Summary
यह प्रोटोकॉल पूर्व विवो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल उत्तेजना के लिए चूहे पूरे कटिस्नायुशूल तंत्रिका ऊतक की तैयारी और पर्यावरण-विनियमित, दो-डिब्बे, सुगंधित खारा स्नान में रिकॉर्डिंग का वर्णन करता है।
Abstract
पूर्व विवो तैयारी स्थानीय ऊतक संरचना को संरक्षित करते हुए शरीर के बाकी हिस्सों से अलगाव में कई न्यूरोफिजियोलॉजिकल प्रक्रियाओं के अध्ययन को सक्षम करती है। यह काम पूर्व विवो न्यूरोफिजियोलॉजी के लिए चूहे कटिस्नायुशूल तंत्रिकाओं की तैयारी का वर्णन करता है, जिसमें बफर तैयारी, पशु प्रक्रियाएं, उपकरण सेटअप और न्यूरोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग शामिल हैं। यह काम इस पद्धति के साथ संभव विभिन्न प्रकार के प्रयोगों का अवलोकन प्रदान करता है। उल्लिखित विधि का उद्देश्य परिणामों में इष्टतम स्थिरता के लिए कसकर नियंत्रित स्थितियों में निकाले गए परिधीय तंत्रिका ऊतक पर उत्तेजना और रिकॉर्डिंग के 6 घंटे प्रदान करना है। इस पद्धति का उपयोग करके प्राप्त परिणाम प्रयोग की पूरी अवधि में मिलीवोल्ट रेंज में पीक-टू-पीक आयाम के साथ ए-फाइबर कंपाउंड एक्शन पोटेंशिअल (सीएपी) हैं। सीएपी आयाम और आकार सुसंगत और विश्वसनीय हैं, जिससे उन्हें मौजूदा मॉडलों के लिए नए इलेक्ट्रोड का परीक्षण और तुलना करने के लिए उपयोगी बनाया जाता है, या ऊतक पर हस्तक्षेप के प्रभाव, जैसे रसायनों, सर्जिकल परिवर्तन, या न्यूरोमोडुलेटरी उत्तेजना तकनीकों का उपयोग। प्लैटिनम-इरिडियम संपर्कों और कस्टम-निर्मित प्रवाहकीय इलास्टोमर इलेक्ट्रोड के साथ पारंपरिक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कफ इलेक्ट्रोड दोनों का परीक्षण किया गया और तंत्रिका उत्तेजना शक्ति-अवधि प्रतिक्रिया के संदर्भ में समान परिणाम दिए गए।
Introduction
सिलिको में मॉडलिंग के रूप में मौलिक तंत्रिका समारोह की वर्तमान समझ में कई पहलुओं की कमी है, विशेष रूप से सोमा, अक्षतंतु और डेंड्राइट्स के बाहर तंत्रिका ऊतक विभाजन के प्रभावों के संबंध में। एक्सोन-माइलिन इंटरैक्शन को अभी भी इस तथ्य से स्पष्ट रूप से समझा जाता है कि यहां तक कि विस्तृत कम्प्यूटेशनल तंत्रिका मॉडल जैसे एमआरजी1 (स्तनधारी नसों के लिए) जो पारंपरिक विद्युत उत्तेजना प्रतिक्रिया को पर्याप्त रूप से कैप्चर करते हैं, अन्य प्रयोगात्मक रूप से देखे गए व्यवहारों को कैप्चर नहीं करते हैं जैसे कि उच्च आवृत्ति ब्लॉक कैरीओवर2 या माध्यमिक शुरुआत प्रतिक्रिया3.
यह प्रोटोकॉल तंत्रिका को अलग करने, अपने पर्यावरण को नियंत्रित करने और इसे पूर्व विवो संदर्भ में विवो संदर्भ से हटाने के लिए एक मानकीकृत तैयारी प्रोटोकॉल का उपयोग करके, एक तीव्र छोटे प्रयोगशाला पशु मॉडल में तंत्रिका स्तर पर न्यूरोफिजियोलॉजिकल प्रक्रियाओं की कुशलतापूर्वक जांच करने के लिए एक विधि प्रदान करता है। यह तंत्रिका व्यवहार को बदलने और मापा परिणाम या उनकी व्याख्या 4,5 को बदलने के लिए विवो तंत्रिका उत्तेजना प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली अन्य शरीर प्रक्रियाओं या संवेदनाहारी को रोक देगा। यह तंत्रिका ऊतकों के लिए विशिष्ट प्रभावों पर पूरी तरह से ध्यान केंद्रित करने वाले अधिक यथार्थवादी मॉडल के विकास को सक्षम बनाता है जो खराब समझे जाते हैं। यह प्रोटोकॉल नई तंत्रिका उत्तेजना और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड सामग्री और ज्यामिति के साथ-साथ उच्च आवृत्ति ब्लॉक 2,3 जैसे नए उत्तेजना प्रतिमानों के लिए एक टेस्टबेड के रूप में भी उपयोगी है। इस तकनीक की विविधताओं का उपयोग पहले कसकर नियंत्रित स्थितियों में तंत्रिका शरीर विज्ञान का अध्ययन करने के लिए किया गया है6, उदाहरण के लिए, आयन चैनल गतिशीलता और गुणों या स्थानीय संवेदनाहारी केप्रभावों को मापने के लिए 7.
यह तकनीक विवो छोटे पशु प्रयोग8 में तीव्र जैसे विकल्पों की तुलना में कई फायदे प्रदान करती है। तकनीक संज्ञाहरण गहराई को बनाए रखने की आवश्यकता को कम करती है क्योंकि ऊतक शरीर से निकाला गया है, जिससे एनेस्थेटिक विसारक, ऑक्सीजन कंसंट्रेटर और हीटिंग पैड जैसे आवश्यक उपकरणों की मात्रा कम हो जाती है। यह प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को सरल बनाता है, गलतियों के जोखिम को कम करता है। चूंकि एनेस्थेटिक्स संभावित रूप से तंत्रिका समारोह4 को बदल सकता है, यह तकनीक यह सुनिश्चित करती है कि उपाय इन संवेदनाहारी यौगिकों से दुष्प्रभावों से भ्रमित नहीं होंगे। अंत में, यह तकनीक टेट्रोडोटॉक्सिन जैसे न्यूरोटॉक्सिक यौगिकों के प्रभावों का अध्ययन करते समय विवो प्रयोगों में तीव्र की तुलना में अधिक उपयुक्त है, जो पक्षाघात द्वारा एक संवेदनाहारी जानवर को मार देगा।
परिधीय तंत्रिका अनुभाग एक अद्वितीय पूर्व विवो प्रणाली हैं क्योंकि एक उच्च संभावना है कि रिकॉर्ड किए गए तंत्रिका संकेतों के लिए जिम्मेदार फाइबर में कोई सोमा नहीं होता है। जैसा कि ये सामान्य रूप से स्थित होंगे, मोटर न्यूरॉन्स के लिए, रीढ़ की हड्डी में, और रीढ़ के बगल में पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया में संवेदी न्यूरॉन्स के लिए, स्तनधारी तंत्रिका के एक खंड की तैयारी को मोटे तौर पर आयन चैनलों के साथ ट्यूबलर झिल्ली के संग्रह के रूप में मॉडलिंग किया जा सकता है, दोनों सिरों पर खुला9. ऊतक विच्छेदन10 के समय अक्षतंतु में स्थित माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा चयापचय बनाए रखा जाता है। एक्सोलेम्मा के खुले सिरों को बंद करने के लिए निष्कर्षण के बाद प्रोत्साहित किया जाता है और इस तरह झिल्ली में मौजूदा आयनिक ढाल को बनाए रखने में मदद मिलती है, जो सामान्य तंत्रिका कार्य के लिए आवश्यक हैं।
