Summary
El objetivo de este protocolo es detectar metabolitos fenólicos en plasma utilizando un método de cromatografía semi-dirigida-espectrometría de masas.
Abstract
Un grupo de 23 ancianos recibió comidas funcionales (una bebida y un muffin) especialmente formuladas para la prevención de la sarcopenia (pérdida de masa muscular relacionada con la edad). Se tomaron muestras de plasma al inicio de la intervención y después de 30 días de consumir las comidas funcionales. Se llevó a cabo una cromatografía semi-dirigida de ultra alto rendimiento junto con un análisis de masa en tándem (UPLC-MS/MS) para identificar compuestos fenólicos y sus metabolitos. Las proteínas plasmáticas se precipitaron con etanol y las muestras se concentraron y resuspendieron en la fase móvil (acetonitrilo 1:1: agua) antes de la inyección en el instrumento UPLC-MS/MS. La separación se llevó a cabo con una columna de fase inversa C18 , y los compuestos se identificaron utilizando su masa experimental, distribución isotópica y patrón de fragmentos. Los compuestos de interés se compararon con los de los bancos de datos y la biblioteca interna semi-dirigida. Los resultados preliminares mostraron que los principales metabolitos identificados después de la intervención fueron ácido fenilacético, glicitina, ácido 3-hidroxifenilvalérico y gomisina M2.
Introduction
La sarcopenia es un trastorno esquelético progresivo relacionado con una pérdida acelerada de músculo en la población de edad avanzada. Esta condición aumenta el riesgo de caídas y conduce a actividades limitadas de la vida diaria. La sarcopenia está presente en aproximadamente el 5%-10% de las personas mayores de 65 años y alrededor del 50% de las personas de 80 años o más1. No se han aprobado fármacos específicos para el tratamiento de la sarcopenia, por lo que la prevención con actividad física y una dieta equilibrada es importante1,2. Las intervenciones nutricionales con alimentos especialmente formulados enriquecidos con proteína láctea y aminoácidos esenciales han mostrado resultados positivos en la prevención de la sarcopenia2. En otros estudios, los autores han incluido vitaminas y antioxidantes, como la vitamina E y las isoflavonas, en la dieta, aumentando los beneficios para la ganancia muscular en la cintura y las caderas3.
Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) es un árbol que crece en las regiones tropicales mexicanas; ha sido consumido por los cultivos mayas debido a su alto valor nutricional4. Es una buena fuente de proteínas, fibra, minerales y antioxidantes fenólicos, como el ácido clorogénico5. Dado que puede ser molido en polvo y utilizado en productos de panadería o consumido en bebidas, estudios recientes han evaluado la incorporación de harina de semilla de Ramón (RSF) en diferentes alimentos para mejorar su valor nutricional. Se formuló una bebida con sabor a capuchino suplementada con RSF, que era alta en fibra dietética y tenía más de 6 g de proteína por porción, y fue altamente aceptada por los consumidores; por lo tanto, se consideró una alternativa potencial para satisfacer necesidades dietéticas especiales6. En un estudio de seguimiento, RSF también se utilizó para formular un muffin y una nueva bebida rica en proteínas, fibra dietética, micronutrientes y antioxidantes fenólicos. El muffin y la bebida se utilizaron en una intervención dietética para personas mayores, que consumieron ambos productos dos veces al día durante 30 días. Después de este período, el estado nutricional y sarcopénico de los participantes mejoró, y el contenido fenólico total de plasma aumentó7. Sin embargo, la determinación de los compuestos fenólicos totales en plasma se llevó a cabo por un método espectrofotométrico, por lo que no fue posible la identificación de los compuestos fenólicos reales que se absorbieron; además, este método no es completamente específico para los compuestos fenólicos, por lo que puede producirse cierta sobreestimación8.
La identificación y cuantificación de los compuestos fenólicos que se absorben después del consumo de alimentos ricos en estos antioxidantes es una tarea difícil pero es necesaria para demostrar la actividad biológica de estos fitoquímicos. La biodisponibilidad de la mayoría de los compuestos fenólicos es baja; menos del 5% de ellos se pueden encontrar sin transformación estructural en plasma. Los compuestos fenólicos sufren varias biotransformaciones, como la metilación, la sulfonación o la glucuronidación, que son llevadas a cabo por enterocitos y hepatocitos9. Los compuestos fenólicos también son biotransformados por la microbiota en catabolitos bacterianos que pueden ejercer sus efectos beneficiosos en el cuerpo después de ser absorbidos por el plasma10. Por ejemplo, el ácido fenilacético es un producto de la transformación bacteriana de flavonoides y proantocianidinas oligoméricas, que pueden inhibir hasta el 40% de la adhesión de bacterias (Escherichia coli) en el tracto urinario después del consumo de arándano11.
