-MS/MS. La separazione è stata effettuata con una colonna di fase inversa C18 e i composti sono stati identificati utilizzando la loro massa sperimentale, la distribuzione isotopica e il modello di frammento. I composti di interesse sono stati confrontati con quelli delle banche dati e della libreria semi-mirata interna. I risultati preliminari hanno mostrato che i principali metaboliti identificati dopo l'intervento erano acido fenilacetico, glicina, acido 3-idrossifenilvalerico e gomisina M2.
Introduction
La sarcopenia è un disturbo scheletrico progressivo correlato ad una perdita accelerata di muscoli nella popolazione anziana. Questa condizione aumenta il rischio di cadute e porta a attività limitate della vita quotidiana. La sarcopenia è presente in circa il 5%-10% delle persone di età superiore ai 65 anni e in circa il 50% delle persone di età pari o superiore a 80 anni1. Non sono stati approvati farmaci specifici per il trattamento della sarcopenia, quindi la prevenzione con l'attività fisica e una dieta equilibrata è importante1,2. Gli interventi nutrizionali con alimenti appositamente formulati arricchiti con proteine del latte e aminoacidi essenziali hanno mostrato risultati positivi nella prevenzione della sarcopenia2. In altri studi, gli autori hanno incluso vitamine e antiossidanti, come la vitamina E e gli isoflavoni, nella dieta, aumentando i benefici per il guadagno muscolare sulla vita e sui fianchi3.
Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) è un albero che cresce nelle regioni tropicali messicane; è stato consumato dalle culture Maya grazie al suo alto valore nutrizionale4. È una buona fonte di proteine, fibre, minerali e antiossidanti fenolici, come l'acido clorogenico5. Poiché può essere macinato in polvere e utilizzato nei prodotti da forno o consumato nelle bevande, studi recenti hanno valutato l'incorporazione della farina di semi di Ramón (RSF) in diversi alimenti per migliorare il loro valore nutrizionale. È stata formulata una bevanda al gusto di cappuccino integrata con RSF, che era ricca di fibre alimentari e aveva più di 6 g di proteine per porzione, ed era altamente accettata dai consumatori; pertanto, è stata considerata una potenziale alternativa per soddisfare esigenze dietetiche speciali6. In uno studio di follow-up, RSF è stato utilizzato anche per formulare un muffin e una nuova bevanda ricca di proteine, fibre alimentari, micronutrienti e antiossidanti fenolici. Il muffin e la bevanda sono stati utilizzati in un intervento dietetico per le persone anziane, che hanno consumato entrambi i prodotti due volte al giorno per 30 giorni. Dopo questo periodo, lo stato nutrizionale e sarcopenico dei partecipanti è migliorato e il contenuto fenolico totale del plasma è aumentato7. Tuttavia, la determinazione dei composti fenolici totali nel plasma è stata effettuata con un metodo spettrofotometrico, quindi l'identificazione dei composti fenolici effettivi che sono stati assorbiti non è stata possibile; inoltre, questo metodo non è completamente specifico per i composti fenolici, quindi può verificarsi una sovrastima8.
L'identificazione e la quantificazione dei composti fenolici che vengono assorbiti dopo il consumo di alimenti ricchi di questi antiossidanti è un compito difficile ma è necessario per dimostrare l'attività biologica di questi fitochimici. La biodisponibilità della maggior parte dei composti fenolici è bassa; meno del 5% di essi può essere trovato senza trasformazione strutturale nel plasma. I composti fenolici subiscono diverse biotrasformazioni, come la metilazione, la solfonazione o la glucuronidazione, che vengono effettuate da enterociti ed epatociti9. I composti fenolici sono anche biotrasformati dal microbiota in cataboliti batterici che possono esercitare i loro effetti benefici nel corpo dopo essere stati assorbiti nel plasma10. Ad esempio, l'acido fenilacetico è un prodotto della trasformazione batterica dei flavonoidi e delle proantocianidine oligomeriche, che possono inibire fino al 40% dell'adesione dei batteri (Escherichia coli) nel tratto urinario dopo il consumo di mirtilli11.