शरीर के बाहर ऊतक होमियोस्टेसिस को बनाए रखने के लिए, कई पर्यावरणीय चर को कसकर नियंत्रित किया जाना चाहिए। ये तापमान11,ऑक्सीजनेशन 12, ऑस्मोलरिटी, पीएच13,14 और चयापचय को बनाए रखने के लिए ग्लूकोज तक पहुंच हैं। इस प्रोटोकॉल के लिए, दृष्टिकोण ऑक्सीजन और कार्बन डाइऑक्साइड के मिश्रण के साथ लगातार वातित एक संशोधित क्रेब्स-हेन्सेलाइट बफर 15,16 (एमकेएचबी) का उपयोग करना है। एमकेएचबी कार्डियोप्लेजिक बफर 6,17 के परिवार में है जिसका उपयोग शरीर के बाहर विच्छेदित ऊतकों को संरक्षित करने के लिए किया जाता है, उदाहरण के लिए, पूर्व विवो प्रयोगों में। इन बफर में कोई हीमोग्लोबिन, एंटीबायोटिक्स या एंटिफंगल नहीं होते हैं और इसलिए, केवल सीमित समय के लिए ऊतक की थोड़ी मात्रा से जुड़ी तैयारी के लिए उपयुक्त होते हैं। पीएच नियंत्रण कार्बोनेट और कार्बन डाइऑक्साइड रेडॉक्स जोड़ी के साथ प्राप्त किया गया था, पीएच संतुलन बनाए रखने के लिए कार्बन डाइऑक्साइड के साथ बफर के निरंतर वातन की आवश्यकता होती है। यह एचईपीईएस जैसे अन्य सामान्य बफरिंग एजेंटों का उपयोग करने से बचने के लिए है, जो तंत्रिका कोशिका समारोह18 को संशोधित कर सकते हैं। बफर को ऑक्सीजन देने और पीएच नियंत्रण प्रदान करने के लिए, कार्बोजन (95% ओ 2, 5% सीओ 2) नामक ऑक्सीजन में 5% कार्बन डाइऑक्साइड के मिश्रण का उपयोग किया गया था। एक हीटिंग उत्तेजक का उपयोग एक बफर कंटेनर के तापमान नियंत्रण के लिए किया गया था, और बफर को तंत्रिका स्नान के माध्यम से सुगंधित किया गया था, और फिर शुरुआती कंटेनर में फिर से परिचालित किया गया था। तंत्रिका अपनी व्यवहार्यता खोने से पहले एक विशिष्ट प्रयोग 6-8 घंटे तक चलेगा और अब स्वस्थ ऊतक के प्रतिनिधि होने के उपायों के लिए उत्तेजना के लिए पर्याप्त प्रतिक्रिया नहीं देता है।
सिग्नल-टू-शोर अनुपात को अनुकूलित करने के लिए, रिकॉर्डिंग के लिए सिल्वर-क्लोराइड इलेक्ट्रोड का उपयोग किया गया था, जो पहले वर्णित विधियों19 के अनुसार तैयार किए गए थे। उत्तेजना के लिए, वाणिज्यिक ऑफ-द-शेल्फ प्लैटिनम कफ इलेक्ट्रोड और कस्टम-निर्मित प्रवाहकीय बहुलक कफ इलेक्ट्रोड के संयोजन का उपयोग किया जा सकता है। प्रवाहकीय बहुलक कफ इलेक्ट्रोड में विशेष रूप से उच्च चार्ज क्षमता होती है, जो उच्च आयाम तरंगों का उपयोग करके तंत्रिका को उत्तेजित करते समय उपयोगीहोती है 20.
इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले उत्तेजक को पहले20 वर्णित किया गया है। प्रलेखन, डिजाइन फ़ाइलें, और सॉफ्टवेयर स्क्रिप्ट इसका उपयोग करने के लिए सार्वजनिक रूप से उपलब्ध हैं21. इस प्रोटोकॉल को निष्पादित करने के लिए अन्य उत्तेजक का उपयोग किया जा सकता है; हालांकि, कस्टम उत्तेजक उच्च आवृत्ति वैकल्पिक वर्तमान (एचएफएसी) ब्लॉक2,20 में भी सक्षम है, जो न्यूरोफिजियोलॉजी प्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला को सक्षम बनाता है। एचएफएसी ब्लॉक का उपयोग करने के लिए, तंत्रिका को नुकसान से बचने के लिए प्रवाहकीय इलास्टोमर कफ की सिफारिश की जाती है। प्रवाहकीय इलास्टोमर तंत्रिका कफ नरम और पूरी तरह से बहुलक इलेक्ट्रोड सरणियों हैं जो प्रवाहकीय इलास्टोमर्स से प्रवाहकीय घटक के रूप में और पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन इन्सुलेशन22 के रूप में उत्पन्न होते हैं। पारंपरिक लेजर माइक्रोफैब्रिकेशन तकनीकों का उपयोग करके एक द्विध्रुवी कॉन्फ़िगरेशन में उपकरणों का निर्माण किया गया था।
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Protocol
सभी पशु देखभाल और प्रक्रियाओं को पशु (वैज्ञानिक प्रक्रियाएं) अधिनियम (1986) के तहत यूके होम ऑफिस द्वारा जारी किए गए उचित लाइसेंस के तहत किया गया था और इंपीरियल कॉलेज लंदन के पशु कल्याण और नैतिक समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. बफ़र्स की तैयारी
नोट: प्रोटोकॉल का यह हिस्सा प्रोटोकॉल के बाकी हिस्सों से पहले अच्छी तरह से किया जा सकता है, 1x एकाग्रता पर संशोधित क्रेब्स-हेन्सेलाइट बफर (एमकेएचबी) की तैयारी से जुड़े अंतिम चरणों को छोड़कर।
- 1 एम सीएसीएल2 स्टॉक समाधान तैयार करें
- एक साफ 100 मिलीलीटर बीकर में 14.701 ग्राम सीएसीएल2 डाइहाइड्रेट जोड़ें। विआयनीकृत पानी के ~ 75 मिलीलीटर जोड़ें और नमक के पूर्ण विघटन तक हलचल करें।
- समाधान को 100 एमएल स्नातक फ्लास्क में स्थानांतरित करें और 100 मिलीलीटर मात्रा तक पहुंचने तक विआयनीकृत पानी जोड़ें। समाधान को एक बोतल में स्थानांतरित करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर रेफ्रिजरेटर में स्टोर करें।
- 10x केंद्रित एमकेएचबी स्टॉक तैयार करें
- 66.03 ग्राम सोडियम क्लोराइड (एनएसीएल), 3.57 ग्राम पोटेशियम क्लोराइड (केसीएल), 1.63 ग्राम पोटेशियम डाइहाइड्रोजन फॉस्फेट (केएच2पीओ4), और 1.44 ग्राम मैग्नीशियम सल्फेट को 2 एल बीकर में जोड़ें।
- बीकर में ~ 750 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी जोड़ें और तब तक हलचल करें जब तक कि लवण भंग न हो जाएं (नीचे छोटे नमक क्रिस्टल बचे हो सकते हैं)। 1 एम सीएसीएल 2 स्टॉक समाधान (चरण 1.1) के25 एमएल जोड़ें और हलचल; सुनिश्चित करें कि यह अंतिम नमक जोड़ा गया है।
- समाधान को 1 एल स्नातक फ्लास्क में स्थानांतरित करें और 1 एल की कुल मात्रा तक पहुंचने के लिए विआयनीकृत पानी जोड़ें। एक रेफ्रिजरेटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रित 10x एमकेएचबी स्टोर करें।
नोट: केंद्रित एमकेएचबी स्टॉक प्रतिस्थापन से पहले लगभग 1 महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।
- विच्छेदन पेट्री डिश (कोटिंग) तैयार करें
- पकवान को सावधानी से धोने और सुखाने के द्वारा कोटिंग के लिए एक साफ ग्लास पेट्री डिश (120 मिमी व्यास) तैयार करें।
- अनुरूप अल्कोक्सी कोटिंग के उपयोग और इलाज के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, वांछित मोटाई तक पहुंचने तक पकवान में अनुरूप कोटिंग मिश्रण को सावधानीपूर्वक डालकर ~ 3-5 मिमी कोटिंग के साथ पेट्री डिश के नीचे कोट करें।
- 60 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में कोटिंग का इलाज करें जब तक कि यह स्पर्श करने के लिए दृढ़ न हो। विच्छेदन पेट्री डिश अब तैयार है।
नोट: प्रत्येक उपयोग के बाद पकवान की कोमल सफाई यह सुनिश्चित करेगी कि प्रतिस्थापन की आवश्यकता से पहले कोटिंग वर्षों तक रहती है। कोटिंग को बदलते समय, एक नई कोटिंग लगाने से पहले सभी कोटिंग सामग्री को हटाना सुनिश्चित करें। ध्यान दें कि इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली अनुरूप अल्कोक्सी कोटिंग (सामग्री की तालिका) में एक वर्ष से कम शेल्फ जीवन है।
2. पूर्व विच्छेदन तैयारी
नोट: यह चरण प्रयोग प्रारंभ करता है। नीचे दिए गए चरणों को उसी दिन किया जाना चाहिए, इस क्रम में।
- 1x एमकेएचबी तैयार करें
- बफर के लिए एक साफ 2 एल बीकर तैयार करें। 10x एमकेएचबी स्टॉक के 200 एमएल को 2 एल बीकर में स्थानांतरित करें। 2 एल बीकर में 2.1 ग्राम सोडियम कार्बोनेट (एनएएचसीओ3) और 0.99 ग्राम निर्जल डेक्सट्रोज (डी-ग्लूकोज) जोड़ें।
