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Neuroscience

自由に動くマウスにおける腸由来微生物代謝物の脳室内送達

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63972
Automatic Translation
*1,2, *2, 1,2
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Physiology, College of Medicine, National Cheng Kung University
* These authors contributed equally

Summary

腸由来の微生物代謝物は、動物の複雑な行動につながる多面的な影響を及ぼします。私たちは、ガイドカニューレを介した脳室内送達を介して脳内の腸由来微生物代謝物の影響を描写するための段階的な方法を提供することを目指しています。

Abstract

腸内細菌叢とその代謝産物が宿主の生理学と行動に与える影響は、この10年間で広範囲に調査されてきました。多くの研究により、腸内細菌叢由来の代謝物が宿主の複雑な腸脳経路を介して脳を介した生理学的機能を調節することが明らかになっています。短鎖脂肪酸(SCFA)は、腸内細菌叢による食物繊維発酵中に生成される主要な細菌由来の代謝物です。腸から分泌されたSCFAは、末梢の複数の部位で作用し、SCFA受容体の膨大な分布により、免疫、内分泌、および神経応答に影響を与える可能性があります。したがって、SCFAの経口および腹腔内投与を通じてSCFAの中枢および末梢効果を区別することは困難です。この論文は、自由に動くマウスのガイドカニューレ を介して 脳内のSCFAの機能的役割を調べるビデオベースの方法を提示します。脳内のSCFAの量と種類は、注入量と速度を制御することによって調整できます。この方法は、脳内の腸由来代謝物の役割を理解する方法を科学者に提供することができます。

Introduction

ヒトの胃腸管には、宿主に影響を与える多様な微生物が宿主を宿している1,2,3。これらの腸内細菌は、宿主によって消費される食事成分の利用中に腸由来の代謝産物を分泌することができる4,5。興味深いことに、末梢で代謝されていない腸代謝産物は、循環を介して他の臓器に輸送することができます6。注目すべきことに、これらの分泌された代謝産物は、中枢神経系と腸の間の双方向通信として定義される腸脳軸のメディエーターとして機能することができます7。以前の研究では、腸由来の代謝物が動物の複雑な行動や感情を調節できることが示されています8,9,10,11。

短鎖脂肪酸(SCFA)は、食物繊維と難消化性炭水化物の発酵中に腸内細菌叢によって生成される主要な代謝物です6。酢酸塩、プロピオン酸塩、および酪酸塩は、腸内で最も豊富なSCFAです12。SCFAは、消化管内の細胞のエネルギー源として機能します。腸内の代謝されていないSCFAは、門脈を通って脳に輸送され、脳と行動を調節することができます6,12。以前の研究では、SCFAが神経精神障害において重要な役割を果たす可能性があることが示唆されています6,12。例えば、自閉症スペクトラム障害(ASD)の動物モデルであるBTBR T+ Itpr3tf/J(BTBR)マウスへの酪酸の腹腔内注射は、彼らの社会的欠陥を救済しました13。うつ病の被験者から微生物叢を投与された抗生物質治療ラットは、不安様行動および糞便SCFAの増加を示した14。臨床的には、ASD患者では、通常発達中の対照と比較して、糞便SCFAレベルの変化が観察されました15,16。うつ病の人は、健康な被験者よりも糞便SCFAレベルが低くなっています17,18。これらの研究は、SCFAがさまざまな経路で動物や人間の行動を変える可能性があることを示唆しています。

微生物代謝産物は、体内の複数の部位に多様な影響を及ぼし、胃腸管、迷走神経、交感神経など、宿主の生理学と行動に影響を与えます4,19。末梢経路を介して代謝物を投与する場合、脳内の腸由来代謝物の正確な役割を特定することは困難です。.この論文では、自由に動くマウスの脳における腸由来代謝物の影響を調べるためのビデオベースのプロトコルを提示します(図1)。SCFAは行動テスト中にガイドカニューレを介して急性に投与できることを示しました。代謝物の種類、量、注入速度は、目的に応じて変更することができます。カニューレ挿入部位を調整して、特定の脳領域における腸代謝物の影響を調べることができます。私たちは、腸由来の微生物代謝物が脳と行動に与える潜在的な影響を探求する方法を科学者に提供することを目指しています。

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Protocol

すべての実験プロトコルと動物の世話は、国立成功大学(NCKU)の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。

1. 実験動物の準備

  1. ベンダーから6〜8週齢の野生型C57BL / 6JNarlオスマウスを入手します。
  2. 標準的なマウス飼料と滅菌水を 自由に入れた標準的なマウスケージにマウスを収容します。
    注意: NCKUの実験動物センターの収容条件は、温度22±1°C、湿度55%±10%、および13時間/ 11時間の明暗サイクルです。