La diversità strutturale dei composti fenolici presenti in natura, aggiunta alla diversità dei loro metaboliti e alla loro bassa biodisponibilità, rende la loro identificazione nel plasma ancora più difficile. La profilazione metabolomica, utilizzando piattaforme di analisi spettroscopica come la risonanza magnetica nucleare (NMR) e la spettroscopia di massa tandem (MS/MS), è probabilmente l'approccio migliore per raggiungere questo obiettivo; sfortunatamente, l'apparecchiatura non è facilmente accessibile e lo sviluppo di protocolli di analisi è ancora limitato12. Diversi studi hanno riportato MS / MS accoppiato con un sistema di separazione (come la cromatografia liquida) come strategia per ridurre la complessità degli spettri di massa negli studi metabolomici. La recente introduzione di metodi di separazione per cromatografia liquida (UPLC) ad altissime prestazioni ha ridotto il tempo di analisi e aumentato la risoluzione e la sensibilità rispetto ai protocolli liquidi convenzionali ad alte prestazioni, pertanto i sistemi UPLC-MS/MS sono stati rapidamente ampiamente accettati dalla comunità della metabolomica analitica13. In questo modo, alcuni studi hanno studiato metaboliti fenolici e rilevato derivati glucuronidati dall'acido caffeico, quercetina e acido ferulico, nonché derivati solfonati dall'acido siringico e vanillico nel plasma di individui dopo l'assunzione di mirtilli rossi14. I protocolli precedenti hanno lo scopo di trovare composti fenolici e metaboliti fenolici in biofluidi come il plasma. Questi protocolli si basavano sull'identificazione e la quantificazione mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) accoppiata a un rivelatore UV-vis15. Tuttavia, tali protocolli richiedono l'uso di standard autentici per valutare l'identificazione assoluta e la quantificazione accurata. Una vasta gamma di studi ha identificato i metaboliti più comuni nei biofluidi (forme solfonate, glucuronidate e metilate) mediante UPLC-MS e UPLC-MS/MS; tuttavia, gran parte dei metaboliti batterici non è stata segnalata a causa della mancanza di database che contengano le loro informazioni complete16. L'identificazione dei metaboliti è complicata dal costo e dalla disponibilità commerciale degli standard dei metaboliti. Pertanto, la strategia migliore può essere l'analisi dei metaboliti MS/MS non mirata o semi-mirata, che si basa sull'uso di informazioni sulle caratteristiche molecolari (m/z, massa esatta monoisotopica, distribuzione isotopica e modello di frammentazione) per determinare l'identità chimica e confrontarla con database online liberamente disponibili che contengono metaboliti polifenolici identificati nei biofluidi dopo il consumo di polipolifenoli-ricchi12 . I database più importanti utilizzati negli studi UPLC-MS/MS per l'identificazione di composti fenolici e dei loro metaboliti sono il Database del Metaboloma Umano (HMDB), lipidBlast Library, METLIN Library e altri database complementari, come PubChem, ChemSpider e Phenol Explorer17.
Nel presente studio, è stato sviluppato un metodo UPLC-MS/MS semi-mirato per analizzare i campioni di plasma del gruppo di persone anziane coinvolte nello studio sul consumo di muffin e bevande contenenti RSF7. I dati provenienti da diversi database online gratuiti di metaboliti plasmatici sono stati raccolti e integrati in un database specializzato. Questo database è accessibile automaticamente dal software dell'apparecchiatura per identificare i metaboliti polifenolici nei cinque campioni di plasma prima e dopo l'intervento nutrizionale di 30 giorni. Questo viene fatto per identificare i principali composti fenolici, o i loro metaboliti, che vengono assorbiti dagli alimenti funzionali appositamente formulati progettati per la prevenzione della sarcopenia.
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Protocol
I campioni di plasma utilizzati in questo protocollo sono stati raccolti in uno studio precedente seguendo tutte le linee guida etiche e approvati dal Comitato istituzionale di etica e bioetica (CIEB-2018-1-37) dell'Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. Il protocollo completo per l'estrazione e l'identificazione dei composti fenolici e dei metaboliti nel plasma da parte di UPLC-MS/MS è rappresentato nella Figura 1.
Figura 1: Rappresentazione schematica dell'estrazione e dell'identificazione di composti fenolici e metaboliti nel plasma mediante il metodo semi-mirato UPLC-MS/MS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
1. Preparazione del campione
- Conservare i campioni di plasma a -80 °C fino all'analisi.
- Scongelare i campioni di plasma a temperatura ambiente per 15 min.
NOTA: I campioni possono essere posti a bagnomaria a 37 °C per accelerare il processo (5 min). - Posizionare 200 μL di campione di plasma in un microtubo da 2 mL e mescolare con 1.000 μL di etanolo puro. Vortice il campione di plasma per 30 s.
NOTA: utilizzare sempre i guanti quando si lavora con campioni di plasma. - Centrifugare il campione a 6.580 x g per 5 min. Dopo la centrifugazione, raccogliere il surnatante con una micropipetta o una pipetta Pasteur e posizionarlo in un nuovo microtubo. Conservare il surnatante a 4 °C.
- Mescolare il pellet della fase precedente con 1.000 μL di etanolo al 100%, vortice per 30 s e quindi centrifugare a 6.580 x g per 5 minuti.
NOTA: Il pellet è fortemente imballato e deve essere risospeso bene per garantire il contatto tra il campione e l'etanolo puro. Si consiglia l'uso di una micropipetta per lavare il pellet con etanolo. - Dopo la centrifugazione, raccogliere il surnatante e mescolare con il surnatante precedentemente ottenuto dal passo 1.4. in un microtubo da 2 ml.
- Rimuovere l'etanolo dal campione utilizzando azoto puro (99,997%) a 135 psi. Tenere l'ago a 1 cm di distanza dalla parte superiore del microtubo per evitare la perdita del campione e il lavaggio fino a quando il campione non è asciutto. Non è necessario alcun calore per evaporare l'etanolo.