- बीकर में लगभग 1 एल विआयनीकृत पानी जोड़ें। तब तक हिलाएं जब तक कि लवण पूरी तरह से भंग न हो जाए। समाधान को 2 एल स्नातक फ्लास्क में स्थानांतरित करें और 2 एल की कुल मात्रा तक पहुंचने के लिए विआयनीकृत पानी जोड़ें।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट तापमान के साथ एक हीटिंग उत्तेजक पर रखा एक 2 एल कांच की बोतल के लिए समाधान स्थानांतरण।
नोट: छोटे हीटिंग उत्तेजक अक्सर पानी से भरे बड़े कंटेनरों की थर्मल जड़ता के कारण लक्ष्य 37 डिग्री सेल्सियस तापमान तक पहुंचने में असमर्थ होंगे। तापमान को ऊपर की ओर समायोजित करें ताकि बोतल की सामग्री सरगर्मी के साथ 37 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच जाए। प्रयोग के दौरान तापमान की निगरानी करें और ओवरशूट की स्थिति में सेट तापमान को कम करें। - थर्मामीटर को सरगर्मी पिस्सू से प्रभावित होने से रोकने के लिए ग्रिपर्स का उपयोग करके तापमान की निगरानी के लिए 2 एल बोतल में थर्मामीटर रखें। समाधान को ऑक्सीजन करने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए कार्बोजन के साथ बफर को वातित करें। यह पीएच को 7.4 पर सेट करना चाहिए। पीएच मीटर के साथ पीएच को मापें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि यह 7.4 (37 डिग्री सेल्सियस पर) की 0.1 पीएच इकाइयों के भीतर है।
नोट: पीएच को 7.4 में समायोजित करने के लिए, जरूरत पड़ने पर हाइड्रोक्लोरिक एसिड या सोडियम हाइड्रॉक्साइड का उपयोग करें। - एमकेएचबी के साथ दो 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब और एक 100 एमएल की बोतल भरें और उन्हें ठंडा करने के लिए बर्फ पर रखें।
नोट: अपकेंद्रित्र ट्यूबों और बोतल को ऑटोक्लेविंग के बिना प्रत्येक प्रयोग के बाद साफ और पुन: उपयोग किया जा सकता है। - प्रयोग के बाद के हिस्सों के लिए, निरंतर सरगर्मी के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कार्बोजन के साथ 2 एल बोतल में बफर को वातित करना जारी रखें।
नोट: कार्बोजेन का असुरक्षित उपयोग खतरनाक हो सकता है यदि रिसाव की स्थिति में गैस प्रवाह को बंद करने के लिए कोई स्वचालित सिस्टम नहीं है। एक स्वचालित सेंसर और इलेक्ट्रॉनिक शटऑफ वाल्व इसे कम कर सकता है; अन्यथा, एक व्यक्ति को उपकरण की देखरेख करने के लिए छोड़ दिया जाना चाहिए यदि विच्छेदन एक अलग कमरे में होता है। सभी मामलों में, परिवेश ऑक्सीजन एकाग्रता 25% से ऊपर बढ़ने पर ऑपरेटरों को चेतावनी देने के लिए सेटअप के पास एक ऑक्सीजन सेंसर का उपयोग किया जाना चाहिए। यदि संभव हो तो सक्रिय वेंटिलेशन वाले कमरे का उपयोग करें।
- तापमान स्थिरीकरण के लिए पर्याप्त समय की अनुमति देने के लिए, रिकॉर्डिंग और उत्तेजना के लिए सिग्नल अधिग्रहण डिवाइस, कम शोर प्रीएम्पलीफायर, लाइन शोर फिल्टर और ऑसिलोस्कोप चालू करें।
- सुनिश्चित करें कि सभी विद्युत रिकॉर्डिंग उपकरण सही ढंग से कॉन्फ़िगर किया गया है
- इनपुट बैंड-पास फ़िल्टर के साथ एसी-युग्मित इनपुट पर कम शोर प्रीम्पलीफायर सेट करें प्रति दशक 6 डीबी रोल-ऑफ पर सेट करें, और कटऑफ आवृत्तियों को क्रमशः उच्च-पास और कम-पास फिल्टर के लिए 30 हर्ट्ज और 3 किलोहर्ट्ज़ पर सेट करें।
- कम शोर प्रीएम्पलीफायर के लाभ को 100 पर सेट करें।
3. पशु संज्ञाहरण और इच्छामृत्यु
नोट: 250 और 330 ग्राम (सामग्री की तालिका) के बीच मादा चूहों का उपयोग अध्ययन के लिए किया गया था।
- सर्जिकल उपकरण और उपभोग्य सामग्रियां तैयार करें: 12 सेमी सीधे कैंची (कुंद); 2 मिमी काटने के किनारे कोण वसंत कैंची; 4 सेमी ठीक कैंची, तेज या अर्ध-तेज; # 7 ड्यूमोंट संदंश; 45 ° कोण ठीक संदंश और 6-0 टांके रेशम या धागे।
- चूहे को एनेस्थेटाइजेशन कंटेनर या चैंबर में रखें। ऑक्सीजन और संवेदनाहारी विसारक को कंटेनर से कनेक्ट करें। संवेदनाहारी (आइसोफ्लूरेन) एकाग्रता को 3.5% पर सेट करें और लगभग 10 मिनट प्रतीक्षा करें या जब तक कि जानवर संज्ञाहरण के संकेत नहीं दिखाता है जैसे कि सही पलटा का नुकसान।
- चूहे संज्ञाहरण के संकेत दिखाता है के बाद, एक पैर की अंगुली चुटकी वापसी पलटा परीक्षण के साथ चेतना के नुकसान की पुष्टि करें। पैर की अंगुली की निकासी न होने पर ही आगे बढ़ें; अन्यथा, विसारक में सभी कनेक्शन और संवेदनाहारी स्तरों की जांच करें और चरण 3.2 दोहराएं।
- जानवर को कंटेनर से बाहर निकालें और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के साथ आगे बढ़ें, इसके बाद मृत्यु की पुष्टि के लिए एक ऊरु धमनी का चीरा लगाया जाए।
4. विच्छेदन प्रोटोकॉल
नोट: विच्छेदन तालिका पर अपने पेट के साथ जानवर रखें। दोनों पैरों के लिए निम्नलिखित चरणों को दोहराएं। आमतौर पर, दाहिने पैर को पहले विच्छेदित किया जाता है।
- अंगूठे, तर्जनी और मध्यमा उंगली के बीच टखने को मजबूती से पकड़कर, 12 सेमी सीधे कुंद कैंची का उपयोग करके कैल्केनियल कण्डरा को अलग करें।
- ठीक तेज कैंची के साथ, रीढ़ की हड्डी के आधार तक पैर के पीछे कैल्केनियल कण्डरा से त्वचा चीरा बनाएं, ध्यान रखें कि नीचे की मांसपेशियों के ऊतकों को विच्छेदित न करें।
- ठीक संदंश और ठीक कैंची का उपयोग करके, कटिस्नायुशूल तंत्रिका उजागर होने तक पैर के पीछे के बीच के पास मांसपेशियों की परतों के माध्यम से सावधान चीरे बनाएं। जैसे ही कटिस्नायुशूल तंत्रिका दिखाई देती है, तंत्रिका को सूखने से रोकने के लिए बर्फ-ठंडे एमकेएचबी का उपयोग करके गुहा को मॉइस्चराइज करें।
- हेमोस्टैट्स का उपयोग करके, प्रत्येक तरफ त्वचा के फ्लैप को अलग करें, और महीन विच्छेदन कार्य के लिए चीरा खुला रखें। ठीक कैंची के साथ कैल्केनियल कण्डरा चीरा के स्थान से शुरू, तंत्रिका को मुक्त करने के लिए पैर के औसत दर्जे की तरफ मांसपेशियों को बाधित करें। बर्फ-ठंडे एमकेएचबी वाले क्षेत्र में नमी के स्तर को बनाए रखना जारी रखें।
- जैसा कि पैर को ऊपर ले जाने के दौरान तंत्रिका उजागर होती है, अतिरंजित मांसपेशियों के ऊतकों को विच्छेदित करें। रीढ़ की हड्डी के करीब तंत्रिका को संयोजी ऊतकों से मुक्त करें जब तक कि रीढ़ की हड्डी के फांक तक नहीं पहुंच जाता है, जिस बिंदु पर तंत्रिका में एक गुत्थी होती है। तंत्रिका को साफ करने का प्रयास न करें क्योंकि इस स्तर पर गति आवश्यक है।
- ठीक कैंची के साथ जितना संभव हो सके रीढ़ की हड्डी के करीब तंत्रिका को अलग करें। विच्छेदन को आसान बनाने के लिए, बहुत धीरे संदंश का उपयोग करके टखने के पास तंत्रिका के अंत को खींचें। बीच में तंत्रिका को कभी चुटकी न लें, लेकिन केवल सिरों। कभी भी तंत्रिका तना हुआ न खींचें।
