Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Intracerebroventrikulær levering af tarmafledte mikrobielle metabolitter i frit bevægelige mus

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63972
Automatic Translation
*1,2, *2, 1,2
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Physiology, College of Medicine, National Cheng Kung University
* These authors contributed equally

Summary

Tarmafledte mikrobielle metabolitter har mangesidede virkninger, der fører til kompleks adfærd hos dyr. Vi sigter mod at give en trinvis metode til at afgrænse virkningerne af tarmafledte mikrobielle metabolitter i hjernen via intracerebroventrikulær levering via en guidekanyle.

Abstract

Virkningen af tarmmikrobiota og deres metabolitter på værtsfysiologi og adfærd er blevet grundigt undersøgt i dette årti. Talrige undersøgelser har afsløret, at tarmmikrobiota-afledte metabolitter modulerer hjernemedierede fysiologiske funktioner gennem indviklede tarm-hjerneveje i værten. Kortkædede fedtsyrer (SCFA'er) er de vigtigste bakterieafledte metabolitter, der produceres under kostfiberfermentering af tarmmikrobiomet. Udskillede SCFA'er fra tarmen kan virke på flere steder i periferien, hvilket påvirker immun-, endokrine og neurale reaktioner på grund af den store fordeling af SCFA-receptorer. Derfor er det udfordrende at differentiere de centrale og perifere virkninger af SCFA'er gennem oral og intraperitoneal administration af SCFA'er. Dette papir præsenterer en videobaseret metode til at forhøre SCFA'ers funktionelle rolle i hjernen via en guidekanyle i frit bevægelige mus. Mængden og typen af SCFA'er i hjernen kan justeres ved at kontrollere infusionsvolumen og -hastighed. Denne metode kan give forskere en måde at værdsætte den rolle, som tarmafledte metabolitter spiller i hjernen.

Introduction

Den menneskelige mave-tarmkanal har forskellige mikroorganismer, der påvirker værten 1,2,3. Disse tarmbakterier kan udskille tarmafledte metabolitter under deres udnyttelse af diætkomponenter, der forbruges af værten 4,5. Interessant nok kan tarmmetabolitterne, der ikke metaboliseres i periferien, transporteres til andre organer via cirkulation6. Bemærk, at disse udskillede metabolitter kan tjene som mediatorer for tarm-hjerneaksen, defineret som tovejskommunikationen mellem centralnervesystemet og tarmen7. Tidligere undersøgelser har vist, at tarmafledte metabolitter kan modulere kompleks adfærd og følelser hos dyr 8,9,10,11.

Kortkædede fedtsyrer (SCFA'er) er de vigtigste metabolitter, der produceres af tarmmikrobiota under fermentering af kostfibre og ufordøjelige kulhydrater6. Acetat, propionat og butyrat er de mest rigelige SCFA'er i tarmen12. SCFA'er tjener som energikilde for celler i mave-tarmkanalen. Umetaboliserede SCFA'er i tarmen kan transporteres til hjernen gennem portalvenen og dermed modulere hjerne og adfærd 6,12. Tidligere undersøgelser har antydet, at SCFA'er kan spille en kritisk rolle i neuropsykiatriske lidelser 6,12. For eksempel reddede intraperitoneal injektion af butyrat i BTBR T + Itpr3tf / J (BTBR) mus, en dyremodel for autismespektrumforstyrrelse (ASD), deres sociale underskud13. Antibiotikabehandlede rotter, der modtog mikrobiota fra depressive forsøgspersoner, viste en stigning i angstlignende adfærd og fækale SCFA'er14. Klinisk blev ændringer i fækale SCFA-niveauer observeret hos mennesker med ASD sammenlignet med typisk udviklende kontroller15,16. Mennesker med depression har lavere fækale SCFAs niveauer end raske forsøgspersoner17,18. Disse undersøgelser antydede, at SCFA'er kan ændre adfærd hos dyr og mennesker gennem forskellige ruter.

Mikrobielle metabolitter udøver forskellige virkninger på flere steder i kroppen, hvilket påvirker værtsfysiologi og adfærd 4,19, herunder mave-tarmkanalen, vagusnerven og sympatisk nerve. Det er vanskeligt at fastslå den præcise rolle, som tarmafledte metabolitter spiller i hjernen, når metabolitterne administreres via perifere veje. Dette papir præsenterer en videobaseret protokol til at undersøge virkningerne af tarmafledte metabolitter i hjernen hos en frit bevægende mus (figur 1). Vi viste, at SCFA'er kunne gives akut gennem guidekanylen under adfærdstest. Typen, volumen og infusionshastigheden af metabolitter kan ændres afhængigt af formålet. Stedet for kanylering kan justeres for at undersøge virkningen af tarmmetabolitter i en bestemt hjerneregion. Vi sigter mod at give forskere en metode til at udforske den potentielle indvirkning af tarmafledte mikrobielle metabolitter på hjernen og adfærd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøgsprotokoller og dyrenes pleje blev godkendt af National Cheng Kung University (NCKU) Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Forberedelse til forsøgsdyret

  1. Få 6-8 uger gamle vildtype C57BL/6JNarl hanmus fra en leverandør.
  2. Hus musene i et standard musebur med standard musechow og steriliseret vand ad libitum.
    BEMÆRK: Staldforholdene for NCKU's Laboratory Animal Center er 22 ± 1 ° C temperatur, 55% ± 10% fugtighed og en 13 h / 11 timers lys / mørk cyklus.

2. Stereotaxisk kirurgi

  1. Forbered og steriliser det stereotaxiske instrument, kirurgiske instrumenter og relaterede genstande.
    BEMÆRK: Alle genstande, der direkte kommer i kontakt med det kirurgiske sted, skal steriliseres for at undgå infektion.
  2. Anæstetiser musen ved at placere den i plexiglasburet med 1%-5% isofluran i ilt.
    BEMÆRK: Hold nøje øje med musen for at sikre, at vejrtrækningen holdes på omkring et åndedrag i sekundet.
  3. Tag musen ud af anæstesikammeret. Barber det kirurgiske sted (musehoved) med en kæledyrstrimmer. Placer musen på den stereotaxiske ramme ved at fastgøre musefortænderne på fortænderne i den stereotaxiske fortænderholder. Dæk næsen med næsekeglemasken.
  4. Anæstetiser musen med 1% -2,5% isofluran i ilt gennem hele stereotaxisk kirurgi. Evaluer musens nociception via tåspidsrefleksen og sørg for en konstant vejrtrækningshastighed, før du skærer det kirurgiske sted.
  5. Placer en varmepude (37,0 °C) under musen på den stereotaxiske ramme for at opretholde kropstemperaturen under operationen. Alternativt kan du opretholde kernetemperaturen ved hjælp af en rektal termisk sonde, der forbinder den programmerede varmere og varmepuden.
  6. Fjern den trimmede pels på hovedet ved hjælp af tape. Injicer musen med smertestillende Ketoprofen (5 mg/kg) subkutant for at lindre smerter. Påfør øjensalve for at undgå tørre øjne.
  7. Indsæt den spidse ørestang i øregangen for at fastgøre hovedet.
  8. Centrer hovedet ved at justere ørestangens skala.
  9. Spænd næseklemmen på fortænderholderen for at undgå lodret bevægelse. Tryk forsigtigt på hovedet for at kontrollere, at hovedet er fastgjort, og undgå, at hovedet løsner sig under efterfølgende operation.
  10. Desinficer hovedbunden med tre skiftende skrubber af chlorhexidin ved hjælp af en vatpind. Start hvert krat fra midten mod ydersiden (fra det mest desinficerede centrale område til det mindst desinficerede område).
    BEMÆRK: Brugen af skrubber fra midten til ydersiden kan hjælpe forskere med at minimere infektion og forurening fra pelsen. Det ydre område ligger tæt på det ubarberede hovedområde, som stadig har en stor mængde pels og ikke er let at desinficere grundigt.
  11. Skær hovedbunden på en anterior / posterior måde (<1 cm) ved hjælp af et kirurgisk blad. Åbn snittet, og tør kraniet af med en vatpind, der holdes af mikrodissekerende tang.
    BEMÆRK: Mikrodissekeringstangen, kirurgisk klinge og vatpinde skal steriliseres ved autoklavering før operationen. Under den kirurgiske proces steriliseres alt kirurgisk udstyr ved hjælp af en glasperlesterilisator (150 °C) i mindst 5 s før og efter hvert dyr. Forbered et steriliseret bægerglas til at holde operationsbladet og tangen under den kirurgiske proces og mellem dyr.
  12. Identificer Bregma og Lambda på kraniet. Brug Bregma som reference til at lokalisere interesseområdet.
    1. Valgfrit: Monter den stereotaxiske boremaskine på den stereotaxiske boreholder, og brug spidsen af boret til at pege Bregma som reference. Steriliser stereotaxisk bor ved hjælp af glasperlesterilisatoren (150 °C) i mindst 5 s.
  13. Kalibrer og juster det flade kranium vandrette plan i venstre / højre og forreste / bageste plan af Bregma / Lambda.
    BEMÆRK: Hvis det ikke er i et korrekt vandret plan, skal du montere musen igen på det stereotaxiske instrument.