La diversidad estructural de los compuestos fenólicos naturales, sumada a la diversidad de sus metabolitos y su baja biodisponibilidad, hace que su identificación en plasma sea aún más difícil. El perfil metabolómico, utilizando plataformas de análisis espectroscópico como la resonancia magnética nuclear (RMN) y la espectroscopia de masas en tándem (MS / MS), es probablemente el mejor enfoque para lograr este objetivo; desafortunadamente, el equipo no es de fácil acceso, y el desarrollo de protocolos de análisis aún es limitado12. Varios estudios han reportado EM / EM junto con un sistema de separación (como la cromatografía líquida) como una estrategia para reducir la complejidad de los espectros de masas en estudios metabolómicos. La reciente introducción de métodos de separación por cromatografía líquida (UPLC) de ultra alto rendimiento ha reducido el tiempo de análisis y ha aumentado la resolución y la sensibilidad en comparación con los protocolos líquidos convencionales de alto rendimiento, por lo que los sistemas UPLC-MS/MS han sido rápidamente ampliamente aceptados por la comunidad de metabolómica analítica13. De esta manera, algunos estudios han investigado metabolitos fenólicos y detectado derivados glucuronidados del ácido cafeico, quercetina y ácido ferúlico, así como derivados sulfonados del ácido siríngrico y vanílico en el plasma de individuos después de la ingesta de arándano14. Los protocolos anteriores han destinado a encontrar compuestos fenólicos y metabolitos fenólicos en biofluidos como el plasma. Estos protocolos se basaron en la identificación y cuantificación mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) acoplada a un detector UV-vis15. Sin embargo, tales protocolos requieren el uso de estándares auténticos para evaluar la identificación absoluta y la cuantificación precisa. Una amplia gama de estudios han identificado los metabolitos más comunes en los biofluidos (formas sulfonadas, glucuronidas y metiladas) por UPLC-MS y UPLC-MS/MS; sin embargo, gran parte de los metabolitos bacterianos no ha sido reportado debido a la falta de bases de datos que contengan su información completa16. La identificación de metabolitos se complica por el costo y la disponibilidad comercial de los estándares de metabolitos. Por lo tanto, la mejor estrategia puede ser el análisis de metabolitos MS/MS no dirigido o semidirigido, que se basa en el uso de información de características moleculares (m/z, masa exacta monoisotópica, distribución isotópica y patrón de fragmentación) para determinar la identidad química y compararla con bases de datos en línea disponibles gratuitamente que contienen metabolitos de polifenoles identificados en biofluidos después del consumo de ricos en polipolifenoles12 . Las bases de datos más importantes utilizadas en los estudios UPLC-MS/MS para la identificación de compuestos fenólicos y sus metabolitos son la Human Metabolome Database (HMDB), LipidBlast Library, METLIN Library y otras bases de datos complementarias, como PubChem, ChemSpider y Phenol Explorer17.
En el presente estudio, se desarrolló un método semi-dirigido UPLC-MS/MS para analizar las muestras plasmáticas del grupo de ancianos involucrados en el estudio de consumo de magdalenas y bebidas que contenía RSF7. Los datos de diferentes bases de datos gratuitas en línea de metabolitos plasmáticos se recopilaron e integraron en una base de datos especializada. El software del equipo puede acceder automáticamente a esta base de datos para identificar los metabolitos polifenólicos en las cinco muestras de plasma antes y después de la intervención nutricional de 30 días. Esto se hace para identificar los principales compuestos fenólicos, o sus metabolitos, que se absorben de los alimentos funcionales especialmente formulados diseñados para la prevención de la sarcopenia.
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Protocol
Las muestras de plasma utilizadas en este protocolo fueron recolectadas en un estudio previo siguiendo todos los lineamientos éticos y aprobado por el Comité Institucional de Ética y Bioética (CIEB-2018-1-37) de la Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. El protocolo completo para la extracción e identificación de los compuestos fenólicos y metabolitos en plasma por UPLC-MS/MS está representado en la Figura 1.
Figura 1: Representación esquemática de la extracción e identificación de compuestos fenólicos y metabolitos en plasma mediante el método semi-dirigido UPLC-MS/MS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
1. Preparación de la muestra
- Conservar las muestras de plasma a -80 °C hasta su análisis.
- Descongelar las muestras de plasma a temperatura ambiente durante 15 min.
NOTA: Las muestras se pueden colocar en un baño de agua a 37 °C para acelerar el proceso (5 min). - Coloque 200 μL de muestra de plasma en un microtubo de 2 ml y mezcle con 1.000 μL de etanol puro. Vórtice la muestra de plasma durante 30 s.
NOTA: Siempre use guantes cuando trabaje con muestras de plasma. - Centrifugar la muestra a 6.580 x g durante 5 min. Después de la centrifugación, recoja el sobrenadante con una micropipeta o pipeta Pasteur y colóquelo en un nuevo microtubo. Conservar el sobrenadante a 4 °C.
- Mezclar el pellet del paso anterior con 1.000 μL de etanol al 100%, vórtice durante 30 s, y luego centrifugar a 6.580 x g durante 5 min.