वैकल्पिक: इस बिंदु पर, यदि समय अनुमति देता है, तो व्यवहार्यता बनाए रखने में मदद करने के लिए तंत्रिका के दोनों सिरों का टांका लगाया जा सकता है। नुकसान को रोकने के लिए कम से कम हैंडलिंग रखें। यदि अपर्याप्त समय है (चरण 4.5 देखें), तो इस चरण को छोड़ दें और बाद में चरण 5.2 का पालन करें। - एमकेएचबी (चरण 2.1.5) से भरे 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में विच्छेदित तंत्रिका रखें, ट्यूब को बंद करें, और सफाई प्रक्रिया की शुरुआत तक ट्यूब को बर्फ पर वापस रखें।
- दूसरे पैर के लिए चरण 4.1-4.7 दोहराएं। आदर्श रूप से, ऊतक व्यवहार्यता को अधिकतम करने के लिए, प्रत्येक तंत्रिका को निकालने के लिए 5-10 मिनट लगना चाहिए।
5. तंत्रिका सफाई प्रक्रिया
- ठंडा ऑक्सीजन युक्त एमकेएचबी के साथ लेपित पेट्री डिश को लगभग आधे रास्ते में भरें। विच्छेदित कटिस्नायुशूल नसों में से एक को पकवान में रखें और तंत्रिका के दोनों सिरों को पकवान में पिन करें जैसे कि तंत्रिका बिना किंक, मरोड़ या मोड़ के सीधे हो। तंत्रिका को जितना संभव हो उतना सिरों के करीब पिन करें।
- 6-0 रेशम टांके या ठीक धागे का उपयोग करके, बफर में साइटोसोल रिसाव को रोकने के लिए तंत्रिका के प्रत्येक छोर के चारों ओर एक डबल गाँठ बांधें। तंत्रिका के केंद्र के करीब कीट पिन के बगल में समुद्री मील रखें, क्योंकि यह तंत्रिका ऊतक से बफर में रिसाव को रोक देगा। यदि तंत्रिका को पहले लिगेट किया गया है तो इस चरण को न करें।
- परिशुद्धता और 2 मिमी कोण वसंत कैंची के लिए माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, तंत्रिका से वसा, रक्त वाहिकाओं और मांसपेशियों के ऊतकों को हटा दें। उत्तेजना और रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल में उपयोग नहीं किया जाएगा कि किसी भी तंत्रिका शाखाओं की छंटाई।
- सफाई के हर 5 मिनट, ताजा ठंडा ऑक्सीजन युक्त एमकेएचबी के साथ बफर को बदलें। विच्छेदन को कम करने के लिए संयोजी ऊतकों, वसा और रक्त वाहिकाओं पर खींचने के लिए ठीक संदंश का प्रयोग करें।
- नसों को ताजा ऑक्सीजन युक्त ठंडा एमकेएचबी से भरे परिवहन ट्यूबों में वापस रखें और ट्यूबों को बर्फ पर रखें।
6. उपकरण सेटअप
नोट: प्रयोगों को पूरा करने के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरण सेटअप को चित्रा 1 में सचित्र किया गया है। संक्षेप में, इसमें एक दोहरे डिब्बे तंत्रिका स्नान, एक हीटिंग उत्तेजक पर रखी गई 2 एल बोतल, बफर वातन के लिए कार्बोजन का एक स्रोत, और बफर को बोतल से स्नान तक प्रवाहित करने की अनुमति देने के लिए ट्यूबिंग और एक पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग करके बोतल में वापस आने की अनुमति मिलती है। स्नान को प्लेक्सीग्लास से बाहर निकाला जा सकता है या वाटरटाइट सामग्री से 3 डी-मुद्रित किया जा सकता है। इसकी गहराई लगभग 2 सेमी है, और स्नान के दो कक्षों को अलग करने वाले विभाजन में दोनों कक्षों में परिधीय तंत्रिका के थ्रेडिंग की अनुमति देने के लिए 1.5 मिमी व्यास का छेद है। एक कक्ष बड़ा है, कम से कम 4 या 5 सेमी लंबा होना चाहिए, और बफर से भरा होगा। दूसरा कक्ष कम से कम 3 सेमी लंबा होना चाहिए और सिलिकॉन या खनिज तेल से भरा होगा। स्नान को बहुत बड़ा नहीं बनाया जाना चाहिए क्योंकि यह छिड़काव, तापमान और पीएच के नियंत्रण को नीचा दिखाएगा। अध्ययन किए जा रहे तंत्रिका ऊतक के आकार के आधार पर विभिन्न स्नान आकारों की आवश्यकता हो सकती है।
- एक साफ दोहरी कक्ष तंत्रिका स्नान तैयार करें (डिजाइन विनिर्देशों के लिए पूरक फ़ाइल देखें)। मानक प्रयोगशाला बॉस सिर और ग्रिपर्स का उपयोग करके हीटिंग उत्तेजक पर रखी गई 2 एल बोतल के स्तर से नीचे तंत्रिका स्नान रखें। स्नान की नाली को पेरिस्टाल्टिक पंप इनलेट से कनेक्ट करें।
- पेरिस्टाल्टिक पंप के आउटलेट को 2 एल बफर बोतल पर वापस जाने वाली ट्यूब से कनेक्ट करें। स्नान इनलेट को समायोज्य प्रवाह वाल्व के साथ एक ट्यूब से कनेक्ट करें और ट्यूब को 2 एल बोतल के अंदर रखें। गुरुत्वाकर्षण-सहायता प्राप्त बफर प्रवाह के लिए साइफन के रूप में ट्यूब को भड़काने में मदद करने के लिए मध्य आउटलेट से जुड़े सिरिंज के साथ तीन-तरफा वाल्व का उपयोग करें।
- सिरिंज ड्राइंग द्वारा साइफन प्राइम जब तक बफर इसमें प्रवाहित होता है। वाल्व को कॉन्फ़िगर करें जैसे कि स्नान में बफर की प्रवाह दर ~ 5-6 एमएल · मिनट -1 है। स्नान को भरने के लिए प्रवाह को शुरू में बढ़ाया जा सकता है। एक बार स्नान बफर स्तर नाली तक पहुंच जाने के बाद, स्नान में नसों को रखें।
- एक कीट पिन का उपयोग करके, बफर से भरे स्नान कक्ष के कोने पर तंत्रिका के अंत को सुरक्षित करें। 45 ° कोण ठीक संदंश का उपयोग करना और केवल सिरों पर तंत्रिका को चुटकी लेना, ध्यान से दो स्नान कक्षों के बीच विभाजन में छेद के माध्यम से उत्तेजित होने के लिए तंत्रिका को थ्रेड करें।
- एक कीट पिन के साथ स्नान के तेल कक्ष में तंत्रिका के दूसरे छोर को सुरक्षित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि तंत्रिका बिना फैले सीधे है और किंक और ट्विस्ट से मुक्त है। सिलिकॉन ग्रीस का उपयोग करके, बफर चैंबर से तेल कक्ष में बफर रिसाव को रोकने के लिए एक सील बनाएं। सिलिकॉन या खनिज तेल के साथ तेल कक्ष भरें।
- एजीसीएल रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड हुक को तेल स्नान कक्ष में रखें और बॉस हेड और ग्रिपर्स का उपयोग करके उन्हें सुरक्षित करें। तंत्रिका तना हुआ खींचने के बिना हुक पर तेल स्नान में तंत्रिका के हिस्से को लपेटें। तंत्रिका चुटकी मत करो; चुटकी के बिना तंत्रिका को उठाने के लिए एंगल्ड संदंश का उपयोग करें।
- तंत्रिका को स्थानांतरित करने के बाद कोई रिसाव देखे जाने पर सिलिकॉन ग्रीस सील को समायोजित या मरम्मत करें।
- एजीसीएल इलेक्ट्रोड को एम्पलीफायर ग्राउंड से कनेक्ट करें और इलेक्ट्रोड को प्रयोगशाला ग्रिपर का उपयोग करके सुरक्षित करके बफर से भरे स्नान कक्ष में रखें।
7. स्नान में तंत्रिका पर इलेक्ट्रोड प्रत्यारोपण
- संदर्भ21 के अनुसार उत्तेजना के लिए एक साफ तंत्रिका कफ इलेक्ट्रोड तैयार करें। इलेक्ट्रोड को बफर से भरे स्नान कक्ष में रखें। कुंद या कोण युक्तियों के साथ संदंश या ठीक चिमटी का उपयोग करके, कफ के अंदर गीला करने के लिए स्नान में इलेक्ट्रोड खोलें।
