Summary
Målet med detta protokoll är att upptäcka fenolmetaboliter i plasma med hjälp av en halvriktad kromatografi-masspektrometrimetod.
Abstract
En grupp på 23 äldre personer fick funktionella måltider (en dryck och en muffins) speciellt formulerad för förebyggande av sarkopeni (åldersrelaterad förlust av muskelmassa). Plasmaprover togs i början av interventionen och efter 30 dagars konsumtion av funktionella måltider. En halvriktad ultra-högpresterande kromatografi i kombination med tandem massa (UPLC-MS/MS) analys utfördes för att identifiera fenolföreningar och deras metaboliter. Plasmaproteiner fälldes ut med etanol och proverna koncentrerades och återanvändes i den mobila fasen (1:1 acetonitril: vatten) före injektion i UPLC-MS/MS-instrumentet. Separation utfördes med en C18 omvänd fas kolumn, och föreningar identifierades med hjälp av deras experimentella massa, isotopisk fördelning och fragment mönster. Föreningar av intresse jämfördes med databankernas och det interna halvriktade bibliotekets. Preliminära resultat visade att de viktigaste metaboliterna som identifierades efter interventionen var fenylaktisk syra, glycitin, 3-hydroxyfenylvalersyra och gomisin M2.
Introduction
Sarkopeni är en progressiv skelettsjukdom relaterad till en accelererad muskelförlust hos den äldre befolkningen. Detta tillstånd ökar risken för fall och leder till begränsade aktiviteter i det dagliga livet. Sarkopeni förekommer hos cirka 5-10% av personer över 65 år och cirka 50% av personer i åldern 80 år eller äldre1. Inga specifika läkemedel har godkänts för behandling av sarkopeni, så förebyggande med fysisk aktivitet och en välbalanserad kost är viktigt1,2. Näringsmässiga interventioner med speciellt formulerade livsmedel berikade med mejeriprotein och essentiella aminosyror har visat positiva resultat för att förebygga sarkopeni2. I andra studier har författare inkluderat vitaminer och antioxidanter, som E-vitamin och isoflavoner, i kosten, vilket ökar fördelarna för muskelmassa på midjan och höfterna3.
Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) är ett träd som växer i de mexikanska tropiska regionerna; Det har konsumerats av Maya kulturer på grund av dess höga näringsvärde4. Det är en bra källa till protein, fiber, mineraler, och fenoliska antioxidanter, såsom klorogensyra5. Eftersom det kan malas till pulver och användas i bakprodukter eller konsumeras i drycker, har nyligen genomförda studier utvärderat införlivandet av Ramón frömjöl (RSF) i olika livsmedel för att förbättra deras näringsvärde. En RSF-kompletterad cappuccino-smaksatt dryck formulerades, som var hög i kostfiber och hade mer än 6 g protein per portion, och var mycket accepterad av konsumenterna; Således ansågs det vara ett potentiellt alternativ för att uppfylla särskilda kostbehov6. I en uppföljande studie användes RSF också för att formulera en muffins och en ny dryck rik på protein, kostfiber, mikronäringsfariter och fenoliska antioxidanter. Muffins och dryck användes i en diet intervention för äldre individer, som konsumerade båda produkterna två gånger per dag i 30 dagar. Efter denna period förbättrades deltagarnas näringsmässiga och sarkopeniska status och det totala fenolinnehållet i plasma ökade7. Bestämning av totala fenolföreningar i plasma utfördes dock med en spektrofotometrisk metod, så identifiering av de faktiska fenolföreningarna som absorberades var dock inte möjlig. Dessutom är denna metod inte helt specifik för fenolföreningar, så viss överskattning kan uppstå8.
Identifiering och kvantifiering av de fenolföreningar som absorberas efter konsumtion av livsmedel som är rika på dessa antioxidanter är en svår uppgift men är nödvändig för att visa den biologiska aktiviteten hos dessa fytokemikalier. Biotillgängligheten hos de flesta fenolföreningar är låg; mindre än 5% av dem kan hittas utan strukturell omvandling i plasma. Fenolföreningar genomgår flera biotransformationer, såsom metylering, sulfonation eller glukuronidation, som utförs av enterocyter och hepatocyter9. Fenolföreningar är också biotransformerade av mikrobiotan till bakteriella kataboliter som kan utöva sina positiva effekter i kroppen efter att ha absorberats i plasma10. Till exempel är fenylaktisk syra en produkt av bakteriell omvandling av flavonoider och oligomeriska proanthocyanidiner, vilket kan hämma upp till 40% av bakterierna (Escherichia coli) vidhäftning i urinvägarna efter tranbärskonsumtion11.