NOTA: El pellet está fuertemente envasado y debe resuspendirse bien para garantizar el contacto entre la muestra y el etanol puro. Se recomienda el uso de una micropipeta para enjuagar el pellet con etanol. - Después de la centrifugación, recoger el sobrenadante y mezclar con el sobrenadante previamente obtenido del Paso 1.4. en un microtubo de 2 ml.
- Elimine el etanol de la muestra mediante el uso de nitrógeno puro (99.997%) a 135 psi. Mantenga la aguja a 1 cm de distancia de la parte superior del microtubo para evitar la pérdida de muestra y enjuague hasta que la muestra esté seca. No se necesita calor para evaporar el etanol.
NOTA: El flujo de nitrógeno debe ser bajo para evitar la pérdida de muestra. Una vez que el etanol se haya secado, mantenga el flujo de nitrógeno durante al menos 5 minutos para garantizar la sequedad de la muestra. El protocolo se puede pausar en este punto; las muestras deberán almacenarse a -20 °C. Evite almacenar las muestras durante más de 12 h. - Resuspend las muestras secas en 100 μL de una mezcla de acetonitrilo: agua en una proporción de 50:50 (v:v).
- Filtre la muestra a través de una membrana de jeringa de nylon de 0,45 μm directamente en un microinserto de vial de HPLC.
NOTA: Las muestras en el vial se pueden almacenar a -20 °C antes del análisis. Almacene las muestras durante no más de 8 h. Se recomienda inyectar las muestras en el sistema UPLC justo después de la filtración.
2. Análisis UPLC-MS/MS
- Inyectar 3 μL de muestra en un UPLC equipado con una columna de fase inversa C18 (50 mm x 2,1 mm; 1,8 μm). Ajuste la temperatura del muestreador automático a 20 °C y el termostato de columna a 25 °C. Inyecte cada muestra por triplicado.
- Use ácido fórmico al 0.1% (v:v) en agua como solvente A, y 100% acetonitrilo como solvente B. Establezca el caudal en 0.4 mL/min y un programa de gradiente de la siguiente manera: 0-1 min 10% B, 1-4 min 30% B, 4-6 min 38% B, 6-8 min 60% B, 8-8.5 min 60% B, 8.5-9 min 10% B (Tabla 1).
- Ajuste el espectrómetro de masas a ionización en modo negativo. Utilice nitrógeno como gas de secado a 340 °C y un caudal de 13 L/min. Ajuste la presión del nebulizador a 60 psi. Ajuste el voltaje capilar a 4.000 V, el voltaje del fragmentor a 175 V y el voltaje skimmer a 65 V. Utilice la energía de colisión a 20 V (Tabla 2).
- Escanee las masas entre 100-1100 la relación masa-carga (m/z) y, para MS/MS, escanee masas entre 50-1000 m/z (Tabla 2). Establezca la adquisición de datos en modo MS/MS automático. Utilice la siguiente masa de referencia: 119.036 y 966.0007.
| Tiempo (min) | Disolvente A (0,1 % de ácido fórmico en agua HPLC) | Disolvente B (100 % acetonitrilo) |
| 0 a 1 | 90 | 10 |
| 1 a 4 | 70 | 30 |
| De 4 a 6 | 62 | 38 |
| De 6 a 8 | 40 | 60 |
| De 8 a 8,5 | 40 | 60 |
| 8,5 a 9 | 90 | 10 |
Tabla 1: Gradiente de fase móvil utilizado para la separación de compuestos fenólicos por UPLC.
| Modo de ionización | Negativo |
| Gas de secado | Nitrógeno a 340 °C, caudal 13 L/min |
| Presión del nebulizador | 60 psi |
| Tensión capilar | 175 V |
| Masas de escaneo MS | 100-1100 m/z |
| Masas de escaneo MS/MS | 50-1000 m/z |
Tabla 2: Parámetros de ionización para el análisis MS/MS.
3. Construcción de bases de datos
- Búsqueda de compuestos fenólicos, metabolitos fenólicos u otros compuestos de interés en la literatura científica.
- Abra el software de gestión de bases de datos incluido en el sistema UPLC. Seleccione archivo | Nueva biblioteca compuesta de base de datos personales (PCDL) | Crear nuevo PCDL. Seleccione el tipo de PCDL: LC/MS Metabolomics. Establezca un nombre para el PCDL. A continuación, seleccione Crear.
- En la barra de herramientas, seleccione PCDL y, a continuación, la opción Permitir edición . A continuación, haga clic en el botón Buscar compuestos .
NOTA: Dado que se trata de un nuevo PCDL, los resultados de la tabla estarán vacíos. Esto cambiará una vez que se agreguen nuevos compuestos al PCDL.- Agregue compuestos a la biblioteca de compuestos de la base de datos personal especializada copiándolos de la biblioteca general del instrumento. Abra la base de datos existente del instrumento incluida en el software de administración de bases de datos. Haga clic en el botón Buscar compuestos. En la opción Búsqueda única , introduzca los criterios de búsqueda de compuestos para encontrar el compuesto de interés.