3. Kommerciel tilpasset guide kanyleimplantation

  1. Identificer og mærk placeringen af højre laterale ventrikel baseret på de stereotaxiske koordinater: Afstand til Bregma, anterior / posterior (A / P): 0,26 mm, medial / lateral (M / L): -1,0 mm, dorsal / ventral (D / V): -2,0 mm20.
    BEMÆRK: Koordinaterne kan ændres baseret på interesseområdet. Koordinaterne for den laterale ventrikel var baseret på voksne C57BL/6J mus med et vægtinterval på 26-30 g. Hvis der anvendes yngre mus, henvises til diskussionen.
  2. Bor et hul (diameter = 1,5 mm) gennem kraniet på det mærkede sted ved hjælp af en stereotaxisk boremaskine til implantation af en kommerciel styrekanyle.
  3. Bor yderligere to til fire huller (diameter = 1,5 mm) på kraniet ved hjælp af en stereotaxisk boremaskine til montering af skruer i rustfrit stål.
    BEMÆRK: Steriliser stereotaxisk bor ved hjælp af en glasperlesterilisator (150 °C) i mindst 5 s før og efter hvert dyr.
  4. Tør knogleresterne af og stop blødningen med en vatpind.
  5. Tør kraniet af med lidokain (1 mg/kg) ved hjælp af en vatpind til lokalbedøvelse, antipruritisk og smertelindrende virkninger. Hvis blødningen ikke stopper efter boring, skal du forsigtigt placere en vatpind på hullet for hæmostase.
  6. Monter to til fire rustfrie skruer på hullerne for at give ankre til tandakryl.
  7. Anbring den kommercielle styrekanyle på den stereotaxiske kanyleholder, og desinficer med glasperlesterilisatoren (150 °C).
    BEMÆRK: Den kommercielle guidekanyle, kommerciel dummy og kommerciel injektor (figur 2A) blev tilpasset med specifikationerne vist i materialetabellen.
  8. Flyt den stereotaxiske kanyleholder til hullet, der er boret til lateral ventriklen, og indsæt langsomt den kommercielle styrekanyle i hullet indtil den ønskede dybde (2,5 mm).
    BEMÆRK: Den dorsale / ventrale koordinat kan defineres ved at indstille spidsen af den kommercielle styrekanyle som reference, når spidsen næppe indsættes i hullet.
  9. Påfør 10 μL n-butylcyanoacrylatklæbemiddel (vævslimlim) for at fastgøre den kommercielle styrekanyle i det borede hul og vent i 3-4 minutter. Slip den kommercielle styrekanyle forsigtigt fra den stereotaxiske kanyleholder, og flyt holderen væk.
  10. Påfør tandakryl på den indskårne hovedbund for at fastgøre den kommercielle guidekanyle og vent i mindst 5 minutter. Implanter den kommercielle dummy i den kommercielle styrekanyle for at undgå, at kanyle tilstoppes af blod eller kropsvæske (figur 2B).
  11. Slip ørestangen fra øregangen, og fjern musen fra den stereotaxiske ramme.
  12. Placer musen i et nyt bur med en varmepude nedenunder for at komme sig efter anæstesi og observer kontinuerligt, indtil musen vågner helt.
    BEMÆRK: Efterlad ikke dyret uden opsyn, før det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde sternal recumbency. Et dyr, der har gennemgået kirurgi, bør ikke vende tilbage til andre dyrs selskab, før det er fuldt ud genoprettet.
  13. Returner musen til enkeltboliger eller gruppeboliger, afhængigt af den institutionelle IACUC-protokol og det eksperimentelle design. For gruppeopstaldning skal du sørge for, at færre mus er anbragt i et bur for at minimere uønskede skader eller løsrivelse af kanylen.
  14. Ibuprofen (0,2 mg/ml) indgives i drikkevandet i mindst 3 dage til postoperativ pleje, og der monitoreres to gange dagligt for tegn på smerte og nød i mindst 3 dage.
    1. Under postoperativ pleje skal du anvende roxithromycin salve omkring huden for at forhindre betændelse og infektion i musene.
    2. Fortsæt med at overvåge dyrets tilstand og giv en rettidig intraperitoneal injektion af 5% glucose og / eller 0,9% natriumchlorid for at give tilstrækkelig energi.
    3. Hvis tilstanden af smerte, nød eller infektion forværres støt, skal du aflive musen ved CO2 -indånding.
  15. Vent i 1 uge efter operationen, før musen er klar til intracerebroventrikulær levering af SCFA'er og adfærdstest.

4. Udarbejdelse af SCFA'er

  1. Natriumacetat, natriumbutyrat og natriumpropionat opløses i kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) (se materialetabellen).
  2. Sørg for, at kemikalierne er helt opløst, juster derefter pH-værdien til 7,4, og filtrer SCFA-blandingen gennem et 0,22 μm filter til sterilisering.

5. Opsæt infusionssystemet til intracerebroventrikulær levering af SCFA'er under adfærdstest

  1. Monter et loftkamera for at optage adfærden. Tilslut kameraet med en computer for at styre videooptagelsessoftwaren (figur 3).
  2. Fyld en 10 μL sprøjte med destilleret vand.
    BEMÆRK: Undgå luftbobler i mikrolitersprøjten.
  3. Tilslut en mikroinjektionspumpe med mikroinjektionsregulatoren.
  4. Monter mikrolitersprøjten på mikroinjektionspumpen. For at installere sprøjten skal du trykke på knappen for at løsne klemmen og installere sprøjten på den tilsvarende position. Luk klemmen, og stram stempelholderskruen på mikroinjektionspumpen (figur 4A).
  5. Indsæt den kommercielle injektor i polyethylenrøret (figur 2A).
  6. Hæng polyethylenrøret på loftkameraet over testarenaen.
  7. Fyld polyethylenrøret med destilleret vand ved hjælp af en insulinsprøjte. Tilslut mikrolitersprøjten til det hængende polyethylenrør.
    BEMÆRK: Sørg for, at polyethylenrøret er langt nok til, at musen kan bevæge sig frit i hele testarenaen.