Den strukturella mångfalden av naturligt förekommande fenolföreningar, som läggs till mångfalden av deras metaboliter och deras låga biotillgänglighet, gör deras identifiering i plasma ännu mer utmanande. Metabolomisk profilering, med hjälp av spektroskopiska analysplattformar som kärnmagnetisk resonans (NMR) och tandemmasspektroskopi (MS/MS), är förmodligen det bästa tillvägagångssättet för att uppnå detta mål. Tyvärr är utrustningen inte lättillgänglig, och utvecklingen av analysprotokoll är fortfarande begränsad12. Flera studier har rapporterat MS/MS i kombination med ett separationssystem (såsom vätskekromatografi) som en strategi för att minska komplexiteten i masspektra i metabolomiska studier. Den senaste introduktionen av ultra-högpresterande vätskekromatografi (UPLC) separationsmetoder har minskat tiden för analys och ökat upplösningen och känsligheten jämfört med konventionella högpresterande vätskeprotokoll, så UPLC-MS / MS-system har snabbt accepterats allmänt av den analytiska metabolomikgemenskapen13. På detta sätt har vissa studier undersökt fenolmetaboliter och upptäckt glukuronidated derivat från koffeinsyra, quercetin och ferulsyra, samt sulfonerade derivat från syringsyra och vanillsyra i plasma av individer efter tranbär intag14. Tidigare protokoll har varit avsedda att hitta fenolföreningar och fenolmetaboliter i biofluider som plasma. Dessa protokoll baserades på identifiering och kvantifiering av högpresterande flytande kromatografi (HPLC) kopplad till en UV-vis detektor15. Sådana protokoll kräver dock användning av autentiska standarder för att bedöma absolut identifiering och korrekt kvantifiering. Ett brett spektrum av studier har identifierat de vanligaste metaboliterna i biofluider (sulfonerade, glukuronidated och metylerade former) av UPLC-MS och UPLC-MS/MS. En stor del av bakteriemetaboliterna har dock inte rapporterats på grund av bristen på databaser som innehåller deras fullständiga information16. Metabolitidentifiering kompliceras av kostnaden och kommersiell tillgänglighet av metabolitstandarder. Därför kan den bästa strategin vara oriktad eller halvriktad MS/MS-metabolitanalys, som bygger på användning av molekylär funktionsinformation (m/z, monoisotopic exakt massa, isotopfördelning och fragmenteringsmönster) för att bestämma den kemiska identiteten och jämför den med fritt tillgängliga onlinedatabaser som innehåller polyfenolmetaboliter som identifieras i biofluider efter konsumtion av polypolyfenolrikar12 . De viktigaste databaserna som används i UPLC-MS/MS-studier för identifiering av fenolföreningar och deras metaboliter är Human Metabolome Database (HMDB), LipidBlast Library, METLIN Library och andra kompletterande databaser, såsom PubChem, ChemSpider och Phenol Explorer17.
I den aktuella studien utvecklades en halvriktad UPLC-MS/MS-metod för att analysera plasmaproverna från den grupp äldre personer som deltar i den RSF-innehållande muffin- och dryckeskonsumtionsstudien7. Data från olika gratis onlinedatabaser av plasmametaboliter samlades in och integrerades i en specialiserad databas. Denna databas kan nås automatiskt av utrustningsprogramvaran för att identifiera polyfenolmetaboliterna i de fem plasmaproverna före och efter 30-dagars näringsintervention. Detta görs för att identifiera de viktigaste fenolföreningarna, eller deras metaboliter, som absorberas från de speciellt formulerade funktionella livsmedel som är utformade för att förebygga sarkopeni.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Plasmaproverna som användes i detta protokoll samlades in i en tidigare studie enligt alla etiska riktlinjer och godkändes av Institutional Ethics and Bioethics Committee (CIEB-2018-1-37) från Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. Det fullständiga protokollet för extraktion och identifiering av fenolföreningar och metaboliter i plasma med UPLC-MS/MS finns representerat i figur 1.
Figur 1: Schematisk framställning av extraktion och identifiering av fenolföreningar och metaboliter i plasma med den halvriktade UPLC-MS/MS-metoden. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
1. Provberedning
- Förvara plasmaproverna vid -80 °C tills analys.
- Tina plasmaproverna i rumstemperatur i 15 minuter.
OBS: Proverna kan placeras i ett vattenbad vid 37 °C för att påskynda processen (5 min). - Placera 200 μL plasmaprov i ett 2 ml mikrorör och blanda med 1 000 μL ren etanol. Virvla plasmaprovet i 30 s.
OBS: Använd alltid handskar när du arbetar med plasmaprover. - Centrifugera provet vid 6 580 x g i 5 minuter. Efter centrifugering samlar du övernatanten med en mikropipette eller Pasteur pipetter och placerar den i ett nytt mikrorör. Förvara supernatanten vid 4 °C.
- Blanda pelleten från föregående steg med 1 000 μL 100% etanol, virvel i 30 s och centrifugera sedan vid 6 580 x g i 5 min.
OBS: Pelleten är kraftigt förpackad och måste återanvändas väl för att säkerställa kontakt mellan provet och ren etanol. Användning av en mikropipette för att spola pelleten med etanol rekommenderas. - Efter centrifugering, samla supernatanten och blanda med supernatanten som tidigare erhållits från steg 1.4. i ett 2 ml mikrorör.
- Avlägsna etanol från provet med rent kväve (99,997%) vid 135 psi. Håll nålen 1 cm borta från toppen av mikroröret för att förhindra provförlust och spola tills provet är torrt. Ingen värme behövs för att avdunsta etanolen.
OBS: Kväveflödet måste vara lågt för att förhindra provförlust. När etanolen har torkats, håll kväveflödet i minst 5 minuter för att säkerställa provtorrhet. Protokollet kan pausas nu. Proverna skall förvaras vid -20 °C. Undvik att lagra proverna i mer än 12 timmar. - Återutnyttja de torra proverna i 100 μL av en blandning av acetonitril: vatten med en andel av 50:50 (v:v).
- Filtrera provet genom ett 0,45 μm nylonsprutmembran direkt i en HPLC injektionsflaska mikroinsats.
OBS: Proverna i injektionsflaskan kan förvaras vid -20 °C före analys. Förvara proverna i högst 8 timmar. Det rekommenderas att injicera proverna i UPLC-systemet strax efter filtrering.