2.定位固定手術

  1. 定位固定装置、手術器具、および関連アイテムを準備および滅菌します。
    注:手術部位に直接接触するすべてのアイテムは、感染を避けるために滅菌する必要があります。
  2. マウスを酸素中の1%〜5%イソフルランを含むプレキシグラスケージに入れて麻酔します。
    注意: マウスを注意深く観察して、呼吸数が毎秒約1回の呼吸に維持されていることを確認します。
  3. マウスを麻酔室から取り出します。ペットトリマーで手術部位(マウスの頭)を剃ります。マウス切歯を定位固定装置用切歯ホルダーの切歯バーに固定することにより、マウスを定位固定装置フレームに置きます。ノーズコーンマスクで鼻を覆います。
  4. 脳定位固定装置手術全体を通して、酸素中の1%〜2.5%イソフルランでマウスを麻酔します。つま先のピンチ反射 を介して マウスの侵害受容を評価し、手術部位を切開する前に一定の呼吸数を確保します。
  5. 手術中に体温を維持するために、脳定位固定フレームのマウスの下に加熱パッド(37.0°C)を置きます。あるいは、プログラムされたウォーマーと加熱パッドを接続する直腸サーマルプローブを使用してコア温度を維持します。
  6. 粘着テープを使用して頭のトリミングされた毛皮を取り除きます。痛みを和らげるために、鎮痛剤のケトプロフェン(5 mg / kg)をマウスに皮下注射します。.ドライアイを避けるために目の軟膏を塗ります。
  7. 先のとがったイヤーバーを外耳道に挿入して頭を固定します。
  8. イヤーバーのスケールを調整して、頭を中央に配置します。
  9. 切歯ホルダーのノーズクランプを締めて、垂直方向の動きを避けます。頭を軽く押して、頭が固定されていることを確認し、その後の手術中に頭が緩まないようにしてください。
  10. 綿棒を使用してクロルヘキシジンの3つの交互のスクラブで頭皮を消毒します。各スクラブを中央から外側に向かって開始します(最も消毒された中央領域から最も消毒されていない領域まで)。
    注:中央から外側へのスクラブの使用は、科学者が毛皮からの感染と汚染を最小限に抑えるのに役立ちます。外側の領域は、まだ大量の毛皮があり、徹底的に消毒することは容易ではない、剃っていない頭の領域に近いです。
  11. 外科用ブレードを使用して、頭皮を前方/後方(<1 cm)に切開します。切開部を開き、マイクロ解剖鉗子で保持した綿棒で頭蓋骨を拭きます。
    注意: 微小解剖鉗子、手術用ブレード、綿棒は、手術前にオートクレーブ滅菌する必要があります。手術プロセス中、ガラスビーズ滅菌器(150°C)を使用して、各動物の前後に少なくとも5秒間、すべての手術器具を滅菌します。手術中および動物間で手術用ブレードと鉗子を保持するための滅菌ビーカーを準備します。
  12. 頭蓋骨のブレグマとラムダを特定します。ブレグマを参照として使用して、関心領域を特定します。
    1. オプション: 定位固定装置用ドリルホルダーに定位固定装置用ドリルを取り付け、ドリルの先端を使用して Bregma を参照としてポイントします。ガラスビーズ滅菌器(150°C)を使用して、脳定位固定装置ドリルを少なくとも5秒間滅菌します。
  13. 平らな頭蓋骨の水平面を左/右および前/後面でブレグマ/ラムダで調整および位置合わせします。
    注意: 正しい水平面にない場合は、マウスを定位固定装置に再度取り付けます。

3.商業カスタマイズされたガイドカニューレの移植

  1. 脳定位固定装置座標に基づいて、右側脳室の位置を特定してラベル付けします:ブレグマまでの距離、前部/後部(A / P):0.26 mm、内側/外側(M / L):-1.0 mm、背側/腹側(D / V):-2.0 mm20。
    注: 座標は、関心領域に基づいて変更できます。側脳室の座標は、体重範囲が26〜30gの成体C57BL/6Jマウスに基づいていた。若いマウスを使用する場合は、ディスカッションを参照してください。
  2. 市販のガイドカニューレを移植するための定位固定装置ドリルを使用して、ラベル付けされた部位の頭蓋骨に穴(直径= 1.5 mm)を開けます。
  3. ステンレス鋼ネジを取り付けるための定位固定装置ドリルを使用して、頭蓋骨にさらに2〜4つの穴(直径= 1.5 mm)を開けます。
    注:ガラスビーズ滅菌器(150°C)を使用して、各動物の前後に少なくとも5秒間、脳定位固定装置ドリルを滅菌します。
  4. 骨くずを拭き、綿棒で出血を止めます。
  5. 局所麻酔薬、鎮痒薬、および鎮痛効果のために綿棒を使用してリドカイン(1 mg / kg)で頭蓋骨を拭きます。穴を開けても出血が止まらない場合は、止血のために綿棒を穴にそっと置きます。
  6. 穴に2〜4本のステンレスネジを取り付けて、歯科用アクリル用のアンカーを提供します。
  7. 市販のガイドカニューレを固定装置用カニューレホルダーに置き、ガラスビーズ滅菌器(150°C)で消毒します。
    注意: 市販のガイドカニューレ、市販のダミー、および市販のインジェクター(図2A)は、 材料の表に示されている仕様でカスタマイズされました。
  8. 定位固定装置カニューレホルダーを側脳室用に開けられた穴に移動し、市販のガイドカニューレを希望の深さ(2.5 mm)までゆっくりと穴に挿入します。
    注:背側/腹側の座標は、先端が穴にかろうじて挿入されている場合、市販のガイドカニューレの先端を基準として設定することで定義できます。
  9. 10μLのn-ブチルシアノアクリレート接着剤(組織接着剤接着剤)を塗布して、市販のガイドカニューレをドリル穴に固定し、3〜4分間待ちます。市販のガイドカニューレを定位固定装置カニューレホルダーからそっと外し、ホルダーを遠ざけます。
  10. 切開した頭皮に歯科用アクリルを塗布して市販のガイドカニューレを固定し、少なくとも5分間待ちます。市販のダミーを市販のガイドカニューレに埋め込んで、血液や体液によるカニューレの詰まりを防ぎます(図2B)。
  11. イヤーバーを外耳道から外し、マウスを脳定位固定装置フレームから取り外します。
  12. 麻酔からの回復のために、下に加熱パッドがある新しいケージにマウスを置き、マウスが完全に目覚めるまで観察し続けます。
    注意: 胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。手術を受けた動物は、完全に回復するまで他の動物の会社に戻ってはいけません。
  13. 施設のIACUCプロトコルと実験デザインに応じて、マウスをシングルハウジングまたはグループハウジングに戻します。グループハウジングの場合は、不要な怪我やカニューレの剥離を最小限に抑えるために、ケージに収容されるマウスの数を減らしてください。
  14. イブプロフェン(0.2 mg / mL)を飲料水に少なくとも3日間投与し、少なくとも3日間、痛みや苦痛の兆候がないか1日2回監視します。.
    1. 術後のケア中に、マウスの炎症や感染を防ぐために、皮膚の周りにロキシスロマイシン軟膏を塗布します。
    2. 動物の状態を監視し続け、十分なエネルギーを提供するために5%グルコースおよび/または0.9%塩化ナトリウムのタイムリーな腹腔内注射を行います。
    3. 疼痛、苦痛、または感染の状態が着実に悪化する場合は、CO2 吸入によりマウスを安楽死させる。
  15. マウスがSCFAの脳室内送達と行動検査の準備が整うまで、手術後1週間待ちます。