NOTA: il flusso di azoto deve essere basso per evitare la perdita del campione. Una volta essiccato l'etanolo, mantenere il flusso di azoto per almeno 5 minuti per garantire la secchezza del campione. Il protocollo può essere messo in pausa a questo punto; i campioni devono essere conservati a -20 °C. Evitare di conservare i campioni per più di 12 ore. - Sospendere i campioni secchi in 100 μL di una miscela di acetonitrile: acqua in una proporzione di 50:50 (v:v).
- Filtrare il campione attraverso una membrana di siringa di nylon da 0,45 μm direttamente in un micro inserto per flaconcino HPLC.
NOTA: i campioni nel flaconcino possono essere conservati a -20 °C prima dell'analisi. Conservare i campioni per non più di 8 ore. Si consiglia di iniettare i campioni nel sistema UPLC subito dopo la filtrazione.
2. Analisi UPLC-MS/MS
- Iniettare 3 μL di campione su un UPLC dotato di una colonna inversa C18 (50 mm x 2,1 mm; 1,8 μm). Impostare la temperatura dell'autocampionatore a 20 °C e il termostato a colonna a 25 °C. Iniettare ogni campione in triplice copia.
- Utilizzare acido formico allo 0,1% (v:v) in acqua come solvente A e acetonitrile al 100% come solvente B. Impostare la portata a 0,4 ml/min e un programma di gradiente come segue: 0-1 min 10% B, 1-4 min 30% B, 4-6 min 38% B, 6-8 min 60% B, 8-8,5 min 60% B, 8,5-9 min 10% B (Tabella 1).
- Impostare lo spettrometro di massa su ionizzazione in modalità negativa. Utilizzare l'azoto come gas di essiccazione a 340 °C e una portata di 13 L/min. Impostare la pressione del nebulizzatore a 60 psi. Impostare la tensione capillare a 4.000 V, la tensione del frammentatore a 175 V e la tensione dello Skimmer a 65 V. Utilizzare l'energia di collisione a 20 V (Tabella 2).
- Eseguire la scansione delle masse tra 100-1100 rapporto massa/carica (m/z) e, per MS/MS, masse di scansione comprese tra 50-1000 m/z (Tabella 2). Impostare l'acquisizione dati in modalità Auto MS/MS. Utilizzare la seguente massa di riferimento: 119.036 e 966.0007.
| Tempo (min) | Solvente A (0,1 % di acido formico in acqua HPLC) | Solvente B (100 % acetonitrile) |
| 0 a 1 | 90 | 10 |
| 1 a 4 | 70 | 30 |
| 4 a 6 | 62 | 38 |
| 6 a 8 | 40 | 60 |
| Da 8 a 8,5 | 40 | 60 |
| Da 8,5 a 9 | 90 | 10 |
Tabella 1: Gradiente di fase mobile utilizzato per la separazione di composti fenolici mediante UPLC.
| Modalità di ionizzazione | Negativo |
| Gas di essiccazione | Azoto a 340 °C, portata 13 L/min |
| Pressione del nebulizzatore | 60 psi |
| Tensione capillare | 175 V |
| Masse di scansione MS | 100-1100 m/z |
| Masse di scansione MS/MS | 50-1000 m/z |
Tabella 2: Parametri di ionizzazione per l'analisi MS/MS.
3. Costruzione di database
- Ricerca di composti fenolici, metaboliti fenolici o altri composti di interesse nella letteratura scientifica.
- Aprire il software di gestione del database incluso nel sistema UPLC. Seleziona file | Nuovo | PCDL (Personal Database Compound Library) Crea nuovo PCDL. Selezionare il tipo di PCDL: LC/MS Metabolomics. Impostare un nome per il PCDL. Quindi seleziona Crea.
- Nella barra degli strumenti, selezionare PCDL e quindi l'opzione Consenti modifica . Quindi fare clic sul pulsante Trova composti .
NOTA: poiché si tratta di un nuovo PCDL, i risultati della tabella saranno vuoti. Questo cambierà una volta che nuovi composti saranno aggiunti al PCDL.- Aggiungere composti alla libreria di composti di database personali specializzati copiandoli dalla libreria generale dello strumento. Aprire il database esistente dello strumento incluso nel software di gestione del database. Fare clic sul pulsante Trova composti. Nell'opzione Ricerca singola , inserisci i criteri di ricerca composti per trovare il composto di interesse.
NOTA: i composti possono essere trovati per nome, formula molecolare, massa esatta e tempo di ritenzione. - Nella tabella dei risultati composti, selezionare il composto di interesse. Per selezionare più composti, fare clic sul primo composto, tenere premuto CTRL e quindi fare clic su ogni composto di interesse. Quindi, fare clic con il pulsante destro del mouse su tutti i composti evidenziati e selezionare Aggiungi a PCDL.