2. UPLC-MS/MS-analys
- Injicera 3 μL prov på en UPLC utrustad med en C18-kolonn i omvänd fas (50 mm x 2,1 mm; 1,8 μm). Ställ in autosamplertemperaturen på 20 °C och kolonntermostaten på 25 °C. Injicera varje prov i tre exemplar.
- Använd 0,1% (v:v) myrsyra i vatten som lösningsmedel A och 100% acetonitril som lösningsmedel B. Ställ in flödeshastigheten på 0,4 mL/min och ett gradientprogram enligt följande: 0-1 min 10% B, 1-4 min 30% B, 4-6 min 38% B, 6-8 min 60% B, 8-8% B, 8-8% B, 8-8% B, 8-8% B, 8-8% B, 8-8% B, 8-8% B, 8-8% B, 8-8% B, 8-8% B.
- Ställ in masspektrometern på negativ lägesjonisering. Använd kväve som torkgas vid 340 °C och ett flödeshastighet på 13 L/min. Ställ in nebulisatortrycket på 60 psi. Ställ in kapillärspänningen på 4 000 V, fragmentorspänningen på 175 V och Skimmerspänningen på 65 V. Använd kollisionsenergi vid 20 V (tabell 2).
- Skanna massorna mellan 100-1100 mass-till-laddning-förhållande (m/z) och, för MS/MS, skanna massorna mellan 50-1000 m/z (tabell 2). Ange datainsamling till automatiskt MS/MS-läge. Använd följande referensmassa: 119.036 och 966.0007.
| Tid (min) | Lösningsmedel A (0,1 % myrsyra i HPLC-vatten) | Lösningsmedel B (100 % acetonitril) |
| 0 till 1 | 90 | 10 |
| 1 till 4 | 70 | 30 |
| 4 till 6 | 62 | 38 |
| 6 till 8 | 40 | 60 |
| 8 till 8,5 | 40 | 60 |
| 8,5 till 9 | 90 | 10 |
Tabell 1: Mobil fasgradient som används för separation av fenolföreningar med UPLC.
| Joniseringsläge | Negativ |
| Torkgas | Kväve vid 340 °C, flödeshastighet 13 L/min |
| Nebulisatortryck | 60 psi |
| Kapillärspänning | 175 V |
| MS-skanningsmassor | 100-1100 m/z |
| MS/MS skanningsmassor | 50-1000 m/z |
Tabell 2: Joniseringsparametrar för MS/MS-analysen.
3. Databaskonstruktion
- Sök efter fenolföreningar, fenolmetaboliter eller andra föreningar av intresse för den vetenskapliga litteraturen.
- Öppna databashanteringsprogramvaran som ingår i UPLC-systemet. Välj Arkiv | PCDL-| (New Personal Database Compound Library) Skapa nytt PCDL. Välj typ av PCDL: LC/MS Metabolomics. Ange ett namn på PCDL. Välj sedan Skapa.
- Välj PCDL i verktygsfältet och sedan alternativet Tillåt redigering . Klicka sedan på knappen Sök föreningar .
Eftersom det är en ny PCDL kommer tabellresultaten att vara tomma. Detta kommer att ändras när nya föreningar läggs till i PCDL.- Lägg till föreningar i det specialiserade personliga databasblandningsbiblioteket genom att kopiera dem från instrumentets allmänna bibliotek. Öppna instrumentets befintliga databas som ingår i databashanteringsprogramvaran. Klicka på knappen Sök föreningar. I alternativet Enkel sökning anger du de sammansatta sökvillkoren för att hitta den sammansatta intresseblandningen.
OBS: Föreningar kan hittas efter namn, molekylär formel, exakt massa, och retentionstid. - Välj ränteblandningen i tabellen sammansatta resultat. Om du vill markera mer än en sammansättning klickar du på den första stansen, håller ned CTRL-tangenten och klickar sedan på varje intresseförening. Högerklicka sedan på alla markerade föreningar och välj Lägg till i PCDL.
- I det nya fönstret söker du efter och väljer den specialiserade personliga databasfilen. Markera rutorna Inkludera spektra för föreningar om det finns och Inkludera jonmobilitetsinformation för föreningar om det finns. Klicka på knappen Lägg till . I den nya dialogrutan väljer du Ja för att kontrollera de nya föreningarna som lagts till. Välj Nej om du vill fortsätta söka efter fler föreningar av intresse.
- Lägg till föreningar i det specialiserade personliga databasblandningsbiblioteket genom att kopiera dem från instrumentets allmänna bibliotek. Öppna instrumentets befintliga databas som ingår i databashanteringsprogramvaran. Klicka på knappen Sök föreningar. I alternativet Enkel sökning anger du de sammansatta sökvillkoren för att hitta den sammansatta intresseblandningen.
- Om föreningarna av intresse inte är tillgängliga i instrumentets allmänna bibliotek, lägg till nya föreningar manuellt.
- Öppna den specialiserade personliga databasen. Följ steg 3.3 när det har öppnats. Välj alternativet Redigera föreningar . Klicka på knappen Lägg till ny .
- Fyll i informationen för den nya föreningen i den övre delen av fönstret. Fyll i formeln, namnet, IUPAC-namnet, CAS-numret, Chemspider-ID:t och andra identifierare.
- Använd informationen som finns tillgänglig i de gratis onlinebiblioteken (Chemspider, PubChem och Phenol Explorer) för att fylla i informationen för den nya föreningen av intresse. När du är klar klickar du på knappen Spara som ny för att spara den nya sammansatta informationen i den specialiserade personliga databasen.