NOTA: Los compuestos se pueden encontrar por nombre, fórmula molecular, masa exacta y tiempo de retención. - En la tabla de resultados compuestos, seleccione el compuesto de interés. Para seleccionar más de un compuesto, haga clic en el primer compuesto, mantenga presionada la tecla CTRL y, a continuación, haga clic en cada compuesto de interés. Luego, haga clic derecho en todos los compuestos resaltados y seleccione Anexar a PCDL.
- En la nueva ventana, busque y seleccione el archivo de base de datos personal especializado. Marque las casillas Incluya espectros para compuestos si están presentes e Incluya información de movilidad iónica para compuestos si está presente. Haga clic en el botón Anexar . En el nuevo cuadro de diálogo, seleccione Sí para comprobar los nuevos compuestos agregados. Seleccione No para seguir buscando más compuestos de interés.
- Agregue compuestos a la biblioteca de compuestos de la base de datos personal especializada copiándolos de la biblioteca general del instrumento. Abra la base de datos existente del instrumento incluida en el software de administración de bases de datos. Haga clic en el botón Buscar compuestos. En la opción Búsqueda única , introduzca los criterios de búsqueda de compuestos para encontrar el compuesto de interés.
- Si los compuestos de interés no están disponibles en la biblioteca general del instrumento, agregue nuevos compuestos manualmente.
- Abra la base de datos personal especializada. Una vez abierto, siga el paso 3.3. Seleccione la opción Editar compuestos . Haga clic en el botón Agregar nuevo .
- En la sección superior de la ventana, complete la información del nuevo compuesto. Rellene la fórmula, el nombre, el nombre de la IUPAC, el número CAS, el ID de Chemspider y otros identificadores.
- Utilice la información disponible en las bibliotecas en línea gratuitas (Chemspider, PubChem y Phenol Explorer) para completar la información del nuevo compuesto de interés. Una vez terminado, haga clic en el botón Guardar como nuevo para guardar la nueva información compuesta en la base de datos personal especializada.
NOTA: Al agregar información de bibliotecas gratuitas, asegúrese de incluir la información del compuesto sin la presencia de iones cloruro o yoduro. Esto puede modificar la masa exacta y la fórmula molecular del compuesto de interés.
- Repite el proceso con todos los compuestos de interés para completar la base de datos personal especializada.
4. Análisis de datos
- Utilice el software de gestión cualitativa del instrumento para identificar los compuestos fenólicos y los metabolitos fenólicos presentes en las muestras.
- Abra el archivo de ejemplo. En el panel Cromatograma, seleccione Definir cromatogramas y extraiga el cromatograma iónico total (TIC), el cromatograma iónico extraído de MS (EIC) y el EIC de MS/MS. Seleccione la opción integrar cromatograma.
- En el panel Buscar compuestos , seleccione Buscar por opciones de fórmula. En la nueva ventana, seleccione Origen de fórmula y, a continuación, la opción Base de datos/Biblioteca . Encuentre la base de datos personal creada anteriormente y haga clic en Abrir.
- Seleccione la opción Coincidencia de fórmulas y establezca una tolerancia de coincidencia de masa de 5 partes por millón (ppm).
NOTA: Se puede establecer una tolerancia de coincidencia diferente de masas en 10 ppm; esta diferencia depende del espectrómetro de masas utilizado. - Seleccione la opción Iones negativos y seleccione sólo el cuadro de diálogo -H . En la opción Resultados , marque los cuadros de diálogo Extraer EIC, Extraer espectro limpio, Extraer espectro sin procesar e Incluir estructura .
- Seleccione la opción Filtros de resultados . Marque Advertir si la puntuación es y establecer la coincidencia de puntuación en 80.00%. Marcar No coincidir si la puntuación es y establecer la puntuación en 75.00%.
NOTA: Las puntuaciones de coincidencia/no coincidencia se pueden cambiar a valores más bajos si es necesario. Esto reducirá la precisión de la identificación. - Haga clic en Buscar compuestos por fórmula para identificar compuestos de interés en la muestra.
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Representative Results
El proceso paso a paso para la identificación de metabolitos fenólicos a través del análisis semi-dirigido UPLC-MS/MS, en modo negativo, de muestras de plasma se representa en la Figura 2. En primer lugar, el cromatograma iónico total (TIC) del extracto fenólico plasmático (obtenido después de la precipitación proteica de la muestra plasmática total) se obtuvo a través del software cualitativo del instrumento. Luego, se utilizó el cromatograma iónico extraído, y se comparó el patrón exacto de masa y fragmentación (análisis MS / MS) de cada señal (o característica molecular) con los de una base de datos personal específica creada también en el software del instrumento. A las señales con una coincidencia de masa de menos de 5 ppm se les asignó una fórmula molecular de la base de datos. Finalmente, se comparó la distribución isotópica de cada señal con la de la fórmula molecular asignada para lograr la identificación tentativa final. Los compuestos que a) se identificaron solo en una réplica o b) presentaron un área inferior a 10,000 fueron tratados como identificaciones falsas. A partir de este análisis, se identificaron un total de 25 compuestos fenólicos y metabolitos en las muestras de plasma (Tabla 3). En esta lista, se encontraron tanto compuestos fenólicos como sus metabolitos, como el ácido 3-hidroxifenilvalérico y el isopropil 3-(3,4-dihidroxifenil)-2-hidroxipropanoato. Dado que el modo de ionización negativa es el más adecuado para todas las clases de compuestos fenólicos, excepto las antocianinas, estos compuestos no se pudieron detectar con el método actual. Si las antocianinas son componentes importantes de la matriz alimentaria, también se debe utilizar el modo positivo.