4. SCFAの準備

  1. 酢酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウムを人工脳脊髄液(ACSF)に溶解します( 材料表を参照)。
  2. 化学薬品が完全に溶解していることを確認してから、pHを7.4に調整し、SCFA混合物を0.22μmフィルターでろ過して滅菌します。

5.行動テスト中にSCFAの脳室内送達のための注入システムを設定します

  1. 天井カメラを取り付けて、動作を記録します。カメラをコンピュータに接続して、ビデオ録画ソフトウェアを制御します(図3)。
  2. 10 μLシリンジに蒸留水を入れます。
    注意: マイクロリットルシリンジ内の気泡を避けてください。
  3. マイクロインジェクションポンプをマイクロインジェクションコントローラーに接続します。
  4. マイクロリットルシリンジをマイクロインジェクションポンプに取り付けます。シリンジを取り付けるには、ボタンを押してclを緩めますamp シリンジを対応する位置に取り付けます。クランプを閉じ、マイクロインジェクションポンプのプランジャー保持ネジを締めます(図4A)。
  5. 市販のインジェクターをポリエチレンチューブに挿入します(図2A)。
  6. ポリエチレンチューブをテストアリーナの上の天井カメラに掛けます。
  7. インスリン注射器を使用してポリエチレンチューブに蒸留水を入れます。マイクロリットルシリンジを吊り下げポリエチレンチューブに接続します。
    注意: ポリエチレンチューブが、マウスがテストアリーナ内を自由に動くのに十分な長さであることを確認してください。

6. マイクロインジェクションコントローラのシステム設定

  1. マイクロインジェクションコントローラの電源を入れ、[すべてのチャンネルを表示]を押してコマンド画面にアクセスします(図4C)。[構成]を押して、ボリュームターゲットを9,800 nL、配信速度を100 nL / sに設定します。マイクロリットルシリンジに接続されたポリエチレンチューブから9,800 nLの蒸留水を注入します(方向を押して注入モードに切り替え、実行を押します)(図4Cのコマンド画面の赤い四角を参照)。
  2. [構成]を押し、ボリュームターゲットを3,000 nL、配信速度を100 nL/sに設定します。3,000 nLの鉱油を引き出します(方向を押して撤回モードに切り替え、実行を押します)(図4Cのコマンド画面の赤い四角を参照)。
    注意: ポリエチレンチューブで明確な油水相分離を観察する必要があります。
  3. ポリエチレンチューブをマイクロリットルシリンジ針から分解します。マイクロリットルのシリンジ針から3,000nLの蒸留水を吐き出します( 方向 を押して インフューズ モードに切り替え、 実行を押します)。
  4. マイクロリットルシリンジをポリエチレンチューブに戻します。[構成]を押し、ボリュームターゲットを9,500 nL、配信速度を100 nL/sに設定します。9,500 nLのSCFAを引き出します(方向を押して撤回モードに切り替え、実行を押します)。オイル-SCFA相にラベルを付けて、SCFAが正常に注入されたかどうかを検証します。
  5. [構成]を押して、配信レートで目的のボリュームターゲットを7 nL / sに設定します。方向を押して、注入モードに切り替えます(図4Cのコマンド画面の赤い四角を参照)。
    注:注入時間に基づいて容量を決定します。例えば、送達速度が7 nL/sに対して注入時間が3分の場合、目標容量=1,260nLとなります。
  6. RUNを押して、市販のインジェクターの前端に液体が出るまでマイクロリットルのシリンジを前方に注入してから、SCFA注射用のカニューレにインジェクターを挿入します。

7.自由に動くマウスの市販ガイドカニューレを介した側脳室へのSCFAの注入

  1. マウスを酸素中の1%〜5%イソフルランを含むプレキシグラスケージに入れて麻酔します。
    注意: マウスを注意深く観察して、呼吸数が毎秒約1回の呼吸に維持されていることを確認します。
  2. マウスを首筋にし、市販のインジェクターを市販のガイドカニューレに挿入します(図4B)。
    注意: 市販のガイドカニューレが血液や体液で詰まっている場合は、ピンセットでそっと詰まりを取り除きます。
  3. 行動テストの前に、ケージ内でマウスが麻酔から15分間回復するのを待ちます。
  4. 基本的な移動テストでは、マウスを新しいケージに入れ、35分間自由に探索できるようにします。最初の5分間で、ターゲットボリューム2,100 nLに対して7 nL/sの送達速度を使用してSCFAを注入します(方向を押して注入モードにし、実行を押します)。
    注:新規ケージ内の移動運動は、動物行動ビデオ追跡ソフトウェア21、22を用いて分析することができる。
  5. マウスを麻酔し(ステップ7.1を繰り返し)、市販のインジェクターを市販のガイドカニューレから取り外します。
    注:マウスは、前の注射を洗い流すために適切な時間を与えた後、異なるコントロール/代謝物を繰り返し注射することができます。カニューレがマウスヘッドに固定されている限り、マウスは異なる代謝物で繰り返し試験することができる。