OBS: När du lägger till information från fria bibliotek, var noga med att inkludera den sammansatta informationen utan förekomst av klorid eller jodidjoner. Detta kan ändra den exakta massan och molekylformeln för den sammansatta av intresse.
- Upprepa processen med alla föreningar av intresse för att slutföra den specialiserade personliga databasen.
4. Dataanalys
- Använd instrumentets kvalitativa managerprogramvara för att identifiera de fenolföreningar och fenolmetaboliter som finns i proverna.
- Öppna exempelfilen. På panelen Kromatogram väljer du Definiera kromatogram och extraherar det totala jonkromatogrammet (TIC), det extraherade jonkromatogrammet för MS (EIC) och EIC för MS/MS. Välj alternativet integrera kromatogram.
- Välj Sök efter Formelalternativ på panelen Sök bland föreningar. Välj Formelkälla och sedan alternativet Databas/bibliotek i det nya fönstret. Hitta den personliga databasen som tidigare skapats och klicka på Öppna.
- Välj alternativet Formelmatchning och ange en massmatchningstolerans på 5 delar per miljon (ppm).
OBS: En annan matchningstolerans för massor kan ställas in på 10 ppm; Denna skillnad beror på vilken masspektrometer som används. - Markera alternativet Negativa Joner och markera bara dialogrutan -H. Markera dialogrutorna Extrahera EIC, Extrahera rensat spektrum, Extrahera råspektrum i alternativet Resultat och inkludera struktur.
- Välj alternativet Resultatfilter . Markera Varna om poängen är och ställ in poängmatchen till 80,00%. Markera Matcha inte om poängen är och ställ in poängen till 75,00%.
Matchningspoängen/inte matchresultaten kan ändras till lägre värden om det behövs. Detta minskar identifieringens noggrannhet. - Klicka på Sök föreningar efter formel för att identifiera föreningar av intresse för provet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Steg-för-steg-processen för identifiering av fenolmetaboliter genom den halvriktade UPLC-MS/MS-analysen, i negativt läge, av plasmaprover beskrivs i figur 2. För det första erhölls det totala jonkromatogrammet (TIC) från plasmafenolikextraktet (erhållen efter proteinutfällning av det totala plasmaprovet) genom instrumentets kvalitativa programvara. Sedan användes det extraherade jonkromatogrammet, och det exakta mass- och fragmenteringsmönstret (MS/MS-analys) för varje signal (eller molekylär funktion) jämfördes med dem i en specifik personlig databas som skapats också i instrumentets programvara. Signaler med en massmatchning på mindre än 5 ppm tilldelades en molekylär formel från databasen. Slutligen jämfördes isotopfördelningen av varje signal med den tilldelade molekylära formeln för att uppnå den slutliga preliminära identifieringen. Föreningar som a) identifierades endast i en replikat eller b) presenterade ett område under 10 000 behandlades som falska identifieringar. Från denna analys identifierades totalt 25 fenolföreningar och metaboliter i plasmaproverna (tabell 3). I denna lista hittades både fenolföreningar och deras metaboliter, såsom 3-hidroxyfenylvalersyra och isopropyl 3-(3,4-dihydroxyfenyl)-2-hydroxypropanoat. Eftersom det negativa joniseringsläget är bäst lämpat för alla klasser av fenolföreningar, utom antocyaniner, kunde dessa föreningar inte detekteras med den nuvarande metoden. Om antocyaniner är viktiga komponenter i livsmedelsmatrisen, bör det positiva läget också användas.
| Fenolmetaboliter | R.T. (min) | Formel | Föregångare | Experimentell massa | Den politiska massan | Skillnad (ppm) | |
| 2,3-Dihydroxybensosyra | 0.622 | C7H6O4 | 153.0203 | 154.0273 | 154.0266 | 4.2 | |
| 2-Hydroxyhippuric syra | 8.631 | C18H33NO4 | 410.1648 | 411.1725 | 411.1717 | 1.8 | |
| 3,4-Dihydroxytoluen | 2.239 | C7H8O2 | 123.0451 | 124.0524 | 124.0524 | -0.25 | |
| 3-Hydroxifenylvalersyra | 6.717 | C11H14O3 | 193.0874 | 194.0947 | 194.0943 | 2.12 | |
| 5-(3',4'-dihydroxyfenyl)-valersyra | 4.293 | C11H14O4 | 209.0823 | 210.0894 | 210.0892 | 0.68 | |
| 6-Hydroxyenterodiol | 9.201 | C18H22O5 | 317.1387 | 318.1465 | 318.1467 | -0.65 | |
| Ajugol | 3.889 | C15H24O9 | 347.134 | 348.1418 | 348.142 | -0.59 | |
| Bensoesyra | 3.915 | C7H6O2 | 121.0296 | 122.0367 | 122.0368 | -0.28 | |
| Karnossyra | 6.785 | C20H28O4 | 331.1905 | 332.1979 | 332.1988 | -2.58 | |
| Kaross | 6.347 | C20H26O4 | 329.1764 | 330.1842 | 330.1831 | 3.43 | |
| Katekol | 0.892 | C6H6O2 | 109.0297 | 110.037 | 110.0368 | 1.91 | |
| Glycitin | 6.01 | C22H22O10 | 445.1155 | 446.1228 | 446.1213 | 3.4 | |
| Hesperetin | 6.01 | C16H14O6 | 301.0718 | 302.0796 | 302.079 | -1.81 | |
| Hippursyra | 1.396 | C9H9NO3 | 178.051 | 179.058 | 179.0582 | -1.16 | |