| Metabolitos fenólicos | R.T. (min) | Fórmula | Precursor | Masa experimental | Masa teórica | Diferencia (ppm) | |
| Ácido 2,3-dihidroxibenzoico | 0.622 | C7H6O4 | 153.0203 | 154.0273 | 154.0266 | 4.2 | |
| Ácido 2-hidroxihipúrico | 8.631 | C18H33NO4 | 410.1648 | 411.1725 | 411.1717 | 1.8 | |
| 3,4-dihidroxitolueno | 2.239 | C7H8O2 | 123.0451 | 124.0524 | 124.0524 | -0.25 | |
| Ácido 3-hidroxifenilvalérgico | 6.717 | C11H14O3 | 193.0874 | 194.0947 | 194.0943 | 2.12 | |
| Ácido 5-(3',4'-dihidroxifenil)-valérico | 4.293 | C11H14O4 | 209.0823 | 210.0894 | 210.0892 | 0.68 | |
| 6-Hidroxienterodiol | 9.201 | C18H22O5 | 317.1387 | 318.1465 | 318.1467 | -0.65 | |
| Ajugol | 3.889 | C15H24O9 | 347.134 | 348.1418 | 348.142 | -0.59 | |
| Ácido benzoico | 3.915 | C7H6O2 | 121.0296 | 122.0367 | 122.0368 | -0.28 | |
| Ácido carnósico | 6.785 | C20H28O4 | 331.1905 | 332.1979 | 332.1988 | -2.58 | |
| Carnosol | 6.347 | C20H26O4 | 329.1764 | 330.1842 | 330.1831 | 3.43 | |
| Catecol | 0.892 | C6H6O2 | 109.0297 | 110.037 | 110.0368 | 1.91 | |
| Glicitina | 6.01 | C22H22O10 | 445.1155 | 446.1228 | 446.1213 | 3.4 | |
| Hesperetin | 6.01 | C16H14O6 | 301.0718 | 302.0796 | 302.079 | -1.81 | |
| Ácido hipúrico | 1.396 | C9H9NO3 | 178.051 | 179.058 | 179.0582 | -1.16 | |
| Ácido homovanílico | 0.823 | C9H10O4 | 181.0503 | 182.0576 | 182.0579 | -1.88 | |
| Isopropil 3-(3,4-dihidroxifenil)-2-hidroxipropanoato | 6.177 | C12H16O5 | 239.0926 | 240.0999 | 240.0998 | 0.48 | |
| Ácido fenilacético | 5.666 | C8H8O2 | 135.0444 | 136.0518 | 136.0524 | -4.92 | |
| Ácido floretico | 2.811 | C9H10O3 | 165.0556 | 166.0626 | 166.063 | -2.41 | |
| Aldehído protocatecuático | 1.094 | C7H6O3 | 137.0247 | 138.0311 | 138.0317 | -4.5 | |
| Secoisolariciresinol | 8.837 | C20H26O6 | 361.1656 | 362.1729 | 362.1729 | -0.23 | |
| Vainillina | 2.508 | C8H8O3 | 151.04 | 152.0471 | 152.0473 | -1.82 | |
| Epicatequina 3'-O-glucurónido | 9.342 | C21H22O12 | 465.1024 | 466.109 | 466.1111 | -4.64 | |
| Gomisin M2 | 5.234 | C22H26O6 | 385.1676 | 386.1746 | 386.1729 | 4.38 | |
| Irisolidona | 6.145 | C17H14O6 | 313.0727 | 314.0798 | 314.079 | 2.33 | |
| Urolitina C | 6.753 | C13H8O5 | 243.0294 | 244.0368 | 244.0372 | -1.69 | |
Tabla 3: Identificación tentativa de compuestos fenólicos y metabolitos en muestras de plasma por el método semi-dirigido UPLC-MS/MS.