8.マイクロインジェクションシステムの復元

  1. ポリエチレンチューブをマイクロリットルシリンジから分解します。
  2. インスリン注射器を使用してチューブに空気を注入し、ポリエチレンチューブ内の蒸留水を廃棄します。マイクロリットルシリンジを空にします。
  3. 設定画面でPosのリセットを押して、シリンジ停止定義画面を開きます(図4C)。
  4. ビープ音が鳴るまで Withdraw を押して、マイクロインジェクションポンプを完全に引き出した位置にリセットします(図4C)。
  5. コマンド画面に戻り、この画面に**END REACH**記号がある場合は、マイクロインジェクションコントローラーをオフにします(図4C)。

9.オプション:神経トレーサーによる脳室内注射の検証

  1. 2,100 nLのニューラルトレーサーに7 nL/sの送達速度で注入し、注入部位を確認します。
    注意: 逆流を防ぐために、インジェクターをガイドカニューレに5分間置いたままにします。
  2. 神経トレーサーの注入の30分後に、イソフルラン(5%)の過剰投与によってマウスを麻酔する。
  3. 麻酔をかけたマウスの呼吸数と尾/足のピンチ反射を確認します。
    メモ: 次の手順の前に、マウスが応答しないようにする必要があります。
  4. 胸郭の下の皮膚、筋肉、腹壁を通して4〜5 cmの切開を行います。
  5. 肝臓を横隔膜から慎重に少し離します。
  6. 横隔膜を切開してマウスの心臓を露出させます。
  7. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)と氷冷した4%パラホルムアルデヒドをPBSで心臓に浸透させます。
  8. マウスを断頭し、微小解剖鉗子と微小解剖ハサミで脳を注意深く解剖して脳全体を取り出します23。脳サンプルを氷冷した4%パラホルムアルデヒドのPBSに3〜4日間入れ、PBSで3 x 5分間洗浄します。
  9. マウス脳スライスホルダーの8番目のカット(1 mm /セクション)で、マウス脳スライスホルダーで脳を前方から後方向に2つの部分に切断します。脳を埋め込み型に入れ、脳サンプルを低融点アガロース(PBS溶液4%)に埋め込みます。
  10. アガロースに埋め込まれた脳を瞬間接着剤を使用してビブラトームのステージに接着します。ビブラトームを使用して脳を冠状に50μmの脳スライスに切断します。
  11. ブロッキングバッファー(1:1,000希釈)で希釈したニューラルトレーサーを標的とする抗体の脳スライスを室温で一晩インキュベートします。
    注:ブロッキングバッファーには、10%の馬血清、0.1%のTriton X-100、および0.02%のアジ化ナトリウムが含まれていました。
  12. スライスをPBST(0.1%トリトンX-100を含むPBS)で3 x 5分洗浄します。
  13. ブロッキングバッファー(1:500希釈)で希釈した蛍光色素結合二次抗体で脳スライスを室温で2時間インキュベートします。
  14. スライスをPBSで3 x 5分洗浄します。
  15. 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含む封入剤を使用して、スライド上の脳スライスをマウントします。
  16. スライドを顕微鏡カバーガラスで覆います。
  17. スライドの端にマニキュアを塗り、封入剤の漏れを防ぎます。
  18. 室温で一晩インキュベートした後、光から保護し、蛍光顕微鏡を用いて注入部位の蛍光シグナルを画像化する。

10.オプション:マウスの側脳室にあるカスタマイズされたステンレス鋼ガイドカニューレを介した代謝物の注入

  1. プロトコルセクション1〜8に従い、市販のガイドカニューレをステンレス鋼のガイドカニューレに交換して、マウスのステンレス鋼のインジェクターを介して化学物質を注入します。
    注:さまざまな市販およびステンレス鋼のカニューレの長所と短所については、ディスカッションセクションで詳しく説明します。
  2. 市販のガイドカニューレをステンレス鋼のガイドカニューレに交換することを忘れないでください(図5B)。
    注意: ステンレス鋼のガイドカニューレ、ステンレス鋼のダミー、およびステンレス鋼のインジェクター(図5A)は、 材料の表に示されている仕様でカスタマイズされました。カスタマイズされたステンレス鋼ガイドカニューレを希望の深さ(2.0 mm)まで穴に挿入します。
  3. マイクロインジェクションコントローラーとマイクロインジェクションポンプ(図4B)で構成されるマイクロインジェクションシステムを使用して、ステンレス鋼ガイドカニューレを介してSCFAを注入します(プロトコルセクション4〜7と同じ)。ステンレス鋼ガイドカニューレのステンレス鋼ダミーの場合、反対側の先端がステンレス鋼ガイドカニューレより1mm長くなるまで、ステンレス鋼インジェクターの片側をそっと曲げます。
  4. 2,100 nLのニューラルトレーサーをステンレス鋼ガイドカニューレを通してマウスの側脳室に注入します(プロトコルセクション9と同じ)。
  5. 神経トレーサー注入後30分間サンプルを収集します(プロトコルセクション9と同じ)。
  6. ニューラルトレーサー注入脳スライスで画像取得を実行します(プロトコルセクション9と同じ)。

