Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist es, phenolische Metaboliten im Plasma mit einer semi-zielgerichteten Chromatographie-Massenspektrometrie-Methode nachzuweisen.
Abstract
Einer Gruppe von 23 älteren Personen wurden funktionelle Mahlzeiten (ein Getränk und ein Muffin) verabreicht, die speziell zur Vorbeugung von Sarkopenie (altersbedingter Verlust von Muskelmasse) entwickelt wurden. Plasmaproben wurden zu Beginn des Eingriffs und nach 30 Tagen des Verzehrs der funktionellen Mahlzeiten entnommen. Eine semi-zielgerichtete Ultra-Hochleistungschromatographie in Verbindung mit Tandemmasse (UPLC-MS/MS) Analyse wurde durchgeführt, um phenolische Verbindungen und ihre Metaboliten zu identifizieren. Plasmaproteine wurden mit Ethanol ausgefällt und die Proben vor der Injektion in das UPLC-MS/MS-Gerät in der mobilen Phase (1:1 Acetonitril: Wasser) konzentriert und resuspendiert. Die Trennung wurde mit einer C18-Umkehrphasensäule durchgeführt, und Verbindungen wurden anhand ihrer experimentellen Masse, Isotopenverteilung und ihres Fragmentmusters identifiziert. Zinseszinsverläufe wurden mit denen von Datenbanken und der internen Semi-Targeting-Bibliothek verglichen. Vorläufige Ergebnisse zeigten, dass die wichtigsten Metaboliten, die nach der Intervention identifiziert wurden, Phenylessigsäure, Glycitin, 3-Hydroxyphenylvaleriansäure und Gomisin M2 waren.
Introduction
Sarkopenie ist eine fortschreitende Skeletterkrankung, die mit einem beschleunigten Muskelverlust in der älteren Bevölkerung zusammenhängt. Dieser Zustand erhöht das Sturzrisiko und führt zu eingeschränkten Aktivitäten des täglichen Lebens. Sarkopenie ist bei etwa 5%-10% der Personen über 65 Jahre und etwa 50% der Personen im Alter von 80 Jahren oder älter vorhanden1. Für die Behandlung von Sarkopenie wurden keine spezifischen Medikamente zugelassen, daher ist eine Prävention mit körperlicher Aktivität und einer ausgewogenen Ernährung wichtig1,2. Ernährungsinterventionen mit speziell formulierten Lebensmitteln, die mit Milchprotein und essentiellen Aminosäuren angereichert sind, haben positive Ergebnisse bei der Prävention von Sarkopenie gezeigt2. In anderen Studien haben die Autoren Vitamine und Antioxidantien wie Vitamin E und Isoflavone in die Ernährung aufgenommen, was die Vorteile für den Muskelaufbau an Taille und Hüfte erhöht3.
Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) ist ein Baum, der in den mexikanischen tropischen Regionen wächst; Es wurde aufgrund seines hohen Nährwerts von Maya-Kulturen konsumiert4. Es ist eine gute Quelle für Protein, Ballaststoffe, Mineralien und phenolische Antioxidantien wie Chlorogensäure5. Da es zu Pulver gemahlen und in Backwaren verwendet oder in Getränken konsumiert werden kann, haben neuere Studien die Einarbeitung von Ramón-Samenmehl (RSF) in verschiedene Lebensmittel untersucht, um deren Nährwert zu verbessern. Es wurde ein mit RSF ergänztes Getränk mit Cappuccinogeschmack formuliert, das reich an Ballaststoffen war und mehr als 6 g Protein pro Portion enthielt und von den Verbrauchern sehr akzeptiert wurde. Daher wurde es als mögliche Alternative zur Erfüllung spezieller Ernährungsbedürfnisse angesehen6. In einer Folgestudie wurde RSF auch verwendet, um einen Muffin und ein neues Getränk zu formulieren, das reich an Protein, Ballaststoffen, Mikronährstoffen und phenolischen Antioxidantien ist. Der Muffin und das Getränk wurden in einer diätetischen Intervention für ältere Menschen verwendet, die beide Produkte 30 Tage lang zweimal täglich konsumierten. Nach diesem Zeitraum verbesserte sich der ernährungsphysiologische und sarkopenische Status der Teilnehmer und der Gesamtphenolgehalt des Plasmas nahm zu7. Die Bestimmung der gesamten phenolischen Verbindungen im Plasma wurde jedoch mit einem spektralphotometrischen Verfahren durchgeführt, so dass eine Identifizierung der tatsächlich absorbierten phenolischen Verbindungen nicht möglich war; Darüber hinaus ist diese Methode nicht vollständig spezifisch für phenolische Verbindungen, so dass eine gewisse Überschätzung auftreten kann8.
Die Identifizierung und Quantifizierung der phenolischen Verbindungen, die nach dem Verzehr von Lebensmitteln, die reich an diesen Antioxidantien sind, absorbiert werden, ist eine schwierige Aufgabe, aber notwendig, um die biologische Aktivität dieser sekundären Pflanzenstoffe nachzuweisen. Die Bioverfügbarkeit der meisten phenolischen Verbindungen ist gering; Weniger als 5% von ihnen können ohne strukturelle Transformation im Plasma gefunden werden. Phenolische Verbindungen durchlaufen mehrere Biotransformationen wie Methylierung, Sulfonierung oder Glucuronidierung, die von Enterozyten und Hepatozyten durchgeführt werden9. Phenolische Verbindungen werden auch von der Mikrobiota in bakterielle Katabolite umgewandelt, die nach der Aufnahme in das Plasma ihre wohltuende Wirkung im Körper entfalten können10. Zum Beispiel ist Phenylessigsäure ein Produkt der bakteriellen Umwandlung von Flavonoiden und oligomeren Proanthocyanidinen, die nach dem Cranberry-Verzehr bis zu 40% der Adhäsion von Bakterien (Escherichia coli) in den Harnwegen hemmen können11.