6. Systemindstillinger for mikroinjektionsregulatoren

  1. Tænd for mikroinjektionscontrolleren, og tryk på Vis alle kanaler for at få adgang til kommandoskærmen (figur 4C). Tryk på Konfiguration, og indstil Volumenmål til 9.800 nL med leveringshastighed til 100 nL/s. Tilsæt 9.800 nL destilleret vand fra polyethylenrøret, der er tilsluttet mikrolitersprøjten (tryk på Retning for at skifte til infusionstilstand, og tryk på RUN) (se røde firkanter på kommandoskærmen i figur 4C).
  2. Tryk på Konfiguration, og indstil Volume Target til 3.000 nL med leveringshastighed til 100 nL/s. Udtræk 3.000 nL mineralolie (tryk på Retning for at skifte til tilbagetrækningstilstand, og tryk på RUN) (se røde firkanter på kommandoskærmen i figur 4C).
    BEMÆRK: En klar olie-vandfaseseparation skal observeres på polyethylenrøret.
  3. Demonter polyethylenrøret fra mikroliter sprøjtenålen. Spyt 3.000 nL destilleret vand ud af mikrolitersprøjtenålen (tryk på Retning for at skifte til infusionstilstand, og tryk på RUN).
  4. Indsæt mikrolitersprøjten tilbage i polyethylenrøret. Tryk på Konfiguration, og indstil Volume Target til 9,500 nL med leveringshastighed til 100 nL / s. Træk 9.500 nL SCFA'er tilbage (tryk på Retning for at skifte til Tilbagetrækningstilstand, og tryk på RUN). Mærk olie-SCFA-fasen for at validere, om SCFA'erne er infunderet med succes.
  5. Tryk på Konfiguration , og indstil det ønskede volumenmål med leveringshastighed til 7 nL / s. Tryk på Retning for at skifte til infusionstilstand (se røde firkanter på kommandoskærmen i figur 4C).
    BEMÆRK: Bestem volumen baseret på infusionstiden. Hvis infusionstiden f.eks. er 3 minutter for leveringshastigheden på 7 nL/s, er målvolumen = 1.260 nL.
  6. Tryk på RUN for at tilføre mikrolitersprøjten fremad, indtil væsken kommer ud i forenden af den kommercielle injektor, før injektoren indsættes i kanylen til SCFA-injektion.

7. Infusion af SCFA'er i lateral ventrikel gennem den kommercielle styrekanyle i frit bevægende mus

  1. Anæstetiser musen ved at placere den i plexiglasburet med 1%-5% isofluran i ilt.
    BEMÆRK: Hold nøje øje med musen for at sikre, at vejrtrækningen holdes på omkring et åndedrag i sekundet.
  2. Skrub musen og indsæt den kommercielle injektor i den kommercielle styrekanyle (figur 4B).
    BEMÆRK: Hvis den kommercielle guidekanyle er tilsluttet med blod eller kropsvæske, skal du forsigtigt rense den med pincet.
  3. Lad musen komme sig efter anæstesi i 15 minutter i et bur inden adfærdstest.
  4. Til den grundlæggende bevægelsestest skal du placere musen i et nyt bur og lade den frit udforske i 35 minutter. Tilsæt SCFA'er ved hjælp af en leveringshastighed på 7 nL/s for en målvolumen på 2.100 nL i de første 5 minutter (tryk på Retning til Infund-tilstand, og tryk på RUN).
    BEMÆRK: Bevægelsen i det nye bur kan analyseres ved hjælp af videosporingssoftware til dyreadfærd21,22.
  5. Bedøve musen (gentaget trin 7.1) og fjern den kommercielle injektor fra den kommercielle guide kanyle.
    BEMÆRK: Musen kan injiceres gentagne gange med forskellige kontroller/metabolitter efter at have givet den passende tid til at vaske den tidligere injektion ud. Så længe kanylen er fastgjort på musehovedet, kan musen gentagne gange testes med forskellige metabolitter.

8. Restaurering af mikroinjektionssystemet

  1. Demonter polyethylenrøret fra mikrolitersprøjten.
  2. Injicer luft i røret ved hjælp af insulinsprøjten for at kassere det destillerede vand i polyethylenrøret. Tøm mikrolitersprøjten.
  3. Tryk på Nulstil Pos på konfigurationsskærmen for at åbne skærmen Definition af sprøjtestop (figur 4C).
  4. Tryk på Træk ud, indtil der opstår en biplyd for at nulstille mikroinjektionspumpen til den helt udtrukne position (figur 4C).
  5. Gå tilbage til kommandoskærmen , og sluk for mikroinjektionscontrolleren, hvis der er et ** END REACHED** -tegn på denne skærm (figur 4C).

9. Valgfrit: Validering af intracerebroventrikulær injektion med neuralt sporstof

  1. Tilsæt 2.100 nL af det neurale sporstof med leveringshastigheden på 7 nL/s for at verificere infusionsstedet.
    BEMÆRK: Lad injektoren stå i styrekanylen i 5 minutter for at forhindre tilbagestrømning.
  2. Bedøve musen ved en overdosis isofluran (5%) 30 minutter efter infusion af neuralt sporstof.
  3. Kontroller vejrtrækningshastigheden og hale / pote klemmerefleks i den bedøvede mus.
    BEMÆRK: Mus skal ikke reagere før næste trin.
  4. Lav et 4-5 cm snit gennem huden, musklerne og mavevæggen under brystkassen.
  5. Flyt leveren forsigtigt væk fra membranen.
  6. Skær membranen for at udsætte musens hjerte.
  7. Gennemsæt musen gennem hjertet med fosfatbufferet saltvand (PBS) og iskold 4% paraformaldehyd i PBS.
  8. Afhug musen og disseker hjernen omhyggeligt med mikrodissekerende tang og mikrodissekerende saks for at tage hele hjernen ud23. Læg hjerneprøverne i iskold 4% paraformaldehyd i PBS i 3-4 dage og vask dem 3 x 5 min med PBS.
  9. Skær hjernen i to dele i musens hjerneskiveholder ved det ottende snit af musens hjerneskiveholder (1 mm/sektion) fra den forreste til bageste retning. Placer hjernen i indlejringsformen og indlejr hjerneprøverne i lavsmeltepunkt agarose (4% i PBS).
  10. Lim hjernen indlejret i agarose på scenen af vibratomet ved hjælp af superlim. Sektion hjernen koronalt i 50 μm hjerneskiver ved hjælp af vibratomet.
  11. Inkuber hjerneskiverne i antistoffet rettet mod det neurale sporstof fortyndet i blokerende buffer (1: 1.000 fortynding) natten over ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Den blokerende buffer indeholdt 10% hesteserum, 0,1% Triton X-100 og 0,02% natriumazid.
  12. Skiverne vaskes 3 x 5 min med PBST (PBS med 0,1% triton X-100).
  13. Inkubere hjerneskiverne i fluorescensfarvekonjugeret sekundært antistof fortyndet i blokerende buffer (1:500 fortynding) i 2 timer ved stuetemperatur.
  14. Vask skiverne 3 x 5 min med PBS.
  15. Monter hjerneskiverne på diaset med et monteringsmedium indeholdende 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI).
  16. Dæk diaset med en mikroskopdæksel.
  17. Påfør neglelak på glidekanten for at undgå lækage af monteringsmediet.
  18. Efter inkubation natten over ved stuetemperatur, beskyttet mod lys, afbildes fluorescenssignalet på infusionsstedet ved hjælp af et fluorescensmikroskop.