- Nella nuova finestra, cercare e selezionare il file di database personale specializzato. Contrassegnare le caselle Includi spettri per composti se presenti e Includi informazioni sulla mobilità ionica per i composti se presenti. Fare clic sul pulsante Aggiungi . Nella finestra di dialogo Nuovo selezionare Sì per controllare i nuovi composti aggiunti. Selezionare No per continuare a cercare altri composti di interesse.
- Aggiungere composti alla libreria di composti di database personali specializzati copiandoli dalla libreria generale dello strumento. Aprire il database esistente dello strumento incluso nel software di gestione del database. Fare clic sul pulsante Trova composti. Nell'opzione Ricerca singola , inserisci i criteri di ricerca composti per trovare il composto di interesse.
- Se i composti di interesse non sono disponibili nella libreria generale dello strumento, aggiungere manualmente nuovi composti.
- Aprire il database personale specializzato. Una volta aperto, seguire il passaggio 3.3. Selezionate l'opzione Modifica composti (Edit compounds ). Fare clic sul pulsante Aggiungi nuovo .
- Nella sezione superiore della finestra, completare le informazioni per il nuovo composto. Inserisci la formula, il nome, il nome IUPAC, il numero CAS, l'ID Chemspider e altri identificatori.
- Utilizza le informazioni disponibili nelle librerie online gratuite (Chemspider, PubChem e Phenol Explorer) per inserire le informazioni per il nuovo composto di interesse. Una volta terminato, fare clic sul pulsante Salva come nuovo per salvare le nuove informazioni sul composto nel database personale specializzato.
NOTA: quando si aggiungono informazioni da librerie libere, assicurarsi di includere le informazioni sul composto senza la presenza di ioni cloruro o ioduro. Questo può modificare l'esatta massa e la formula molecolare del composto di interesse.
- Ripeti il processo con tutti i composti di interesse per completare il database personale specializzato.
4. Analisi dei dati
- Utilizzare il software di gestione qualitativa dello strumento per identificare i composti fenolici e i metaboliti fenolici presenti nei campioni.
- Aprire il file di esempio. Nel pannello Cromatogramma, selezionate Definisci cromatogrammi ed estratte il cromatogramma ionico totale (TIC), il cromatogramma ionico estratto di MS (EIC) e l'EIC di MS/MS. Selezionate l'opzione integra cromatogramma.
- Nel pannello Trova composti , selezionate Trova per formula-Opzioni. Nella nuova finestra selezionare Origine formula e quindi l'opzione Database/Libreria . Trova il database personale creato in precedenza e fai clic su Apri.
- Selezionate l'opzione Corrispondenza formule (Formula Matching ) e impostate una tolleranza di corrispondenza di massa di 5 parti per milione (ppm).
NOTA: una diversa tolleranza di corrispondenza delle masse può essere impostata a 10 ppm; questa differenza dipende dallo spettrometro di massa utilizzato. - Selezionate l'opzione Ioni negativi (Negative Ions ) e selezionate solo la finestra di dialogo -H . Nell'opzione Risultati selezionare le finestre di dialogo EIC E Extract, Extract Cleaned Spectrum, Extract Raw Spectrum e includi Struttura .
- Selezionare l'opzione Filtri risultati . Contrassegna se il punteggio è e imposta la corrispondenza del punteggio all'80,00%. Contrassegna Non corrispondere se il punteggio è e imposta il punteggio al 75,00%.
NOTA: i punteggi di corrispondenza/non corrispondenza possono essere modificati in valori più bassi, se necessario. Ciò ridurrà l'accuratezza dell'identificazione. - Fare clic su Trova composti per formula per identificare i composti di interesse nel campione.
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Representative Results
Il processo passo-passo per l'identificazione dei metaboliti fenolici attraverso l'analisi semi-mirata UPLC-MS/MS, in modalità negativa, di campioni di plasma è illustrato nella Figura 2. In primo luogo, il cromatogramma ionico totale (TIC) dall'estratto fenolico plasmatico (ottenuto dopo la precipitazione proteica del campione plasmatico totale) è stato ottenuto attraverso il software qualitativo dello strumento. Successivamente, è stato utilizzato il cromatogramma ionico estratto e l'esatto modello di massa e frammentazione (analisi MS/MS) di ciascun segnale (o caratteristica molecolare) è stato confrontato con quelli di uno specifico database personale creato anche nel software dello strumento. Ai segnali con una corrispondenza di massa inferiore a 5 ppm è stata assegnata una formula molecolare dal database. Infine, la distribuzione isotopica di ciascun segnale è stata confrontata con quella della formula molecolare assegnata per ottenere l'identificazione provvisoria finale. I composti che a) sono stati identificati solo in una replica o b) hanno presentato un'area inferiore a 10.000 sono stati trattati come false identificazioni. Da questa analisi, un totale di 25 composti fenolici e metaboliti sono stati identificati nei campioni di plasma (Tabella 3). In questo elenco sono stati trovati sia composti fenolici che i loro metaboliti, come l'acido 3-idroossifenilvalerico e l'isopropil 3-(3,4-diidrossifenil)-2-idrossipropanoato. Poiché la modalità di ionizzazione negativa è più adatta per tutte le classi di composti fenolici, ad eccezione degli antociani, questi composti non possono essere rilevati con il metodo attuale. Se gli antociani sono componenti importanti della matrice alimentare, dovrebbe essere utilizzata anche la modalità positiva.