Para evaluar la efectividad del método diseñado para la identificación de los principales compuestos fenólicos, o sus metabolitos, que fueron absorbidos por el muffin y la bebida que contenían RSF, se analizaron cinco muestras aleatorias de los participantes del estudio, obtenidas antes y después de la intervención de 30 días. La abundancia relativa de cada compuesto se calculó dividiendo el área bajo la curva (AUC) después del tratamiento por el AUC antes del tratamiento. A partir de este análisis, se pudo observar que algunos compuestos solo aparecían en las muestras obtenidas antes del tratamiento, otros permanecían sin cambios, mientras que algunos de ellos aumentaban tras el consumo de los alimentos funcionales. La Tabla 4 muestra la lista de 12 compuestos fenólicos que mostraron un aumento en el plasma después del consumo de 30 días de los alimentos que contienen RSF. El ácido fenilacético fue el único metabolito encontrado consistentemente en concentraciones más altas después del tratamiento. La glicitina, una isoflavona glicosilada, y el ácido 3-hidroxifenilvalérico (un metabolito fenólico) aumentaron en tres de las cinco muestras, pero disminuyeron en las otras dos. Gomisin M2, un lignano, se detectó en tres de las cinco muestras solo después de la intervención nutricional. Los otros compuestos fenólicos (como hesperetina, secoisolariciresinol y vainillina) y metabolitos (como el ácido 2-hidroxihipúrico) se encontraron solo en una muestra y solo después del tratamiento.
| Muestra (AUC después del tratamiento/AUC antes del tratamiento) | |||||||
| Compuesto | Fórmula | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| Ácido 2-hidroxihipúrico | C18H33NO4 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Ácido 3-hidroxifenilvalérgico | C11H14O3 | 1.30 | 2.69 | 2.69 | 0.62 | 0.62 | |
| 6-Hidroxienterodiol | C18H22O5 | Nd | Nd | T | Nd | Nd | |
| Glicitina | C22H22O10 | 1.88 | 1.07 | 1.07 | 0.43 | 0.45 | |
| Hesperetin | C16H14O6 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Ácido fenilacético | C8H8O2 | 4.06 | T | T | T | 1.28 | |
| Ácido floretico | C9H10O3 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Aldehído protocatecuático | C7H6O3 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Secoisolariciresinol | C20H26O6 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Vainillina | C8H8O3 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Gomisin M2 | C22H26O6 | Nd | T | T | T | Nd | |
Tabla 4: Lista de compuestos fenólicos que aumentaron en el plasma de personas mayores después de 30 días de consumo de alimentos que contienen RSF. Los datos son las proporciones de la abundancia (AUC) de cada compuesto después del tratamiento en comparación con su abundancia antes del tratamiento. T indica que el compuesto solo se identificó en la muestra después del tratamiento. Nd: no detectado.
Figura 2: Protocolo para la identificación de metabolitos compuestos fenólicos por UPLC-MS/MS semi-dirigido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La identificación y cuantificación de los fitoquímicos bioactivos que se absorben después del consumo de un alimento o complemento alimenticio son cruciales para demostrar y comprender los beneficios para la salud de estos compuestos y los alimentos que los contienen. En el presente trabajo se desarrolló el método UPLC-MS/MS, dirigido únicamente a la identificación de los principales compuestos fenólicos y sus metabolitos que aumentaron en concentración en plasma tras una intervención nutricional de 30 días con dos productos alimenticios especialmente formulados para personas mayores. Se asumió que, si un compuesto aumentaba o aparecía en el plasma sólo después del período de intervención, ese compuesto había sido absorbido y/o biotransformado a partir de los alimentos utilizados en la intervención.
UPLC-MS/MS es una de las tecnologías preferidas para estudios metabolómicos en los que se analizan simultáneamente muchos compuestos de bajo peso molecular en muestras complejas para evaluar el efecto de algún tratamiento o alteración ambiental13. Esto se puede hacer a través de métodos dirigidos y no dirigidos (o globales). Los análisis dirigidos se centran en un pequeño número conocido de metabolitos de interés. Son la mejor opción para cuantificar compuestos con los estándares disponibles, proporcionando la mejor especificidad y sensibilidad; sin embargo, estos métodos deben estar completamente optimizados para los metabolitos seleccionados y son incapaces de detectar compuestos inesperados en las muestras12. En otros estudios, se ha utilizado HPLC junto con un detector UV-vis para identificar ácidos fenólicos y metabolitos en plasma, pero este tipo de estudio ha utilizado estándares analíticos para identificar y cuantificar el compuesto de interés15. En otro estudio, se propuso la adición de una norma interna18; sin embargo, sólo los ácidos ferúlico y cafeico y sus metabolitos fueron analizados en este trabajo. Por otro lado, la síntesis de estándares internos de metabolitos fenólicos se ha propuesto como una alternativa a la falta de estándares analíticos comerciales19. Sin embargo, la síntesis de una gran variedad de compuestos fenólicos es difícil, lenta y costosa. Los métodos no dirigidos intentan detectar e identificar tantos compuestos moleculares como sea posible y son principalmente generadores de hipótesis12. Pueden identificar varios cientos de compuestos en una muestra asignando fórmulas a señales cromatográficas detectables con rasgos característicos, como m/z o masa precisa medida, tiempo de retención cromatográfica, huella dactilar isotópica, etc., por lo que los datos generados por estos análisis son muy abundantes y pueden ser difíciles de interpretar20 . Dado que el objetivo del presente método no era obtener un perfil metabólico completo de las muestras plasmáticas (lo que sería un enfoque no dirigido) sino identificar los principales compuestos fenólicos y metabolitos fenólicos (previamente desconocidos) en ellos, se diseñó un enfoque semidirigido. Para ello, todas las señales identificadas se extrajeron automáticamente con el software del instrumento y luego se compararon con una base de datos autocreada que contenía 645 compuestos fenólicos y sus metabolitos, que se obtuvieron de bases de datos en línea gratuitas. La base de datos incluía patrones de fragmentación MS/MS de referencia de los compuestos que se utilizaron para la asignación del nombre y la fórmula del compuesto, lo que permite una identificación más precisa de los compuestos en la muestra12.