| Homovanillsyra | 0.823 | C9H10O4 | 181.0503 | 182.0576 | 182.0579 | -1.88 | |
| Isopropyl 3-(3,4-Dihydroxyfenyl)-2-hydroxipropanoat | 6.177 | C12H16O5 | 239.0926 | 240.0999 | 240.0998 | 0.48 | |
| Fenylaktisk syra | 5.666 | C8H8O2 | 135.0444 | 136.0518 | 136.0524 | -4.92 | |
| Slörsyra | 2.811 | C9H10O3 | 165.0556 | 166.0626 | 166.063 | -2.41 | |
| Protocatechuic aldehyd | 1.094 | C7H6O3 | 137.0247 | 138.0311 | 138.0317 | -4.5 | |
| Secoisolariciresinol | 8.837 | C20H26O6 | 361.1656 | 362.1729 | 362.1729 | -0.23 | |
| Vanillin | 2.508 | C8H8O3 | 151.04 | 152.0471 | 152.0473 | -1.82 | |
| Epicatechin 3'-O-glucuronide | 9.342 | C21H22O12 | 465.1024 | 466.109 | 466.1111 | -4.64 | |
| Gomisin M2 | 5.234 | C22H26O6 | 385.1676 | 386.1746 | 386.1729 | 4.38 | |
| Irisolidon | 6.145 | C17H14O6 | 313.0727 | 314.0798 | 314.079 | 2.33 | |
| Urolithin C | 6.753 | C13H8O5 | 243.0294 | 244.0368 | 244.0372 | -1.69 | |
Tabell 3: Preliminär identifiering av fenolföreningar och metaboliter i plasmaprover med den halvriktade UPLC-MS/MS-metoden.
För att utvärdera effektiviteten hos den utformade metoden för identifiering av de viktigaste fenolföreningarna, eller deras metaboliter, som absorberades från RSF-innehållande muffins och dryck analyserades fem aleatoriska prover av studiedeltagarna, erhållna före och efter 30-dagarsinterventionen. Den relativa förekomsten av varje förening beräknades genom att dela området under kurvan (AUC) efter behandling av AUC före behandling. Från denna analys var det möjligt att observera att vissa föreningar endast uppträdde i de prover som erhållits före behandlingen, andra förblev oförändrade, medan några av dem ökade efter konsumtion av de funktionella livsmedlen. Tabell 4 visar en lista över 12 fenolföreningar som visade en ökning av plasma efter 30 dagars konsumtion av RSF-innehållande livsmedel. Fenylaktisk syra var den enda metabolit som hittades konsekvent i högre koncentrationer efter behandlingen. Glycitin, en glykosylerad isoflavon och 3-hydroxifenylvalersyra (en fenolmetabolit) ökade i tre av de fem proverna men minskade i de andra två. Gomisin M2, en lignan, upptäcktes i tre av de fem proverna först efter näringsmässiga intervention. De andra fenolföreningarna (såsom hesperetin, secoisolariciresinol och vanillin) och metaboliter (såsom 2-hydroxyhippursyra) hittades endast i ett prov och först efter behandlingen.
| Prov (AUC efter behandling/AUC före behandling) | |||||||
| Förening | Formel | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| 2-Hydroxyhippuric syra | C18H33NO4 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| 3-Hydroxifenylvalersyra | C11H14O3 | 1.30 | 2.69 | 2.69 | 0.62 | 0.62 | |
| 6-Hydroxyenterodiol | C18H22O5 | Nd | Nd | T | Nd | Nd | |
| Glycitin | C22H22O10 | 1.88 | 1.07 | 1.07 | 0.43 | 0.45 | |
| Hesperetin | C16H14O6 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Fenylaktisk syra | C8H8O2 | 4.06 | T | T | T | 1.28 | |
| Slörsyra | C9H10O3 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Protocatechuic aldehyd | C7H6O3 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Secoisolariciresinol | C20H26O6 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Vanillin | C8H8O3 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Gomisin M2 | C22H26O6 | Nd | T | T | T | Nd | |
Tabell 4: Förteckning över fenolföreningar som ökade i plasma hos äldre individer efter 30 dagars konsumtion av RSF-innehållande livsmedel. Data är förhållandet mellan förekomst (AUC) av varje förening efter behandling jämfört med deras överflöd före behandlingen. T anger att föreningen identifierades först i provet efter behandlingen. Nd: inte upptäckt.
Figur 2: Protokoll för identifiering av fenolföreningar metaboliter med halvriktad UPLC-MS/MS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Identifiering och kvantifiering av de bioaktiva fytokemikalier som absorberas efter konsumtion av ett livsmedel eller kosttillskott är avgörande för att visa och förstå hälsofördelarna med dessa föreningar och de livsmedel som innehåller dem. I det nuvarande arbetet utvecklades UPLC-MS/MS-metoden, som endast syftade till identifiering av de viktigaste fenolföreningarna och deras metaboliter som ökade i koncentrationen i plasma efter en 30-dagars näringsintervention med två livsmedelsprodukter speciellt formulerade för äldre. Det antogs att om en förening ökade eller uppträdde i plasma först efter interventionsperioden, hade denna förening absorberats och/eller biotransformerats från de livsmedel som användes vid interventionen.
