Summary
Bu protokolün amacı, yarı hedefli kromatografi-kütle spektrometrisi yöntemi kullanarak plazmadaki fenolik metabolitleri tespit etmektir.
Abstract
23 yaşlı kişiden oluşan bir gruba, sarkopeninin (yaşa bağlı kas kütlesi kaybı) önlenmesi için özel olarak formüle edilmiş fonksiyonel yemekler (bir içecek ve bir kek) verildi. Plazma örnekleri, müdahalenin başlangıcında ve fonksiyonel öğünlerin tüketilmesinden 30 gün sonra alındı. Fenolik bileşikleri ve metabolitlerini tanımlamak için tandem kütle (UPLC-MS / MS) analizi ile birleştirilmiş yarı hedefli ultra yüksek performanslı kromatografi gerçekleştirildi. Plazma proteinleri etanol ile çökeltildi ve numuneler UPLC-MS / MS cihazına enjeksiyondan önce mobil fazda (1: 1 asetonitril: su) konsantre edildi ve yeniden askıya alındı. Ayırma bir C18 ters faz sütunu ile gerçekleştirildi ve bileşikler deneysel kütleleri, izotopik dağılımları ve fragman desenleri kullanılarak tanımlandı. İlgilenilen bileşikler, veri bankalarının ve dahili yarı hedefli kütüphaneninkilerle karşılaştırıldı. Ön sonuçlar, müdahaleden sonra tanımlanan başlıca metabolitlerin fenilasetik asit, glisitin, 3-hidroksifenilvalerik asit ve gomisin M2 olduğunu göstermiştir.
Introduction
Sarkopeni yaşlı popülasyonda hızlandırılmış kas kaybına bağlı ilerleyici bir iskelet hastalığıdır. Bu durum düşme riskini arttırır ve günlük yaşam aktivitelerinin sınırlı olmasına neden olur. Sarkopeni, 65 yaşın üzerindeki kişilerin yaklaşık% 5-10'unda ve 80 yaş ve üstü kişilerin yaklaşık% 50'sinde bulunur1. Sarkopeni tedavisi için spesifik bir ilaç onaylanmamıştır, bu nedenle fiziksel aktivite ve dengeli bir diyetle korunma önemlidir1,2. Süt proteini ve esansiyel amino asitlerle zenginleştirilmiş özel olarak formüle edilmiş gıdalarla yapılan beslenme müdahaleleri, sarkopeninin önlenmesinde olumlu sonuçlar göstermiştir2. Diğer çalışmalarda, yazarlar diyete E vitamini ve izoflavonlar gibi vitamin ve antioksidanları dahil ederek, bel ve kalçalardaki kas kazanımının faydalarını arttırmıştır3.
Brosimum alicastrum Sw. (Ramón), Meksika tropikal bölgelerinde yetişen bir ağaçtır; yüksek besin değeri nedeniyle Maya kültürleri tarafından tüketilmiştir4. İyi bir protein, lif, mineral ve klorojenik asit gibi fenolik antioksidanlar kaynağıdır5. Toz haline getirilebildiği ve pişirme ürünlerinde kullanılabildiği veya içeceklerde tüketilebildiği için, son çalışmalar Ramón tohumu ununun (RSF) besin değerlerini artırmak için farklı gıdalara dahil edilmesini değerlendirmiştir. RSF takviyeli kapuçino aromalı bir içecek formüle edildi, diyet lifi bakımından yüksekti ve porsiyon başına 6 g'dan fazla protein içeriyordu ve tüketiciler tarafından oldukça kabul edildi; bu nedenle, özel diyet gereksinimlerini karşılamak için potansiyel bir alternatif olarak kabul edildi6. Bir takip çalışmasında, RSF ayrıca bir kek ve protein, diyet lifi, mikro besinler ve fenolik antioksidanlar bakımından zengin yeni bir içecek formüle etmek için kullanıldı. Muffin ve içecek, her iki ürünü de 30 gün boyunca günde iki kez tüketen yaşlı bireyler için bir diyet müdahalesinde kullanıldı. Bu süreden sonra, katılımcıların beslenme ve sarkopenik durumları iyileşti ve plazmanın toplam fenolik içeriği arttı7. Bununla birlikte, plazmadaki toplam fenolik bileşiklerin belirlenmesi spektrofotometrik bir yöntemle gerçekleştirilmiştir, bu nedenle emilen gerçek fenolik bileşiklerin tanımlanması mümkün olmamıştır; Dahası, bu yöntem fenolik bileşikler için tamamen spesifik değildir, bu nedenle bazı abartılı tahminler meydana gelebilir8.
Bu antioksidanlar bakımından zengin gıdaların tüketiminden sonra emilen fenolik bileşiklerin tanımlanması ve miktarının belirlenmesi zor bir iştir, ancak bu fitokimyasalların biyolojik aktivitesini göstermek için gereklidir. Çoğu fenolik bileşiğin biyoyararlanımı düşüktür; Bunların %5'inden azı plazmada yapısal dönüşüm olmadan bulunabilir. Fenolik bileşikler, enterositler ve hepatositler tarafından gerçekleştirilen metilasyon, sülfonasyon veya glukuronidasyon gibi çeşitli biyotransformasyonlara uğrar9. Fenolik bileşikler ayrıca mikrobiyota tarafından plazmaya emildikten sonra vücutta yararlı etkilerini gösterebilecek bakteriyel katabolitlere biyotransforme edilir10. Örneğin, fenilasetik asit, flavonoidlerin ve oligomerik proantosiyanidinlerin bakteriyel dönüşümünün bir ürünüdür ve kızılcık tüketiminden sonra idrar yollarındaki bakterilerin (Escherichia coli) yapışmasının% 40'ına kadarını inhibe edebilir11.