10. Valgfrit: Infusion af metabolitter gennem en tilpasset styrekanyle i rustfrit stål i lateral ventrikel hos mus

  1. Følg protokolafsnit 1-8 og udskift den kommercielle styrekanyle med en styrekanyle i rustfrit stål for at tilføre kemikalier gennem en injektor i rustfrit stål i musen.
    BEMÆRK: Fordele og ulemper ved de forskellige kommercielle og rustfri stålkanyler uddybes i diskussionsafsnittet.
  2. Udfør den kirurgiske protokol på samme måde som beskrevet i protokolafsnit 2 og 3, bortset fra at du husker at udskifte den kommercielle styrekanyle med en styrekanyle i rustfrit stål (figur 5B).
    BEMÆRK: Styrekanylen i rustfrit stål, dummy i rustfrit stål og injektor i rustfrit stål (figur 5A) blev tilpasset med specifikationerne vist i materialetabellen. Indsæt den tilpassede styrekanyle i rustfrit stål i hullet indtil den ønskede dybde (2,0 mm).
  3. Tilsæt SCFA'er via styrekanylen i rustfrit stål ved hjælp af mikroinjektionssystemet bestående af mikroinjektionsregulatoren og mikroinjektionspumpen (figur 4B) (samme som protokolafsnit 4-7). For styrekanylen i rustfrit stål skal du bøje den ene side af injektoren i rustfrit stål forsigtigt, indtil spidsen af den anden side er 1 mm længere end styrekanylen i rustfrit stål.
  4. Tilsæt 2.100 nL af det neurale sporstof gennem styrekanylen i rustfrit stål i lateral ventrikel hos mus (samme som protokolafsnit 9).
  5. Prøven indsamles i 30 minutter efter infusion af neuralt sporstof (samme som protokolafsnit 9).
  6. Udfør billedoptagelse i de neurale sporstof-infunderede hjerneskiver (samme som protokolafsnit 9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Musen blev infunderet med SCFA'er 1 uge efter genopretning fra guidekanyleimplantationen for at evaluere lokomotorisk aktivitet i et nyt bur. Musen blev anbragt i et nyt bur og infunderet med 2.100 nL SCFA'er eller ACSF i de første 5 minutter (leveringshastighed på 7 nL / s) i hjernen gennem den kommercielle guidekanyle implanteret i hjernens laterale ventrikel. Den lokomotoriske aktivitet i et nyt bur blev registreret i yderligere 30 minutter efter infusion. Der blev ikke observeret nogen forskel i den bevægelsesmæssige aktivitet i det nye bur mellem infusion af SCFA'er og ACSF (figur 6) (n = 2 mus pr. gruppe; data vises som middelværdi ± s.e.m. og analyseres ved tovejs ANOVA).

For at validere nøjagtigheden af implantation af styrekanylen i hjerneområderne blev et fluorescerende neuralt sporstof infunderet i musene via styrekanylen med samme volumen og leveringshastighed som SCFA'erne (2.100 nL på 5 min; 7 nL / s). Hjernerne blev indsamlet til histologi 30 minutter senere. Det fluorescerende farvestof blev påvist i den laterale ventrikel og de omkringliggende områder af musehjernen (figur 7A). En styrekanyle i rustfrit stål blev implanteret i hjernens laterale ventrikel til infusion af neuralt sporstof under de samme forhold. I lighed med styrekanylen viste resultaterne, at et fluorescerende farvesignal blev detekteret i den laterale ventrikel og de omkringliggende områder af musehjernen, selv efter infusion gennem styrekanylen i rustfrit stål (figur 7B).

Figure 1
Figur 1: Proceduren for intracerebroventrikulær infusion i frit bevægelige mus. Flowdiagrammet for intracerebroventrikulær levering af tarmafledte mikrobielle metabolitter i frit bevægelige mus. Forkortelse: SCFA'er = kortkædede fedtsyrer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Implantation af den kommercielle styrekanyle i mus. (A) Det repræsentative billede af kommerciel styrekanyle, dummy og injektor. (B) Det repræsentative billede af kommerciel guide kanyle og dummy implanteret i hjernen hos mus ved fiksering med dental akryl. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Den intracerebroventrikulære infusionsrig til adfærdstest. Diagrammet over mikroinjektionssystem, videooptagelsessystem og adfærdsapparat. Forkortelse: SCFA'er = kortkædede fedtsyrer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Mikroinjektionssystemet . (A) Installation af mikrolitersprøjten ved hjælp af en mikroinjektionspumpe. (B) Indsættelse af den kommercielle injektor, der er forbundet med polyethylenrør, i den kommercielle styrekanyle (C) Mikroinjektionsregulatorens berøringsskærm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Implantation af styrekanyler i rustfrit stål i musens laterale ventrikel . (A) Det repræsentative billede af styrekanyle i rustfrit stål, dummy og injektor. (B) Det repræsentative billede af styrekanyler i rustfrit stål og dummy implanteret i hjernen hos mus ved fiksering med tandakryl. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Lokomotorisk aktivitet af SCFAs-infunderede mus i det nye bur . (A) Tidslinjeskematisk for implantation af guidekanyler og ny burbevægelse ved ACSF- eller SCFA-infusion. (B) Tidslinjeskematisk for placering af infusionssprøjte, infusionsvindue (blå skygge) og den nye test af burets adfærd. (C) Samlet afstand flyttet af ACSF- og SCFAs-infunderede mus i et nyt bur i 35 min. Tidsvinduet for infusion er angivet med blå skygge (0-5 min). (D) Repræsentative billeder af baner for ACSF- og SCFAs-infunderede mus i et nyt bur. n = 2 mus pr. gruppe. Data vist som gennemsnit ± s.e.m. og analyseret af tovejs ANOVA. NS: Ikke signifikant. Forkortelser: SCFA'er = kortkædede fedtsyrer; ACSF = kunstig cerebrospinalvæske. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Histologien af hjerneinfunderet fluorescerende farvestof. Infusion gennem den tilpassede (A) kommercielle og (B) styrekanyle i rustfrit stål implanteret i musens laterale ventrikel (LV). Skalastænger = 1 mm (venstre) og 500 μm (højre). Blå: DAPI farvning; Grøn: Anti-fluorescerende guldmærkning. Forkortelser: LV = lateral ventrikel; AC = forreste kommission; CPu = caudat putamen; LS = lateral septum; MS = medial septum. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tarmafledte metabolitter har været forbundet med hjernemedierede sygdomme uden meget præcis mekanisme, delvis på grund af deres flere bindingssteder i kroppen 6,12,24. Tidligere rapporter viste, at SCFA'er kunne tjene som ligander for G-proteinkoblede receptorer, epigenetiske regulatorer og kilder til energiproduktion på flere steder i kroppen 6,12. For at omgå de forvirrende faktorer, der stammer fra periferien (såsom immunceller, hormoner og autonomt nervesystem), blev der udviklet en metode ved at vedtage intracerebroventrikulær injektion af SCFA'er i hjernen gennem en guidekanyle i frit bevægelige mus. Derudover blev kanylerings- og infusionsstederne valideret for at udforske de hjerneområder, der potentielt er påvirket af SCFA'er. Alt i alt præsenterer dette papir en præcis, omhyggelig og valideret metode til at levere tarmafledte metabolitter ind i hjernen til tarm-hjerneakseforskning.