UPLC-MS/MS är en av de föredragna teknikerna för metabolomiska studier där många lågmolekylära föreningar analyseras samtidigt i komplexa prover för att bedöma effekten av viss behandling eller miljöförändring13. Detta kan göras genom riktade och icke-riktade (eller globala) metoder. Riktade analyser fokuserar på ett känt, litet antal metaboliter av intresse. De är det bästa alternativet för att kvantifiera föreningar med tillgängliga standarder, vilket ger bästa specificitet och känslighet; Dessa metoder måste dock optimeras noggrant för de utvalda metaboliterna och är oförmögna att upptäcka oväntade föreningar i proverna12. I andra studier har HPLC i kombination med en UV-vis-detektor använts för att identifiera fenolsyror och metaboliter i plasma, men denna typ av studie har använt analytiska standarder för att identifiera och kvantifiera den sammansatta intresse15. I en annan studie föreslogs tillägg av en intern standard18; emellertid analyserades endast feruliska och koffeinsyra och deras metaboliter i detta arbete. Å andra sidan har syntesen av interna standarder för fenolmetaboliter föreslagits som ett alternativ till bristen på kommersiella analytiska standarder19. Ändå är syntesen av ett stort antal fenolföreningar svår, tidskrävande och dyr. Icke-riktade metoder försöker upptäcka och identifiera så många molekylära föreningar som möjligt och är främst hypotesgenererande12. De kan identifiera flera hundra föreningar i ett prov genom att tilldela formler till detekterbara kromatografiska signaler med karakteristiska egenskaper, såsom m/z eller uppmätt exakt massa, kromatografisk retentionstid, isotopiskt fingeravtryck etc., så de data som genereras av dessa analyser är mycket rikliga och kan vara svåra att tolka20 . Eftersom syftet med den nuvarande metoden inte var att erhålla en fullständig metabolisk profil av plasmaproverna (vilket skulle vara ett oriktat tillvägagångssätt) utan att identifiera de viktigaste fenolföreningarna och fenolmetaboliterna (tidigare okända) i dem, utformades ett halvriktat tillvägagångssätt. För detta extraherades alla identifierade signaler automatiskt med instrumentets programvara och jämfördes sedan med en självskapad databas som innehöll 645 fenolföreningar och deras metaboliter, som erhölls från gratis onlinedatabaser. Databasen innehöll referensmönster för MS/MS-fragmentering av de föreningar som användes för tilldelningen av det sammansatta namnet och formeln, vilket möjliggör en mer exakt identifiering av föreningar i provet12.
De mest kritiska stegen i protokollet var 1) provförbehandling (extraktion och koncentration av fenolföreningar och metaboliter från plasmaprover). 2) Uppbyggnad av en fullständig och särskild databas för halvriktad analys av proverna och identifiering av alla möjliga föreningar som tillhör en viss föreningsklass. och 3) valet av de parametrar som används av instrumentets kvalitativa programvara (massmatchtolerans ppm och poäng%) för att korrekt identifiera föreningarna i provet. Vid provförbehandling måste försiktighet iakttas för att undvika förlust av föreningar av intresse, återvinna dem vid en hög slutlig koncentration och kunna eliminera störande föreningar. Vid skapandet av den specifika databasen är det viktigt att genomföra en grundlig litteratursökning och sedan använda gratis onlinedatabaser för att erhålla specifika kemiska data som kommer att användas för sammansatt identifiering i provet. Valet av de bästa värdena för massmatchning och poäng krävde tidigare validering av analysmetoden med hjälp av standarder och kända prover21,22.
När protokollet väl hade implementerats var de gemensamma problemen och deras rekommenderade lösningar följande: 1) Inga föreningar identifierades i proverna. Detta berodde på den låga koncentrationen av föreningarna och kunde lösas genom att torka provet och återlösa det i en mindre volym. 2) Signaler uppträdde i TIC, men föreningar identifierades inte. Detta kan bero på ett fel i massakalibreringen, så skillnaden mellan experimentella och teoretiska massor var hög. I detta fall bör instrumentets massakalibrering utföras enligt utrustningens tillverkare och modell. En annan orsak kan vara en ofullständig personlig databas, så det är viktigt att ständigt kontrollera och underhålla databasen. Massor av föreningar som misstänks vara av intresse kan kontrolleras och jämföras med fritt tillgängliga onlinedatabaser eller ny vetenskaplig litteratur. 3) Signaler visades i tomma körningar. Detta indikerar kontaminering och kan lösas genom rengöring av autosamplernålen och kolonnen. Standard rengöringsprotokollet är att utföra vissa körningar med metanol, sedan isopropanol och slutligen acetonitril som mobil fas. Sedan återklassificeras kolumnen och kör mobilfasen i minst 30 minuter.