Doğal olarak oluşan fenolik bileşiklerin yapısal çeşitliliği, metabolitlerinin çeşitliliğine ve düşük biyoyararlanımlarına eklendiğinde, plazmadaki tanımlamalarını daha da zorlaştırmaktadır. Nükleer manyetik rezonans (NMR) ve tandem kütle spektroskopisi (MS / MS) gibi spektroskopik analiz platformlarını kullanan metabolomik profilleme, muhtemelen bu hedefe ulaşmak için en iyi yaklaşımdır; ne yazık ki, ekipmana kolayca erişilemez ve analiz protokollerinin geliştirilmesi hala sınırlıdır12. Birçok çalışma, metabolomik çalışmalarda kütle spektrumlarının karmaşıklığını azaltmak için bir strateji olarak MS / MS'in bir ayırma sistemi (sıvı kromatografisi gibi) ile birleştiğini bildirmiştir. Ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi (UPLC) ayırma yöntemlerinin yakın zamanda piyasaya sürülmesi, analiz süresini kısaltmış ve geleneksel yüksek performanslı sıvı protokollerine kıyasla çözünürlüğü ve hassasiyeti artırmıştır, bu nedenle UPLC-MS / MS sistemleri analitik metabolomik topluluğu tarafından hızla kabul görmüştür13. Bu şekilde, bazı çalışmalar fenolik metabolitleri araştırmış ve kızılcık alımından sonra bireylerin plazmasında kafeinik asit, quercetin ve ferulik asitten glukuronid türevlerinin yanı sıra şırıngaik ve vanilik asitten sülfonlu türevleri tespit etmiştir14. Önceki protokoller, plazma gibi biyoakışkanlarda fenolik bileşikleri ve fenolik metabolitleri bulmayı amaçlamıştır. Bu protokoller, bir UV-vis dedektörüne bağlanmış yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile tanımlama ve nicelleştirmeye dayanıyordu15. Bununla birlikte, bu tür protokoller, mutlak tanımlamayı ve doğru nicelemeyi değerlendirmek için otantik standartların kullanılmasını gerektirir. Çok çeşitli çalışmalar, biyoakışkanlarda (sülfonlanmış, glukuronidlenmiş ve metillenmiş formlar) UPLC-MS ve UPLC-MS / MS tarafından en yaygın metabolitleri tanımlamıştır; Bununla birlikte, bakteriyel metabolitlerin büyük bir kısmı, tam bilgilerini içeren veritabanlarının bulunmaması nedeniyle bildirilmemiştir16. Metabolit tanımlama, metabolit standartlarının maliyeti ve ticari kullanılabilirliği nedeniyle karmaşıktır. Bu nedenle, en iyi strateji, kimyasal kimliği belirlemek için moleküler özellik bilgilerinin (m / z, monoizotopik tam kütle, izotopik dağılım ve parçalanma paterni) kullanılmasına dayanan ve polipolifenol-richts tüketiminden sonra biyoakışkanlarda tanımlanan polifenol metabolitlerini içeren serbestçe kullanılabilen çevrimiçi veritabanlarıyla karşılaştıran hedefsiz veya yarı hedefli MS / MS metabolit analizi olabilir12 . Fenolik bileşiklerin ve metabolitlerinin tanımlanması için UPLC-MS / MS çalışmalarında kullanılan en önemli veritabanları İnsan Metabolom Veritabanı (HMDB), LipidBlast Kütüphanesi, METLIN Kütüphanesi ve PubChem, ChemSpider ve Phenol Explorer17 gibi diğer tamamlayıcı veritabanlarıdır.
Bu çalışmada, RSF içeren çörek ve içecek tüketimi çalışmasına katılan yaşlı insan grubunun plazma örneklerini analiz etmek için yarı hedefli bir UPLC-MS/MS yöntemi geliştirilmiştir7. Plazma metabolitlerinin farklı ücretsiz çevrimiçi veritabanlarından elde edilen veriler toplandı ve özel bir veritabanına entegre edildi. Bu veritabanına, 30 günlük beslenme müdahalesinden önce ve sonra beş plazma örneğindeki polifenolik metabolitleri tanımlamak için ekipman yazılımı tarafından otomatik olarak erişilebilir. Bu, sarkopeninin önlenmesi için tasarlanmış özel olarak formüle edilmiş fonksiyonel gıdalardan emilen ana fenolik bileşikleri veya metabolitlerini tanımlamak için yapılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde kullanılan plazma örnekleri, tüm etik kuralları takip eden ve Universidad Autónoma de Ciudad Juárez'den Kurumsal Etik ve Biyoetik Komitesi (CIEB-2018-1-37) tarafından onaylanan önceki bir çalışmada toplanmıştır. Plazmadaki fenolik bileşiklerin ve metabolitlerin UPLC-MS / MS ile ekstraksiyonu ve tanımlanması için tam protokol Şekil 1'de gösterilmiştir.
Şekil 1: Plazmadaki fenolik bileşiklerin ve metabolitlerin yarı hedefli UPLC-MS/MS yöntemi ile ekstraksiyonu ve tanımlanmasının şematik gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
1. Numune hazırlama
- Plazma numunelerini analize kadar -80 °C'de saklayın.
- Plazma numunelerini oda sıcaklığında 15 dakika boyunca çözün.
NOT: Numuneler, prosesi hızlandırmak için 37 °C'de bir su banyosuna yerleştirilebilir (5 dk). - 200 μL plazma örneğini 2 mL'lik bir mikrotüpe yerleştirin ve 1.000 μL saf etanol ile karıştırın. 30 sn için plazma örneğini vorteksleyin.
NOT: Plazma numuneleriyle çalışırken daima eldiven kullanın. - Numuneyi 5 dakika boyunca 6.580 x g'de santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı bir mikropipet veya Pasteur pipet ile toplayın ve yeni bir mikrotüpe yerleştirin. Süpernatantı 4 °C'de saklayın.
- Önceki adımdaki peleti 1.000 μL %100 etanol, 30 s vorteks ile karıştırın ve ardından 5 dakika boyunca 6.580 x g'de santrifüj yapın.
NOT: Pelet güçlü bir şekilde paketlenmiştir ve numune ile saf etanol arasındaki teması sağlamak için iyice askıya alınması gerekir. Peletin etanol ile yıkanması için mikropipet kullanılması önerilir. - Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı toplayın ve daha önce Adım 1.4'ten elde edilen süpernatant ile karıştırın. 2 mL'lik bir mikrotüp içinde.
- 135 psi'de saf azot (% 99.997) kullanarak etanol'ü numuneden çıkarın. Numune kaybını önlemek için iğneyi mikrotüpün üstünden 1 cm uzakta tutun ve numune kuruyana kadar yıkayın. Etanolün buharlaştırılması için ısıya gerek yoktur.