Den intracerebroventrikulære levering af stoffer og kemikalier gennem en guidekanyle til dyr er veletableret 25,26,27,28,29 til forskellige lægemiddeltest 29, sygdomsmodellering 26,28 og specifikt design af adfærdstest 27 . Vigtigst er det, at flere undersøgelser har leveret tarmmikrobielle metabolitter ind i hjernen gennem intracerebroventrikulær injektion og testet deres virkninger på fysiologiske funktioner30,31,32,33. Denne protokol giver en add-on attribut til administration af tarmmetabolitter på en akut måde til hjernen i realtid, hvilket ville gøre det muligt for forskere at forstå de dynamiske virkninger af tarmmetabolitter på hjernen og adfærd.

Leveringshastigheden for metabolitinfusionen er afgørende for at simulere strømmen af cerebrospinalvæske i hjernens ventrikler. En undersøgelse viste, at cerebrospinalvæskeproduktionshastigheden hos mus er 5,3 nL / s34. For at kontrollere strømningshastigheden af SCFA'er naturligt i frit bevægelige mus har vi evalueret strømningshastigheden for dette mikroinjektionssystem (figur 3 og figur 4). SCFA'erne kunne infunderes jævnt uden megen modstand, selv når det 350 cm lange polyethylenrør blev brugt til at infundere SCFA'er i en frit bevægelig mus. Ved opfyldning af destilleret vand og mineralolie for at mindske væskemodstanden i polyethylenrøret (se protokolafsnit 5 og 6) kunne strømningshastigheden sænkes til 7 nL/s fra 100 nL/s. Infusion af SCFA'erne eller ACSF med en strømningshastighed på 7 nL / s resulterede ikke i nogen unormal opførsel af musene.

Mængden og doseringen af tarmafledte metabolitter til intracerebroventrikulær injektion er kritisk. Det er fortsat udfordrende at analysere de absolutte niveauer af tarmafledte metabolitter i forskellige hjerneområder. For eksempel har meget få undersøgelser vist påvisning af de fysiologiske niveauer af SCFA'er i hjernen35,36. En undersøgelse viste, at koncentrationerne af acetat, propionat og butyrat i hjernen hos mus er henholdsvis ca. 1640,6-3281,2 μg / g, 288,18-384,24 μg / g og 44,036-66,054 μg / g,henholdsvis 36. En anden undersøgelse rapporterede imidlertid lavere niveauer af SCFA'er i hjernen (acetat 128,1 μg / g, propionat 0,3883 μg / g og butyrat 0,1640 μg / g)35. Mængderne af infunderet acetat, propionat og butyrat, der blev vedtaget i denne protokol, var henholdsvis 5,81385 μg / g, 4,62378 μg / g og 2,6124 μg / g. Derfor kan koncentrationerne af SCFA'erne, der er infunderet i denne protokol, sammenlignes med fysiologiske koncentrationer. Vi kunne dog ikke udelukke muligheden for, at koncentrationerne af SCFA'er kan variere i forskellige hjerneområder. Flere undersøgelser viste, at levering af propionat i hjernens ventrikel ved intracerebroventrikulær injektion (4 μL 0,26 M propionsyre på 1 min; ca. 249,756 μg / g) nedsat social adfærd og kognition hos rotter30,31. Doseringen og strømningshastigheden af det infunderede propionat var relativt høj, som rapporteret hos mus35 og rotter37. Derfor vil fremskridt inden for metabolitanalyse og metabolomisk profilering i hjernen og periferien hjælpe forskere med bedre at forstå de rumlige og tidsmæssige dynamiske ændringer i tarmafledte metabolitter.

To typer styrekanyler er blevet præsenteret i denne protokol til intracerebroventrikulær injektion i mus - en kommerciel styrekanyle og en styrekanyle i rustfrit stål. Den kommercielle guide kanyle og dummy er godt designet til implantation. Det er ikke let for mus at fjerne den tilpassede dummy på grund af hætten. Tværtimod kan dummyen i rustfrit stål let fjernes fra styrekanylen i rustfrit stål af mus under 1-ugers genopretning, hvilket forårsager koagulering af blod / cerebrospinalvæske i kanylen. Den kommercielle tilpassede kanyle er dog 64 mg, og dummyen til denne kanyle er 86 mg. Således er den samlede vægt af den kommercielle tilpassede kanyle og dummy 150 mg. I modsætning hertil er den tilpassede styrekanyle i rustfrit stål 18,3 mg, og dummyen til denne kanyle er 8,5 mg. Således er den samlede vægt af den tilpassede styrekanyle i rustfrit stål 26,8 mg. Teoretisk set ville den lave vægt af styrekanylesættet i rustfrit stål minimere kanylens indvirkning på dyrets bevægelse og hjernen. Desuden er omkostningerne ved den kommercielle styrekanyle højere end styrekanylen og injektoren i rustfrit stål. Derfor anbefaler vi styrekanylen i rustfrit stål til uerfarne forskere, der udfører stereotaxisk kirurgi i mus.

Den implanterede kanyle kan tilstoppes af blod og cerebrospinalvæske på grund af hjerneskade. Denne tilstopning af kanylen kan forekomme hyppigere i kanylen i rustfrit stål over den kommercielle kanyle. Dummyen kan gevindskæres for at stramme den kommercielle kanyle sikkert (figur 2A), men ikke til kanylen i rustfrit stål (figur 5A). Derfor ville sikring af fastgørelsen af dummyen i genopretningsperioden minimere tilstopningen af kanylen. En ny dummy skal indsættes, hvis løsrivelse opstår under 1-ugers opsving. Desuden skal en steriliseret engangsinjektor indsættes flere gange for at rense kanylen, inden injektoren tilsluttes, der forbinder polyethylenrøret, monteres.

Valget af bedøvelsesmidler vil i høj grad påvirke kirurgi og adfærdstest. Her blev inhalationsbedøvelsesmidlet isofluran valgt frem for injicerede anæstetika, fordi restitutionstiden er kortere, og den er mindre skadelig for dyrene af humane årsager. Doseringen til indånding af isofluran kan dog varieres afhængigt af musens status og kropsvægt. Derfor skal status for anæstesi observeres nøje under hele den kirurgiske procedure, og isofluranfordamperen justeres i overensstemmelse hermed. Den optimerede vejrtrækningshastighed skal være et åndedrag i sekundet under alle procedurer. Desuden skal gasfilterbeholderen fyldt med aktivt kul tilsluttes anæstesikammeret og næsekeglemasken for at annullere isofluran- og udstødningsgasforureningen i driftsområdet. Dette vil beskytte kirurgen mod den toksiske virkning af isofluran.

De repræsentative resultater viste, at SCFAs infusion ikke gav nogen dramatisk effekt på bevægelse i et nyt bur. Dette kan skyldes, at et lille antal dyr blev brugt til at opnå dette resultat (figur 6). Desuden infunderede vi kun SCFA'erne i de første 5 minutter af den nye burbevægelsesadfærdstest, men ikke hele testen, fordi det meste af adfærden blev testet inden for et kort tidsvindue (5-15 min). Tidsvinduet for de tarmafledte mikrobielle metabolitter bør justeres ud fra forskernes hypotese.