| Metaboliti fenolici | R.T. (min) | Formula | Precursore | Massa sperimentale | Massa teorica | Differenza (ppm) | |
| Acido 2,3-diidrossibenzoico | 0.622 | C7H6O4 · | 153.0203 | 154.0273 | 154.0266 | 4.2 | |
| Acido 2-idrossiippurico | 8.631 | C18H33NO4 | 410.1648 | 411.1725 | 411.1717 | 1.8 | |
| 3,4-diidrossitoluene | 2.239 | C7H8O2 · | 123.0451 | 124.0524 | 124.0524 | -0.25 | |
| Acido 3-idrossifenilvalerico | 6.717 | C11H14O3 | 193.0874 | 194.0947 | 194.0943 | 2.12 | |
| Acido 5-(3',4'-diidrossifenil)-valerico | 4.293 | C11H14O4 · | 209.0823 | 210.0894 | 210.0892 | 0.68 | |
| 6-Idrossienterodiolo | 9.201 | C18H22O5 · | 317.1387 | 318.1465 | 318.1467 | -0.65 | |
| Ajugol · | 3.889 | C15H24O9 · | 347.134 | 348.1418 | 348.142 | -0.59 | |
| Acido benzoico | 3.915 | C7H6O2 · | 121.0296 | 122.0367 | 122.0368 | -0.28 | |
| Acido carnosico | 6.785 | C20H28O4 · | 331.1905 | 332.1979 | 332.1988 | -2.58 | |
| Carnosol · | 6.347 | C20H26O4 · | 329.1764 | 330.1842 | 330.1831 | 3.43 | |
| Catecolo | 0.892 | C6H6O2 · | 109.0297 | 110.037 | 110.0368 | 1.91 | |
| Glicitina | 6.01 | C22H22O10 | 445.1155 | 446.1228 | 446.1213 | 3.4 | |
| Esperitetina | 6.01 | C16H14O6 · | 301.0718 | 302.0796 | 302.079 | -1.81 | |
| Acido ippurico | 1.396 | C9H9NO3 · | 178.051 | 179.058 | 179.0582 | -1.16 | |
| Acido omovanillico | 0.823 | C9H10O4 · | 181.0503 | 182.0576 | 182.0579 | -1.88 | |
| 3-(3,4-diidrossifenil)-2-idrossipropanoato di isopropile | 6.177 | C12H16O5 · | 239.0926 | 240.0999 | 240.0998 | 0.48 | |
| Acido fenilacetico | 5.666 | C8H8O2 · | 135.0444 | 136.0518 | 136.0524 | -4.92 | |
| Acido floretico | 2.811 | C9H10O3 · | 165.0556 | 166.0626 | 166.063 | -2.41 | |
| Aldeide protocatechuica | 1.094 | C7H6O3 · | 137.0247 | 138.0311 | 138.0317 | -4.5 | |
| Secoisolariciresinolo | 8.837 | C20H26O6 · | 361.1656 | 362.1729 | 362.1729 | -0.23 | |
| Vanillina | 2.508 | C8H8O3 · | 151.04 | 152.0471 | 152.0473 | -1.82 | |
| Epicatechina 3'-O-glucuronide | 9.342 | C21H22O12 | 465.1024 | 466.109 | 466.1111 | -4.64 | |
| Gomisin M2 | 5.234 | C22H26O6 | 385.1676 | 386.1746 | 386.1729 | 4.38 | |
| Irisolidone | 6.145 | C17H14O6 · | 313.0727 | 314.0798 | 314.079 | 2.33 | |
| Urolithin C | 6.753 | C13H8O5 · | 243.0294 | 244.0368 | 244.0372 | -1.69 | |
Tabella 3: Identificazione provvisoria di composti fenolici e metaboliti in campioni plasmatici mediante il metodo semi-mirato UPLC-MS/MS.
Per valutare l'efficacia del metodo progettato per l'identificazione dei principali composti fenolici, o dei loro metaboliti, che sono stati assorbiti dal muffin e dalla bevanda contenenti RSF, sono stati analizzati cinque campioni aleatori dei partecipanti allo studio, ottenuti prima e dopo l'intervento di 30 giorni. L'abbondanza relativa di ciascun composto è stata calcolata dividendo l'area sotto la curva (AUC) dopo il trattamento da parte dell'AUC prima del trattamento. Da questa analisi, è stato possibile osservare che alcuni composti apparivano solo nei campioni ottenuti prima del trattamento, altri sono rimasti invariati, mentre alcuni di essi sono aumentati dopo il consumo degli alimenti funzionali. La Tabella 4 mostra l'elenco di 12 composti fenolici che hanno mostrato un aumento del plasma dopo il consumo di 30 giorni degli alimenti contenenti RSF. L'acido fenilacetico è stato l'unico metabolita trovato costantemente in concentrazioni più elevate dopo il trattamento. La glicitina, un isoflavone glicosilato, e l'acido 3-idrossifenilvalerico (un metabolita fenolico) sono aumentati in tre dei cinque campioni, ma sono diminuiti negli altri due. La gomisina M2, un lignan, è stata rilevata in tre dei cinque campioni solo dopo l'intervento nutrizionale. Gli altri composti fenolici (come l'esperetina, il secoisolariciresinolo e la vanillina) e i metaboliti (come l'acido 2-idrossiippurico) sono stati trovati solo in un campione e solo dopo il trattamento.