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Representative Results

ガイドカニューレ移植からの回復から1週間後にマウスにSCFAを注入し、新規ケージ内の自発運動を評価した。マウスを新しいケージに入れ、最初の5分間で2,100 nLのSCFAまたはACSFを注入しました(送達速度7 nL / s)脳の側脳室に埋め込まれた市販のガイドカニューレを介して脳に注入します。新規ケージ内の自発運動は、注入後さらに30分間記録されました。.SCFAsとACSFの注入では、新規ケージ内の自発運動活動に差は認められなかった(図6)(n = 2匹/群;データはs.e.m.±平均値として示し、双方向ANOVAで分析した)。

脳領域へのガイドカニューレの移植の精度を検証するために、蛍光ニューラルトレーサーをガイドカニューレ を介して SCFAと同じ体積と送達速度でマウスに注入しました(5分で2,100 nL; 7 nL / s)。脳は30分後に組織学のために集められました。蛍光色素は、マウス脳の側脳室および周辺領域で検出された(図7A)。同じ条件下で神経トレーサーを注入するために、ステンレス鋼のガイドカニューレを脳の側脳室に移植しました。ガイドカニューレと同様に、ステンレス製のガイドカニューレを通して注入した後でも、マウス脳の側脳室とその周辺領域で蛍光色素シグナルが検出されることが示されました(図7B)。

Figure 1
図1:自由に動くマウスにおける脳室内注入の手順。 自由に動くマウスにおける腸由来微生物代謝産物の脳室内送達のフローチャート。略語:SCFAs=短鎖脂肪酸。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:市販のガイドカニューレのマウスへの移植 。 (A)市販のガイドカニューレ、ダミー、インジェクターの代表画像。(B)市販のガイドカニューレとダミーを歯科用アクリルで固定してマウスの脳に移植した代表的な画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:行動試験用の脳室内輸液装置。 マイクロインジェクションシステム、ビデオ録画システム、および行動装置の図。略語:SCFAs=短鎖脂肪酸。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:マイクロインジェクションシステム 。 (a)マイクロインジェクションポンプを用いたマイクロリットルシリンジの設置。(B)ポリエチレンチューブで接続された市販のインジェクターを市販のガイドカニューレに挿入する(C)マイクロインジェクションコントローラのタッチスクリーン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:マウスの側脳室へのステンレス鋼ガイドカニューレの移植 。 (A)ステンレスガイドカニューレ、ダミー、インジェクターの代表的な画像。(B)歯科用アクリルで固定してマウスの脳に埋め込んだステンレスガイドカニューレとダミーの代表像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:新規ケージ内のSCFAを注入したマウスの自発運動活動 。 (A)ガイドカニューレの移植とACSFまたはSCFA注入時の新しいケージ移動のタイムライン概略図。(B)輸液シリンジの配置、輸液ウィンドウ(青い影)、および新しいケージ挙動テストのタイムライン概略図。(C)ACSFおよびSCFAを注入したマウスを新しいケージ内で35分間移動させた総距離。注入の時間枠は青い影(0〜5分)で示されます。(D)新規ケージ内のACSFおよびSCFAを注入したマウスの軌跡の代表的な画像。n=群あたり2匹のマウス。データは平均±s.e.m.として示され、二元配置ANOVAによって分析された。NS: 重要ではありません。略語:SCFAs=短鎖脂肪酸;ACSF =人工脳脊髄液。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 7
図7:脳注入蛍光色素の組織学。 カスタマイズされた(A)市販の(B)ステンレス製ガイドカニューレをマウスの側脳室(LV)に移植した注入。スケールバー= 1 mm(左)および500 μm(右)。青:DAPI染色;緑:蛍光防止金のラベル。略語:LV =側脳室;AC =前方交連;CPu =尾状被殻;LS =外側中隔;MS =内側中隔。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

腸由来の代謝産物は、体内での複数の結合部位のために、あまり正確なメカニズムなしに脳介在性疾患と関連しています6,12,24。以前の報告では、SCFAがGタンパク質共役型受容体、エピジェネティック調節因子、および体内の複数の部位でのエネルギー生産の源のリガンドとして機能する可能性があることが示されました6,12。末梢由来の交絡因子(免疫細胞、ホルモン、自律神経系など)を回避するため、自由に動くマウスにガイドカニューレを介してSCFAを脳内に脳内注射する方法を開発しました。さらに、カニューレ挿入部位と注入部位を検証して、SCFAの影響を受ける可能性のある脳領域を探索しました。全体として、この論文は、腸脳軸研究のために腸由来の代謝物を脳に送達するための正確で綿密で検証された方法を提示します。

ガイドカニューレを介した動物への薬物および化学物質の脳室内送達は、さまざまな薬物検査29、疾患モデリング26、28、および行動検査の特定の設計27について十分に確立されています25,26,27,28,29.最も重要なことは、いくつかの研究が脳室内注射を通じて腸内微生物代謝物を脳に送達し、生理学的機能に対するそれらの効果をテストしたことです30,31,32,33。このプロトコルは、腸代謝物をリアルタイムで脳に急性に投与する際のアドオン属性を提供し、科学者が脳と行動に対する腸代謝物の動的影響を理解することを可能にします。

代謝物注入の送達速度は、脳室内の脳脊髄液の流れをシミュレートするために重要です。ある研究では、マウスの脳脊髄液産生率は5.3 nL / s34であることが示されました。自由に動くマウスで自然にSCFAの流速を制御するために、このマイクロインジェクションシステムの流速を評価しました(図3および図4)。SCFAは、長さ350cmのポリエチレンチューブを使用して自由に動くマウスにSCFAを注入した場合でも、あまり抵抗なくスムーズに注入することができました。蒸留水と鉱物油を充填してポリエチレンチューブ内の液体抵抗を減らすと(プロトコルセクション5および6を参照)、流量を100 nL/sから7 nL/sに下げることができます。SCFAまたはACSFを7 nL/sの流速で注入しても、マウスの異常な行動は見られませんでした。