Los pasos más críticos en el protocolo fueron 1) pretratamiento de muestras (extracción y concentración de compuestos fenólicos y metabolitos de muestras de plasma); 2) la construcción de una base de datos completa y específica para el análisis semidirigido de las muestras y la identificación de todos los compuestos posibles pertenecientes a una clase específica de compuestos; y 3) la selección de los parámetros utilizados por el software cualitativo del instrumento (tolerancia de coincidencia de masa ppm y puntuación%) para identificar con precisión los compuestos de la muestra. En el pretratamiento de muestras, se debe tener precaución para evitar la pérdida de los compuestos de interés, recuperarlos a una alta concentración final y poder eliminar los compuestos interferentes. En la creación de la base de datos específica, es fundamental realizar una búsqueda bibliográfica exhaustiva y luego utilizar bases de datos en línea gratuitas para obtener datos químicos específicos que se utilizarán para la identificación de compuestos en la muestra. La selección de los mejores valores para la coincidencia masiva y la puntuación requirió la validación previa del método analítico utilizando estándares y muestras conocidas21,22.
Una vez implementado el protocolo, los problemas comunes y sus soluciones recomendadas fueron los siguientes: 1) No se identificaron compuestos en las muestras. Esto se debía a la baja concentración de los compuestos y podía resolverse secando la muestra y redesuelviéndola en un volumen menor. 2) Aparecieron señales en las TIC, pero no se identificaron compuestos. Esto podría deberse a una falla en la calibración de masa, por lo que la diferencia entre las masas experimentales y teóricas era alta. En este caso, la calibración de masa del instrumento debe realizarse de acuerdo con el fabricante y el modelo del equipo. Una segunda razón podría ser una base de datos personal incompleta, por lo que es fundamental verificar y mantener constantemente la base de datos. Las masas de compuestos sospechosos de ser de interés se pueden verificar y comparar con bases de datos en línea disponibles gratuitamente o nueva literatura científica. 3) Las señales aparecieron en tiradas en blanco. Esto indica contaminación y se puede resolver limpiando la aguja y la columna del muestreador automático. El protocolo de limpieza estándar es realizar algunas tiradas utilizando metanol, luego isopropanol y finalmente acetonitrilo como fase móvil. Luego, la columna se reequilibra, ejecutando la fase móvil durante al menos 30 minutos.
Las principales dificultades en el desarrollo de este tipo de métodos son 1) la baja biodisponibilidad, en términos generales, de todos los fitoquímicos, incluidos los compuestos fenólicos, lo que se traduce en concentraciones plasmáticas muy bajas16; 2) la alta diversidad de compuestos fenólicos presentes en los alimentos, que se ve incrementada por su metabolismo y biotransformación que se producen en los enterocitos y hepatocitos humanos y en la microbiota colónica23; 3) la falta de estándares (algunos estándares existen pero son muy difíciles de obtener) para muchos compuestos, especialmente para los metabolitos, y la existencia de algunos compuestos desconocidos o no caracterizados23; y 4) respuestas variables entre individuos, tanto en la absorción como en el metabolismo de fitoquímicos14. Para superar el problema de las bajas concentraciones plasmáticas de metabolitos fenólicos, deben extraerse y concentrarse. Esto se puede lograr mediante extracción en fase micro sólida14 o, como en el presente trabajo, mediante la adición de disolventes que precipitan proteínas y disuelven compuestos fenólicos y metabolitos, seguidos de evaporación y resuspensión de disolventes en un volumen menor19. Esta técnica es simple, económica y adecuada para un pequeño número de muestras. Sin embargo, la recuperación de compuestos de interés podría mejorarse fácilmente mediante el uso de volúmenes plasmáticos más grandes, por lo que la concentración final de todos los compuestos sería mayor. La alta diversidad de metabolitos fenólicos y la falta de estándares es la razón por la cual se utilizó un enfoque semi dirigido para identificar los compuestos aumentados por la intervención antes de intentar cuantificarlos. Mediante el uso de una base de datos especialmente creada en lugar de un análisis completamente no dirigido, fue posible ignorar los numerosos metabolitos primarios en el plasma, centrándose solo en los compuestos fenólicos y sus metabolitos. Una limitación importante de esta base de datos, específica para compuestos fenólicos y sus metabolitos humanos, fue la falta de información espectral de masas para muchos compuestos y sus metabolitos, lo que reduce la precisión de la identificación de compuestos.