Die strukturelle Vielfalt der natürlich vorkommenden phenolischen Verbindungen, die der Vielfalt ihrer Metaboliten und ihrer geringen Bioverfügbarkeit hinzugefügt wird, macht ihre Identifizierung im Plasma noch schwieriger. Die metabolomische Profilerstellung unter Verwendung spektroskopischer Analyseplattformen wie Kernspinresonanz (NMR) und Tandem-Massenspektroskopie (MS/MS) ist wahrscheinlich der beste Ansatz, um dieses Ziel zu erreichen. Leider sind die Geräte nicht leicht zugänglich, und die Entwicklung von Analyseprotokollen ist immer noch begrenzt12. Mehrere Studien haben über MS/MS in Verbindung mit einem Trennsystem (z. B. Flüssigkeitschromatographie) als Strategie zur Verringerung der Komplexität von Massenspektren in metabolomischen Studien berichtet. Die jüngste Einführung von UPLC-Trennmethoden (Ultra-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) hat die Analysezeit verkürzt und die Auflösung und Empfindlichkeit im Vergleich zu herkömmlichen Hochleistungs-Flüssigkeitsprotokollen erhöht, so dass UPLC-MS/MS-Systeme von der analytischen Metabolomik-Community schnell akzeptiert wurden13. Auf diese Weise haben einige Studien phenolische Metaboliten untersucht und glucuronidierte Derivate aus Kaffeesäure, Quercetin und Ferulasäure sowie sulfonierte Derivate aus Spritz- und Vanillsäure im Plasma von Personen nach der Aufnahme von Cranberry nachgewiesen14. Frühere Protokolle haben beabsichtigt, phenolische Verbindungen und phenolische Metaboliten in Bioflüssigkeiten wie Plasma zu finden. Diese Protokolle basierten auf der Identifizierung und Quantifizierung durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), die an einen UV-Vis-Detektor gekoppelt war15. Solche Protokolle erfordern jedoch die Verwendung authentischer Standards, um die absolute Identifizierung und genaue Quantifizierung zu bewerten. Eine breite Palette von Studien hat die häufigsten Metaboliten in Biofluiden (sulfonierte, glucuronidierte und methylierte Formen) durch UPLC-MS und UPLC-MS/MS identifiziert; Ein großer Teil der bakteriellen Metaboliten wurde jedoch aufgrund fehlender Datenbanken, die ihre vollständigen Informationen enthalten, nicht gemeldet16. Die Identifizierung von Metaboliten wird durch die Kosten und die kommerzielle Verfügbarkeit von Metabolitenstandards erschwert. Daher kann die beste Strategie eine ungezielte oder semi-zielgerichtete MS/MS-Metabolitenanalyse sein, die sich auf die Verwendung molekularer Merkmalsinformationen (m/z, monoisotopengenaue Masse, Isotopenverteilung und Fragmentierungsmuster) stützt, um die chemische Identität zu bestimmen und sie mit frei verfügbaren Online-Datenbanken zu vergleichen, die Polyphenolmetaboliten enthalten, die nach dem Verbrauch von Polypolyphenol-Richts in Biofluiden identifiziert wurden12 . Die wichtigsten Datenbanken, die in UPLC-MS/MS-Studien zur Identifizierung phenolischer Verbindungen und ihrer Metaboliten verwendet werden, sind die Human Metabolome Database (HMDB), die LipidBlast Library, die METLIN Library und andere ergänzende Datenbanken wie PubChem, ChemSpider und Phenol Explorer17.
In der vorliegenden Studie wurde eine semi-zielgerichtete UPLC-MS/MS-Methode entwickelt, um die Plasmaproben der Gruppe älterer Personen zu analysieren, die an der RSF-haltigen Muffin- und Getränkekonsumstudie beteiligt waren7. Daten aus verschiedenen kostenlosen Online-Datenbanken von Plasmametaboliten wurden gesammelt und in eine spezialisierte Datenbank integriert. Auf diese Datenbank kann die Gerätesoftware automatisch zugreifen, um die polyphenolischen Metaboliten in den fünf Plasmaproben vor und nach der 30-tägigen Ernährungsintervention zu identifizieren. Dies geschieht, um die wichtigsten phenolischen Verbindungen oder ihre Metaboliten zu identifizieren, die aus den speziell formulierten funktionellen Lebensmitteln zur Vorbeugung von Sarkopenie absorbiert werden.
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Protocol
Die in diesem Protokoll verwendeten Plasmaproben wurden in einer früheren Studie nach allen ethischen Richtlinien gesammelt und von der Institutionellen Ethik- und Bioethikkommission (CIEB-2018-1-37) der Universidad Autónoma de Ciudad Juárez genehmigt. Das vollständige Protokoll für die Extraktion und Identifizierung der phenolischen Verbindungen und Metaboliten im Plasma durch UPLC-MS/MS ist in Abbildung 1 dargestellt.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Extraktion und Identifizierung von phenolischen Verbindungen und Metaboliten im Plasma mittels der semi-targeted UPLC-MS/MS-Methode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
1. Probenvorbereitung
- Lagern Sie die Plasmaproben bis zur Analyse bei -80 °C.
- Die Plasmaproben bei Raumtemperatur für 15 min auftauen.
HINWEIS: Die Proben können in ein Wasserbad bei 37 °C gelegt werden, um den Prozess zu beschleunigen (5 min). - Geben Sie 200 μL Plasmaprobe in ein 2-ml-Mikroröhrchen und mischen Sie es mit 1.000 μL reinem Ethanol. Vortex der Plasmaprobe für 30 s.
HINWEIS: Verwenden Sie immer Handschuhe, wenn Sie mit Plasmaproben arbeiten. - Zentrifugieren Sie die Probe bei 6.580 x g für 5 min. Nach der Zentrifugation den Überstand mit einer Mikropipette oder Pasteurpipette sammeln und in ein neues Mikroröhrchen geben. Lagern Sie den Überstand bei 4 °C.
- Mischen Sie das Pellet aus dem vorherigen Schritt mit 1.000 μL 100% Ethanol, wirbeln Sie es für 30 s und zentrifugieren Sie dann bei 6.580 x g für 5 min.