脳室内注射のための腸由来代謝物の量と投与量は重要です。.さまざまな脳領域における腸由来代謝物の絶対レベルを包括的に分析することは依然として困難です。例えば、脳内のSCFAの生理学的レベルの検出を示した研究はほとんどありません35,36。ある研究では、マウスの脳内の酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩の濃度は、それぞれ約1640.6〜3281.2μg/g、288.18〜384.24μg/g、および44.036〜66.054μg/gであることが示されました36。しかし、別の研究では、脳内のSCFAのレベルが低いことが報告されています(酢酸128.1 μg/g、プロピオン酸0.3883 μg/g、酪酸0.1640 μg/g)35。このプロトコルで採用された注入された酢酸塩、プロピオン酸塩、および酪酸塩の量は、それぞれ5.81385 μg / g、4.62378 μg / g、および2.6124 μg / gでした。したがって、このプロトコルに注入されたSCFAの濃度は、生理学的濃度に匹敵します。しかし、SCFAの濃度が異なる脳領域で異なる可能性を排除することはできませんでした。いくつかの研究は、脳室内注射(1分間に4μLの0.26 Mプロピオン酸;約249.756 μg / g)による脳室へのプロピオン酸の送達がラットの社会的行動と認知を損なうことを示しました30,31。注入されたプロピオン酸塩の投与量および流速は、マウス35およびラット37で報告されているように比較的高かった。したがって、脳および末梢における代謝物分析とメタボロームプロファイリングの進歩は、研究者が腸由来代謝物の空間的および時間的動的変化をよりよく理解するのに役立ちます。

このプロトコルでは、マウスの脳室内注射用に、市販のガイドカニューレとステンレス鋼のガイドカニューレの2種類のガイドカニューレが提示されています。市販のガイドカニューレとダミーは、移植用にうまく設計されています。マウスがキャップのためにカスタマイズされたダミーを取り除くことは容易ではありません。それどころか、ステンレス鋼のダミーは、1週間の回復中にマウスによってステンレス鋼のガイドカニューレから簡単に取り外すことができ、カニューレ内の血液/脳脊髄液の凝固を引き起こします。ただし、市販のカスタマイズされたカニューレは64mgで、このカニューレのダミーは86mgです。したがって、市販のカスタマイズされたカニューレとダミーの総重量は150mgです。対照的に、カスタマイズされたステンレス鋼ガイドカニューレは18.3mgであり、このカニューレのダミーは8.5mgです。したがって、カスタマイズされたステンレス鋼ガイドカニューレの総重量は26.8mgです。理論的には、ステンレス鋼のガイドカニューレセットの軽量は、動物の動きと脳に対するカニューレの影響を最小限に抑えます。さらに、市販のガイドカニューレのコストは、ステンレス鋼のガイドカニューレやインジェクターよりも高くなります。したがって、マウスで定位固定手術を行う経験の浅い研究者には、ステンレス鋼ガイドカニューレをお勧めします。

埋め込まれたカニューレは、脳の損傷により血液や脳脊髄液によって詰まる可能性があります。このカニューレの目詰まりは、市販のカニューレよりもステンレス鋼のカニューレでより頻繁に発生する可能性があります。ダミーは、市販のカニューレをしっかりと締めるためにねじ込むことができますが(図2A)、ステンレス鋼のカニューレ(図5A)にはねじ込むことはできません。したがって、回復期間中にダミーを確実に取り付けることで、カニューレの目詰まりを最小限に抑えることができます。1週間の回復中に剥離が発生した場合は、新しいダミーを挿入する必要があります。さらに、ポリエチレンチューブを接続するインジェクターを取り付ける前に、使い捨て滅菌インジェクターを数回挿入してカニューレの詰まりを取り除く必要があります。

麻酔薬の選択は、手術と行動検査に大きく影響します。ここで、吸入麻酔薬イソフルランは、回復時間が短く、人道的な理由から動物への害が少ないため、注射麻酔薬よりも選択されました。しかしながら、イソフルラン吸入の投与量は、マウスの状態および体重に応じて変えることができる。したがって、麻酔の状態は手術全体を通して注意深く観察されなければならず、イソフルラン気化器はそれに応じて調整されなければならない。最適化された呼吸数は、 すべての 手順で1秒あたり1回の呼吸である必要があります。さらに、活性炭で満たされたガスフィルターキャニスターを麻酔室とノーズコーンマスクに接続して、手術領域のイソフルランと排気ガス汚染を排出する必要があります。これは、イソフルランの毒性作用から外科医を保護します。

代表的な結果は、SCFAの注入が新しいケージの移動に劇的な効果をもたらさないことを示しました。これは、この結果を得るために少数の動物を使用したためである可能性があります(図6)。さらに、新しいケージ移動動作テストの最初の5分間はSCFAのみを注入しましたが、ほとんどの動作は短い時間枠(5〜15分)内でテストされたため、テスト全体は注入しませんでした。腸由来の微生物代謝物の時間枠は、研究者の仮説に基づいて調整する必要があります。

麻酔と麻酔からの意識回復の時間は、行動テストにとって重要です。ここでは、マウスを注射器移植およびSCFAs注入のために短時間麻酔し、15分後に行動試験を行った。吸入麻酔の停止後に回復する時間は、以前の研究に基づいて決定された38。パイロット研究では、マウスが活動的で、自由に動き、麻酔後15分で不快ではないことが確認されました。インジェクターの装着に麻酔ステップを導入したのは、以下の理由からです。まず、インジェクターゲージは33Gです。動物が活発に動いているときにそのような繊細な注射器をカニューレに挿入することは非常に困難です。さらに、意識のあるマウスの首筋は、マウス39にストレスを生じさせ、行動転帰を混乱させる可能性がある。第二に、血液/脳脊髄液の凝固によりカニューレが詰まることがあります。インジェクターを取り付ける前にカニューレをやさしく詰まらせることは、代謝物の注入に理想的です。これらの2つの理由に基づいて、インジェクターを取り付けるためのマウスを短時間麻酔することをお勧めします。吸入麻酔からの動物の回復に懸念がある場合は、研究者はより長く(30分)待つことができます。さらに、ポリエチレンチューブを接続する輸液注入器の別のセットを設定して、実験を加速することができます。

このプロトコルにはいくつかの制限があります。第一に、ガイドカニューレと接続ポリエチレンチューブの移植は、光遺伝学的およびファイバー測光のための光ファイバーを同じ座標、周囲領域、または脳の同じ半球に移植するための手術領域を制限するであろう。マイクロ内視鏡検査用のレンズを、埋め込まれたガイドカニューレと一緒にマウスの頭に埋め込むことはさらに困難になります。第二に、ガイドカニューレの移植は、マウスの頭部にかなりの重量を発生させ得る。カスタマイズされたカニューレセットの総重量は26.8-150mg、ネジは~48mg、取り付けられた歯科用アクリルは450-500mgです。インストールセット全体がマウスの動きを制限する場合があります。しかしながら、最近の研究では、自由に動くマウス40、41においてカルシウムシグナルをモニターするためのミニスコープが埋め込まれている。ミニスコープの重量は、ネジと歯科用アクリルを除いて、1.6gから4.5gの範囲です。したがって、ガイドカニューレの重量は、マウスの行動試験に比較的許容できると考えられる。第三に、輸液用の接続ポリエチレンチューブの長さは~350cmであり、行動試験中のマウスの動きを制限する可能性があります。この懸念に対処するために、マウスの運動機能に対する接続ポリエチレンチューブの影響を評価するために、オープンフィールドテストでの移動の事前テストが必要になる場合があります。第四に、歯科用アクリルはマウスに神経毒性作用を生じさせる可能性がある。ただし、試験期間中はガイドカニューレをマウスヘッドに取り付ける必要があります。マウスに対する歯科用アクリルの潜在的な神経毒性効果を減らすために、オペレーターは歯科用アクリルの使用法に精通している必要があります。歯科用アクリルは、歯科用アクリル混合物(粉末と液体)がわずかに固化して、歯科用アクリル液の脳への浸透を減らす場合によりよく適用されます。

微生物叢とその代謝産物は、明確な開発マイルストーンでの行動機能に関連しています。このプロトコルは、体重が26 gから30 gの範囲の成体C57BL / 6マウスに基づいていますが、さまざまな年齢とサイズのマウスにも適用できます。以前の研究では、若いマウスで定位固定手術が採用されています42、43、44、45。ただし、脳領域の座標は、マウスのサイズと年齢によって異なる場合があります。年齢に対応するアトラスまたはオンラインリソース(http://mouse.brain-map.org/static/atlas)を参照することをお勧めします。さらに、トリパンブルーまたは蛍光色素を若いカリングマウスに注入して座標を検証し、実験マウスで実行する前に方法を最適化する必要があります。このプロトコルで使用されるガイドカニューレはすべてカスタマイズされており、さまざまなサイズのマウスの座標を検証した後に調整できます。

このプロトコルは、多くの変更を加えることなく、装置の上部にオープンアリーナを備えたほとんどのげっ歯類の行動試験と互換性があります。げっ歯類の行動テストは、オープンフィールドテスト、高架プラス/ゼロ迷路、ステップダウンテスト、直接社会的相互作用、成人超音波発声、強制水泳テスト、テールサスペンション、水迷路、TまたはY迷路、新しい物体認識、大理石の埋葬、セルフグルーミングテスト、ビーム交差、 ポールテスト、および水回避ストレス暴露。密閉されたチャンバーまたはチューブを使用したテストは、ポリエチレンチューブがマウスと一緒に自由に移動できるように、3室ソーシャルテスト、明暗ボックス、恐怖条件付け、ショ糖選好、拘束ストレス、驚愕テスト、プレパルスパルス阻害などを変更する必要があります。テストする前に、カリングマウスのポリエチレンチューブに必要な長さを事前にテストして推定することをお勧めします。

腸内微生物代謝産物は、宿主の行動に影響を与えることが示されています8、46、47、48、49。科学者は、この方法を採用して、腸内細菌叢由来の代謝物が脳とマウスの行動に与える時間的および空間的影響を直接調査できます。例えば、微生物代謝産物4-エチルフェニル硫酸塩(4EPS)は、ASDの前臨床マウスモデルおよびASD46,48,49の人々において増加した。4EPSの注射と4EPSを産生する細菌のコロニー形成は、マウスの視床の脳室傍核(PVT)における不安様行動を増加させ、希突起膠細胞の成熟を障害した46,48。不安様行動試験中にマウスのPVTに対する4EPSの直接的な影響を評価することは興味深いでしょう。しかしながら、PVT中の4EPSの絶対濃度はまだ不明である。したがって、PVTにおける4EPSの適切なレベルを決定するには、用量反応試験が重要である可能性がある。同様の概念は、脳および行動に対する他の微生物代謝産物の影響についても採用することができる。

オプトジェネティクス、ケモジェネティクス、in vivoカルシウムイメージングなどの回路ベースのニューロテクノロジーは、科学者が行動の制御における神経回路を理解することを可能にする重要な方法です50、51、52。腸脳軸は、腸内微生物とその代謝物が宿主の行動を媒介するために重要な複雑な接続です。腸と脳の間の興味深いクロストークを理解するために回路ベースのニューロテクノロジーを採用する研究が増えています33,53,54,55,56,57,58,59。このプロトコルは、腸代謝物によって引き起こされる行動の脳領域ベースの制御を理解するための代替方法を提供します。このプロトコルを回路ベースのニューロテクノロジーと組み合わせることで、研究者は腸の代謝物によってもたらされる行動と脳活動の回路ベースの制御についての洞察を得ることができます。

結論として、腸脳軸の概念は科学界で広く受け入れられており、神経精神障害における腸由来代謝産物の関与の可能性を促進する11,13,60,61,62,63,64,65.腸由来の代謝物がマウスの脳と行動にどのように影響するかを調べるには、この分野で包括的で生理学的に基づいた方法論が必要になります。この記事では、自由に動くマウスで腸由来の代謝物を脳に直接、最も重要なことに送達するための段階的なプロトコルを提供します。この設計は、腸由来代謝産物を様々な脳領域に送達することによる領域特異的効果を調査するためにさらに適合させることができる。

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Disclosures

著者には、この作業に関連する利益相反はありません。

Acknowledgments

国立成功大学(NCKU)の実験動物センターのスタッフに、動物の世話をしてくれたことに感謝します。この作業は、チェンシン医療財団のクンイェンファン教育基金からC.-W.L.への奨学金によってサポートされました。台湾の科学技術部(MOST)からの資金:(学部研究MOST 109-2813-C-006-095-B)からT.-H.Y.;(ほとんどの107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3)からW.-L.W.;高等教育スプラウトプロジェクト、教育省からNCKUの大学進学本部からW.-L.W.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41 Pfizer n/a
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit ThermoFisher Scientific A-21206
Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal) Millipore AB153-I
Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μm, PES, Sterile NEST 121921LA01
CaCl2  Sigma-Aldrich C1016 ACSF: 0.14 g/L
Chlorhexidine scrub 2% Phoenix NDC 57319-611-09
Chlorhexidine solution Phoenix NDC 57319-599-09
Commercial dummy RWD Life Science 62004 Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm
Commercial guide cannul RWD Life Science 62104 Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm 
Commercial injector RWD Life Science 62204 Single_OD 0.21 mm-33G/ Mates with M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 ACSF: 0.61 g/L
Dental acrylic HYGENIC n/a
Fixing screws RWD Life Science 62521
Fluoroshield mounting medium with DAPI Abcam AB104139
Horse serum ThermoFisher Scientific 16050130
Insulin syringes BBraun XG-LBB-9151133S-1BX 1 mL
Isoflurane  Panion & BF biotech DG-4900-250D
KCl  Sigma-Aldrich P3911 ACSF: 0.19 g/L
Ketoprofen  Swiss Pharmaceutical n/a
Lidocaine  AstraZeneca n/a
Low melting point agarose Invitrogen 16520
MgCl2  Sigma-Aldrich M8266 ACSF: 0.19 g/L
Microscope cover slips MARIENFELD 101242
Microscope slides ThermoFisher Scientific 4951PLUS-001E
Mineral oil light, white NF Macron Fine Chemicals MA-6358-04
NaCl  Sigma-Aldrich S9888 ACSF: 7.46 g/L
NaH2PO4  Sigma-Aldrich S8282 ACSF: 0.18 g/L
NaHCO3  Sigma-Aldrich S5761 ACSF: 1.76 g/L
n-butyl cyanoacrylate adhesive (tissue adhesive glue) 3M 1469SB 3M Vetbond
Neural tracer  Santa Cruz SC-358883 FluoroGold
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Polyethylene tube RWD Life Science 62329 OD 1.50, I.D 0.50 mm and OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (eye) Ointment Dechra  12920060
Sodium acetate  Sigma-Aldrich S2889 SCFAs: 13.5 mM
Sodium azide  Sigma-Aldrich S2002
Sodium butyrate  Sigma-Aldrich B5887 SCFAs: 8 mM
Sodium propionate  Sigma-Aldrich P1880 SCFAs: 5.18 mM
Stainless guide cannula Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.63 mm; Local vendor
Stainless injector Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.3 mm; dummy is made from injector; local vendor
Superglue Krazy Glue KG94548R
Triton X-100 Merck 1.08603.1000
Equipment
Cannula holder RWD Life Science B485-68217
Ceiling camera FOSCAM R2
Digital stereotaxic instruments Stoelting 51730D
Dissecting microscope INNOVIEW SEM-HT/TW
Glass Bead Sterilizer RWD Life Science RS1501
Heating pad Stoelting 53800M
Leica microscope  Leica DM2500
Micro Dissecting Forceps ROBOZ RS-5136 Serrated, Slight Curve; Extra Delicate; 0.5mm Tip Width; 4" Length 
Micro Dissecting Scissors ROBOZ RS-5918 4.5" Angled Sharp
Microinjection controller World Precision Instruments (WPI) MICRO2T SMARTouch Controller
Microinjection syringe pump World Precision Instruments (WPI) UMP3T-1 UltraMicroPump3  
Microliter syringe Hamilton 80014 10 µL
Optical Fiber Cold Light with double Fiber Step LGY-150 Local vendor
Pet trimmer WAHL 09962-2018
Vaporiser for Isoflurane Step AS-01 Local vendor
Vibratome Leica VT1000S
Software
Animal behavior video tracking software Noldus EthoVision Version: 15.0.1416
Leica Application Suite X software Leica LASX Version: 3.7.2.22383

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神経科学、第184号、
自由に動くマウスにおける腸由来微生物代謝物の脳室内送達
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Liou, C. W., Yao, T. H., Wu, W. L.… More

Liou, C. W., Yao, T. H., Wu, W. L. Intracerebroventricular Delivery of Gut-Derived Microbial Metabolites in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (184), e63972, doi:10.3791/63972 (2022).

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