De största svårigheterna i utvecklingen av denna typ av metod är 1) den låga biotillgängligheten, i allmänhet, för alla fytokemikalier, inklusive fenolföreningar, vilket innebär mycket låga plasmakoncentrationer16; 2) Den stora mångfalden av fenolföreningar som finns i livsmedel, som ökar genom deras metabolism och biotransformation som förekommer hos mänskliga enterocyter och hepatocyter och den coloniska mikrobiotan23; 3) Bristen på standarder (vissa standarder finns men är mycket svåra att erhålla) för många föreningar, särskilt för metaboliterna, och förekomsten av några okända eller okarakteriserade föreningar23; och 4) varierande svar bland individer, både i absorption och metabolism av fytokemikalier14. För att övervinna problemet med låga plasmakoncentrationer av fenolmetaboliter bör de extraheras och koncentreras. Detta kan uppnås genom mikrofast fas extraktion14 eller, som i det nuvarande arbetet, genom tillsats av lösningsmedel som fäller ut proteiner och löser upp fenolföreningar och metaboliter, följt av lösningsmedel avdunstning och resuspension i en mindre volym19. Denna teknik är enkel, ekonomisk och tillräcklig för ett litet antal prover. Återvinningen av föreningar av intresse skulle dock lätt kunna förbättras med hjälp av större plasmavolymer, så den slutliga koncentrationen av alla föreningar skulle vara högre. Den stora mångfalden av fenolmetaboliter och brist på standarder är anledningen till att ett halvriktat tillvägagångssätt användes för att identifiera de föreningar som ökades av interventionen innan man försökte kvantifiera dem. Genom att använda en speciellt skapad databas istället för en helt oriktad analys var det möjligt att ignorera de många primära metaboliterna i plasma, med fokus endast på fenolföreningarna och deras metaboliter. En viktig begränsning av denna databas, specifik för fenolföreningar och deras mänskliga metaboliter, var bristen på massa spektralinformation för många föreningar och deras metaboliter, vilket minskar noggrannheten i föreningen identifiering.
Stor variation bland individer observeras regelbundet i studier som utvärderar absorption och metabolism av fenolföreningar, både kvantitativt och kvalitativt. I de nuvarande resultaten presenterade en individ 18 föreningar i plasmaprovet som togs efter interventionen, medan de andra visade endast 9 eller 10. Dessutom hittades många fenolföreningar och metaboliter endast i baslinjeproverna (före interventionen), och de varierade också mellan individer. Totalt sett uppvisade mer än hälften av de identifierade föreningarna högre koncentrationer (AUC) före än efter interventionen eller hittades endast i proverna före interventionen. Därför var det nödvändigt att jämföra enskilda prover som tagits före och efter interventionen för att förstå vilka föreningar som faktiskt ökades av det. Den enda metabolit som konsekvent ökade efter behandlingen var fenylaktisk syra, en mikrobiell katabolt av flavan-3-ols24 som har hittats i plasma av individer i akuta studier av konsumtionen av fenolrika livsmedel14,25. De flesta studier som har identifierat och kvantifierat fenolmetaboliter i plasma var akuta studier, där koncentrationerna av föreningarna övervakades under 24 timmar efter konsumtion av den fenolrika måltiden, med konstaterande att deras koncentrationer efter 24 timmar låg nära basalvärdet19,25. Därför är det förståeligt att de prover som analyserades i det nuvarande arbetet visade låga antal och koncentrationer av fenolmetaboliter. Nyligen utvärderade Zhang et al.25 konsumtionen av röda hallon, både i akuta studier och efter 4 veckors tillskott. De observerade att både akuta och kroniska interventioner ökade fenolföreningar och deras metaboliter, medan efter 4-veckors tillskott, den basala plasma koncentrationen av vissa metaboliter ökade (urolithins, cinnamic, fenylpropionic, och hippuric syror) och andra minskade (konjugerade antocyanin derivat).
En slutlig undersökning av den metod som utvecklats i detta dokument visar att den i de flesta delar var väl lämpad för det mål för vilket den skapades. Provförbehandlingen var enkel och effektiv, och UPLC separation och halvriktad MS/MS identifiering av fenol metaboliter uppnåddes. Denna halvriktade metod kan vara användbar som en första screeningmetod för att identifiera fenolföreningar som kan absorberas från olika livsmedelsmatriser, liksom de fenolmetaboliter som finns i human plasma. Dessutom är protokollet användbart eftersom det tillåter identifiering när inga standarder från fenolföreningar eller metaboliter finns tillgängliga. Slutligen använder metoden en liten plasmamängd, vilket är kritiskt i de flesta in vivo-studier där plasmaprover är knappa. Det rekommenderas dock att en akut studie för framtida studier bör genomföras före den kroniska interventionen för att bättre identifiera de viktigaste fenolföreningarna och metaboliterna som absorberas från de speciellt formulerade livsmedel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma för det ekonomiska stödet från CONACYT, Mexiko (CB- 2016-01-286449) och UACJ-PIVA (Projekt 313-17-16 och 335-18-13). OAMB vill tacka CONACYT för hans doktorandstipendium. Teknisk support från Multimedia Production-kontoret från UACJ är tacksamt erkänd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Tedia | Al1129-001 | LC Mass spectrometry |
| Autosampler | Agilent Technologies | G4226A | 1290 Infinity series |
| C18 reverse phase column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse plus C18 2.1x50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD |
| Centrifuge | Eppendorf | 5452000018 | Mini Spin; Rotor F-45-12-11 |
| Column compartment with thermostat | Agilent Technologies | G1316C | 1290 Infinity series |
| Diode Array Detector (UV-Vis) | Agilent Technologies | G4212B | 1260 Infinity series |
| Electrospray ionnization source | Agilent Technologies | G3251B | Dual sprayer ESI source |
| Formic acid | J.T. Baker | 0128-02 | Baker reagent, ACS |
| Mass Hunter Data Acquisition | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Qualitative Analysis | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Microcentrifuge tube | Brand | BR780546 | Microcentrifuge tube, 2 mL with lid |
| Pure ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-1L | 200 proof, for molecular biology |
| Q-TOF LC/MS | Agilent Technologies | G6530B | 6530 Accurate Mass |
| Quaternary pump | Agilent Technologies | G4204A | 1290 Infinity series |
| Syringe filter | Thermo Scientific | 44514-NN | 17 mm, 0.45 μm, nylon membrane |
| Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | 1290 Infinity series |
| Vial | Agilent Technologies | 8010-0199 | Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps |
| Vial insert | Agilent Technologies | 5183-2089 | Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical |
| Water | Tedia | WL2212-001 | LC Mass spectrometry |
References
- Morley, J. E., Anker, S. D., von Haehling, S. Prevalence, incidence, and clinical impact of sarcopenia: facts, numbers, and epidemiology-update 2014. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 5 (4), 253-259 (2014).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A.