Tiden for anæstesi og genvinde bevidstheden fra anæstesi er afgørende for adfærdstest. Her blev musene bedøvet kortvarigt til injektorimplantation og SCFAs infusion, og adfærdstest blev udført efter 15 min. Tiden til at komme sig efter ophør af inhalationsbedøvelse blev bestemt ud fra en tidligere undersøgelse38. En pilotundersøgelse sikrede, at musene var aktive, frit bevægelige og ikke ubehagelige 15 minutter efter anæstesi. Vi introducerede anæstesitrinnet til montering af injektoren af følgende grunde. For det første er injektormåleren 33 G; Det er meget udfordrende at indsætte en så delikat injektor i kanylen, når dyret bevæger sig aktivt. Derudover kan scruffing af bevidste mus producere stress på musene39, hvilket forvirrer de adfærdsmæssige resultater. For det andet er kanylen lejlighedsvis tilstoppet på grund af koagulering af blod / cerebrospinalvæske. Tilstopning af kanylen forsigtigt inden montering af injektoren ville være ideel til metabolitinfusion. Baseret på disse to grunde anbefales det kort at bedøve musene til montering af injektoren. Efterforskere kan vente længere (30 minutter), hvis der er nogen bekymring for dyrets genopretning fra indåndingsanæstesi. Desuden kan der opsættes et separat sæt infusionsindsprøjtningsinjektor, der forbinder polyethylenrøret, for at fremskynde forsøgene.

Denne protokol har flere begrænsninger. For det første ville implantationen af styrekanylen og det forbindende polyethylenrør begrænse det kirurgiske område til implantering af optiske fibre til optogenetisk og fiberfotometri i samme koordinat, det omkringliggende område eller endda den samme hjernehalvdel. Det vil være endnu mere udfordrende at implantere linsen til mikroendoskopi på musehovedet sammen med den implanterede styrekanyle. For det andet kan implantationen af styrekanylen generere en betydelig vægt på musehovedet. Den samlede vægt af et tilpasset kanylesæt er 26,8-150 mg, en skrue er ~ 48 mg, og den monterede tandakryl er 450-500 mg. Hele installationssættet kan begrænse musenes bevægelser. Imidlertid har nylige undersøgelser implanteret et miniskop til overvågning af calciumsignaler i frit bevægelige mus40,41. Miniskopets vægt varierer fra 1,6 g til 4,5 g, eksklusive skruer og tandakryl. Derfor kan vægten af styrekanylen betragtes som relativt acceptabel til test af musens adfærd. For det tredje er det forbindende polyethylenrør til infusionen ~ 350 cm langt, hvilket kan begrænse musens bevægelse under adfærdstesten. For at imødegå denne bekymring kan det være nødvendigt at præteste for bevægelse i en åben felttest for at evaluere virkningen af det forbindende polyethylenrør på musemotorfunktionen. For det fjerde kan tandakryl producere en neurotoksisk virkning på musene. Det er dog nødvendigt at fastgøre styrekanylen til musehovedet i testperioden. For at mindske den potentielle neurotoksiske virkning af dental akryl på mus, operatørerne skal være bekendt med brugen af dental acryl. Dental akryl anvendes bedre, når tandakrylblandingen (pulver og væske) størkner lidt for at reducere penetrationen af dental akrylvæske i hjernen.

Mikrobiota og deres metabolitter er forbundet med adfærdsfunktion ved forskellige udviklingsmilepæle. Selvom denne protokol er baseret på voksne C57BL/6-mus med kropsvægt fra 26 g til 30 g, kan den også anvendes på mus i forskellige aldre og størrelser. Tidligere undersøgelser har vedtaget stereotaxisk kirurgi hos unge mus42,43,44,45. Koordinaterne for hjerneområder kan dog variere afhængigt af musens størrelse og alder. Vi anbefaler, at der henvises til det alderssvarende atlas eller onlineressource (http://mouse.brain-map.org/static/atlas). Desuden skal koordinaterne valideres ved at injicere trypanblå eller fluorescensfarvestof i de unge cullmus og dermed optimere metoden, før den udføres på forsøgsmusene. Guidekanylerne, der bruges i denne protokol, er alle tilpasset og kan justeres efter validering af koordinaterne for forskellige størrelser af mus.

Denne protokol vil være kompatibel med de fleste gnaveradfærdstest med en åben arena oven på apparatet uden meget ændring. Gnaveradfærdstest kan udføres med en polyethylenrørledning oven på musehovedet uden nogen hindring, herunder åben felttest, forhøjet plus / nul labyrint, trin ned test, direkte social interaktion, voksen ultralyd vokalisering, tvungen svømmetest, hale suspension, vand labyrint, T eller Y labyrint, ny objektgenkendelse, marmor begravelse, selvplejende test, stråle krydsning, poltest og eksponering for vandundgåelsesstress. Test ved hjælp af lukkede kamre eller rør skal ændres for at tillade polyethylenrøret frit at bevæge sig sammen med musene, såsom tre-kammer social test, lys-mørk boks, frygtkonditionering, saccharosepræference, fastholdelsesstress, forskrækkelsestest og hæmning af præpulspuls. Vi foreslår fortest og estimering af den længde, der er nødvendig for polyethylenrøret på aflivningsmusene inden test.

Tarmmikrobielle metabolitter har vist sig at påvirke værtsadfærd 8,46,47,48,49. Forskere kan vedtage denne metode til direkte at undersøge de tidsmæssige og rumlige virkninger af tarmmikrobiota-afledte metabolitter på hjernen og adfærd hos mus. For eksempel blev den mikrobielle metabolit 4-ethylphenylsulfat (4EPS) øget i prækliniske musemodeller af ASD og personer med ASD46,48,49. Injektion af 4EPS og kolonisering af bakterierne, der producerer 4EPS, øgede angstlignende adfærd og nedsat oligodendrocytmodning i den paraventrikulære kerne af thalamus (PVT) hos mus46,48. Det ville være fascinerende at evaluere den direkte effekt af 4EPS på PVT hos mus under angstlignende adfærdstest. Den absolutte koncentration af 4EPS i PVT er dog stadig ukendt. Derfor kan en dosis-respons-test være afgørende for at bestemme de tilstrækkelige niveauer af 4EPS i PVT. Et lignende koncept kan vedtages for virkningerne af andre mikrobielle metabolitter på hjernen og adfærd.

Kredsløbsbaserede neuroteknologier, såsom optogenetik, kemogenetik og in vivo calciumbilleddannelse, er kritiske metoder, der gør det muligt for forskere at forstå det neurale kredsløb i kontrollen af adfærd50,51,52. Tarm-hjerneaksen er en kompliceret forbindelse, der er kritisk for tarmmikroberne og deres metabolitter for at formidle værtsadfærd. Et stigende antal undersøgelser har anvendt kredsløbsbaserede neuroteknologier til at forstå den spændende krydstale mellem tarmen og hjernen 33,53,54,55,56,57,58,59. Denne protokol vil give en alternativ måde at forstå hjerneregionbaseret kontrol af adfærd forårsaget af tarmmetabolitter. Ved at kombinere denne protokol med kredsløbsbaserede neuroteknologier kan forskere få indsigt i den kredsløbsbaserede kontrol af adfærd og hjerneaktivitet, som tarmmetabolitter bidrager med.

Afslutningsvis er begrebet tarm-hjerneakse godt accepteret i det videnskabelige samfund og fremmer muligheden for involvering af tarmafledte metabolitter i neuropsykiatriske lidelser 11,13,60,61,62,63,64,65 . For at undersøge, hvordan og hvilke tarmafledte metabolitter påvirker hjernen og adfærden hos mus, vil der være behov for en omfattende og fysiologisk baseret metode på området. Denne artikel giver en trin-for-trin protokol til at levere tarmafledte metabolitter direkte ind i hjernen, vigtigst af alt, i en frit bevægende mus. Dette design kan yderligere tilpasses til at undersøge de regionsspecifikke virkninger ved levering af de tarmafledte metabolitter til forskellige hjerneområder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter relateret til dette arbejde.