NOT: Numune kaybını önlemek için azot akışı düşük olmalıdır. Etanol kuruduktan sonra, numune kuruluğunu sağlamak için azot akışını en az 5 dakika tutun. Protokol bu noktada duraklatılabilir; numuneler -20 °C'de saklanmalıdır. Numuneleri 12 saatten fazla saklamaktan kaçının. - Kuru numuneleri 100 μL'lik bir asetonitril karışımında yeniden askıya alın: 50:50 (v:v) oranında su.
- Numuneyi 0,45 μm naylon şırınga membranından doğrudan bir HPLC şişe mikro ekine filtreleyin.
NOT: Flakondaki numuneler analizden önce -20 °C'de saklanabilir. Numuneleri en fazla 8 saat saklayın. Numunelerin filtrasyondan hemen sonra UPLC sistemine enjekte edilmesi önerilir.
2. UPLC-MS/MS analizi
- C18 ters faz sütunu (50 mm x 2,1 mm; 1,8 μm) ile donatılmış bir UPLC'ye 3 μL numune enjekte edin. Otomatik numune alma cihazı sıcaklığını 20 °C'ye ve kolon termostatını 25 °C'ye ayarlayın. Her numuneyi üçlü olarak enjekte edin.
- Suda çözücü A olarak% 0.1 (v: v) formik asit ve çözücü B olarak% 100 asetonitril kullanın Akış hızını 0.4 mL / dak ve gradyan programını aşağıdaki gibi ayarlayın: 0-1 dakika % 10 B, 1-4 dakika % 30 B, 4-6 dakika% 38 B, 6-8 dakika % 60 B, 8-8.5 dakika% 60 B, 8.5-9 dakika % 10 B (Tablo 1).
- Kütle spektrometresini negatif mod iyonizasyonuna ayarlayın. 340 °C'de kurutma gazı olarak azot ve 13 L/dak debi kullanın. Nebülizör basıncını 60 psi'ye ayarlayın. Kılcal gerilimi 4.000 V'a, parçalayıcı voltajını 175 V'a ve Sıyırıcı voltajını 65 V'a ayarlayın. çarpışma enerjisini 20 V'ta kullanın (Tablo 2).
- 100-1100 kütle-yük oranı (m/z) arasındaki kütleleri tarayın ve MS/MS için 50-1000 m/z arasındaki kütleleri tarayın (Tablo 2). Veri alımını Otomatik MS/MS moduna ayarlayın. Aşağıdaki referans kütlesini kullanın: 119.036 ve 966.0007.
| Süre (dk) | Solvent A (HPLC suyunda %0,1 formik asit) | Solvent B (%100 asetonitril) |
| 0 ila 1 | 90 | 10 |
| 1 ila 4 | 70 | 30 |
| 4 ila 6 | 62 | 38 |
| 6 ila 8 | 40 | 60 |
| 8 ila 8,5 | 40 | 60 |
| 8,5 ila 9 | 90 | 10 |
Tablo 1: Fenolik bileşiklerin UPLC ile ayrılması için kullanılan mobil faz gradyanı.
| İyonizasyon modu | Negatif |
| Kurutma gazı | 340 °C'de azot, akış hızı 13 L/dak |
| Nebülizör basıncı | 60 psi |
| Kılcal gerilim | 175 V |
| MS tarama kütleleri | 100-1100 m/z |
| MS/MS tarama kütleleri | 50-1000 m/z |
Tablo 2: MS/MS analizi için iyonizasyon parametreleri.
3. Veritabanı oluşturma
- Fenolik bileşikleri, fenolik metabolitleri veya bilimsel literatürde ilgi çeken diğer bileşikleri arayın.
- UPLC sisteminde bulunan veritabanı yönetim yazılımını açın. Dosya |'nı seçin Yeni Kişisel Veritabanı Bileşik Kitaplığı (PCDL) | Yeni PCDL oluşturun. PCDL türünü seçin: LC/MS Metabolomics. PCDL için bir ad ayarlayın. Ardından Oluştur'u seçin.
- Araç çubuğunda PCDL'yi ve ardından Düzenlemeye izin ver seçeneğini belirleyin. Ardından Bileşikleri bul düğmesini tıklayın.
NOT: Yeni bir PCDL olduğundan, tablo sonuçları boş olacaktır. PCDL'ye yeni bileşikler eklendiğinde bu durum değişecektir.- Bileşikleri, cihazın genel kütüphanesinden kopyalayarak özel kişisel veritabanı bileşik kütüphanesine ekleyin. Cihazın veritabanı yönetim yazılımında bulunan mevcut veritabanını açın. Bileşikleri bul düğmesini tıklayın. Tek arama seçeneğinde, ilgilenilen bileşiği bulmak için bileşik arama ölçütlerini girin.
NOT: Bileşikler isim, moleküler formül, tam kütle ve tutma süresi ile bulunabilir. - Bileşik sonuçlar tablosunda, faiz bileşiğini seçin. Birden fazla bileşik seçmek için, ilk bileşiği tıklatın, CTRL tuşunu basılı tutun ve ardından ilgilenilen her bileşiği tıklatın. Ardından, vurgulanan tüm bileşiklere sağ tıklayın ve PCDL'ye Ekle'yi seçin.
- Yeni pencerede, özelleştirilmiş kişisel veritabanı dosyasını arayın ve seçin. Kutuları işaretleyin Varsa bileşikler için spektrumları dahil edin ve varsa bileşikler için iyon hareketlilik bilgilerini ekleyin. Ekle düğmesini tıklatın. Yeni iletişim kutusunda, eklenen yeni bileşikleri kontrol etmek için Evet'i seçin. İlgilendiğiniz daha fazla bileşik aramaya devam etmek için Hayır'ı seçin.
- Bileşikleri, cihazın genel kütüphanesinden kopyalayarak özel kişisel veritabanı bileşik kütüphanesine ekleyin. Cihazın veritabanı yönetim yazılımında bulunan mevcut veritabanını açın. Bileşikleri bul düğmesini tıklayın. Tek arama seçeneğinde, ilgilenilen bileşiği bulmak için bileşik arama ölçütlerini girin.
- İlgilenilen bileşikler cihazın genel kütüphanesinde mevcut değilse, yeni bileşikleri manuel olarak ekleyin.
- Özel kişisel veritabanını açın. Açıldıktan sonra, Adım 3.3'ü izleyin. Bileşikleri düzenle seçeneğini belirleyin. Yeni ekle düğmesini tıklayın.
- Pencerenin üst kısmında, yeni bileşik için bilgileri doldurun. Formülü, adı, IUPAC adını, CAS numarasını, Chemspider ID'yi ve diğer tanımlayıcıları doldurun.
- Yeni ilgi alanı bileşiğinin bilgilerini doldurmak için ücretsiz çevrimiçi kütüphanelerde (Chemspider, PubChem ve Phenol Explorer) bulunan bilgileri kullanın. İşiniz bittiğinde, yeni bileşik bilgileri özel kişisel veritabanına kaydetmek için Yeni olarak kaydet düğmesine tıklayın.
NOT: Serbest kütüphanelerden bilgi eklerken, klorür veya iyodür iyonları olmadan bileşik bilgileri eklediğinizden emin olun. Bu, ilgilenilen bileşiğin tam kütlesini ve moleküler formülünü değiştirebilir.
- Özel kişisel veritabanını tamamlamak için işlemi ilgilendiğiniz tüm bileşiklerle tekrarlayın.
4. Veri analizi
- Numunelerde bulunan fenolik bileşikleri ve fenolik metabolitleri tanımlamak için cihazın kalitatif yönetici yazılımını kullanın.
- Örnek dosyayı açın. Kromatogram panelinde, Kromatogramları Tanımla'yı seçin ve toplam iyon kromatogramını (TIC), çıkarılan MS iyon kromatogramını (EIC) ve MS/MS'nin EIC'sini ayıklayın.
- Bileşikleri Bul panelinde, Formüle Göre Bul-Seçenekler'i seçin. Yeni pencerede, Formül Kaynağı'nı ve ardından Veritabanı/Kitaplık seçeneğini belirleyin. Daha önce oluşturulmuş kişisel veritabanını bulun ve Aç'a tıklayın.
- Formül Eşleştirme seçeneğini belirleyin ve milyonda 5 parçalık (ppm) bir kütle eşleşme toleransı ayarlayın.
NOT: Kütlelerin farklı bir eşleşme toleransı 10 ppm'ye ayarlanabilir; bu fark kullanılan kütle spektrometresine bağlıdır. - Negatif İyonlar seçeneğini belirleyin ve yalnızca -H iletişim kutusunu seçin. Sonuçlar seçeneğinde, Extract EIC, Extract Clean Spectrum, Extract Raw Spectrum ve include Structure iletişim kutularını işaretleyin.
- Sonuç Filtreleri seçeneğini belirleyin. Mark Skor ise uyar ve skor eşleşmesini %80,00 olarak ayarla. İşaret Skoru eşleşmiyorsa eşleşmiyor ve skoru %75,00 olarak ayarlayın.
NOT: Eşleşme/eşleşmeme skorları gerekirse daha düşük değerlerle değiştirilebilir. Bu, tanımlamanın doğruluğunu azaltacaktır. - Numunede ilgilenilen bileşikleri tanımlamak için Formüle Göre Bileşikleri Bul'a tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Plazma örneklerinin negatif modda yarı hedefli UPLC-MS/MS analizi yoluyla fenolik metabolitlerin tanımlanması için adım adım süreç Şekil 2'de gösterilmiştir. İlk olarak, plazma fenolik ekstraktından elde edilen toplam iyon kromatogramı (TIC) (toplam plazma örneğinin protein çökelmesinden sonra elde edilen), cihazın kalitatif yazılımı aracılığıyla elde edildi. Daha sonra, ekstrakte edilen iyon kromatogramı kullanıldı ve her sinyalin (veya moleküler özelliğin) tam kütle ve parçalanma paterni (MS / MS analizi), cihazın yazılımında da oluşturulan belirli bir kişisel veritabanınınkilerle karşılaştırıldı. Kütle eşleşmesi 5 ppm'den az olan sinyallere veritabanından moleküler bir formül atandı. Son olarak, her sinyalin izotopik dağılımı, nihai geçici tanımlamayı elde etmek için atanan moleküler formülünkiyle karşılaştırıldı. A) sadece bir replikasyonda tanımlanan veya b) 10.000'den daha düşük bir alan sunan bileşikler yanlış tanımlamalar olarak kabul edildi. Bu analizden plazma örneklerinde toplam 25 fenolik bileşik ve metabolit tespit edilmiştir (Tablo 3). Bu listede, hem fenolik bileşikler hem de 3-hidroksifenilvalerik asit ve izopropil 3-(3,4-dihidroksifenil)-2-hidroksipropanoat gibi metabolitleri bulunmuştur. Negatif iyonizasyon modu, antosiyaninler hariç tüm fenolik bileşik sınıfları için en uygun olduğundan, bu bileşikler mevcut yöntemle tespit edilememiştir. Antosiyaninler gıda matrisinin önemli bileşenleriyse, pozitif mod da kullanılmalıdır.
| Fenolik metabolitler | R.T. (dk) | Formül | Öncül | Deneysel kütle | Teorik kütle | Fark (ppm) | |
| 2,3-Dihidroksibenzoik asit | 0.622 | C7H6O4 Serisi | 153.0203 | 154.0273 | 154.0266 | 4.2 | |
| 2-Hidroksihippurik asit | 8.631 | C18H33NO4 göster | 410.1648 | 411.1725 | 411.1717 | 1.8 | |
| 3,4-Dihidroksitoluen | 2.239 | C7H8O2 Serisi | 123.0451 | 124.0524 | 124.0524 | -0.25 | |
| 3-Hidroksifenilvalerik asit | 6.717 | C11H14O3 göster | 193.0874 | 194.0947 | 194.0943 | 2.12 | |
| 5-(3',4'-dihidroksifenil)-valerik asit | 4.293 | C11H14O4 göster | 209.0823 | 210.0894 | 210.0892 | 0.68 | |
| 6-Hidroksienterodiol | 9.201 | C18H22O5 göster | 317.1387 | 318.1465 | 318.1467 | -0.65 | |
| Ajugol | 3.889 | C15H24O9 göster | 347.134 | 348.1418 | 348.142 | -0.59 | |
| Benzoik asit | 3.915 | C7H6O2 Serisi | 121.0296 | 122.0367 | 122.0368 | -0.28 | |
| Karnosik asit | 6.785 | C20H28O4 göster | 331.1905 | 332.1979 | 332.1988 | -2.58 | |
| Karnosol | 6.347 | C20H26O4 göster | 329.1764 | 330.1842 | 330.1831 | 3.43 | |
| Catechol (Kedi) | 0.892 | C6H6O2 Serisi | 109.0297 | 110.037 | 110.0368 | 1.91 | |
| Glisitin | 6.01 | C22H22O10 göster | 445.1155 | 446.1228 | 446.1213 | 3.4 | |
| Hesperetin | 6.01 | C16H14O6 göster | 301.0718 | 302.0796 | 302.079 | -1.81 | |
| Hippurik asit | 1.396 | C9H9NO3 Serisi | 178.051 | 179.058 | 179.0582 | -1.16 | |
| Homovanillik asit | 0.823 | C9H10O4 göster | 181.0503 | 182.0576 | 182.0579 | -1.88 | |
| İzopropil 3-(3,4-Dihidroksifenil)-2-hidroksipropanoat | 6.177 | C12H16O5 göster | 239.0926 | 240.0999 | 240.0998 | 0.48 | |
| Fenilasetik asit | 5.666 | C8H8O2 Serisi | 135.0444 | 136.0518 | 136.0524 | -4.92 | |
| Floretik asit | 2.811 | C9H10O3 göster | 165.0556 | 166.0626 | 166.063 | -2.41 | |
| Protokateçuik aldehit | 1.094 | C7H6O3 Serisi | 137.0247 | 138.0311 | 138.0317 | -4.5 | |
| Sekoizolarisiresinol | 8.837 | C20H26O6 göster | 361.1656 | 362.1729 | 362.1729 | -0.23 | |
| Vanilin | 2.508 | C8H8O3 Serisi | 151.04 | 152.0471 | 152.0473 | -1.82 | |
| Epikateşin 3'-O-glukuronid | 9.342 | C21H22O12 göster | 465.1024 | 466.109 | 466.1111 | -4.64 | |
| Gomisin M2 | 5.234 | C22H26O6 göster | 385.1676 | 386.1746 | 386.1729 | 4.38 | |
| İrisolidon | 6.145 | C17H14O6 göster | 313.0727 | 314.0798 | 314.079 | 2.33 | |
| Ürolit C | 6.753 | C13H8O5 göster | 243.0294 | 244.0368 | 244.0372 | -1.69 | |
Tablo 3: Plazma örneklerinde fenolik bileşiklerin ve metabolitlerin yarı hedefli UPLC-MS/MS yöntemi ile geçici olarak tanımlanması.
RSF içeren kek ve içecekten emilen ana fenolik bileşiklerin veya metabolitlerinin tanımlanması için tasarlanan yöntemin etkinliğini değerlendirmek için, 30 günlük müdahaleden önce ve sonra elde edilen çalışma katılımcılarının beş aleatory örneği analiz edildi. Her bileşiğin nispi bolluğu, tedaviden önce AUC tarafından yapılan tedaviden sonra eğrinin altındaki alanın (AUC) bölünmesiyle hesaplandı. Bu analizden, bazı bileşiklerin sadece tedaviden önce elde edilen örneklerde ortaya çıktığını, diğerlerinin değişmeden kaldığını, bazılarının ise fonksiyonel gıdaların tüketiminden sonra arttığını gözlemlemek mümkün olmuştur. Tablo 4 , RSF içeren gıdaların 30 günlük tüketiminden sonra plazmada bir artış gösteren 12 fenolik bileşiğin listesini göstermektedir. Fenilasetik asit, tedaviden sonra sürekli olarak daha yüksek konsantrasyonlarda bulunan tek metabolitti. Glisitin, glikozile bir izoflavon ve 3-hidroksifenilvalerik asit (fenolik bir metabolit) beş numunenin üçünde artmış, ancak diğer ikisinde azalmıştır. Bir lignan olan Gomisin M2, beş numunenin üçünde ancak beslenme müdahalesinden sonra tespit edildi. Diğer fenolik bileşikler (hesperetin, sekoizolarisiresinol ve vanilin gibi) ve metabolitler (2-hidroksihippurik asit gibi) sadece bir numunede ve sadece tedaviden sonra bulundu.
| Numune (tedaviden sonra AUC/tedaviden önce AUC) | |||||||
| Bileşik | Formül | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| 2-Hidroksihippurik asit | C18H33NO4 göster | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| 3-Hidroksifenilvalerik asit | C11H14O3 göster | 1.30 | 2.69 | 2.69 | 0.62 | 0.62 | |
| 6-Hidroksienterodiol | C18H22O5 göster | Nd | Nd | T | Nd | Nd | |
| Glisitin | C22H22O10 göster | 1.88 | 1.07 | 1.07 | 0.43 | 0.45 | |
| Hesperetin | C16H14O6 göster | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Fenilasetik asit | C8H8O2 Serisi | 4.06 | T | T | T | 1.28 | |
| Floretik asit | C9H10O3 göster | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Protokateçuik aldehit | C7H6O3 Serisi | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Sekoizolarisiresinol | C20H26O6 göster | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Vanilin | C8H8O3 Serisi | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Gomisin M2 | C22H26O6 göster | Nd | T | T | T | Nd | |
Tablo 4: RSF içeren gıdaların 30 günlük tüketiminden sonra yaşlı bireylerin plazmasında artan fenolik bileşiklerin listesi. Veriler, tedaviden sonra her bir bileşiğin bolluğunun (AUC) oranları, tedaviden önceki bolluklarına kıyasladır. T, bileşiğin sadece tedaviden sonra numunede tanımlandığını gösterir. Nd: algılanmadı.
Şekil 2: Fenolik bileşik metabolitlerin yarı hedefli UPLC-MS/MS ile tanımlanması için protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir gıda veya gıda takviyesinin tüketiminden sonra emilen biyoaktif fitokimyasalların tanımlanması ve miktarının belirlenmesi, bu bileşiklerin ve bunları içeren gıdaların sağlık yararlarını göstermek ve anlamak için çok önemlidir. Bu çalışmada, sadece yaşlılar için özel olarak formüle edilmiş iki gıda ürünü ile 30 günlük bir beslenme müdahalesinden sonra plazmada konsantrasyonu artan ana fenolik bileşiklerin ve metabolitlerinin tanımlanmasına yönelik UPLC-MS / MS yöntemi geliştirilmiştir. Bir bileşiğin plazmada sadece müdahale süresinden sonra artması veya ortaya çıkması durumunda, bu bileşiğin müdahalede kullanılan gıdalardan emildiği ve / veya biyotransforme edildiği varsayılmaktadır.
UPLC-MS/MS, bazı işlemlerin veya çevresel değişikliklerin etkisini değerlendirmek için karmaşık numunelerde aynı anda birçok düşük moleküler ağırlıklı bileşiğin analiz edildiği metabolomik çalışmalar için tercih edilen teknolojilerden biridir13. Bu, hedefli ve hedefsiz (veya küresel) yöntemlerle yapılabilir. Hedeflenen analizler, bilinen, az sayıda ilgi çekici metabolitlere odaklanır. Bileşikleri mevcut standartlarla ölçmek için en iyi seçenektir, en iyi özgüllüğü ve hassasiyeti sağlar; ancak, bu yöntemler seçilen metabolitler için tamamen optimize edilmelidir ve numunelerde beklenmeyen bileşikleri tespit edemezler12. Diğer çalışmalarda, HPLC, plazmadaki fenolik asitleri ve metabolitleri tanımlamak için bir UV-vis dedektörü ile birlikte kullanılmıştır, ancak bu tür bir çalışma, ilgilenilen bileşiği tanımlamak ve ölçmek için analitik standartları kullanmıştır15. Başka bir çalışmada, bir iç standardın eklenmesi önerilmiştir18; ancak bu çalışmada sadece ferulik ve kafeik asitler ve metabolitleri analiz edilmiştir. Öte yandan, fenolik metabolitlerin iç standartlarının sentezi, ticari analitik standartların eksikliğine alternatif olarak önerilmiştir19. Bununla birlikte, çok çeşitli fenolik bileşiklerin sentezi zor, zaman alıcı ve pahalıdır. Hedeflenmemiş yöntemler, mümkün olduğunca çok sayıda moleküler bileşiği tespit etmeye ve tanımlamaya çalışır ve öncelikle hipotez üretir12. m/z veya ölçülen doğru kütle, kromatografik tutma süresi, izotopik parmak izi vb. gibi karakteristik özelliklere sahip algılanabilir kromatografik sinyallere formüller atayarak bir numunedeki yüzlerce bileşiği tanımlayabilirler, bu nedenle bu analizler tarafından üretilen veriler çok fazladır ve yorumlanması zor olabilir20 . Mevcut yöntemin amacı, plazma örneklerinin tam bir metabolik profilini elde etmek (hedeflenmemiş bir yaklaşım olacaktır) değil, içlerindeki başlıca fenolik bileşikleri ve fenolik metabolitleri (daha önce bilinmeyen) tanımlamak olduğundan, yarı hedefli bir yaklaşım tasarlanmıştır. Bunun için, tanımlanan tüm sinyaller cihazın yazılımı ile otomatik olarak çıkarıldı ve daha sonra ücretsiz çevrimiçi veritabanlarından elde edilen 645 fenolik bileşik ve metabolitlerini içeren kendi kendine oluşturulan bir veritabanı ile karşılaştırıldı. Veri tabanı, bileşik adının ve formülünün atanması için kullanılan bileşiklerin referans MS / MS parçalanma modellerini içeriyordu ve bu da numunedeki bileşiklerin daha doğru bir şekilde tanımlanmasını sağlıyor12.
Protokoldeki en kritik adımlar 1) numune ön işlemi (plazma örneklerinden fenolik bileşiklerin ve metabolitlerin ekstraksiyonu ve konsantrasyonu); 2) Numunelerin yarı hedefli analizi ve belirli bir bileşik sınıfına ait tüm olası bileşiklerin tanımlanması için eksiksiz ve spesifik bir veri tabanının oluşturulması; ve 3) numunedeki bileşikleri doğru bir şekilde tanımlamak için cihazın kalitatif yazılımı (kütle eşleşme toleransı ppm ve skor) tarafından kullanılan parametrelerin seçimi. Numune ön işleminde, ilgilenilen bileşiklerin kaybını önlemek, bunları yüksek bir nihai konsantrasyonda geri kazanmak ve müdahale eden bileşikleri ortadan kaldırabilmek için dikkatli olunmalıdır. Belirli bir veritabanının oluşturulmasında, kapsamlı bir literatür taraması yapmak ve daha sonra numunede bileşik tanımlama için kullanılacak belirli kimyasal verileri elde etmek için ücretsiz çevrimiçi veritabanlarını kullanmak çok önemlidir. Kütle eşleşmesi ve skor için en iyi değerlerin seçilmesi, standartlar ve bilinen numuneler kullanılarak analitik yöntemin önceden doğrulanmasını gerektiriyordu21,22.
Protokol uygulandıktan sonra, yaygın problemler ve önerilen çözümleri şunlardı: 1) Numunelerde hiçbir bileşik tanımlanmadı. Bu, bileşiklerin düşük konsantrasyonundan kaynaklanıyordu ve numuneyi kurutarak ve daha küçük bir hacimde yeniden çözerek çözülebilirdi. 2) TIC'de sinyaller ortaya çıktı, ancak bileşikler tanımlanmadı. Bu, kütle kalibrasyonundaki bir başarısızlıktan kaynaklanıyor olabilir, bu nedenle deneysel ve teorik kütleler arasındaki fark yüksekti. Bu durumda, cihazın kütle kalibrasyonu, ekipmanın üreticisine ve modeline göre yapılmalıdır. İkinci bir neden eksik bir kişisel veritabanı olabilir, bu nedenle veritabanını sürekli kontrol etmek ve sürdürmek çok önemlidir. İlgilendiğinden şüphelenilen bileşik kütleleri kontrol edilebilir ve serbestçe erişilebilen çevrimiçi veritabanları veya yeni bilimsel literatür ile karşılaştırılabilir. 3) Sinyaller boş koşularda ortaya çıktı. Bu, kontaminasyonu gösterir ve otomatik numune alma iğnesi ve kolonunun temizlenmesiyle çözülebilir. Standart temizleme protokolü, metanol, daha sonra izopropanol ve son olarak mobil faz olarak asetonitril kullanarak bazı işlemleri gerçekleştirmektir. Daha sonra sütun, mobil fazı en az 30 dakika boyunca çalıştırarak yeniden dengelenir.
Bu tür bir yöntemin geliştirilmesindeki en büyük zorluklar şunlardır: 1) genel anlamda, fenolik bileşikler de dahil olmak üzere tüm fitokimyasalların düşük biyoyararlanımı, çok düşük plazma konsantrasyonlarına karşılık gelir16; 2) insan enterositlerinde ve hepatositlerinde ve kolonik mikrobiyota23'te meydana gelen metabolizmaları ve biyotransformasyonları ile artan gıdalarda bulunan fenolik bileşiklerin yüksek çeşitliliği; 3) Birçok bileşik için, özellikle metabolitler için standartların eksikliği (bazı standartlar mevcuttur, ancak elde edilmesi çok zordur) ve bazı bilinmeyen veya karakterize edilmemiş bileşiklerin varlığı23; ve 4) fitokimyasalların hem emiliminde hem de metabolizmasında bireyler arasında değişken yanıtlar14. Fenolik metabolitlerin düşük plazma konsantrasyonları sorununun üstesinden gelmek için, bunlar ekstrakte edilmeli ve konsantre edilmelidir. Bu, mikro katı faz ekstraksiyonu14 veya mevcut çalışmada olduğu gibi, proteinleri çökelten ve fenolik bileşikleri ve metabolitleri çözen çözücülerin eklenmesiyle, ardından çözücü buharlaşması ve daha küçük bir hacimde yeniden süspansiyonla sağlanabilir19. Bu teknik basit, ekonomik ve az sayıda numune için yeterlidir. Bununla birlikte, ilgilenilen bileşiklerin geri kazanımı, daha büyük plazma hacimleri kullanılarak kolayca geliştirilebilir, bu nedenle tüm bileşiklerin nihai konsantrasyonu daha yüksek olacaktır. Fenolik metabolitlerin yüksek çeşitliliği ve standartların eksikliği, müdahale tarafından arttırılan bileşikleri ölçmeye çalışmadan önce tanımlamak için yarı hedefli bir yaklaşımın kullanılmasının nedenidir. Tamamen hedefsiz bir analiz yerine özel olarak oluşturulmuş bir veritabanı kullanarak, plazmadaki sayısız birincil metaboliti görmezden gelmek, sadece fenolik bileşiklere ve metabolitlerine odaklanmak mümkündü. Fenolik bileşikler ve insan metabolitleri için spesifik olan bu veritabanının önemli bir sınırlaması, birçok bileşik ve metabolitleri için kütle spektral bilgisinin olmamasıydı ve bu da bileşik tanımlamanın doğruluğunu azaltıyordu.
Fenolik bileşiklerin emilimini ve metabolizmasını hem nicel hem de nitel olarak değerlendiren çalışmalarda bireyler arasında büyük değişkenlik düzenli olarak gözlenmektedir. Mevcut sonuçlarda, bir birey müdahaleden sonra alınan plazma örneğinde 18 bileşik sunarken, diğerleri sadece 9 veya 10 gösterdi. Dahası, birçok fenolik bileşik ve metabolit sadece temel örneklerde (müdahaleden önce) bulundu ve ayrıca bireyler arasında da çeşitlilik gösterdi. Genel olarak, tanımlanan bileşiklerin yarısından fazlası, müdahaleden önce olduğundan daha yüksek konsantrasyonlar (AUC) gösterdi veya sadece müdahale öncesi örneklerde bulundu. Bu nedenle, hangi bileşiklerin gerçekten arttırıldığını anlamak için müdahaleden önce ve sonra alınan bireysel örnekleri karşılaştırmak gerekiyordu. Tedaviden sonra sürekli olarak artan tek metabolit, fenolik bakımından zengin gıdaların tüketimine ilişkin akut çalışmalarda bireylerin plazmasında bulunan flavan-3-ols24'ün mikrobiyal bir kataboliti olan fenilasetik asitti14,25. Plazmadaki fenolik metabolitleri tanımlayan ve nicelleştiren çalışmaların çoğu, fenolik bakımından zengin öğünün tüketiminden sonraki 24 saat boyunca bileşik konsantrasyonlarının izlendiği ve 24 saat sonra konsantrasyonlarının bazal değere yakın olduğunu gözlemleyen akut çalışmalardı19,25. Bu nedenle, bu çalışmada analiz edilen örneklerin düşük sayıda ve konsantrasyonlarda fenolik metabolit göstermesi anlaşılabilir bir durumdur. Son zamanlarda, Zhang ve ark.25, hem akut çalışmalarda hem de 4 haftalık takviyeden sonra kırmızı ahududu tüketimini değerlendirdi. Hem akut hem de kronik müdahalelerin fenolik bileşikleri ve metabolitlerini arttırdığını, 4 haftalık takviyeden sonra, bazı metabolitlerin bazal plazma konsantrasyonunun arttığını (ürolitinler, sinnamik, fenilpropiyonik ve hippurik asitler) ve diğerlerinin azaldığını (konjuge antosiyanin türevleri) gözlemlediler.
Bu makalede geliştirilen yöntemin son bir incelemesi, çoğu bölümde, yaratıldığı amaç için çok uygun olduğunu göstermektedir. Numune ön işlemi basit ve etkiliydi ve fenolik metabolitlerin UPLC ayrımı ve yarı hedefli MS / MS tanımlaması sağlandı. Bu yarı hedefli yöntem, farklı gıda matrislerinden emilebilen fenolik bileşikleri ve insan plazmasında bulunan fenolik metabolitleri tanımlamak için ilk tarama yaklaşımı olarak yararlı olabilir. Dahası, protokol yararlıdır çünkü fenolik bileşiklerden veya metabolitlerden herhangi bir standart bulunmadığında tanımlamaya izin verir. Son olarak, yöntem, plazma örneklerinin az olduğu çoğu in vivo çalışmada kritik olan küçük bir plazma miktarı kullanır. Bununla birlikte, gelecekteki çalışmalar için, özel olarak formüle edilmiş gıdalardan emilen ana fenolik bileşikleri ve metabolitleri daha iyi tanımlamak için kronik müdahaleden önce akut bir çalışma yapılması önerilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Yazarlar, CONACYT, Meksika (CB- 2016-01-286449) ve UACJ-PIVA'nın (Projeler 313-17-16 ve 335-18-13) finansal desteği için minnettardır. OAMB, doktora bursu için CONACYT'e teşekkür eder. UACJ'nin Multimedya Üretim ofisinden gelen teknik destek minnetle kabul edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Tedia | Al1129-001 | LC Mass spectrometry |
| Autosampler | Agilent Technologies | G4226A | 1290 Infinity series |
| C18 reverse phase column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse plus C18 2.1x50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD |
| Centrifuge | Eppendorf | 5452000018 | Mini Spin; Rotor F-45-12-11 |
| Column compartment with thermostat | Agilent Technologies | G1316C | 1290 Infinity series |
| Diode Array Detector (UV-Vis) | Agilent Technologies | G4212B | 1260 Infinity series |
| Electrospray ionnization source | Agilent Technologies | G3251B | Dual sprayer ESI source |
| Formic acid | J.T. Baker | 0128-02 | Baker reagent, ACS |
| Mass Hunter Data Acquisition | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Qualitative Analysis | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Microcentrifuge tube | Brand | BR780546 | Microcentrifuge tube, 2 mL with lid |
| Pure ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-1L | 200 proof, for molecular biology |
| Q-TOF LC/MS | Agilent Technologies | G6530B | 6530 Accurate Mass |
| Quaternary pump | Agilent Technologies | G4204A | 1290 Infinity series |
| Syringe filter | Thermo Scientific | 44514-NN | 17 mm, 0.45 μm, nylon membrane |
| Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | 1290 Infinity series |
| Vial | Agilent Technologies | 8010-0199 | Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps |
| Vial insert | Agilent Technologies | 5183-2089 | Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical |
| Water | Tedia | WL2212-001 | LC Mass spectrometry |
References
- Morley, J. E., Anker, S. D., von Haehling, S. Prevalence, incidence, and clinical impact of sarcopenia: facts, numbers, and epidemiology-update 2014. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 5 (4), 253-259 (2014).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A.