La gran variabilidad entre los individuos se observa regularmente en los estudios que evalúan la absorción y el metabolismo de los compuestos fenólicos, tanto cuantitativa como cualitativamente. En los presentes resultados, un individuo presentó 18 compuestos en la muestra de plasma tomada después de la intervención, mientras que los otros mostraron solo 9 o 10. Además, muchos compuestos fenólicos y metabolitos se encontraron solo en las muestras basales (antes de la intervención), y también variaron entre los individuos. En general, más de la mitad de los compuestos identificados mostraron concentraciones más altas (AUC) antes que después de la intervención o se encontraron solo en las muestras previas a la intervención. Por lo tanto, fue necesario comparar las muestras individuales tomadas antes y después de la intervención para comprender qué compuestos se incrementaron realmente con ella. El único metabolito que aumentó consistentemente después del tratamiento fue el ácido fenilacético, un catabolito microbiano de flavan-3-ols24 que se ha encontrado en el plasma de individuos en estudios agudos del consumo de alimentos ricos en fenólicos14,25. La mayoría de los estudios que han identificado y cuantificado metabolitos fenólicos en plasma fueron estudios agudos, en los que se monitorizaron las concentraciones de compuestos durante las 24 h posteriores al consumo de la harina rica en fenólicos, observándose que, a partir de las 24 h, sus concentraciones se situaban cerca del valor basal19,25. Por lo tanto, es comprensible que las muestras analizadas en el presente trabajo mostraran bajos números y concentraciones de metabolitos fenólicos. Recientemente, Zhang et al.25 evaluaron el consumo de frambuesa roja, tanto en estudios agudos como después de 4 semanas de suplementación. Observaron que tanto las intervenciones agudas como las crónicas aumentaron los compuestos fenólicos y sus metabolitos, mientras que después de la suplementación de 4 semanas, la concentración plasmática basal de algunos metabolitos aumentó (urolitinas, ácidos cinámico, fenilpropiónico e hipúrico) y de otros disminuyó (derivados conjugados de antocianinas).
Un examen final del método desarrollado en el presente documento muestra que, en la mayoría de las partes, era muy adecuado para el objetivo para el que fue creado. El pretratamiento de la muestra fue simple y efectivo, y se logró la separación UPLC y la identificación semi-dirigida MS/MS de metabolitos fenólicos. Este método semi-dirigido puede ser útil como un primer enfoque de detección para identificar compuestos fenólicos que pueden ser absorbidos de diferentes matrices alimentarias, así como los metabolitos fenólicos presentes en el plasma humano. Además, el protocolo es útil porque permite la identificación cuando no se dispone de estándares de compuestos fenólicos o metabolitos. Finalmente, el método utiliza una pequeña cantidad de plasma, que es crítica en la mayoría de los estudios in vivo donde las muestras de plasma son escasas. Sin embargo, se recomienda que, para futuros estudios, se realice un estudio agudo antes de la intervención crónica para identificar mejor los principales compuestos fenólicos y metabolitos absorbidos de los alimentos especialmente formulados.
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Disclosures
Todos los autores declaran no tener conflicto de intereses.
Acknowledgments
Los autores agradecen el apoyo financiero del CONACYT, México (CB- 2016-01-286449) y UACJ-PIVA (Proyectos 313-17-16 y 335-18-13). OAMB desea agradecer al CONACYT por su beca de doctorado. Se agradece el apoyo técnico de la oficina de Producción Multimedia de la UACJ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Tedia | Al1129-001 | LC Mass spectrometry |
| Autosampler | Agilent Technologies | G4226A | 1290 Infinity series |
| C18 reverse phase column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse plus C18 2.1x50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD |
| Centrifuge | Eppendorf | 5452000018 | Mini Spin; Rotor F-45-12-11 |
| Column compartment with thermostat | Agilent Technologies | G1316C | 1290 Infinity series |
| Diode Array Detector (UV-Vis) | Agilent Technologies | G4212B | 1260 Infinity series |
| Electrospray ionnization source | Agilent Technologies | G3251B | Dual sprayer ESI source |
| Formic acid | J.T. Baker | 0128-02 | Baker reagent, ACS |
| Mass Hunter Data Acquisition | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Qualitative Analysis | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Microcentrifuge tube | Brand | BR780546 | Microcentrifuge tube, 2 mL with lid |
| Pure ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-1L | 200 proof, for molecular biology |
| Q-TOF LC/MS | Agilent Technologies | G6530B | 6530 Accurate Mass |
| Quaternary pump | Agilent Technologies | G4204A | 1290 Infinity series |
| Syringe filter | Thermo Scientific | 44514-NN | 17 mm, 0.45 μm, nylon membrane |
| Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | 1290 Infinity series |
| Vial | Agilent Technologies | 8010-0199 | Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps |
| Vial insert | Agilent Technologies | 5183-2089 | Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical |
| Water | Tedia | WL2212-001 | LC Mass spectrometry |
References
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