- यदि बुलबुले बने रहते हैं, तो स्नान से बफर खींचने और बुलबुले को कफ से बाहर निकालने के लिए एक ठीक सिरिंज का उपयोग करें। तंत्रिका के नीचे एक चिमटी के साथ, धीरे से कफ खोलें और इसे तंत्रिका के नीचे स्लाइड करें। तंत्रिका के चारों ओर कफ को बंद करें, तंत्रिका के किसी भी किंकिंग या घुमाव से बचने के लिए ध्यान रखें।
- उत्तेजना इलेक्ट्रोड उत्तेजक से कनेक्ट करें और टेप के साथ उत्तेजना इलेक्ट्रोड लीड को सुरक्षित करें। उत्तेजक करने के लिए वर्तमान वापसी इलेक्ट्रोड कनेक्ट और टेप के साथ नेतृत्व सुरक्षित। यदि वर्तमान रिटर्न इलेक्ट्रोड के रूप में एक वर्ग प्लैटिनम शीट का उपयोग करते हैं, तो शीट को स्नान में तंत्रिका से दूर रखें।
8. उत्तेजना और रिकॉर्डिंग
- उत्तेजक टीटीएल सिग्नल आउटपुट को ऑसिलोस्कोप के चैनल 4 से कनेक्ट करें, जिसका उपयोग ऑसिलोस्कोप को ट्रिगर करने के लिए किया जाएगा। ऑसिलोस्कोप स्क्रीन पर, ट्रिगर चैनल टैब दबाएं, और चैनल 4 को ट्रिगरिंग चैनल के रूप में निर्दिष्ट करें। स्तर घुंडी का उपयोग कर 1 वी करने के लिए ट्रिगर स्तर सेट करें।
- ऑसिलोस्कोप पर, 1 एमएस /डिवीजन के लिए समय रिज़ॉल्यूशन और 10 एमवी / डिवीजन के लिए वोल्टेज रिज़ॉल्यूशन सेट करें। समय में ट्रिगर संदर्भ को केंद्र में रखें और ट्रिगर स्तर को 1 वी पर सेट करें।
नोट: कस्टम उत्तेजक का उपयोग करते समय 8.3 से 8.6 चरणों का पालन करें ( सामग्री की तालिका देखें)। यह माना जाता है कि कस्टम तंत्रिका उत्तेजक21 के लिए स्वतंत्र रूप से ऑनलाइन प्रदान किए गए निर्देशों का उपयोग करके मैटलैब सॉफ्टवेयर और डिवाइस ड्राइवरों को प्रयोगशाला कंप्यूटर पर स्थापित किया गया है। अन्यथा, एक विकल्प के रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उत्तेजक के उपयोग के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें। - उत्तेजक को प्रयोगशाला कंप्यूटर से कनेक्ट करें। बैटरी पावर सप्लाई को पावर इनपुट से कनेक्ट करके उत्तेजक को चालू करें। प्रयोगशाला कंप्यूटर पर MATLAB सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें।
- कस्टम मैटलैब स्क्रिप्ट निष्पादित करें: HFAC_4ch_Stimulator_Initialization बजे (सामग्री की तालिका)।
नोट: कंप्यूटर और उत्तेजक के बीच यूएसबी संचार केबल हरे रंग की फ्लैश होनी चाहिए। यदि ऐसा नहीं होता है, तो एक कॉन्फ़िगरेशन त्रुटि है, और बिजली की आपूर्ति और कनेक्शन सत्यापित किया जाना चाहिए। - मैटलैब स्क्रिप्ट खोलें: HFAC_4ch_Monophasic_Stimulation बजे (सामग्री की तालिका)। मैटलैब स्क्रिप्ट को सीधे संपादित करके, मापदंडों को निम्नानुसार सेट करें: उत्तेजक पल्स आयाम = -300 μA, उत्तेजक पल्स चौड़ाई = 300 μs, दालों की उत्तेजक संख्या = 10 और दालों के बीच उत्तेजक समय = 1 एस।
- मैटलैब सॉफ्टवेयर में रन पर क्लिक करके उत्तेजना प्रोटोकॉल शुरू करें।
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Representative Results
प्रतिनिधि परिणाम है कि इस प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त किया जा सकता कटिस्नायुशूल तंत्रिका के भीतर ए प्रकार तंत्रिका तंतुओं से लगातार यौगिक कार्रवाई क्षमता रहे हैं। इन एक्शन पोटेंशिअल में आमतौर पर इलेक्ट्रोड पर लगभग 1 एमवी का पीक-टू-पीक आयाम होता है और इसलिए 100 एमवी एक बार प्रवर्धित होता है (चित्रा 2)। समान उत्तेजना आयाम और नाड़ी चौड़ाई समान सीएपी आयाम पैदा करना चाहिए। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्लैटिनम कफ इलेक्ट्रोड की तुलना में एक ही सीएपी आयाम प्राप्त करने के लिए प्रवाहकीय इलास्टोमर कफ इलेक्ट्रोड को आमतौर पर थोड़ा अधिक उत्तेजना आयाम की आवश्यकता होगी। यह अंतर आम तौर पर विभिन्न जानवरों से आने वाली नसों को उत्तेजित करने के लिए आवश्यक उत्तेजना आयाम में भिन्नता की तुलना में छोटा होता है। ऐसा इसलिए है क्योंकि तंत्रिका आकार और कफ फिट में छोटे अंतर कफ सामग्री की परवाह किए बिना एक विशिष्ट सीएपी आयाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक उत्तेजना आयाम पर एक बड़ा प्रभाव डालते हैं। इसका उपयोग विभिन्न बफर रचनाओं के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि विभिन्न आयन सांद्रता या तंत्रिका उत्तेजक या निरोधात्मक पदार्थों जैसे टेट्रोडोटॉक्सिन के अलावा। यदि बफर अपशिष्ट पाइप को एक अतिरिक्त कंटेनर में रूट किया जाता है, तो तंत्रिका उत्तेजना-फेरबदल पदार्थों के अलावा प्रयोग के लिए अस्थायी बनाया जा सकता है, जिसमें बफर प्रवाह की दर पर निर्भर वॉश-आउट दरें होती हैं।
न्यूनतम वर्तमान घनत्व, उत्तेजना इलेक्ट्रोड की सतह क्षेत्र द्वारा विभाजित उत्तेजना आयाम के रूप में गणना की, ए-प्रकार के तंतुओं को सक्रिय करने के लिए आवश्यक है, और आस्टसीलस्कोप की एक अवलोकन योग्य यौगिक कार्रवाई क्षमता प्राप्त करने के लिए चित्रा 3 में पल्स चौड़ाई बनाम साजिश रची गई थी। चित्रा 3 में दिखाए गए परिणाम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानक प्लैटिनम तंत्रिका कफ और कस्टम-निर्मित प्रवाहकीय इलास्टोमर तंत्रिका कफ दोनों के लिए विशिष्ट तंत्रिका उत्तेजना का प्रतिनिधित्व करते हैं।
निकाले गए तंत्रिकाओं को निष्कर्षण के बाद लगभग 6 घंटे के लिए व्यवहार्य रहना चाहिए और इसलिए, प्रयोगों को इस समय खिड़की के भीतर फिट होना चाहिए। तंत्रिका व्यवहार्यता के नुकसान से सीएपी आयाम और चालन गति में प्रगतिशील गिरावट आती है। एक्शन पोटेंशियल आयाम प्रारंभिक आयाम (रिकॉर्डिंग की शुरुआत में) के 50% से नीचे गिरने के बाद, तंत्रिका को अब व्यवहार्य नहीं माना जाना चाहिए क्योंकि परिणाम काफी तिरछे होंगे। तंत्रिका दीर्घायु के संबंध में प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 4 में दिखाए गए हैं। दाएं और बाएं कटिस्नायुशूल तंत्रिकाओं को एक जानवर से किसी दिए गए दिन सुबह 10:00 बजे से 11:00 बजे के बीच निकाला गया था। प्रयोगों से पहले प्रारंभिक परीक्षणों के दौरान दाएं कटिस्नायुशूल तंत्रिका से प्रारंभिक सीएपी प्राप्त किए गए थे, और मानक सीएपी बाएं और दाएं कटिस्नायुशूल तंत्रिकाओं दोनों से प्राप्त किए गए थे, जिन्हें प्रयोगों के अंत में इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके जीवित रखा गया था। न्यूनतम सीएपी आयाम में कमी सही कटिस्नायुशूल तंत्रिका के साथ मनाया गया था, जबकि लगभग 3 एमवी पर बाएं कटिस्नायुशूल तंत्रिका कैप आयाम तंत्रिका निष्कर्षण के बाद 6 घंटे से अधिक प्रयोग की शुरुआत में सही कटिस्नायुशूल तंत्रिका के समान था।