| Campione (AUC dopo trattamento/AUC prima del trattamento) | |||||||
| Composto | Formula | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| Acido 2-idrossiippurico | C18H33NO4 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Acido 3-idrossifenilvalerico | C11H14O3 | 1.30 | 2.69 | 2.69 | 0.62 | 0.62 | |
| 6-Idrossienterodiolo | C18H22O5 · | Nd | Nd | T | Nd | Nd | |
| Glicitina | C22H22O10 | 1.88 | 1.07 | 1.07 | 0.43 | 0.45 | |
| Esperitetina | C16H14O6 · | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Acido fenilacetico | C8H8O2 · | 4.06 | T | T | T | 1.28 | |
| Acido floretico | C9H10O3 · | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Aldeide protocatechuica | C7H6O3 · | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Secoisolariciresinolo | C20H26O6 · | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Vanillina | C8H8O3 · | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Gomisin M2 | C22H26O6 | Nd | T | T | T | Nd | |
Tabella 4: Elenco dei composti fenolici che sono aumentati nel plasma degli individui anziani dopo il consumo di 30 giorni di alimenti contenenti RSF. I dati sono i rapporti dell'abbondanza (AUC) di ciascun composto dopo il trattamento rispetto alla loro abbondanza prima del trattamento. T indica che il composto è stato identificato nel campione solo dopo il trattamento. Nd: non rilevato.
Figura 2: Protocollo per l'identificazione di metaboliti composti fenolici da parte di UPLC-MS/MS semi-mirati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'identificazione e la quantificazione dei fitochimici bioattivi che vengono assorbiti dopo il consumo di un alimento o di un integratore alimentare sono cruciali per dimostrare e comprendere i benefici per la salute di questi composti e degli alimenti che li contengono. Nel presente lavoro è stato sviluppato il metodo UPLC-MS/MS, finalizzato unicamente all'identificazione dei principali composti fenolici e dei loro metaboliti che sono aumentati di concentrazione nel plasma dopo un intervento nutrizionale di 30 giorni con due prodotti alimentari appositamente formulati per gli anziani. Si presumeva che, se un composto aumentava o appariva nel plasma solo dopo il periodo di intervento, tale composto era stato assorbito e/o biotrasformato dagli alimenti utilizzati nell'intervento.
UPLC-MS/MS è una delle tecnologie preferite per gli studi metabolomici in cui molti composti a basso peso molecolare vengono analizzati simultaneamente in campioni complessi per valutare l'effetto di alcuni trattamenti o alterazioni ambientali13. Questo può essere fatto attraverso metodi mirati e non mirati (o globali). Le analisi mirate si concentrano su un numero noto e piccolo di metaboliti di interesse. Sono l'opzione migliore per quantificare i composti con gli standard disponibili, fornendo la migliore specificità e sensibilità; tuttavia, questi metodi devono essere accuratamente ottimizzati per i metaboliti selezionati e non sono in grado di rilevare composti inaspettati nei campioni12. In altri studi, l'HPLC accoppiato con un rilevatore UV-vis è stato utilizzato per identificare acidi fenolici e metaboliti nel plasma, ma questo tipo di studio ha utilizzato standard analitici per identificare e quantificare il composto di interesse15. In un altro studio è stata proposta l'aggiunta di uno standard interno18; tuttavia, solo gli acidi ferulici e caffeici e i loro metaboliti sono stati analizzati in questo lavoro. D'altra parte, la sintesi di standard interni di metaboliti fenolici è stata proposta come alternativa alla mancanza di standard analitici commerciali19. Tuttavia, la sintesi di una grande varietà di composti fenolici è difficile, dispendiosa in termini di tempo e costosa. I metodi non mirati tentano di rilevare e identificare il maggior numero possibile di composti molecolari e generano principalmente ipotesi12. Possono identificare diverse centinaia di composti in un campione assegnando formule a segnali cromatografici rilevabili con caratteristiche caratteristiche, come m / z o massa misurata accurata, tempo di ritenzione cromatografica, impronta isotopica, ecc., Quindi i dati generati da queste analisi sono molto abbondanti e possono essere difficili da interpretare20 . Poiché l'obiettivo del presente metodo non era quello di ottenere un profilo metabolico completo dei campioni di plasma (che sarebbe un approccio non mirato), ma di identificare i principali composti fenolici e metaboliti fenolici (precedentemente sconosciuti) in essi, è stato progettato un approccio semi-mirato. Per questo, tutti i segnali identificati sono stati estratti automaticamente con il software dello strumento e poi confrontati con un database auto-creato che conteneva 645 composti fenolici e i loro metaboliti, che sono stati ottenuti da database online gratuiti. Il database includeva modelli di frammentazione MS/MS di riferimento dei composti utilizzati per l'assegnazione del nome e della formula del composto, che consente un'identificazione più accurata dei composti nel campione12.
Le fasi più critiche del protocollo sono state 1) pretrattamento del campione (estrazione e concentrazione di composti fenolici e metaboliti da campioni plasmatici); 2) la costruzione di un database completo e specifico per l'analisi semi-mirata dei campioni e l'identificazione di tutti i possibili composti appartenenti ad una specifica classe di composti; e 3) la selezione dei parametri utilizzati dal software qualitativo dello strumento (tolleranza di corrispondenza di massa ppm e punteggio%) per identificare con precisione i composti nel campione. Nel pretrattamento del campione, è necessario prestare attenzione per evitare la perdita dei composti di interesse, recuperarli ad un'alta concentrazione finale ed essere in grado di eliminare i composti interferenti. Nella creazione del database specifico, è fondamentale condurre una ricerca approfondita della letteratura e quindi utilizzare database online gratuiti per ottenere dati chimici specifici che verranno utilizzati per l'identificazione del composto nel campione. La selezione dei valori migliori per la corrispondenza di massa e il punteggio ha richiesto una precedente convalida del metodo analitico utilizzando standard e campioni noti21,22.
Una volta implementato il protocollo, i problemi comuni e le loro soluzioni raccomandate erano i seguenti: 1) Nessun composto è stato identificato nei campioni. Ciò era dovuto alla bassa concentrazione dei composti e poteva essere risolto asciugando il campione e sciogliendolo in un volume più piccolo. 2) I segnali sono apparsi nel TIC, ma i composti non sono stati identificati. Ciò potrebbe essere dovuto a un fallimento nella calibrazione della massa, quindi la differenza tra masse sperimentali e teoriche era elevata. In questo caso, la calibrazione della massa dello strumento deve essere eseguita in base al produttore e al modello dell'apparecchiatura. Un secondo motivo potrebbe essere un database personale incompleto, quindi è fondamentale controllare e mantenere costantemente il database. Masse di composti sospettati di essere di interesse possono essere controllate e confrontate con banche dati online liberamente disponibili o nuova letteratura scientifica. 3) I segnali apparivano in corse vuote. Ciò indica la contaminazione e può essere risolto pulendo l'ago e la colonna dell'autocampionatore. Il protocollo di pulizia standard consiste nell'eseguire alcune corse utilizzando metanolo, quindi isopropanolo e infine acetonitrile come fase mobile. Quindi la colonna viene riequilibrata, eseguendo la fase mobile per almeno 30 minuti.
Le maggiori difficoltà nello sviluppo di questo tipo di metodo sono 1) la bassa biodisponibilità, in termini generali, di tutte le sostanze fitochimiche, compresi i composti fenolici, che si traduce in concentrazioni plasmatiche molto basse16; 2) l'elevata diversità dei composti fenolici presenti negli alimenti, che è aumentata dal loro metabolismo e biotrasformazione che si verificano negli enterociti ed epatociti umani e nel microbiota del colon23; 3) la mancanza di standard (alcuni standard esistono ma sono molto difficili da ottenere) per molti composti, soprattutto per i metaboliti, e l'esistenza di alcuni composti sconosciuti o non caratterizzati23; e 4) risposte variabili tra gli individui, sia nell'assorbimento che nel metabolismo dei fitochimici14. Per superare il problema delle basse concentrazioni plasmatiche di metaboliti fenolici, dovrebbero essere estratti e concentrati. Ciò può essere ottenuto mediante estrazione in micro fase solida14 o, come nel presente lavoro, mediante l'aggiunta di solventi che precipitano proteine e dissolvono composti fenolici e metaboliti, seguiti da evaporazione e risospensione del solvente in un volume minore19. Questa tecnica è semplice, economica e adeguata per un piccolo numero di campioni. Tuttavia, il recupero di composti di interesse potrebbe essere facilmente migliorato utilizzando volumi di plasma maggiori, quindi la concentrazione finale di tutti i composti sarebbe più alta. L'elevata diversità dei metaboliti fenolici e la mancanza di standard è il motivo per cui è stato utilizzato un approccio semi mirato per identificare i composti aumentati dall'intervento prima di tentare di quantificarli. Utilizzando un database appositamente creato invece di un'analisi completamente non mirata, è stato possibile ignorare i numerosi metaboliti primari nel plasma, concentrandosi solo sui composti fenolici e sui loro metaboliti. Un'importante limitazione di questo database, specifico per i composti fenolici e i loro metaboliti umani, è stata la mancanza di informazioni spettrali di massa per molti composti e i loro metaboliti, che riduce l'accuratezza dell'identificazione del composto.
Una grande variabilità tra gli individui è regolarmente osservata negli studi che valutano l'assorbimento e il metabolismo dei composti fenolici, sia quantitativamente che qualitativamente. Nei risultati attuali, un individuo ha presentato 18 composti nel campione di plasma prelevato dopo l'intervento, mentre gli altri ne hanno mostrati solo 9 o 10. Inoltre, molti composti fenolici e metaboliti sono stati trovati solo nei campioni basali (prima dell'intervento) e variavano anche tra gli individui. Nel complesso, più della metà dei composti identificati ha mostrato concentrazioni più elevate (AUC) prima che dopo l'intervento o sono stati trovati solo nei campioni pre-intervento. Pertanto, è stato necessario confrontare i singoli campioni prelevati prima e dopo l'intervento per capire quali composti sono stati effettivamente aumentati da esso. L'unico metabolita che è aumentato costantemente dopo il trattamento è stato l'acido fenilacetico, un catabolite microbico di flavan-3-ols24 che è stato trovato nel plasma di individui in studi acuti sul consumo di alimenti ricchi di fenolici14,25. La maggior parte degli studi che hanno identificato e quantificato metaboliti fenolici nel plasma sono stati studi acuti, in cui le concentrazioni di composti sono state monitorate durante le 24 ore dopo il consumo del pasto ricco di fenolici, osservando che, dopo 24 ore, le loro concentrazioni erano vicine al valore basale19,25. Pertanto, è comprensibile che i campioni analizzati nel presente lavoro abbiano mostrato bassi numeri e concentrazioni di metaboliti fenolici. Recentemente, Zhang et al.25 hanno valutato il consumo di lampone rosso, sia in studi acuti che dopo 4 settimane di integrazione. Hanno osservato che sia gli interventi acuti che quelli cronici hanno aumentato i composti fenolici e i loro metaboliti, mentre dopo l'integrazione di 4 settimane, la concentrazione plasmatica basale di alcuni metaboliti è aumentata (urolitine, acido cinnamico, fenilpropionico e hippurico) e di altri è diminuita (derivati antociani coniugati).
Un esame finale del metodo sviluppato nel presente documento mostra che, nella maggior parte dei casi, era adatto all'obiettivo per il quale era stato creato. Il pretrattamento del campione è stato semplice ed efficace e sono state raggiunte la separazione UPLC e l'identificazione semi-mirata MS/MS dei metaboliti fenolici. Questo metodo semi-mirato può essere utile come primo approccio di screening per identificare composti fenolici che possono essere assorbiti da diverse matrici alimentari, nonché i metaboliti fenolici presenti nel plasma umano. Inoltre, il protocollo è utile perché consente l'identificazione quando non sono disponibili standard da composti fenolici o metaboliti. Infine, il metodo utilizza una piccola quantità di plasma, che è fondamentale nella maggior parte degli studi in vivo in cui i campioni di plasma sono scarsi. Tuttavia, si raccomanda che, per studi futuri, venga effettuato uno studio acuto prima dell'intervento cronico per identificare meglio i principali composti fenolici e metaboliti assorbiti dagli alimenti appositamente formulati.
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Disclosures
Tutti gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Gli autori sono grati per il sostegno finanziario di CONACYT, Messico (CB- 2016-01-286449) e UACJ-PIVA (Progetti 313-17-16 e 335-18-13). OAMB desidera ringraziare CONACYT per la sua borsa di studio di dottorato. Il supporto tecnico dell'ufficio di produzione multimediale di UACJ è grato.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Tedia | Al1129-001 | LC Mass spectrometry |
| Autosampler | Agilent Technologies | G4226A | 1290 Infinity series |
| C18 reverse phase column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse plus C18 2.1x50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD |
| Centrifuge | Eppendorf | 5452000018 | Mini Spin; Rotor F-45-12-11 |
| Column compartment with thermostat | Agilent Technologies | G1316C | 1290 Infinity series |
| Diode Array Detector (UV-Vis) | Agilent Technologies | G4212B | 1260 Infinity series |
| Electrospray ionnization source | Agilent Technologies | G3251B | Dual sprayer ESI source |
| Formic acid | J.T. Baker | 0128-02 | Baker reagent, ACS |
| Mass Hunter Data Acquisition | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Qualitative Analysis | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Microcentrifuge tube | Brand | BR780546 | Microcentrifuge tube, 2 mL with lid |
| Pure ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-1L | 200 proof, for molecular biology |
| Q-TOF LC/MS | Agilent Technologies | G6530B | 6530 Accurate Mass |
| Quaternary pump | Agilent Technologies | G4204A | 1290 Infinity series |
| Syringe filter | Thermo Scientific | 44514-NN | 17 mm, 0.45 μm, nylon membrane |
| Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | 1290 Infinity series |
| Vial | Agilent Technologies | 8010-0199 | Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps |
| Vial insert | Agilent Technologies | 5183-2089 | Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical |
| Water | Tedia | WL2212-001 | LC Mass spectrometry |
References
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