HINWEIS: Das Pellet ist stark verpackt und muss gut resuspendiert werden, um den Kontakt zwischen der Probe und reinem Ethanol sicherzustellen. Die Verwendung einer Mikropipette zum Spülen des Pellets mit Ethanol wird empfohlen. - Nach der Zentrifugation wird der Überstand gesammelt und mit dem zuvor aus Schritt 1.4 erhaltenen Überstand vermischt. in einem 2 ml Mikroröhrchen.
- Entfernen Sie Ethanol aus der Probe, indem Sie reinen Stickstoff (99,997%) bei 135 psi verwenden. Halten Sie die Nadel 1 cm von der Oberseite des Mikroröhrchens entfernt, um Probenverlust zu vermeiden, und spülen Sie, bis die Probe trocken ist. Es wird keine Wärme benötigt, um das Ethanol zu verdampfen.
HINWEIS: Der Stickstofffluss muss niedrig sein, um einen Probenverlust zu vermeiden. Sobald das Ethanol getrocknet ist, halten Sie den Stickstofffluss für mindestens 5 Minuten aufrecht, um die Trockenheit der Probe sicherzustellen. Das Protokoll kann an dieser Stelle pausiert werden; Die Proben müssen bei -20 °C gelagert werden. Vermeiden Sie es, die Proben länger als 12 Stunden zu lagern. - Resuspendiert die trockenen Proben in 100 μL einer Mischung aus Acetonitril: Wasser in einem Verhältnis von 50:50 (v:v).
- Filtern Sie die Probe durch eine 0,45 μm Nylon-Spritzenmembran direkt in einen HPLC-Fläschchen-Mikroeinsatz.
HINWEIS: Die Proben in der Durchstechflasche können vor der Analyse bei -20 °C gelagert werden. Lagern Sie die Proben nicht länger als 8 Stunden. Es wird empfohlen, die Proben kurz nach der Filtration in das UPLC-System zu injizieren.
2. UPLC-MS/MS-Analyse
- Injizieren Sie 3 μL Probe auf einen UPLC, der mit einer C18-Umkehrphasensäule (50 mm x 2,1 mm; 1,8 μm) ausgestattet ist. Stellen Sie die Temperatur des Autosamplers auf 20 °C und den Säulenthermostat auf 25 °C ein. Injizieren Sie jede Probe dreifach.
- Verwenden Sie 0,1% (v:v) Ameisensäure in Wasser als Lösungsmittel A und 100% Acetonitril als Lösungsmittel B. Stellen Sie die Durchflussrate auf 0,4 ml/min und ein Gradientenprogramm wie folgt ein: 0-1 min 10% B, 1-4 min 30% B, 4-6 min 38% B, 6-8 min 60% B, 8-8,5 min 60% B, 8,5-9 min 10% B (Tabelle 1).
- Stellen Sie das Massenspektrometer auf Ionisation im negativen Modus. Stickstoff als Trocknungsgas bei 340 °C und einem Durchfluss von 13 l/min verwenden. Stellen Sie den Verneblerdruck auf 60 psi ein. Stellen Sie die Kapillarspannung auf 4.000 V, die Splitterspannung auf 175 V und die Skimmerspannung auf 65 V ein. Verwenden Sie die Kollisionsenergie bei 20 V (Tabelle 2).
- Scannen Sie die Massen zwischen 100-1100 Massen-zu-Ladungs-Verhältnis (m/z) und scannen Sie bei MS/MS Massen zwischen 50-1000 m/z (Tabelle 2). Legen Sie die Datenerfassung auf den automatischen MS/MS-Modus fest. Verwenden Sie die folgende Bezugsmasse: 119,036 und 966,0007.
| Zeit (min) | Lösungsmittel A (0,1 % Ameisensäure in HPLC-Wasser) | Lösungsmittel B (100 % Acetonitril) |
| 0 bis 1 | 90 | 10 |
| 1 bis 4 | 70 | 30 |
| 4 bis 6 | 62 | 38 |
| 6 bis 8 | 40 | 60 |
| 8 bis 8,5 | 40 | 60 |
| 8,5 bis 9 | 90 | 10 |
Tabelle 1: Mobiler Phasengradient, der von UPLC zur Trennung phenolischer Verbindungen verwendet wird.
| Ionisationsmodus | Negativ |
| Trocknungsgas | Stickstoff bei 340 °C, Durchfluss 13 l/min |
| Verneblerdruck | 60 psi |
| Kapillarspannung | 175 V |
| MS-Scan-Massen | 100-1100 m/z |
| MS/MS-Scanmassen | 50-1000 m/z |
Tabelle 2: Ionisationsparameter für die MS/MS-Analyse.
3. Datenbankaufbau
- Suchen Sie in der wissenschaftlichen Literatur nach phenolischen Verbindungen, phenolischen Metaboliten oder anderen interessanten Verbindungen.
- Öffnen Sie die Datenbankverwaltungssoftware, die im UPLC-System enthalten ist. Wählen Sie Datei | Neue PCDL-| (Personal Database Compound Library) Erstellen Sie eine neue PCDL. Wählen Sie den Typ von PCDL: LC/MS Metabolomics. Legen Sie einen Namen für die PCDL fest. Wählen Sie dann Erstellen aus.
- Wählen Sie in der Symbolleiste PCDL und dann die Option Bearbeitung zulassen aus. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Verbindungen suchen .
HINWEIS: Da es sich um eine neue PCDL handelt, sind die Tabellenergebnisse leer. Dies wird sich ändern, sobald neue Verbindungen in die PCDL aufgenommen werden.- Fügen Sie der spezialisierten zusammengesetzten Bibliothek der persönlichen Datenbank Verbindungen hinzu, indem Sie sie aus der allgemeinen Bibliothek des Instruments kopieren. Öffnen Sie die vorhandene Datenbank des Instruments, die in der Datenbankverwaltungssoftware enthalten ist. Klicken Sie auf die Schaltfläche Verbindungen suchen. Geben Sie in der Option Einzelne Suche die Kriterien für die zusammengesetzte Suche ein, um den Zinseszins zu finden.