चित्रा 1: प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले प्रयोगात्मक सेटअप का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। इस आंकड़े को रेपॉक्स, ए एट अल (2020)20 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: प्रतिनिधि सीएपी ने धातु और प्रवाहकीय इलास्टोमर तंत्रिका कफ सरणियों द्वारा उत्तेजना के बाद पूर्व विवो प्राप्त किया। कट्टाज़, ईए एट अल (2021) 22 से संशोधनों के साथ पुन: पेश किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: धातु और प्रवाहकीय इलास्टोमर कफ सरणियों की ए-फाइबर सक्रियण सीमा। त्रुटि पट्टियाँ माध्य से ±1 मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। कट्टाज़, ईए एट अल (2021) 22 से संशोधनों के साथ पुन: पेश किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: प्रतिनिधि सीएपी ने प्रयोगों के एक दिन में पूर्व विवो प्राप्त किया और एक जानवर से दोनों कटिस्नायुशूल तंत्रिकाओं का उपयोग किया। (ए) ए-टाइप फाइबर कैप सही कटिस्नायुशूल तंत्रिका से दोपहर के पास प्राप्त किया गया। (बी) ए-टाइप फाइबर कैप ने बाएं कटिस्नायुशूल तंत्रिका से मध्य दोपहर प्राप्त किया। (सी) ए-प्रकार फाइबर सीएपी (बी) में एक ही बाएं कटिस्नायुशूल तंत्रिका के साथ प्रयोगों के अंत में प्राप्त किया गया। एक्स-अक्ष दिन के समय से मेल खाता है जिस पर रिकॉर्डिंग ली गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
अनुपूरक फाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
इस काम में, हमने पूर्व विवो न्यूरोफिजियोलॉजी के लिए चूहे कटिस्नायुशूल तंत्रिकाओं को तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया। ऊतक निष्कर्षण में लगभग 30 मिनट लगते हैं, जिसमें पशु हैंडलिंग, संज्ञाहरण, मारने और विच्छेदन शामिल हैं, जबकि तंत्रिका सफाई, स्नान में प्लेसमेंट, और इलेक्ट्रोड प्रत्यारोपण को रिकॉर्डिंग शुरू करने से पहले अतिरिक्त 30 मिनट की आवश्यकता होनी चाहिए। बफर तैयारी 30 मिनट में की जा सकती है, हालांकि यह प्रयोग के बाकी हिस्सों से पहले किया जा सकता है। इस प्रकार की तैयारी और प्रयोग का उपयोग किया गया है और पिछले 7,12 में वर्णित किया गया है, समान बफर का उपयोग करके और एक ही ऊतक प्रकार के लिए। लेखकों के ज्ञान के लिए, हालांकि, यह पहली बार है जब बफर तैयारी, विच्छेदन, उपकरण स्थापित, और बाद की रिकॉर्डिंग का विवरण एक ही दस्तावेज़ में दिया गया है।
यह प्रोटोकॉल न्यूरोफिजियोलॉजी में प्रयोगों की एक विस्तृत विविधता को सक्षम कर सकता है जो इन विट्रो या विवो संदर्भों में संभव नहीं होगा। उदाहरण के लिए, पूर्व विवो तैयारी का एक फायदा यह है कि वे इस ऊतक को शरीर के बाकी हिस्सों से अलग करते हुए निकाले गए ऊतक की मैक्रो और सूक्ष्म संरचना को संरक्षित करते हैं। इसके परिणामस्वरूप एक सरल सेटअप होता है क्योंकि संज्ञाहरण को बनाए रखने की आवश्यकता नहीं होती है, जो अन्यथा विवो प्रयोगों में एक आवश्यकता है। प्रयोगों को सक्षम करने के संदर्भ में, पूर्व विवो तैयारी टेट्रोडोटॉक्सिन जैसे पदार्थों के उपयोग की अनुमति देती है, जिन्हें विवो संदर्भ23 में औचित्य देना मुश्किल है क्योंकि वे जानवर के लिए उच्च जोखिम उठाते हैं। जब ऐसे पदार्थों का उपयोग जांच को लाभ पहुंचाता है, तो उन्हें पूर्व विवो तैयारी में उपयोग करना आसान होता है। कस्टम उत्तेजक20 का उपयोग इस प्रयोगात्मक सेटअप का उपयोग करके न्यूरोमॉड्यूलेशन के लिए एचएफएसी ब्लॉक का उपयोग करके प्रयोगों को सक्षम बनाता है।
प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम विच्छेदन कदम है, क्योंकि विच्छेदन कैंची का उपयोग करके एक छोटी सी गलती भी तंत्रिका को नुकसान पहुंचा सकती है यदि पर्याप्त देखभाल नहीं की जाती है। इस स्तर पर गति भी आवश्यक है क्योंकि ऊतक को शरीर से तेजी से निकाला जाना चाहिए और रिकॉर्डिंग की शुरुआत में व्यवहार्यता को अधिकतम करने के लिए एक ठंडा बफर में रखा जाना चाहिए। ऊतक निष्कर्षण के बाद, जबकि तंत्रिका की सफाई और किसी भी इलेक्ट्रोड को प्रत्यारोपित करते समय देखभाल की जानी चाहिए, प्रोटोकॉल समय के संबंध में अधिक लचीला है, और ऑपरेटर त्रुटि का जोखिम इसलिए कम है। चूंकि तंत्रिका व्यास और नसों के भीतर फासिकल्स की नियुक्ति जानवर से जानवर में भिन्न होगी, परिणामों में कुछ परिवर्तनशीलता की उम्मीद की जानी चाहिए, भले ही एक ही इलेक्ट्रोड और उत्तेजना प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाए। इस परिवर्तनशीलता का प्रभाव चित्रा 3 में उत्तेजना थ्रेसहोल्ड के लिए त्रुटि सलाखों में देखा जा सकता है। तैयारी के किसी भी चरण में तंत्रिका को चुटकी नहीं लेना महत्वपूर्ण है क्योंकि इससे ऊतक को अपरिवर्तनीय क्षति हो सकती है। संदंश का उपयोग कर केवल अपने सिरों से तंत्रिका संभाल और बड़ी देखभाल के साथ तंत्रिका तना हुआ खींचने के लिए नहीं।
अपने वर्तमान रूप में प्रोटोकॉल के कई पहलुओं को उपकरण और सेटअप समय की मात्रा में वृद्धि करके सुधार किया जा सकता है। इस प्रयोगात्मक सेटअप के साथ संभावित मुद्दों के निदान में मदद करने के लिए, स्नान में पीएच और भंग ऑक्सीजन के स्वचालित माप उपयोगी हो सकते हैं लेकिन यहां लागू नहीं किए गए हैं। दोनों माप ों को एम्परोमेट्रिक या पोटेंशियोमेट्रिक विधियों12,19 का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। उपकरण जिन्हें नियमित रखरखाव की आवश्यकता होगी, ट्यूबिंग और कांच के बने पदार्थ हैं, जो समय के साथ नमक जमा करते हैं। एजीसीएल रिकॉर्डिंग हुक को एजीसीएल संदर्भ के साथ नियमित रूप से पुन: कोटिंग या प्रतिस्थापन की भी आवश्यकता होगी। उत्तेजना इलेक्ट्रोड प्रत्येक उपयोग के बाद साफ किया जाना चाहिए, लेकिन आम तौर पर कई प्रयोगों के लिए प्रतिस्थापन की आवश्यकता नहीं होगी।
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Disclosures
लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।
पहुँच कथन खोलें:
ओपन-एक्सेस के उद्देश्य से, लेखक ने क्रिएटिव कॉमन एट्रिब्यूशन (सीसी बीवाई) लाइसेंस (जहां यूकेआरआई द्वारा अनुमति दी गई है, 'ओपन गवर्नमेंट लाइसेंस' या 'क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन नो-डेरिवेटिव्स (सीसी बाय-एनडी) लाइसेंस इसके बजाय कहा जा सकता है) को किसी भी लेखक स्वीकृत पांडुलिपि संस्करण में लागू किया है।
डेटा साझा करना:
इस लेख के आंकड़ों में उपयोग किए गए कच्चे डेटा को लेखकों द्वारा अनुचित आरक्षण के बिना उपलब्ध कराया जाएगा।
Acknowledgments
लेखक ग्लैक्सोस्मिथक्लाइन फार्मास्यूटिकल्स के डॉ गेराल्ड हंसबर्गर, प्रशिया के राजा, पीए, यूएसए और गैल्वानी बायोइलेक्ट्रॉनिक्स (स्टीवनेज, यूके) को हमारे साथ अपनी मूल तंत्रिका तैयारी तकनीक साझा करने के लिए स्वीकार करते हैं। लेखक दोहरे चैंबर तंत्रिका स्नान डिजाइन के लिए रॉबर्ट टोथ को स्वीकार करते हैं। लेखक इंजीनियरिंग और भौतिक विज्ञान अनुसंधान परिषद (ईपीएसआरसी) के हेल्थकेयर टेक्नोलॉजीज चैलेंज अवार्ड्स (एचटीसीए) अनुदान से धन स्वीकार करते हैं। लेखक एड्रियन रेपॉक्स (ईपी / एल 016796/1) के वित्तपोषण के लिए इंपीरियल कॉलेज लंदन के डॉक्टरेट प्रशिक्षण (एचआईपीईडीएस सीडीटी) के लिए उच्च प्रदर्शन एम्बेडेड और वितरित सिस्टम सेंटर को स्वीकार करते हैं। एड्रियन रेपॉक्स वर्तमान में यूके डिमेंशिया रिसर्च इंस्टीट्यूट, केयर रिसर्च एंड टेक्नोलॉजी सेंटर द्वारा वित्त पोषित है। लेखक कृतज्ञतापूर्वक बायोइंजीनियरिंग विभाग में इंपीरियल कॉलेज के जैक बेली को स्वीकार करते हैं, जोव वीडियो लेख के उत्पादन के दौरान प्रयोगों और जानवरों के ऊतकों तक पहुंच में मदद के लिए।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1595 | Borosilicate glass |
| 1 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | 612-3626 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1596 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | BRND937254 | Borosilicate glass |
| Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT | RS UK | 536-2599 | push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube |
| Alkoxy conformal coating | Farnell | 1971829 | ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation |
| Anesthetic | Chanelle | N/A | Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle |
| Beaker, 2 L | VWR International Ltd | 213-0469 | Borosilicate glass |
| Bipolar nerve cuff | Cortec GMBH | N/A | 800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination |
| Bossheads | N/A | N/A | Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902-500g | 500 g in plastic bottle |
| Carbogen canister | BOC | N/A | F-size canister |
| Centrifuge Tubes, 15 mL volume | VWR International Ltd | 734-0451 | Falcon tubes |
| Conductive elastomer nerve cuff | N/A | N/A | high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference |
| Connector, Termimate | Mouser UK | 538-505073-1100-LP | These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11) |
| Crocodile clip connectors | RS UK | 212-1203 | These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10) |
| Deionized Water | N/A | N/A | Obtained from deionized water dispenser |
| Forceps angled 45 degrees | InterFocus Ltd | 91110-10 | Fine forceps, student range |
| Forceps standard Dumont #7 | InterFocus Ltd | 91197-00 | Student range forceps |
| Gas Disperson Tube, Porosity 3 | Merck | 12547866 | N/A |
| Glucose anhydrous, powder | VWR International Ltd | 101174Y | 500 g in plastic bottle |
| Grippers | N/A | N/A | Standard wet laboratory rod-mounted grippers |
| Heating Stirrer | RS UK | 768-9672 | Stuart US152 |
| Hemostats | N/A | N/A | Any hemostat >12 cm in length is suitable |
| Insect Pins, stainless steel, size 2 | InterFocus Ltd | 26001-45 | N/A |
| Laptop computer | N/A | N/A | Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable |
| Line Noise Filter | Digitimer | N/A | Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter) |
| Low-Noise Preamplifier, SR560 | Stanford Research Systems | SR560 | Low-noise voltage preamplifier |
| Magnesium Sulphate salt | VWR International Ltd | 291184P | 500g in plastic bottle |
| MATLAB scripts | Github | https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch | Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator |
| MATLAB software | Mathworks | N/A | Standard package |
| Microscope Light, PL-2000 | Photonic | N/A | Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier |
| Microscope, SMZ 745 | Nikon | SM745 | Stereoscopic Microscope |
| Mineral oil, non-toxic | VWR International Ltd | 31911.A1 | Oil for nerve bath |
| Nerve Bath | N/A | N/A | Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details. |
| Oscilloscope | LeCroy | N/A | 434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers |
| Oxygen Hose, 1 meter | BOC | N/A | 1/4" NPT terminations |
| Oxygen Regulator | BOC | C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar | N/A |
| Peristaltic Pump P-1 | Pharmacia Biotech | N/A | Product may be obtained from third party supplier |
| Petri Dish, Glass | VWR International Ltd | 391-0580 | N/A |
| Potassium Chloride salt | Sigma Aldrich | P5405-250g | 250 g in plastic bottle |
| Potassium Dihydrogen Sulphate salt | Merck | 1.04873.0250 | 250 g in plastic bottle |
| Rat | Charles River Laboratories | N/A | Sprague Dawley, 250-330 grams, female |
| Reference electrode, ET072 | eDaQ (Australia) | ET072-1 | Silver silver-chloride reference electrode |
| Rod | N/A | N/A | Standard wet laboratory rods with fittings for stands |
| Scale | Sartorius | N/A | M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers |
| Scissors straight 12 cm edge | InterFocus Ltd | 91400-12 | blunt-blunt termination, student range |
| Signal Acquisition Device | Cambridge Electronic Design | Micro3-1401 | Micro3-1401 Multichannel ADC |
| Silicone grease, non-toxic | Farnell | 3821559 | for sealing of bath partition |
| Silicone tubing, 2 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silicone tubing, 5 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silver wire | Alfa Aesar | 41390 | 0.5 mm, annealed |
| Sodium Bicarbonate salt | Sigma Aldrich | S5761-500g | 500 g in plastic bottle |
| Sodium Chloride salt | VWR International Ltd | 27810.295 | 1 kg in plastic bottle |
| Spring scissors angled 2 mm edge | InterFocus Ltd | 15010-09 | N/A |
| Stand | N/A | N/A | Standard wet laboratory stands with sockets for rods |
| Stimulator | Digitimer | DS3 | DS3 or Custom Stimulator (see references) |
| Stirring flea | VWR International Ltd | 442-0270 | For use with the heating stirrer |
| Syringe tip, blunt, 1 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe tip, blunt, 2 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe, plastic, 10 mL volume | N/A | N/A | syringe should have luer lock fitting |
| Tape, water-resistant | N/A | N/A | For securing tubing and wiring to workbench |
| Thermometer | VWR International Ltd | 620-0806 | glass thermometer |
| USB Power Bank | RS UK | 135-1000 | Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3 |
| Valve, Leuer Lock, 3-Way | VWR International Ltd | 229-7440 | For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon |
References
- McIntyre, C. C., Richardson, A. G., Grill, W. M. Modeling the excitability of mammalian nerve fibers: Influence of afterpotentials on the recovery cycle. Journal of Neurophysiology. 87 (2), 995-1006 (2002).
- Pelot, N. A., Grill, W. M. In vivo quantification of excitation and kilohertz frequency block of the rat vagus nerve. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026005 (2020).
- Patel, Y. A., Kim, B. S., Rountree, W. S., Butera, R. J. Kilohertz electrical stimulation nerve conduction block: Effects of electrode surface area. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 25 (10), 1906-1916 (2017).
- Kortelainen, J., Al-Nashash, H., Vipin, A., Thow, X. Y., All, A. The effect of anaesthesia on somatosensory evoked potential measurement in a rat model. Laboratory Animals. 50 (1), 63-66 (2016).
- Oh, S. S., Hayes, J. M., Sims-Robinson, C., Sullivan, K. A., Feldman, E. L. The effects of anesthesia on measures of nerve conduction velocity in male C57Bl6/J mice. Neuroscience Letters. 483 (2), 127-131 (2010).
- Kuffler, S. W., Williams, E. M. V. Small-nerve junctional potentials. The distribution of small motor nerves to frog skeletal muscle, and the membrane characteristics of the fibres they innervate. The Journal of Physiology. 121 (2), 289-317 (1953).
- Brunton, E., Blau, C. W., Nazarpour, K. Separability of neural responses to standardised mechanical stimulation of limbs. Scientific Reports. 7 (1), 11138 (2017).
- Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. The Anatomical Record. 215 (1), 71-81 (1986).
- Kagiava, A., Theophilidis, G. Assessing the permeability of the rat sciatic nerve epineural sheath against compounds with local anesthetic activity: an ex vivo electrophysiological study. Toxicology Mechanisms and Methods. 23 (8), 634-640 (2013).
- Motori, E., et al. Neuronal metabolic rewiring promotes resilience to neurodegeneration caused by mitochondrial dysfunction. Science Advances. 6 (35), 8271 (2020).
- Schwarz, J. R., Eikhof, G. Na currents and action potentials in rat myelinated nerve fibres at 20 and 37° C. Pflügers Archiv. 409 (6), 569-577 (1987).
- Cranefield, P. F., Brink, F., Bronk, D. W. The oxygen uptake of the peripheral nerve of the rat. Journal of Neurochemistry. 1 (3), 245-249 (1957).
- Lehmann, J. E. The effect of changes in pH on the action of mammalian A nerve fibers. American Journal of Physiology-Legacy Content. 118 (3), 600-612 (1937).
- Hamm, L. L., Nakhoul, N., Hering-Smith, K. S.
- Minasian, S. M., Galagudza, M. M., Dmitriev, Y. V., Kurapeev, D. I., Vlasov, T. D. Myocardial protection against global ischemia with Krebs-Henseleit buffer-based cardioplegic solution. Journal of Cardiothoracic Surgery. 8, 60 (2013).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Miller, D. J. Sydney Ringer: physiological saline, calcium and the contraction of the heart. The Journal of Physiology. 555, Pt 3 585-587 (2004).
- Yamamoto, D., Suzuki, N., Miledi, R. Blockage of chloride channels by HEPES buffer). Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 230 (1258), 93-100 (1987).
- Janz, G. J., Taniguchi, H. The silver-silver halide electrodes. Preparation, stability, and standard potentials in aqueous and non-aqueous media. Chemical Reviews. 53 (3), 397-437 (1953).
- Rapeaux, A., Constandinou, T. G. An HFAC block-capable and module-extendable 4-channel stimulator for acute neurophysiology. Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046013 (2020).
- Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch. Next Generation Neural Interfaces. , Available from: https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch> (2021).
- Cuttaz, E. A., Chapman, C. A. R., Syed, O., Goding, J. A., Stretchable Green, R. A. fully polymeric electrode arrays for peripheral nerve stimulation. Advanced Science. 8 (8), 2004033 (2021).
- Lossi, L., Merighi, A. The use of ex vivo rodent platforms in neuroscience translational research with attention to the 3Rs philosophy. Frontiers in Veterinary Science. 5, 164 (2018).