Acknowledgments

Vi anerkender laboratoriet dyr center personale på National Cheng Kung University (NCKU) for at passe dyrene. Dette arbejde blev støttet af stipendiet fra Prof. Kun-Yen Huang Education Fund fra CHENG-HSING Medical Foundation til C.-W.L.; midlerne fra ministeriet for videnskab og teknologi (MOST) i Taiwan: (Undergraduate Research MOST 109-2813-C-006-095-B) til T.-H.Y.; (MEST 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) til W.-L.W.; og Higher Education Sprout Project, Undervisningsministeriet til hovedkvarteret for University Advancement på NCKU til W.-L.W.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41 Pfizer n/a
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit ThermoFisher Scientific A-21206
Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal) Millipore AB153-I
Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μm, PES, Sterile NEST 121921LA01
CaCl2  Sigma-Aldrich C1016 ACSF: 0.14 g/L
Chlorhexidine scrub 2% Phoenix NDC 57319-611-09
Chlorhexidine solution Phoenix NDC 57319-599-09
Commercial dummy RWD Life Science 62004 Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm
Commercial guide cannul RWD Life Science 62104 Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm 
Commercial injector RWD Life Science 62204 Single_OD 0.21 mm-33G/ Mates with M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 ACSF: 0.61 g/L
Dental acrylic HYGENIC n/a
Fixing screws RWD Life Science 62521
Fluoroshield mounting medium with DAPI Abcam AB104139
Horse serum ThermoFisher Scientific 16050130
Insulin syringes BBraun XG-LBB-9151133S-1BX 1 mL
Isoflurane  Panion & BF biotech DG-4900-250D
KCl  Sigma-Aldrich P3911 ACSF: 0.19 g/L
Ketoprofen  Swiss Pharmaceutical n/a
Lidocaine  AstraZeneca n/a
Low melting point agarose Invitrogen 16520
MgCl2  Sigma-Aldrich M8266 ACSF: 0.19 g/L
Microscope cover slips MARIENFELD 101242
Microscope slides ThermoFisher Scientific 4951PLUS-001E
Mineral oil light, white NF Macron Fine Chemicals MA-6358-04
NaCl  Sigma-Aldrich S9888 ACSF: 7.46 g/L
NaH2PO4  Sigma-Aldrich S8282 ACSF: 0.18 g/L
NaHCO3  Sigma-Aldrich S5761 ACSF: 1.76 g/L
n-butyl cyanoacrylate adhesive (tissue adhesive glue) 3M 1469SB 3M Vetbond
Neural tracer  Santa Cruz SC-358883 FluoroGold
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Polyethylene tube RWD Life Science 62329 OD 1.50, I.D 0.50 mm and OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (eye) Ointment Dechra  12920060
Sodium acetate  Sigma-Aldrich S2889 SCFAs: 13.5 mM
Sodium azide  Sigma-Aldrich S2002
Sodium butyrate  Sigma-Aldrich B5887 SCFAs: 8 mM
Sodium propionate  Sigma-Aldrich P1880 SCFAs: 5.18 mM
Stainless guide cannula Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.63 mm; Local vendor
Stainless injector Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.3 mm; dummy is made from injector; local vendor
Superglue Krazy Glue KG94548R
Triton X-100 Merck 1.08603.1000
Equipment
Cannula holder RWD Life Science B485-68217
Ceiling camera FOSCAM R2
Digital stereotaxic instruments Stoelting 51730D
Dissecting microscope INNOVIEW SEM-HT/TW
Glass Bead Sterilizer RWD Life Science RS1501
Heating pad Stoelting 53800M
Leica microscope  Leica DM2500
Micro Dissecting Forceps ROBOZ RS-5136 Serrated, Slight Curve; Extra Delicate; 0.5mm Tip Width; 4" Length 
Micro Dissecting Scissors ROBOZ RS-5918 4.5" Angled Sharp
Microinjection controller World Precision Instruments (WPI) MICRO2T SMARTouch Controller
Microinjection syringe pump World Precision Instruments (WPI) UMP3T-1 UltraMicroPump3  
Microliter syringe Hamilton 80014 10 µL
Optical Fiber Cold Light with double Fiber Step LGY-150 Local vendor
Pet trimmer WAHL 09962-2018
Vaporiser for Isoflurane Step AS-01 Local vendor
Vibratome Leica VT1000S
Software
Animal behavior video tracking software Noldus EthoVision Version: 15.0.1416
Leica Application Suite X software Leica LASX Version: 3.7.2.22383