- Beaudart, C., et al. Nutrition and physical activity in the prevention and treatment of sarcopenia: systematic review. Osteoporosis International. 28 (6), 1817-1833 (2017).
- Ozer, H. K. Phenolic compositions and antioxidant activities of Maya nut (Brosimum alicastrum): Comparison with commercial nuts. International Journal of Food Properties. 20 (11), 2772-2781 (2017).
- Subiria-Cueto, R., et al. Brosimum alicastrum Sw. (Ramón): An alternative to improve the nutritional properties and functional potential of the wheat flour tortilla. Foods. 8 (12), 1-18 (2019).
- Martínez-Ruiz, N., Torres, L. E. J., del Hierro-Ochoa, J. C., Larqué-Saavedra, A. Bebida adicionada con Brosimum alicastrum sw.: Una alternativa para requerimientos dietarios especiales. Revista Salud Pública y Nutrición. 18 (3), 1-10 (2019).
- Rodríguez-Tadeo, A., et al. Functionality of bread and beverage added with brosimum alicastrum sw. Seed flour on the nutritional and health status of the elderly. Foods. 10 (8), 1-21 (2021).
- Muñoz-Bernal, ÓA., et al. Nuevo acercamiento a la interacción del reactivo de Folin-Ciocalteu con azúcares durante la cuantificación de polifenoles totales. TIP Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas. 20 (2), 28-33 (2017).
- Luca, S. V., et al. Bioactivity of dietary polyphenols: The role of metabolites. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 60 (4), 626-659 (2020).
- Kawabata, K., Yoshioka, Y., Terao, J. Role of intestinal microbiota in the bioavailability and physiological functions of dietary polyphenols. Molecules. 24 (2), (2019).
- de Llano, D. G., Moreno-Arribas, M. V., Bartolomé, B. Cranberry polyphenols and prevention against urinary tract Infections: Relevant considerations. Molecules. 25 (15), (2020).
- Alsaleh, M., et al. Mass spectrometry: A guide for the clinician. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 9 (5), 597-606 (2019).
- Wang, X., Sun, H., Zhang, A., Wang, P., Han, Y. Ultra-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry as a sensitive and powerful technology for metabolomic studies. Journal of Separation Science. 34 (24), 3451-3459 (2011).
- Feliciano, R. P., Mills, C. E., Istas, G., Heiss, C., Rodriguez-Mateos, A. Absorption, metabolism and excretion of cranberry (poly)phenols in humans: A dose response study and assessment of inter-individual variability. Nutrients. 9 (3), (2017).
- Mateos, R., Goya, L., Bravo, L. Uptake and metabolism of hydroxycinnamic acids (chlorogenic, caffeic, and ferulic acids) by HepG2 cells as a model of the human liver. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (23), 8724-8732 (2006).
- Rodriguez Lanzi,, Perdicaro, C., Antoniolli, D. J., Piccoli, A., Vazquez Prieto, M. A., Fontana, A. Phenolic metabolites in plasma and tissues of rats fed with a grape pomace extract as assessed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Archives of Biochemistry and Biophysics. , 28-33 (2018).
- Hou, Y., He, D., Ye, L., Wang, G., Zheng, Q., Hao, H. An improved detection and identification strategy for untargeted metabolomics based on UPLC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113531 (2020).
- Nagy, K., et al. First identification of dimethoxycinnamic acids in human plasma after coffee intake by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1218 (3), 491-497 (2011).
- Marmet, C., Actis-Goretta, L., Renouf, M., Giuffrida, F. Quantification of phenolic acids and their methylates, glucuronides, sulfates and lactones metabolites in human plasma by LC-MS/MS after oral ingestion of soluble coffee. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 617-625 (2014).
- McCord, J., Strynar, M. Identifying per-and polyfluorinated chemical species with a combined targeted and non-targeted-screening high-resolution mass spectrometry workflow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (146), 1-15 (2019).
- Muñoz-Bernal, ÓA., et al. Phytochemical characterization and antiplatelet activity of Mexican red wines and their by-products. South African Journal of Enology and Viticulture. 42 (1), 77-90 (2021).
- Muñoz-Bernal, ÓA. Enriquecimiento de un vino tinto con un extracto de compuestos fenólicos provenientes de orujo de uva: bioaccesibilidad, análisis sensorial y respuesta biológica. Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. , (2021).
- Low, D. Y., et al. Data sharing in PredRet for accurate prediction of retention time: Application to plant food bioactive compounds. Food Chemistry. , 357 (2021).
- Sánchez-Patán, F., et al. Gut microbial catabolism of grape seed flavan-3-ols by human faecal microbiota. Targeted analysis of precursor compounds, intermediate metabolites and end-products. Food Chemistry. 131 (1), 337-347 (2012).
- Zhang, X., Sandhu, A., Edirisinghe, I., Burton-Freeman, B. M. Plasma and urinary (poly)phenolic profiles after 4-week red raspberry (Rubus idaeus L.) intake with or without fructo-oligosaccharide supplementation. Molecules. 25 (20), (2020).