HINWEIS: Verbindungen können nach Name, Summenformel, genauer Masse und Retentionszeit gefunden werden. - Wählen Sie in der Tabelle zusammengesetzte Ergebnisse den Zinseszins aus. Wenn Sie mehr als eine Verbindung auswählen möchten, klicken Sie auf die erste Verbindung, halten Sie die STRG-TASTE gedrückt, und klicken Sie dann auf die einzelnen Zinseszinspartner. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf alle markierten Verbindungen und wählen Sie An PCDL anhängen aus.
- Suchen Sie im neuen Fenster die spezialisierte persönliche Datenbankdatei, und wählen Sie sie aus. Markieren Sie die Kontrollkästchen Spektren für Verbindungen einschließen, falls vorhanden, und Informationen zur Ionenmobilität für Verbindungen einschließen, falls vorhanden. Klicken Sie auf die Schaltfläche Anhängen. Wählen Sie im neuen Dialogfeld Ja aus, um die neu hinzugefügten Verbindungen zu überprüfen. Wählen Sie Nein aus, um weiter nach weiteren Zinseszinsgruppen zu suchen.
- Fügen Sie der spezialisierten zusammengesetzten Bibliothek der persönlichen Datenbank Verbindungen hinzu, indem Sie sie aus der allgemeinen Bibliothek des Instruments kopieren. Öffnen Sie die vorhandene Datenbank des Instruments, die in der Datenbankverwaltungssoftware enthalten ist. Klicken Sie auf die Schaltfläche Verbindungen suchen. Geben Sie in der Option Einzelne Suche die Kriterien für die zusammengesetzte Suche ein, um den Zinseszins zu finden.
- Wenn die interessierenden Verbindungen nicht in der allgemeinen Bibliothek des Instruments verfügbar sind, fügen Sie neue Verbindungen manuell hinzu.
- Öffnen Sie die spezialisierte persönliche Datenbank. Führen Sie nach dem Öffnen Schritt 3.3 aus. Wählen Sie die Option Verbindungen bearbeiten aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Neu hinzufügen .
- Geben Sie im oberen Bereich des Fensters die Informationen für die neue Verbindung ein. Geben Sie die Formel, den Namen, den IUPAC-Namen, die CAS-Nummer, die Chemspider-ID und andere Identifikatoren ein.
- Verwenden Sie die Informationen, die in den kostenlosen Online-Bibliotheken (Chemspider, PubChem und Phenol Explorer) verfügbar sind, um die Informationen für den neuen Zinseszins auszufüllen. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Als neu speichern, um die neuen zusammengesetzten Informationen in der spezialisierten persönlichen Datenbank zu speichern.
HINWEIS: Wenn Sie Informationen aus freien Bibliotheken hinzufügen, achten Sie darauf, die Verbindungsinformationen ohne das Vorhandensein von Chlorid- oder Jodidionen anzugeben. Dies kann die genaue Masse und die Summenformel der interessierenden Verbindung verändern.
- Wiederholen Sie den Vorgang mit allen Zinseszinspartnern, um die spezialisierte persönliche Datenbank zu vervollständigen.
4. Datenanalyse
- Verwenden Sie die qualitative Manager-Software des Instruments, um die in den Proben vorhandenen phenolischen Verbindungen und phenolischen Metaboliten zu identifizieren.
- Öffnen Sie die Beispieldatei. Wählen Sie im Bedienfeld "Chromatogramm" die Option " Chromatogramme definieren" und extrahieren Sie das Gesamtionenchromatogramm (TIC), das extrahierte Ionenchromatogramm von MS (EIC) und das EIC von MS/MS. Wählen Sie die Option Chromatogramm integrieren aus.
- Wählen Sie im Bedienfeld "Verbindungen suchen" die Option "Nach Formeloptionen suchen". Wählen Sie im neuen Fenster Formelquelle und dann die Option Datenbank/Bibliothek aus. Suchen Sie die zuvor erstellte persönliche Datenbank und klicken Sie auf Öffnen.
- Wählen Sie die Option Formelübereinstimmung und legen Sie eine Massenübereinstimmungstoleranz von 5 Teilen pro Million (ppm) fest.
HINWEIS: Eine andere Übereinstimmungstoleranz der Massen kann auf 10 ppm eingestellt werden. Dieser Unterschied hängt vom verwendeten Massenspektrometer ab. - Wählen Sie die Option Negative Ionen und dann nur das Dialogfeld -H aus. Markieren Sie in der Option Ergebnisse die Dialogfelder EIC extrahieren, Bereinigtes Spektrum extrahieren, Rohspektrum extrahieren und Struktur einschließen .
- Wählen Sie die Option Ergebnisfilter aus. Markieren Sie Warnung, wenn die Punktzahl ist, und legen Sie die Punktzahl auf 80,00% fest. Markieren Sie Nicht übereinstimmen, wenn die Punktzahl ist, und legen Sie die Punktzahl auf 75,00 % fest.
HINWEIS: Die Übereinstimmungs-/Nichtübereinstimmungswerte können bei Bedarf in niedrigere Werte geändert werden. Dadurch wird die Genauigkeit der Identifizierung verringert. - Klicken Sie auf die Schaltfläche Verbindungen nach Formel suchen , um Verbindungen von Interesse in der Probe zu identifizieren.
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Representative Results
Der schrittweise Prozess zur Identifizierung phenolischer Metaboliten durch die semi-gezielte UPLC-MS/MS-Analyse von Plasmaproben im negativen Modus ist in Abbildung 2 dargestellt. Zuerst wurde das Gesamtionenchromatogramm (TIC) aus dem Plasmaphenolextrakt (erhalten nach Proteinausfällung der gesamten Plasmaprobe) durch die qualitative Software des Instruments erhalten. Dann wurde das extrahierte Ionenchromatogramm verwendet, und das genaue Massen- und Fragmentierungsmuster (MS / MS-Analyse) jedes Signals (oder molekularen Merkmals) wurde mit denen einer spezifischen persönlichen Datenbank verglichen, die ebenfalls in der Software des Instruments erstellt wurde. Signalen mit einer Massenübereinstimmung von weniger als 5 ppm wurde eine Summenformel aus der Datenbank zugeordnet. Schließlich wurde die Isotopenverteilung jedes Signals mit der der zugewiesenen Summenformel verglichen, um die endgültige vorläufige Identifizierung zu erreichen. Verbindungen, die a) nur in einem Replikat identifiziert wurden oder b) eine Fläche von weniger als 10.000 aufwiesen, wurden als falsche Identifizierungen behandelt. Aus dieser Analyse wurden insgesamt 25 phenolische Verbindungen und Metaboliten in den Plasmaproben identifiziert (Tabelle 3). In dieser Liste wurden sowohl phenolische Verbindungen als auch ihre Metaboliten, wie 3-Hidrooxyphenylvalersäure und Isopropyl-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-hydroxypropanoat, gefunden. Da der negative Ionisationsmodus für alle Klassen phenolischer Verbindungen, mit Ausnahme von Anthocyanen, am besten geeignet ist, konnten diese Verbindungen mit dem vorliegenden Verfahren nicht nachgewiesen werden. Wenn Anthocyane wichtige Bestandteile der Nahrungsmatrix sind, sollte auch der positive Modus verwendet werden.
| Phenolische Metaboliten | R.T. (min) | Formel | Vorläufer | Experimentelle Masse | Theoretische Masse | Differenz (ppm) | |
| 2,3-Dihydroxybenzoesäure | 0.622 | C7H6O4 | 153.0203 | 154.0273 | 154.0266 | 4.2 | |
| 2-Hydroxyhippursäure | 8.631 | C18H33NO4 | 410.1648 | 411.1725 | 411.1717 | 1.8 | |
| 3,4-Dihydroxytoluol | 2.239 | C7H8O2 | 123.0451 | 124.0524 | 124.0524 | -0.25 | |
| 3-Hydroxyphenylvalersäure | 6.717 | C11H14O3 | 193.0874 | 194.0947 | 194.0943 | 2.12 | |
| 5-(3',4'-dihydroxyphenyl)-Valeriansäure | 4.293 | C11H14O4 | 209.0823 | 210.0894 | 210.0892 | 0.68 | |
| 6-Hydroxyenterodiol | 9.201 | C18H22O5 | 317.1387 | 318.1465 | 318.1467 | -0.65 | |
| Ajugol | 3.889 | C15H24O9 | 347.134 | 348.1418 | 348.142 | -0.59 | |
| Benzoesäure | 3.915 | C7H6O2 | 121.0296 | 122.0367 | 122.0368 | -0.28 | |
| Carnosinsäure | 6.785 | C20H28O4 | 331.1905 | 332.1979 | 332.1988 | -2.58 | |
| Carnosol | 6.347 | C20H26O4 | 329.1764 | 330.1842 | 330.1831 | 3.43 | |
| Katechol | 0.892 | C6H6O2 | 109.0297 | 110.037 | 110.0368 | 1.91 | |
| Glycitin | 6.01 | C22H22O10 | 445.1155 | 446.1228 | 446.1213 | 3.4 | |
| Hesperetin | 6.01 | C16H14O6 | 301.0718 | 302.0796 | 302.079 | -1.81 | |
| Hippursäure | 1.396 | C9H9NO3 | 178.051 | 179.058 | 179.0582 | -1.16 | |
| Homovanillinsäure | 0.823 | C9H10O4 | 181.0503 | 182.0576 | 182.0579 | -1.88 | |
| Isopropyl-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-hydroxypropanoat | 6.177 | C12H16O5 | 239.0926 | 240.0999 | 240.0998 | 0.48 | |
| Phenylessigsäure | 5.666 | C8H8O2 | 135.0444 | 136.0518 | 136.0524 | -4.92 | |
| Phloretinsäure | 2.811 | C9H10O3 | 165.0556 | 166.0626 | 166.063 | -2.41 | |
| Protokatechuischer Aldehyd | 1.094 | C7H6O3 | 137.0247 | 138.0311 | 138.0317 | -4.5 | |
| Secoisolariciresinol | 8.837 | C20H26O6 | 361.1656 | 362.1729 | 362.1729 | -0.23 | |
| Vanillin | 2.508 | C8H8O3 | 151.04 | 152.0471 | 152.0473 | -1.82 | |
| Epicatechin 3'-O-glucuronid | 9.342 | C21H22O12 | 465.1024 | 466.109 | 466.1111 | -4.64 | |
| Gomisin M2 | 5.234 | C22H26O6 | 385.1676 | 386.1746 | 386.1729 | 4.38 | |
| Irisolidon | 6.145 | C17H14O6 | 313.0727 | 314.0798 | 314.079 | 2.33 | |
| Urolithin C | 6.753 | C13H8O5 | 243.0294 | 244.0368 | 244.0372 | -1.69 | |
Tabelle 3: Vorläufige Identifizierung von phenolischen Verbindungen und Metaboliten in Plasmaproben mittels der semi-zielgerichteten UPLC-MS/MS-Methode.
Um die Wirksamkeit der entwickelten Methode zur Identifizierung der wichtigsten phenolischen Verbindungen oder ihrer Metaboliten, die aus dem RSF-haltigen Muffin und Getränk resorbiert wurden, zu bewerten, wurden fünf aleatorische Proben der Studienteilnehmer analysiert, die vor und nach der 30-tägigen Intervention erhalten wurden. Die relative Häufigkeit jeder Verbindung wurde berechnet, indem die Fläche unter der Kurve (AUC) nach der Behandlung durch die AUC vor der Behandlung geteilt wurde. Aus dieser Analyse konnte beobachtet werden, dass einige Verbindungen nur in den vor der Behandlung erhaltenen Proben auftraten, andere unverändert blieben, während einige von ihnen nach dem Verzehr der funktionellen Lebensmittel zunahmen. Tabelle 4 zeigt die Liste der 12 phenolischen Verbindungen, die nach dem 30-tägigen Verzehr der RSF-haltigen Lebensmittel einen Anstieg des Plasmas zeigten. Phenylessigsäure war der einzige Metabolit, der nach der Behandlung konsistent in höheren Konzentrationen gefunden wurde. Glycitin, ein glykosyliertes Isoflavon, und 3-Hydroxyphenylvalersäure (ein phenolischer Metabolit) nahmen in drei der fünf Proben zu, nahmen aber in den anderen beiden ab. Gomisin M2, ein Lignan, wurde in drei der fünf Proben erst nach der Ernährungsintervention nachgewiesen. Die anderen phenolischen Verbindungen (wie Hesperetin, Secoisosolariciresinol und Vanillin) und Metaboliten (wie 2-Hydroxyhippursäure) wurden nur in einer Probe und erst nach der Behandlung gefunden.
| Probe (AUC nach der Behandlung/AUC vor der Behandlung) | |||||||
| Verbindung | Formel | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| 2-Hydroxyhippursäure | C18H33NO4 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| 3-Hydroxyphenylvalersäure | C11H14O3 | 1.30 | 2.69 | 2.69 | 0.62 | 0.62 | |
| 6-Hydroxyenterodiol | C18H22O5 | Nd | Nd | T | Nd | Nd | |
| Glycitin | C22H22O10 | 1.88 | 1.07 | 1.07 | 0.43 | 0.45 | |
| Hesperetin | C16H14O6 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Phenylessigsäure | C8H8O2 | 4.06 | T | T | T | 1.28 | |
| Phloretinsäure | C9H10O3 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Protokatechuischer Aldehyd | C7H6O3 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Secoisolariciresinol | C20H26O6 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Vanillin | C8H8O3 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Gomisin M2 | C22H26O6 | Nd | T | T | T | Nd | |
Tabelle 4: Liste der phenolischen Verbindungen, die im Plasma älterer Menschen nach 30-tägigem Verzehr von RSF-haltigen Lebensmitteln zunahmen. Die Daten sind die Verhältnisse der Häufigkeit (AUC) jeder Verbindung nach der Behandlung im Vergleich zu ihrer Häufigkeit vor der Behandlung. T zeigt an, dass die Verbindung erst nach der Behandlung in der Probe identifiziert wurde. Nd: nicht erkannt.
Abbildung 2: Protokoll zur Identifizierung von phenolischen Stoffmetaboliten durch semi-zielgerichtete UPLC-MS/MS. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Identifizierung und Quantifizierung der bioaktiven Phytochemikalien, die nach dem Verzehr eines Lebensmittels oder Nahrungsergänzungsmittels absorbiert werden, ist entscheidend für den Nachweis und das Verständnis der gesundheitlichen Vorteile dieser Verbindungen und der Lebensmittel, die sie enthalten. In der vorliegenden Arbeit wurde die UPLC-MS/MS-Methode entwickelt, die nur auf die Identifizierung der wichtigsten phenolischen Verbindungen und ihrer Metaboliten abzielt, deren Konzentration im Plasma nach einer 30-tägigen Ernährungsintervention mit zwei speziell für ältere Menschen formulierten Lebensmitteln zunahm. Es wurde angenommen, dass, wenn eine Verbindung erst nach der Interventionsdauer zunahm oder im Plasma auftrat, diese Verbindung aus den bei der Intervention verwendeten Lebensmitteln resorbiert und/oder biotransformiert worden war.
UPLC-MS/MS ist eine der bevorzugten Technologien für metabolomische Studien, bei denen viele niedermolekulare Verbindungen gleichzeitig in komplexen Proben analysiert werden, um die Wirkung einer Behandlung oder einer Umweltveränderung zu bewerten13. Dies kann durch gezielte und nicht zielgerichtete (oder globale) Methoden erfolgen. Gezielte Analysen konzentrieren sich auf eine bekannte, kleine Anzahl von Metaboliten von Interesse. Sie sind die beste Option für die Quantifizierung von Verbindungen mit verfügbaren Standards und bieten die beste Spezifität und Sensitivität; Diese Methoden müssen jedoch gründlich für die ausgewählten Metaboliten optimiert werden und sind nicht in der Lage, unerwartete Verbindungen in den Proben nachzuweisen12. In anderen Studien wurde HPLC in Verbindung mit einem UV-Vis-Detektor verwendet, um Phenolsäuren und Metaboliten im Plasma zu identifizieren, aber diese Art von Studie hat analytische Standards verwendet, um die Verbindung von Interesse zu identifizieren und zu quantifizieren15. In einer anderen Studie wurde die Hinzufügung eines internen Standards vorgeschlagen18; In dieser Arbeit wurden jedoch nur Ferula- und Kaffeesäuren und ihre Metaboliten analysiert. Andererseits wurde die Synthese interner Standards phenolischer Metaboliten als Alternative zum Fehlen kommerzieller analytischer Standards vorgeschlagen19. Dennoch ist die Synthese einer Vielzahl von phenolischen Verbindungen schwierig, zeitaufwendig und teuer. Nicht zielgerichtete Methoden versuchen, so viele molekulare Verbindungen wie möglich nachzuweisen und zu identifizieren, und sind in erster Linie hypothesengenerierend12. Sie können mehrere hundert Verbindungen in einer Probe identifizieren, indem sie Formeln zu nachweisbaren chromatographischen Signalen mit charakteristischen Merkmalen wie m / z oder gemessener genauer Masse, chromatographischer Retentionszeit, Isotopenfingerabdruck usw. zuweisen, so dass die durch diese Analysen erzeugten Daten sehr reichlich vorhanden sind und schwer zu interpretieren sein können20 . Da das Ziel der vorliegenden Methode nicht darin bestand, ein vollständiges metabolisches Profil der Plasmaproben zu erhalten (was ein ungezielter Ansatz wäre), sondern darin, die wichtigsten phenolischen Verbindungen und phenolischen Metaboliten (bisher unbekannt) in ihnen zu identifizieren, wurde ein semi-gezielter Ansatz entwickelt. Dazu wurden alle identifizierten Signale automatisch mit der Software des Instruments extrahiert und dann mit einer selbst erstellten Datenbank verglichen, die 645 phenolische Verbindungen und ihre Metaboliten enthielt, die aus kostenlosen Online-Datenbanken gewonnen wurden. Die Datenbank enthielt Referenz-MS/MS-Fragmentierungsmuster der Verbindungen, die für die Zuweisung des Verbindungsnamens und der Formel verwendet wurden, was eine genauere Identifizierung der Verbindungen in der Stichprobe ermöglicht12.
Die kritischsten Schritte im Protokoll waren 1) Probenvorbehandlung (Extraktion und Konzentration von phenolischen Verbindungen und Metaboliten aus Plasmaproben); 2) den Aufbau einer vollständigen und spezifischen Datenbank für die semi-zielgerichtete Analyse der Proben und die Identifizierung aller möglichen Verbindungen, die zu einer bestimmten Verbindungsklasse gehören; und 3) die Auswahl der Parameter, die von der qualitativen Software des Instruments verwendet werden (Massenübereinstimmungstoleranz ppm und Score%), um die Verbindungen in der Probe genau zu identifizieren. Bei der Probenvorbehandlung ist Vorsicht geboten, um den Verlust der interessierenden Verbindungen zu vermeiden, sie in einer hohen Endkonzentration zurückzugewinnen und störende Verbindungen eliminieren zu können. Bei der Erstellung der spezifischen Datenbank ist es wichtig, eine gründliche Literaturrecherche durchzuführen und dann kostenlose Online-Datenbanken zu verwenden, um spezifische chemische Daten zu erhalten, die für die Identifizierung von Verbindungen in der Probe verwendet werden. Die Auswahl der besten Werte für Massenübereinstimmung und Score erforderte eine vorherige Validierung der Analysemethode unter Verwendung von Standards und bekannten Proben21,22.
Sobald das Protokoll implementiert war, waren die häufigsten Probleme und ihre empfohlenen Lösungen die folgenden: 1) In den Proben wurden keine Verbindungen identifiziert. Dies war auf die geringe Konzentration der Verbindungen zurückzuführen und konnte gelöst werden, indem die Probe getrocknet und in einem kleineren Volumen wieder aufgelöst wurde. 2) Signale erschienen im TIC, aber Verbindungen wurden nicht identifiziert. Dies könnte auf ein Versagen bei der Massenkalibrierung zurückzuführen sein, so dass der Unterschied zwischen experimentellen und theoretischen Massen hoch war. In diesem Fall sollte die Massenkalibrierung des Instruments entsprechend dem Hersteller und dem Modell des Geräts durchgeführt werden. Ein zweiter Grund könnte eine unvollständige persönliche Datenbank sein, daher ist es wichtig, die Datenbank ständig zu überprüfen und zu pflegen. Massen von Verbindungen, die im Verdacht stehen, von Interesse zu sein, können überprüft und mit frei verfügbaren Online-Datenbanken oder neuer wissenschaftlicher Literatur verglichen werden. 3) Signale erschienen in leeren Läufen. Dies deutet auf eine Kontamination hin und kann durch Reinigen der Autosampler-Nadel und -Säule gelöst werden. Das Standardreinigungsprotokoll besteht darin, einige Läufe mit Methanol, dann Isopropanol und schließlich Acetonitril als mobile Phase durchzuführen. Dann wird die Säule neu ausbalanciert, wobei die mobile Phase mindestens 30 Minuten lang läuft.
Die Hauptschwierigkeiten bei der Entwicklung dieser Art von Methode sind 1) die geringe Bioverfügbarkeit aller sekundären Pflanzenstoffe, einschließlich phenolischer Verbindungen, die sich in sehr niedrigen Plasmakonzentrationen niederschlägt16; 2) die hohe Vielfalt an phenolischen Verbindungen, die in Lebensmitteln vorhanden sind, die durch ihren Stoffwechsel und ihre Biotransformation erhöht wird, die in menschlichen Enterozyten und Hepatozyten und der Kolonmikrobiota auftreten23; 3) das Fehlen von Standards (einige Standards existieren, sind aber sehr schwer zu erhalten) für viele Verbindungen, insbesondere für die Metaboliten, und die Existenz einiger unbekannter oder nicht charakterisierter Verbindungen23; und 4) variable Reaktionen zwischen Individuen, sowohl bei der Absorption als auch beim Metabolismus von sekundären Pflanzenstoffen14. Um das Problem niedriger Plasmakonzentrationen phenolischer Metaboliten zu überwinden, sollten sie extrahiert und konzentriert werden. Dies kann durch Mikro-Festphasenextraktion14 oder, wie in der vorliegenden Arbeit, durch die Zugabe von Lösungsmitteln, die Proteine ausfällen und phenolische Verbindungen und Metaboliten auflösen, erreicht werden, gefolgt von Lösungsmittelverdampfung und Resuspension in einem kleineren Volumen19. Diese Technik ist einfach, wirtschaftlich und für eine kleine Anzahl von Proben geeignet. Die Rückgewinnung interessanter Verbindungen könnte jedoch leicht durch die Verwendung größerer Plasmavolumina verbessert werden, so dass die Endkonzentration aller Verbindungen höher wäre. Die hohe Vielfalt an phenolischen Metaboliten und das Fehlen von Standards ist der Grund, warum ein semi-zielgerichteter Ansatz verwendet wurde, um die durch die Intervention erhöhten Verbindungen zu identifizieren, bevor versucht wurde, sie zu quantifizieren. Durch die Verwendung einer speziell erstellten Datenbank anstelle einer völlig ungezielten Analyse war es möglich, die zahlreichen Primärmetaboliten im Plasma zu ignorieren und sich nur auf die phenolischen Verbindungen und ihre Metaboliten zu konzentrieren. Eine wichtige Einschränkung dieser Datenbank, spezifisch für phenolische Verbindungen und ihre menschlichen Metaboliten, war der Mangel an massenspektralen Informationen für viele Verbindungen und ihre Metaboliten, was die Genauigkeit der Verbindungsidentifizierung verringert.
Eine große Variabilität zwischen Individuen wird regelmäßig in Studien beobachtet, die die Absorption und den Metabolismus phenolischer Verbindungen sowohl quantitativ als auch qualitativ bewerten. In den vorliegenden Ergebnissen präsentierte eine Person 18 Verbindungen in der Plasmaprobe, die nach der Intervention entnommen wurde, während die anderen nur 9 oder 10 zeigten. Darüber hinaus wurden viele phenolische Verbindungen und Metaboliten nur in den Ausgangsproben (vor der Intervention) gefunden, und sie variierten auch zwischen den Individuen. Insgesamt zeigten mehr als die Hälfte der identifizierten Verbindungen höhere Konzentrationen (AUC) vor als nach der Intervention oder wurden nur in den Proben vor der Intervention gefunden. Daher war es notwendig, einzelne Proben zu vergleichen, die vor und nach dem Eingriff entnommen wurden, um zu verstehen, welche Verbindungen dadurch tatsächlich erhöht wurden. Der einzige Metabolit, der nach der Behandlung konsequent zunahm, war Phenylessigsäure, ein mikrobieller Katabolit von Flavan-3-ols24, der im Plasma von Personen in akuten Studien über den Verzehr von phenolreichen Lebensmitteln gefunden wurde14,25. Die meisten Studien, die phenolische Metaboliten im Plasma identifiziert und quantifiziert haben, waren akute Studien, in denen die Verbindungskonzentrationen während der 24 Stunden nach dem Verzehr der phenolreichen Mahlzeit überwacht wurden, wobei beobachtet wurde, dass ihre Konzentrationen nach 24 h nahe dem Basalwert lagen19,25. Daher ist es verständlich, dass die in der vorliegenden Arbeit analysierten Proben eine geringe Anzahl und Konzentration von phenolischen Metaboliten zeigten. Vor kurzem bewerteten Zhang et al.25 den Verzehr von roter Himbeere, sowohl in akuten Studien als auch nach 4 Wochen Supplementierung. Sie beobachteten, dass sowohl akute als auch chronische Interventionen phenolische Verbindungen und ihre Metaboliten erhöhten, während nach der 4-wöchigen Supplementierung die Basalplasmakonzentration einiger Metaboliten (Urolithine, Zinnatomsäuren, Phenylpropionsäuren und Hippursäuren) und anderer abnahm (konjugierte Anthocyanderivate).
Eine abschließende Untersuchung der in der vorliegenden Arbeit entwickelten Methode zeigt, dass sie in den meisten Teilen für das Ziel, für das sie geschaffen wurde, gut geeignet war. Die Probenvorbehandlung war einfach und effektiv, und die UPLC-Trennung und die semi-zielgerichtete MS/MS-Identifizierung von phenolischen Metaboliten wurden erreicht. Diese semi-zielgerichtete Methode kann als erster Screening-Ansatz nützlich sein, um phenolische Verbindungen zu identifizieren, die aus verschiedenen Lebensmittelmatrizen absorbiert werden können, sowie die phenolischen Metaboliten, die im menschlichen Plasma vorhanden sind. Darüber hinaus ist das Protokoll nützlich, da es die Identifizierung ermöglicht, wenn keine Standards aus phenolischen Verbindungen oder Metaboliten verfügbar sind. Schließlich verwendet die Methode eine kleine Plasmamenge, die in den meisten In-vivo-Studien , in denen Plasmaproben knapp sind, von entscheidender Bedeutung ist. Es wird jedoch empfohlen, für zukünftige Studien vor der chronischen Intervention eine akute Studie durchzuführen, um die wichtigsten phenolischen Verbindungen und Metaboliten, die aus den speziell formulierten Lebensmitteln absorbiert werden, besser zu identifizieren.
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Disclosures
Alle Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Die Autoren sind dankbar für die finanzielle Unterstützung von CONACYT, Mexiko (CB- 2016-01-286449) und UACJ-PIVA (Projekte 313-17-16 und 335-18-13). OAMB bedankt sich bei CONACYT für sein Ph.D.-Stipendium. Die technische Unterstützung durch das Multimedia Production Office von UACJ wird dankbar zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Tedia | Al1129-001 | LC Mass spectrometry |
| Autosampler | Agilent Technologies | G4226A | 1290 Infinity series |
| C18 reverse phase column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse plus C18 2.1x50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD |
| Centrifuge | Eppendorf | 5452000018 | Mini Spin; Rotor F-45-12-11 |
| Column compartment with thermostat | Agilent Technologies | G1316C | 1290 Infinity series |
| Diode Array Detector (UV-Vis) | Agilent Technologies | G4212B | 1260 Infinity series |
| Electrospray ionnization source | Agilent Technologies | G3251B | Dual sprayer ESI source |
| Formic acid | J.T. Baker | 0128-02 | Baker reagent, ACS |
| Mass Hunter Data Acquisition | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Qualitative Analysis | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Microcentrifuge tube | Brand | BR780546 | Microcentrifuge tube, 2 mL with lid |
| Pure ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-1L | 200 proof, for molecular biology |
| Q-TOF LC/MS | Agilent Technologies | G6530B | 6530 Accurate Mass |
| Quaternary pump | Agilent Technologies | G4204A | 1290 Infinity series |
| Syringe filter | Thermo Scientific | 44514-NN | 17 mm, 0.45 μm, nylon membrane |
| Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | 1290 Infinity series |
| Vial | Agilent Technologies | 8010-0199 | Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps |
| Vial insert | Agilent Technologies | 5183-2089 | Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical |
| Water | Tedia | WL2212-001 | LC Mass spectrometry |
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