- Beaudart, C., et al. Nutrition and physical activity in the prevention and treatment of sarcopenia: systematic review. Osteoporosis International. 28 (6), 1817-1833 (2017).
- Ozer, H. K. Phenolic compositions and antioxidant activities of Maya nut (Brosimum alicastrum): Comparison with commercial nuts. International Journal of Food Properties. 20 (11), 2772-2781 (2017).
- Subiria-Cueto, R., et al. Brosimum alicastrum Sw. (Ramón): An alternative to improve the nutritional properties and functional potential of the wheat flour tortilla. Foods. 8 (12), 1-18 (2019).
- Martínez-Ruiz, N., Torres, L. E. J., del Hierro-Ochoa, J. C., Larqué-Saavedra, A. Bebida adicionada con Brosimum alicastrum sw.: Una alternativa para requerimientos dietarios especiales. Revista Salud Pública y Nutrición. 18 (3), 1-10 (2019).
- Rodríguez-Tadeo, A., et al. Functionality of bread and beverage added with brosimum alicastrum sw. Seed flour on the nutritional and health status of the elderly. Foods. 10 (8), 1-21 (2021).
- Muñoz-Bernal, ÓA., et al. Nuevo acercamiento a la interacción del reactivo de Folin-Ciocalteu con azúcares durante la cuantificación de polifenoles totales. TIP Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas. 20 (2), 28-33 (2017).
- Luca, S. V., et al. Bioactivity of dietary polyphenols: The role of metabolites. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 60 (4), 626-659 (2020).
- Kawabata, K., Yoshioka, Y., Terao, J. Role of intestinal microbiota in the bioavailability and physiological functions of dietary polyphenols. Molecules. 24 (2), (2019).
- de Llano, D. G., Moreno-Arribas, M. V., Bartolomé, B. Cranberry polyphenols and prevention against urinary tract Infections: Relevant considerations. Molecules. 25 (15), (2020).
- Alsaleh, M., et al. Mass spectrometry: A guide for the clinician. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 9 (5), 597-606 (2019).
- Wang, X., Sun, H., Zhang, A., Wang, P., Han, Y. Ultra-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry as a sensitive and powerful technology for metabolomic studies. Journal of Separation Science. 34 (24), 3451-3459 (2011).
- Feliciano, R. P., Mills, C. E., Istas, G., Heiss, C., Rodriguez-Mateos, A. Absorption, metabolism and excretion of cranberry (poly)phenols in humans: A dose response study and assessment of inter-individual variability. Nutrients. 9 (3), (2017).
- Mateos, R., Goya, L., Bravo, L. Uptake and metabolism of hydroxycinnamic acids (chlorogenic, caffeic, and ferulic acids) by HepG2 cells as a model of the human liver. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (23), 8724-8732 (2006).
- Rodriguez Lanzi,, Perdicaro, C., Antoniolli, D. J., Piccoli, A., Vazquez Prieto, M. A., Fontana, A. Phenolic metabolites in plasma and tissues of rats fed with a grape pomace extract as assessed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Archives of Biochemistry and Biophysics. , 28-33 (2018).
- Hou, Y., He, D., Ye, L., Wang, G., Zheng, Q., Hao, H. An improved detection and identification strategy for untargeted metabolomics based on UPLC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113531 (2020).
- Nagy, K., et al. First identification of dimethoxycinnamic acids in human plasma after coffee intake by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1218 (3), 491-497 (2011).
- Marmet, C., Actis-Goretta, L., Renouf, M., Giuffrida, F. Quantification of phenolic acids and their methylates, glucuronides, sulfates and lactones metabolites in human plasma by LC-MS/MS after oral ingestion of soluble coffee. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 617-625 (2014).
- McCord, J., Strynar, M. Identifying per-and polyfluorinated chemical species with a combined targeted and non-targeted-screening high-resolution mass spectrometry workflow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (146), 1-15 (2019).
- Muñoz-Bernal, ÓA., et al. Phytochemical characterization and antiplatelet activity of Mexican red wines and their by-products. South African Journal of Enology and Viticulture. 42 (1), 77-90 (2021).
- Muñoz-Bernal, ÓA. Enriquecimiento de un vino tinto con un extracto de compuestos fenólicos provenientes de orujo de uva: bioaccesibilidad, análisis sensorial y respuesta biológica. Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. , (2021).
- Low, D. Y., et al. Data sharing in PredRet for accurate prediction of retention time: Application to plant food bioactive compounds. Food Chemistry. , 357 (2021).
- Sánchez-Patán, F., et al. Gut microbial catabolism of grape seed flavan-3-ols by human faecal microbiota. Targeted analysis of precursor compounds, intermediate metabolites and end-products. Food Chemistry. 131 (1), 337-347 (2012).
- Zhang, X., Sandhu, A., Edirisinghe, I., Burton-Freeman, B. M. Plasma and urinary (poly)phenolic profiles after 4-week red raspberry (Rubus idaeus L.) intake with or without fructo-oligosaccharide supplementation. Molecules. 25 (20), (2020).