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lynch, J. B., Hsiao, E. Y. Microbiomes as sources of emergent host phenotypes. Science. 365 (6460), 1405-1409 (2019).
  2. Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome-gut-brain axis in health and disease. Gastroenterology Clinics of North America. 46 (1), 77-89 (2017).
  3. Sharon, G., Sampson, T. R., Geschwind, D. H., Mazmanian, S. K. The central nervous system and the gut microbiome. Cell. 167 (4), 915-932 (2016).
  4. Krautkramer, K. A., Fan, J., Backhed, F. Gut microbial metabolites as multi-kingdom intermediates. Nature Reviews: Microbiology. 19 (2), 77-94 (2021).
  5. Lavelle, A., Sokol, H. Gut microbiota-derived metabolites as key actors in inflammatory bowel disease. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. 17 (4), 223-237 (2020).
  6. Dalile, B., Van Oudenhove, L., Vervliet, B., Verbeke, K. The role of short-chain fatty acids in microbiota-gut-brain communication. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. 16 (8), 461-478 (2019).
  7. Morais, L. H., Schreiber, H. L. T., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews: Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
  8. Sharon, G., et al. Human gut microbiota from autism spectrum disorder promote behavioral symptoms in mice. Cell. 177 (6), 1600-1618 (2019).
  9. St Laurent, R., O'Brien, L. M., Ahmad, S. T. Sodium butyrate improves locomotor impairment and early mortality in a rotenone-induced Drosophila model of Parkinson's disease. Neuroscience. 246, 382-390 (2013).
  10. Govindarajan, N., Agis-Balboa, R. C., Walter, J., Sananbenesi, F., Fischer, A. Sodium butyrate improves memory function in an Alzheimer's disease mouse model when administered at an advanced stage of disease progression. Journal of Alzheimer's Disease. 26 (1), 187-197 (2011).
  11. Needham, B. D., et al. A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice. Nature. 602 (7898), 647-653 (2022).
  12. Silva, Y. P., Bernardi, A., Frozza, R. L. The role of short-chain fatty acids from gut microbiota in gut-brain communication. Frontiers in Endocrinology. 11, 25 (2020).
  13. Kratsman, N., Getselter, D., Elliott, E. Sodium butyrate attenuates social behavior deficits and modifies the transcription of inhibitory/excitatory genes in the frontal cortex of an autism model. Neuropharmacology. 102, 136-145 (2016).
  14. Kelly, J. R., et al. Transferring the blues: Depression-associated gut microbiota induces neurobehavioural changes in the rat. Journal of Psychiatric Research. 82, 109-118 (2016).
  15. Wang, L., et al. Elevated fecal short chain fatty acid and ammonia concentrations in children with autism spectrum disorder. Digestive Diseases and Sciences. 57 (8), 2096-2102 (2012).
  16. Adams, J. B., Johansen, L. J., Powell, L. D., Quig, D., Rubin, R. A. Gastrointestinal flora and gastrointestinal status in children with autism--comparisons to typical children and correlation with autism severity. BMC Gastroenterology. 11, 22 (2011).
  17. Skonieczna-Zydecka, K., et al. Faecal short chain fatty acids profile is changed in Polish depressive women. Nutrients. 10 (12), 1939 (2018).
  18. Szczesniak, O., Hestad, K. A., Hanssen, J. F., Rudi, K. Isovaleric acid in stool correlates with human depression. Nutritional Neuroscience. 19 (7), 279-283 (2016).
  19. Martin, A. M., Sun, E. W., Rogers, G. B., Keating, D. J. The influence of the gut microbiome on host metabolism through the regulation of gut hormone release. Frontiers in Physiology. 10, 428 (2019).
  20. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. Paxinos and Franklin's The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2013).
  21. York, J. M., Blevins, N. A., McNeil, L. K., Freund, G. G. Mouse short- and long-term locomotor activity analyzed by video tracking software. Journal of Visualized Experiments. (76), e50252 (2013).
  22. Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice. Journal of Visualized Experiments. (164), e61023 (2020).
  23. Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments. (168), e61941 (2021).
  24. Needham, B. D., Kaddurah-Daouk, R., Mazmanian, S. K. Gut microbial molecules in behavioural and neurodegenerative conditions. Nature Reviews: Neuroscience. 21 (12), 717-731 (2020).
  25. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880 (2008).
  26. Xiaoguang, W., et al. Establishment of a valuable mimic of Alzheimer's disease in rat animal model by intracerebroventricular injection of composited amyloid beta protein. Journal of Visualized Experiments. (137), e56157 (2018).
  27. Venniro, M., Shaham, Y. An operant social self-administration and choice model in rats. Nature Protocols. 15 (4), 1542-1559 (2020).
  28. Ucal, M., et al. Rat model of widespread cerebral cortical demyelination induced by an intracerebral injection of pro-inflammatory cytokines. Journal of Visualized Experiments. (175), e57879 (2021).
  29. Oberrauch, S., et al. Intraventricular drug delivery and sampling for pharmacokinetics and pharmacodynamics study. Journal of Visualized Experiments. (181), e63540 (2022).
  30. Shultz, S. R., et al. Intracerebroventricular injections of the enteric bacterial metabolic product propionic acid impair cognition and sensorimotor ability in the Long-Evans rat: further development of a rodent model of autism. Behavioural Brain Research. 200 (1), 33-41 (2009).
  31. Shultz, S. R., et al. Intracerebroventricular injection of propionic acid, an enteric metabolite implicated in autism, induces social abnormalities that do not differ between seizure-prone (FAST) and seizure-resistant (SLOW) rats. Behavioural Brain Research. 278, 542-548 (2015).
  32. Perry, R. J., et al. Acetate mediates a microbiome-brain-beta-cell axis to promote metabolic syndrome. Nature. 534 (7606), 213-217 (2016).
  33. Muller, P. A., et al. Microbiota modulate sympathetic neurons via a gut-brain circuit. Nature. 583 (7816), 441-446 (2020).
  34. Pardridge, W. M. CSF, blood-brain barrier, and brain drug delivery. Expert Opinion on Drug Delivery. 13 (7), 963-975 (2016).
  35. Wu, J. -T., et al. Oral short-chain fatty acids administration regulates innate anxiety in adult microbiome-depleted mice. Neuropharmacology. , (2022).
  36. Lee, J., et al. Gut microbiota-derived short-chain fatty acids promote poststroke recovery in aged mice. Circulation Research. 127 (4), 453-465 (2020).
  37. Chiu, C., et al. Temporal course of cerebrospinal fluid dynamics and amyloid accumulation in the aging rat brain from three to thirty months. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 3 (2012).
  38. Schuler, B., Rettich, A., Vogel, J., Gassmann, M., Arras, M. Optimized surgical techniques and postoperative care improve survival rates and permit accurate telemetric recording in exercising mice. BMC Veterinary Research. 5, 28 (2009).
  39. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
  40. Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
  41. de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
  42. Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).
  43. Wolter, J. M., et al. Cas9 gene therapy for Angelman syndrome traps Ube3a-ATS long non-coding RNA. Nature. 587 (7833), 281-284 (2020).
  44. Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses for combinatorial cell-subclass-specific labeling. Neuron. 109 (9), 1449-1464 (2021).
  45. Xie, M., et al. TREM2 interacts with TDP-43 and mediates microglial neuroprotection against TDP-43-related neurodegeneration. Nature Neuroscience. 25 (1), 26-38 (2022).
  46. Hsiao, E. Y., et al. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell. 155 (7), 1451-1463 (2013).
  47. Bermudez-Martin, P., et al. The microbial metabolite p-Cresol induces autistic-like behaviors in mice by remodeling the gut microbiota. Microbiome. 9 (1), 157 (2021).
  48. Needham, B. D., et al. A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice. Nature. 602 (7898), 647-653 (2022).
  49. Stewart Campbell, A., et al. Safety and target engagement of an oral small-molecule sequestrant in adolescents with autism spectrum disorder: an open-label phase 1b/2a trial. Nature Medicine. 28 (3), 528-534 (2022).
  50. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  51. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  52. Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
  53. Kaelberer, M. M., et al. A gut-brain neural circuit for nutrient sensory transduction. Science. 361 (6408), (2018).
  54. Needham, B. D., Tang, W., Wu, W. L. Searching for the gut microbial contributing factors to social behavior in rodent models of autism spectrum disorder. Developmental Neurobiology. 78 (5), 474-499 (2018).
  55. Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).
  56. Chu, C., et al. The microbiota regulate neuronal function and fear extinction learning. Nature. 574 (7779), 543-548 (2019).
  57. Wu, W. L., et al. Microbiota regulate social behaviour via stress response neurons in the brain. Nature. 595 (7867), 409-414 (2021).
  58. Buchanan, K. L., et al. The preference for sugar over sweetener depends on a gut sensor cell. Nature Neuroscience. 25 (2), 191-200 (2022).
  59. Han, W., et al. A neural circuit for gut-induced reward. Cell. 175 (3), 665-678 (2018).
  60. Yamawaki, Y., et al. Antidepressant-like effect of sodium butyrate (HDAC inhibitor) and its molecular mechanism of action in the rat hippocampus. World Journal of Biological Psychiatry. 13 (6), 458-467 (2012).
  61. Ho, L., et al. Protective roles of intestinal microbiota derived short chain fatty acids in Alzheimer's disease-type beta-amyloid neuropathological mechanisms. Expert Review of Neurotherapeutics. 18 (1), 83-90 (2018).
  62. Liu, J., et al. Anti-neuroinflammatory effect of short-chain fatty acid acetate against Alzheimer's disease via upregulating GPR41 and inhibiting ERK/JNK/NF-kappaB. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (27), 7152-7161 (2020).
  63. van de Wouw, M., et al. Short-chain fatty acids: microbial metabolites that alleviate stress-induced brain-gut axis alterations. Jounal of Physiology. 596 (20), 4923-4944 (2018).
  64. Olson, C. A., et al. The gut microbiota mediates the anti-seizure effects of the ketogenic diet. Cell. 173 (7), 1728-1741 (2018).
  65. Stewart Campbell, A., et al. Safety and target engagement of an oral small-molecule sequestrant in adolescents with autism spectrum disorder: an open-label phase 1b/2a trial. Nature Medicine. 28 (3), 528-534 (2022).

Tags

Neurovidenskab udgave 184
Intracerebroventrikulær levering af tarmafledte mikrobielle metabolitter i frit bevægelige mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liou, C. W., Yao, T. H., Wu, W. L.… More

Liou, C. W., Yao, T. H., Wu, W. L. Intracerebroventricular Delivery of Gut-Derived Microbial Metabolites in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (184), e63972, doi:10.3791/63972 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter