Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

העברה תוך-מוחית של מטבוליטים מיקרוביאליים שמקורם במעיים בעכברים הנעים בחופשיות

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63972
Automatic Translation
*1,2, *2, 1,2
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Physiology, College of Medicine, National Cheng Kung University
* These authors contributed equally

Summary

למטבוליטים מיקרוביאליים שמקורם במעיים יש השפעות רבות פנים המובילות להתנהגות מורכבת אצל בעלי חיים. אנו שואפים לספק שיטה שלב אחר שלב כדי להגדיר את ההשפעות של מטבוליטים מיקרוביאליים שמקורם במעיים במוח באמצעות העברה תוך-חדרית באמצעות צינורית מנחה.

Abstract

ההשפעה של מיקרוביוטה של המעיים והמטבוליטים שלהם על הפיזיולוגיה וההתנהגות של המארחים נחקרה בהרחבה בעשור זה. מחקרים רבים גילו כי מטבוליטים שמקורם במיקרוביוטה של המעיים מווסתים תפקודים פיזיולוגיים בתיווך המוח באמצעות מסלולים מורכבים בין המעי למוח אצל הפונדקאי. חומצות שומן קצרות שרשרת (SCFAs) הן המטבוליטים העיקריים שמקורם בחיידקים המיוצרים במהלך תסיסת סיבים תזונתיים על-ידי המיקרוביום של המעי. SCFAs מופרשים מהמעיים יכולים לפעול באתרים רבים בפריפריה, ולהשפיע על התגובה החיסונית, האנדוקרינית והעצבית עקב התפוצה העצומה של קולטני SCFAs. לכן, מאתגר להבדיל בין ההשפעות המרכזיות וההיקפיות של SCFAs באמצעות מתן פומי ותוך-צפקי של SCFAs. מאמר זה מציג שיטה מבוססת וידאו לחקור את התפקיד התפקודי של SCFAs במוח באמצעות צינורית מנחה בעכברים הנעים בחופשיות. ניתן להתאים את כמות וסוג ה-SCFAs במוח על ידי שליטה בנפח ובקצב העירוי. שיטה זו יכולה לספק למדענים דרך להעריך את תפקידם של מטבוליטים שמקורם במעיים במוח.

Introduction

מערכת העיכול האנושית מכילה מיקרואורגניזמים מגוונים המשפיעים על המארח 1,2,3. חיידקי המעיים האלה יכולים להפריש מטבוליטים שמקורם במעיים במהלך השימוש שלהם ברכיבים תזונתיים הנצרכים על-ידי המארח 4,5. באופן מעניין, מטבוליטים של המעיים שאינם מטבוליסטים בפריפריה יכולים להיות מועברים לאיברים אחרים דרך מחזור6. שימו לב שהמטבוליטים המופרשים האלה יכולים לשמש כמתווכים לציר המעי-מוח, המוגדר כתקשורת דו-כיוונית בין מערכת העצבים המרכזית למעי7. מחקרים קודמים הראו כי מטבוליטים שמקורם במעיים יכולים לווסת התנהגות ורגש מורכבים אצל בעלי חיים 8,9,10,11.

חומצות שומן קצרות שרשרת (SCFAs) הן המטבוליטים העיקריים המיוצרים על-ידי מיקרוביוטה של המעיים במהלך תסיסה של סיבים תזונתיים ופחמימות בלתי ניתנות לעיכול6. אצטט, פרופיונאט ובוטיראט הם ה-SCFAs הנפוצים ביותר במעיים12. SCFAs משמשים כמקור אנרגיה לתאים במערכת העיכול. SCFAs לא מטבוליים במעיים יכולים להיות מועברים למוח דרך וריד הפורטל, ובכך לווסת את המוח ואת ההתנהגות 6,12. מחקרים קודמים הציעו כי SCFAs עשויים למלא תפקיד קריטי בהפרעות נוירופסיכיאטריות 6,12. לדוגמה, הזרקה תוך-צפקית של בוטיראט בעכברי BTBR T+ Itpr3tf/J (BTBR), מודל חייתי של הפרעת ספקטרום האוטיזם (ASD), הצילה את הגירעונות החברתיים שלהם13. חולדות שטופלו באנטיביוטיקה וקיבלו מיקרוביוטה מנבדקים דיכאוניים הראו עלייה בהתנהגויות דמויות חרדה וב-SCFAs צואתיים14. מבחינה קלינית, שינויים ברמות SCFAs בצואה נצפו אצל אנשים עם ASD בהשוואה לקבוצת הביקורתהמתפתחת בדרך כלל 15,16. לאנשים עם דיכאון יש רמות נמוכות יותר של SCFAs בצואה מאשרלנבדקים בריאים 17,18. מחקרים אלה הציעו כי SCFAs יכולים לשנות התנהגות אצל בעלי חיים ובני אדם באמצעות מסלולים שונים.

מטבוליטים מיקרוביאליים מפעילים השפעות מגוונות על אתרים רבים בגוף, ומשפיעים על הפיזיולוגיה וההתנהגויות של המארח 4,19, כולל מערכת העיכול, עצב הוואגוס והעצב הסימפתטי. קשה להצביע על התפקיד המדויק של מטבוליטים שמקורם במעיים במוח בעת מתן המטבוליטים דרך נתיבים היקפיים. המאמר הזה מציג פרוטוקול מבוסס וידאו כדי לחקור את ההשפעות של מטבוליטים שמקורם במעיים במוחו של עכבר שנע בחופשיות (איור 1). הראינו כי ניתן לתת SCFAs באופן חריף דרך צינורית המדריך במהלך מבחנים התנהגותיים. ניתן לשנות את הסוג, הנפח וקצב העירוי של מטבוליטים בהתאם למטרה. ניתן לכוונן את אתר הקנוליזציה כדי לחקור את ההשפעה של מטבוליטים במעיים באזור מסוים במוח. אנו שואפים לספק למדענים שיטה לחקור את ההשפעה הפוטנציאלית של מטבוליטים מיקרוביאליים שמקורם במעיים על המוח ועל ההתנהגות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל פרוטוקולי הניסוי והטיפול בבעלי החיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת צ'נג קונג (NCKU) (IACUC).

1. הכנה לחיה הניסיונית

  1. השג עכברים זכרים מסוג C57BL/6JNarl בני 6-8 שבועות מספקים פרטיים.
  2. אחסן את העכברים בכלוב עכברים סטנדרטי עם צ'או עכבר סטנדרטי ומים מעוקרים ad libitum.
    הערה: תנאי הדיור של מרכז חיות המעבדה של NCKU הם טמפרטורה של 22 ± 1 מעלות צלזיוס, 55% ± 10% לחות, ומחזור אור/חושך של 13 שעות/11 שעות.

2. ניתוח סטריאוטקסי

  1. הכן ועקר את המכשיר הסטריאוטקסי, כלי הניתוח והפריטים הקשורים.
    הערה: כל הפריטים שייגעו ישירות עם אתר הניתוח צריכים להיות מעוקרים כדי למנוע זיהום.
  2. הרדמת העכבר על ידי הצבתו בכלוב הפרספקס עם 1%-5% איזופלורן בחמצן.
    הערה: התבונן מקרוב בעכבר כדי להבטיח שקצב הנשימה נשמר בסביבות נשימה אחת בשנייה.
  3. הוציאו את העכבר מתא ההרדמה. לגלח את האתר כירורגי (ראש עכבר) עם גוזם לחיות מחמד. הנח את העכבר על המסגרת הסטריאוטקסית על-ידי קיבוע החותכות של העכבר על מוט החותך במחזיק החותך הסטריאוטקסי. מכסים את האף במסכת האף.
  4. הרדימו את העכבר עם 1%-2.5% איזופלורן בחמצן לאורך כל הניתוח הסטריאוטקסי. להעריך את nociception של העכבר באמצעות רפלקס צביטה הבוהן ולהבטיח קצב נשימה קבוע לפני חתיך את האתר כירורגי.
  5. הניחו כרית חימום (37.0°C) מתחת לעכבר על המסגרת הסטריאוטקסית כדי לשמור על טמפרטורת הגוף במהלך הניתוח. לחלופין, שמרו על טמפרטורת הליבה בעזרת בדיקה תרמית רקטלית המחברת בין המחמם המתוכנת לבין כרית החימום.
  6. הסר את הפרווה הגזומה על הראש באמצעות סרט דבק. להזריק לעכבר Ketoprofen משכך כאבים (5 מ"ג / ק"ג) תת עורית כדי להקל על הכאב. יש למרוח משחת עיניים כדי למנוע יובש בעיניים.
  7. הכנס את מוט האוזן המחודד לתעלת האוזן כדי לתקן את הראש.
  8. מרכזו את הראש על ידי התאמת קנה המידה של מוט האוזניים.
  9. הדקו את מהדק האף על מחזיק החותך כדי למנוע תזוזה אנכית. לחץ על הראש בעדינות כדי לבדוק שהראש קבוע ולמנוע מהראש להשתחרר במהלך הניתוח הבא.
  10. יש לחטא את הקרקפת באמצעות שלושה קרצופים מתחלפים של כלורהקסידין באמצעות צמר גפן. התחילו כל קרצוף מהאמצע לכיוון הצד החיצוני (מהאזור המרכזי הכי מחוטא לאזור הכי פחות מחוטא).
    הערה: השימוש בפילינגים מהאמצע ועד החוץ יכול לעזור למדענים למזער את הזיהום והזיהום מהפרווה. האזור החיצוני קרוב לאזור הראש הלא מגולח, שעדיין יש בו כמות גדולה של פרווה ולא קל לחטא אותו ביסודיות.
  11. יש לחדור את הקרקפת באופן קדמי/אחורי (<1 ס"מ) באמצעות להב ניתוחי. פותחים את החתך ומנגבים את הגולגולת בעזרת צמר גפן המוחזק על ידי מלקחיים זעירים.
    הערה: יש לעקר את המלקחיים הזעירים, הלהב הכירורגי ומקלוני הכותנה על ידי אוטוקלבינג לפני הניתוח. במהלך התהליך הכירורגי, לעקר את כל הציוד הכירורגי באמצעות מחטא חרוזי זכוכית (150 מעלות צלזיוס) למשך 5 שניות לפחות לפני ואחרי כל חיה. הכינו מעוקרת להחזקת להב הניתוח והמלקחיים במהלך התהליך הכירורגי ובין בעלי חיים.
  12. זהה את ברגמה ולמבדה על הגולגולת. השתמש ב- Bregma כהפניה לאיתור אזור העניין.
    1. אופציונלי: הרכב את המקדחה הסטריאוטקסית על מחזיק המקדחה הסטריאוטקסית, והשתמש בקצה המקדחה כדי להצביע על ברגמה כהפניה. יש לעקר את המקדחה הסטריאוטקסית באמצעות מעקר חרוזי הזכוכית (150 מעלות צלזיוס) למשך 5 שניות לפחות.
  13. כייל ויישר את המישור האופקי השטוח של הגולגולת במישורים שמאליים/ימניים וקדמיים/אחוריים על ידי Bregma/Lambda.
    הערה: אם לא במישור אופקי נכון, טען מחדש את העכבר על המכשיר הסטריאוטקסי.

3. השתלת צינורית מדריך מותאם אישית מסחרית

  1. זהה ותייג את מיקום החדר הלטרלי הימני, בהתבסס על הקואורדינטות הסטריאוטקסיות: מרחק לברגמה, קדמית/אחורית (A/P): 0.26 מ"מ, מדיאלית/צידית (M/L): -1.0 מ"מ, גב/גחון (D/V): -2.0 מ"מ20.
    הערה: ניתן לשנות את הקואורדינטות בהתבסס על אזור העניין. הקואורדינטות של החדר הצדדי התבססו על עכברי C57BL/6J בוגרים עם טווח משקל של 26-30 גרם. אם משתמשים בעכברים צעירים יותר, עיין בדיון.
  2. קדחו חור (קוטר = 1.5 מ"מ) דרך הגולגולת באתר המסומן באמצעות מקדחה סטריאוטקסית להשתלת צינורית מדריך מסחרית.
  3. קודחים עוד שניים עד ארבעה חורים (קוטר = 1.5 מ"מ) על הגולגולת באמצעות מקדחה סטריאוטקסית להרכבת ברגים מנירוסטה.
    הערה: יש לעקר את המקדחה הסטריאוטקסית באמצעות מחטא חרוזי זכוכית (150 מעלות צלזיוס) למשך 5 שניות לפחות לפני ואחרי כל חיה.
  4. נגבו את שאריות העצם והפסיקו את הדימום בעזרת צמר גפן.
  5. נגבו את הגולגולת עם לידוקאין (1 מ"ג/ק"ג) באמצעות צמר גפן להרדמה מקומית, תרופות נוגדות דיכאון ושיכוך כאבים. אם הדימום אינו מפסיק לאחר הקידוח, בעדינות להניח צמר גפן על החור עבור hemostasis.
  6. הרכיבו שניים עד ארבעה ברגים מנירוסטה על החורים כדי לספק עוגנים לאקריליק דנטלי.
  7. הניחו את צינורית המדריך המסחרי על מחזיק הצינורית הסטריאוטקסית וחטאו עם מחטא חרוזי הזכוכית (150 מעלות צלזיוס).
    הערה: המדריך המסחרי צינורית, דמה מסחרית ומזרק מסחרי (איור 2A) הותאמו אישית עם המפרטים המוצגים בטבלת החומרים.
  8. הזיזו את מחזיק הצינורית הסטריאוטקסית לחור שנקדח עבור החדר הצדדי והכניסו באיטיות את צינורית ההנחיה המסחרית לתוך החור עד לעומק הרצוי (2.5 מ"מ).
    הערה: ניתן להגדיר את הקואורדינטות הגביות/גחוניות על ידי הגדרת קצה צינורית המדריך המסחרי כהפניה כאשר הקצה בקושי מוכנס לתוך החור.
  9. יש למרוח 10 μL של דבק n-butyl cyanoacrylate (דבק דבק רקמות) כדי לתקן את צינורית ההנחיה המסחרית בחור הקדוח ולהמתין 3-4 דקות. שחררו בעדינות את צינורית המדריך המסחרי ממחזיק הצינורית הסטריאוטקסית והרחיקו את המחזיק.
  10. יש למרוח את האקריליק הדנטלי על הקרקפת המשופעת כדי לתקן את צינורית המדריך המסחרי ולהמתין לפחות 5 דקות. שתל את הבובה המסחרית בצינורית המדריך המסחרי כדי למנוע סתימת צינורית על-ידי דם או נוזל גוף (איור 2B).
  11. שחררו את מוט האוזן מתעלת האוזן והסירו את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית.
  12. הכניסו את העכבר לכלוב חדש עם כרית חימום מתחתיו להתאוששות מהרדמה והתבוננו ברציפות עד שהעכבר מתעורר במלואו.
    הערה: אין להשאיר את בעל החיים ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה סטרנלית. בעל חיים שעבר ניתוח לא צריך לחזור לחברה של בעלי חיים אחרים עד להחלמה מלאה.
  13. החזר את העכבר לדיור יחיד או לדיור קבוצתי, בהתאם לפרוטוקול IACUC המוסדי ולתכנון הניסוי. עבור דיור קבוצתי, ודא כי פחות עכברים שוכנים בכלוב כדי למזער פציעות לא רצויות או ניתוק של צינורית.
  14. לתת איבופרופן (0.2 מ"ג / מ"ל) במי השתייה במשך 3 ימים לפחות לטיפול לאחר הניתוח, ולנטר פעמיים ביום עבור סימנים של כאב ומצוקה במשך 3 ימים לפחות.
    1. במהלך הטיפול שלאחר הניתוח, להחיל משחה roxithromycin סביב העור כדי למנוע דלקת וזיהום בעכברים.
    2. המשיכו לעקוב אחר מצב החיה ותנו הזרקה תוך-צפקית בזמן של 5% גלוקוז ו/או 0.9% נתרן כלורי כדי לספק מספיק אנרגיה.
    3. אם מצב הכאב, המצוקה או הזיהום מתדרדר בהתמדה, הרדימו את העכבר על ידי שאיפת CO2 .
  15. המתן שבוע לאחר הניתוח כדי שהעכבר יהיה מוכן לאספקה תוך-חדרית של SCFAs ובדיקות התנהגותיות.

4. הכנת SCFAs

  1. ממיסים את הנתרן אצטט, נתרן בוטיראט ונתרן פרופיונאט בנוזל המוח והשדרה המלאכותי (ACSF) (ראו טבלת חומרים).
  2. ודא שהכימיקלים מומסים במלואם, ולאחר מכן כוונן את ה- pH ל- 7.4, וסנן את תערובת ה- SCFAs דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר לעיקור.

5. הגדר את מערכת העירוי להעברה תוך-חדרית של SCFAs במהלך בדיקות התנהגותיות

  1. הרכיבו מצלמת תקרה כדי לתעד את ההתנהגות. חבר את המצלמה למחשב כדי לשלוט בתוכנת הקלטת הווידאו (איור 3).
  2. מלאו מזרק 10 μL במים מזוקקים.
    הערה: יש להימנע מבועות אוויר במזרק המיקרוליטר.
  3. חבר משאבת מיקרו-הזרקה לבקר המיקרו-הזרקה.
  4. הרכב את מזרק המיקרוליטר על משאבת המיקרו-הזרקה. כדי להתקין את המזרק, לחץ על הלחצן כדי לשחרר את המהדק ולהתקין את המזרק על המיקום המתאים. סגרו את המהדק והדקו את הבורג התומך בבוכנה במשאבת המיקרו-הזרקה (איור 4A).
  5. הכנס את המזרק המסחרי לצינור הפוליאתילן (איור 2A).
  6. תלו את צינור הפוליאתילן על מצלמת התקרה מעל זירת הבדיקה.
  7. מלא את צינור הפוליאתילן במים מזוקקים באמצעות מזרק אינסולין. חבר את מזרק המיקרוליטר לצינור הפוליאתילן התלוי.
    הערה: ודא שצינור הפוליאתילן ארוך מספיק כדי לאפשר לעכבר לנוע בחופשיות לאורך כל זירת הבדיקה.

6. הגדרות המערכת של בקר המיקרו-הזרקה

  1. הפעל את בקר המיקרו-הזרקה ולחץ על הצג את כל הערוצים כדי לגשת למסך הפקודה (איור 4C). לחץ על תצורה והגדר את יעד עוצמת הקול ל- 9,800 nL עם קצב אספקה ל- 100 nL/s. החדירו 9,800 nL של מים מזוקקים מצינור הפוליאתילן המחובר למזרק המיקרוליטר (לחצו על 'כיוון' כדי לעבור למצב 'החדרה' ולחצו על RUN) (ראו ריבועים אדומים במסך הפקודה של איור 4C).
  2. לחץ על תצורה והגדר את יעד עוצמת הקול ל- 3,000 nL עם קצב אספקה ל- 100 nL/s. משכו 3,000 nL של שמן מינרלי (לחצו על ' כיוון ' כדי לעבור למצב ' משיכה' ולחצו על RUN) (ראו ריבועים אדומים במסך הפקודה של איור 4C).
    הערה: יש לראות הפרדת שלב שמן-מים צלולה על צינור הפוליאתילן.
  3. לפרק את צינור פוליאתילן מן מחט מזרק microliter. יש לירוק החוצה 3,000 nL של מים מזוקקים ממחט מזרק המיקרוליטר (לחץ על כיוון כדי לעבור למצב ההחדרה ולחץ על RUN).
  4. הכנס את מזרק microliter בחזרה לתוך צינור פוליאתילן. לחץ על תצורה והגדר את יעד עוצמת הקול ל- 9,500 nL עם קצב אספקה ל- 100 nL/s. משוך 9,500 nL של SCFAs (לחץ על כיוון כדי לעבור למצב משיכה והקש RUN). סמן את שלב ה-OIL-SCFAs כדי לוודא אם ה-SCFAs מוחדרים בהצלחה.
  5. לחץ על תצורה והגדר את יעד עוצמת הקול הרצוי עם קצב אספקה ל- 7 nL/s. לחצו על ' כיוון ' כדי לעבור למצב 'החדרה' (ראו ריבועים אדומים במסך הפקודה של איור 4C).
    הערה: קבע את עוצמת הקול בהתבסס על זמן העירוי. לדוגמה, אם זמן העירוי הוא 3 דקות עבור קצב המסירה של 7 nL/s, נפח היעד = 1,260 nL.
  6. לחץ על RUN כדי להחדיר את מזרק המיקרוליטר קדימה עד שהנוזל יוצא בקצה הקדמי של המזרק המסחרי לפני החדרת המזרק לצינורית להזרקת SCFAs.

7. עירוי של SCFAs לחדר לרוחב דרך צינורית המדריך המסחרי בעכבר הנע בחופשיות

  1. הרדמת העכבר על ידי הצבתו בכלוב הפרספקס עם 1%-5% איזופלורן בחמצן.
    הערה: התבונן מקרוב בעכבר כדי להבטיח שקצב הנשימה נשמר בסביבות נשימה אחת בשנייה.
  2. שפשפו את העכבר והכניסו את המזרק המסחרי לתוך צינורית המדריך המסחרי (איור 4B).
    הערה: אם צינורית המדריך המסחרי מחוברת על ידי דם או נוזל גוף, פתח אותה בעדינות עם פינצטה.
  3. אפשרו לעכבר להתאושש מהרדמה במשך 15 דקות בכלוב לפני בדיקה התנהגותית.
  4. למבחן התנועה הבסיסי, הניחו את העכבר בכלוב חדש ואפשרו לו לחקור בחופשיות במשך 35 דקות. החדירו SCFAs באמצעות קצב אספקה של 7 nL/s עבור נפח יעד של 2,100 nL ב-5 הדקות הראשונות (לחץ על כיוון למצב ההחדרה והקש RUN).
    הערה: ניתן לנתח את התנועה בכלוב החדש באמצעות תוכנת מעקב וידאו אחר התנהגות בעלי חיים21,22.
  5. הרדימו את העכבר (חזרה על שלב 7.1) והסירו את המזרק המסחרי מהצינורית המסחרית.
    הערה: ניתן להזריק לעכבר שוב ושוב פקדים/מטבוליטים שונים לאחר מתן משך הזמן המתאים לשטיפת הזריקה הקודמת. כל עוד הצינורית קבועה על ראש העכבר, ניתן לבדוק את העכבר שוב ושוב עם מטבוליטים שונים.

8. שחזור מערכת המיקרו הזרקות

  1. לפרק את צינור פוליאתילן מן מזרק microliter.
  2. הזריקו אוויר לצינור באמצעות מזרק האינסולין כדי להשליך את המים המזוקקים בצינור הפוליאתילן. לרוקן את מזרק המיקרוליטר.
  3. לחצו על ' אפס קופה ' במסך ' תצורה ' כדי לפתוח את המסך 'הגדרת עצירת מזרק ' (איור 4C).
  4. לחצו על 'משיכה ' עד שנשמע צליל צפצוף כדי לאפס את משאבת המיקרו-הזרקה למצב שבו היא נסוגה במלואה (איור 4C).
  5. חזור למסך הפקודה וכבה את בקר המיקרו-הזרקה אם יש סימן ** END REACHED** במסך זה (איור 4C).

9. אופציונלי: אימות של הזרקה תוך-מוחית על-ידי עוקב עצבי

  1. החדירו 2,100 nL של העקיבה העצבית עם קצב אספקה של 7 nL/s כדי לאמת את אתר העירוי.
    הערה: השאירו את המזרק בצינורית המדריך למשך 5 דקות כדי למנוע זרימה חוזרת.
  2. הרדמת העכבר על ידי מנת יתר של איזופלורן (5%) 30 דקות לאחר עירוי של מעקב עצבי.
  3. בדוק את קצב הנשימה ואת רפלקס צביטה של זנב/כפה בעכבר המורדם.
    הערה: עכברים חייבים להפסיק להגיב לפני השלב הבא.
  4. בצע חתך של 4-5 ס"מ דרך העור, השריר ודופן הבטן מתחת לכלוב הצלעות.
  5. יש להרחיק מעט את הכבד מהסרעפת בזהירות.
  6. חותכים את הסרעפת כדי לחשוף את לב העכבר.
  7. יש לחדור לעכבר דרך הלב עם תמיסת מלח אפופת פוספטים (PBS) ופרפורמלדהיד קר כקרח ב-PBS.
  8. ערפו את העכבר ונתחו את המוח בזהירות בעזרת מלקחיים מיקרו-דיסקים ומספריים זעירים כדי להוציא את כל המוח23. מניחים את דגימות המוח בפרפורמלדהיד קר כקרח 4% ב- PBS למשך 3-4 ימים ושוטפים אותן 3 x 5 דקות עם PBS.
  9. חתכו את המוח לשני חלקים במחזיק פרוסת המוח של העכבר בחיתוך השמיני של מחזיק פרוסת המוח של העכבר (1 מ"מ/חתך) מהכיוון הקדמי לכיוון האחורי. מניחים את המוח בתבנית ההטבעה ומטמיעים את דגימות המוח באגרוז של נקודת התכה נמוכה (4% ב-PBS).
  10. הדביקו את המוח המוטבע באגרוז על במת הוויברטום באמצעות superglue. חלקו את המוח לפרוסות מוח של 50 מיקרומטר באמצעות הוויברטום.
  11. דגירה של פרוסות המוח בנוגדן המכוון לעוקבת העצבית המדוללת בחסימת חיץ (דילול 1:1,000) במשך הלילה בטמפרטורת החדר.
    הערה: המאגר החוסם הכיל 10% סרום סוסים, 0.1% טריטון X-100 ו-0.02% נתרן אזיד.
  12. שוטפים את הפרוסות 3 x 5 דקות עם PBST (PBS עם 0.1% טריטון X-100).
  13. דגירה של פרוסות המוח בנוגדן משני מצומד בצבע פלואורסצנטי מדולל בחיץ חוסם (דילול 1:500) במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
  14. שוטפים את הפרוסות 3 x 5 דקות עם PBS.
  15. הרכיבו את פרוסות המוח על המגלשה עם מדיום הרכבה המכיל 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI).
  16. כסו את השקופית בכיסוי מיקרוסקופ.
  17. יש למרוח לק על קצה ההחלקה כדי למנוע דליפה של מדיום ההרכבה.
  18. לאחר דגירה של לילה בטמפרטורת החדר, מוגנת מפני אור, דמיינו את האות הפלואורסצנטי באתר העירוי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

10. אופציונלי: עירוי של מטבוליטים באמצעות צינורית הנחיה מותאמת אישית מנירוסטה בחדר הצדדי בעכברים

  1. עקוב אחר סעיפי הפרוטוקול 1-8 והחלף את צינורית המדריך המסחרית בצינורית מדריך מנירוסטה כדי להחדיר כימיקלים דרך מזרק נירוסטה בעכבר.
    הערה: היתרונות והחסרונות של הצינוריות המסחריות והנירוסטה השונות מפורטות בסעיף הדיון.
  2. בצעו את הפרוטוקול הניתוחי באותו אופן כפי שמתואר בסעיפים 2 ו-3 של הפרוטוקול, מלבד זכרו להחליף את צינורית ההנחיה המסחרית בצינורית הנחיה מפלדת אל-חלד (איור 5B).
    הערה: צינורית מדריך נירוסטה, בובת נירוסטה ומזרק נירוסטה (איור 5A) הותאמו אישית עם המפרטים המוצגים בטבלת החומרים. הכנס את צינורית מדריך הנירוסטה המותאמת אישית לתוך החור עד לעומק הרצוי (2.0 מ"מ).
  3. החדירו SCFAs דרך צינורית ההנחיה מפלדת אל-חלד באמצעות מערכת המיקרו-הזרקות המורכבת מבקר המיקרו-הזרקה ומשאבת המיקרו-הזרקה (איור 4B) (זהה לסעיפים 4-7 בפרוטוקול). עבור בובת הנירוסטה של צינורית מדריך הנירוסטה, כופפו צד אחד של מזרק הנירוסטה בעדינות עד שקצה הצד השני ארוך ב-1 מ"מ מהצינורית המנחה מנירוסטה.
  4. החדירו 2,100 nL של העקיבה העצבית דרך צינורית הנחיית הנירוסטה לחדר הצדדי בעכברים (זהה לפרוטוקול סעיף 9).
  5. אסוף את הדגימה במשך 30 דקות לאחר עירוי מעקב עצבי (זהה לפרוטוקול סעיף 9).
  6. בצע רכישת תמונה בפרוסות המוח החדורות של המעקב העצבי (זהה לפרוטוקול סעיף 9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

העכבר הוחדר ל-SCFAs שבוע לאחר ההחלמה מהשתלת צינורית המדריך כדי להעריך את פעילות התנועה בכלוב חדש. העכבר הוכנס לכלוב חדשני והוחדר עם 2,100 nL של SCFAs או ACSF ב-5 הדקות הראשונות (קצב אספקה של 7 nL/s) לתוך המוח דרך צינורית המדריך המסחרית שהושתלה בחדר הצדדי של המוח. פעילות התנועה בכלוב חדש נרשמה במשך 30 דקות נוספות לאחר העירוי. לא נצפה הבדל בפעילות התנועתית בכלוב החדש בין עירוי של SCFAs ו-ACSF (איור 6) (n = 2 עכברים לכל קבוצה; הנתונים מוצגים כממוצע ± s.e.m. ומנותחים על ידי ANOVA דו-כיווני).

כדי לאמת את דיוק ההשתלה של צינורית המדריך באזורי המוח, הוכנס מעקב עצבי פלואורסצנטי לעכברים דרך צינורית המדריך באותו נפח וקצב מסירה כמו ה-SCFAs (2,100 nL ב-5 דקות; 7 nL/s). המוחות נאספו להיסטולוגיה כעבור 30 דקות. הצבע הפלואורסצנטי זוהה בחדר הצדדי ובאזורים הסובבים אותו במוח העכבר (איור 7A). צינורית מדריך מנירוסטה הושתלה בחדר הצדדי של המוח לצורך עירוי של עוקבים עצביים באותם תנאים. בדומה לצינורית המנחה, התוצאות הראו כי אות צבע פלואורסצנטי זוהה בחדר הצדדי ובאזורים הסובבים אותו במוח העכבר גם לאחר עירוי דרך צינורית ההנחיה מנירוסטה (איור 7B).

Figure 1
איור 1: ההליך של עירוי תוך-מוחי בעכברים הנעים בחופשיות. תרשים הזרימה להעברה תוך-חדרית של מטבוליטים מיקרוביאליים שמקורם במעיים בעכברים הנעים בחופשיות. קיצור: SCFAs = חומצות שומן קצרות שרשרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: השתלת צינורית המדריך המסחרי בעכברים . (A) התמונה הייצוגית של צינורית מדריך מסחרית, דמה ומזרק. (B) הדימוי הייצוגי של צינורית מדריך מסחרית ודמה המושתלים במוחם של עכברים על ידי קיבוע עם אקריליק דנטלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: מתקן העירוי הבין-מוחי לבדיקת התנהגות. הדיאגרמה של מערכת מיקרו-הזרקה, מערכת הקלטת וידאו ומנגנון התנהגותי. קיצור: SCFAs = חומצות שומן קצרות שרשרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: מערכת המיקרו-הזרקות . (A) התקנת מזרק המיקרוליטר באמצעות משאבת מיקרו-הזרקה. (B) החדרת המזרק המסחרי המחובר בצינור פוליאתילן לתוך צינורית ההנחיה המסחרית (C) מסך המגע של בקר המיקרו-הזרקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: השתלת צינורית מנחה מנירוסטה בחדר הצדדי של עכברים. (A) התמונה הייצוגית של צינורית הנחיית נירוסטה, דמה ומזרק. (B) התמונה הייצוגית של צינורית מדריך נירוסטה ודמה המושתלת במוחם של עכברים על ידי קיבוע עם אקריליק דנטלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: פעילות לוקומוטורית של עכברים חדורים SCFAs בכלוב החדש . (A) סכמת ציר זמן של השתלת צינורית מדריך ותנועת כלוב חדשנית על עירוי ACSF או SCFAs. (B) סכמת ציר הזמן למיקום מזרק העירוי, חלון העירוי (צל כחול), ובדיקת התנהגות הכלוב החדשנית. (C) המרחק הכולל שהועברו על ידי עכברים חדורים ACSF ו-SCFAs בכלוב חדש למשך 35 דקות. חלון הזמן עבור עירוי מסומן עם צל כחול (0-5 דקות). (D) תמונות מייצגות של מסלולים עבור עכברים החדורים ב-ACSF וב-SCFAs בכלוב חדש. n = 2 עכברים לכל קבוצה. הנתונים מוצגים כממוצע ± s.e.m. ונותחו על ידי ANOVA דו כיוונית. NS: לא משמעותי. קיצורים: SCFAs = חומצות שומן קצרות שרשרת; ACSF = נוזל מוחי מלאכותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: ההיסטולוגיה של צבע פלואורסצנטי המוחדר במוח. עירוי באמצעות צינורית הנחיה מותאמת אישית (A) מסחרית ו- (B) מפלדת אל-חלד המושתלת בחדר הצדדי (LV) של עכברים. פסי קנה מידה = 1 מ"מ (משמאל) ו- 500 מיקרומטר (מימין). כחול: DAPI מכתים; ירוק: סימון זהב אנטי-פלואורסצנטי. קיצורים: LV = חדר לרוחב; AC = קומיסור קדמי; CPu = caudate putamen; LS = מחיצה לרוחב; MS = מחיצה מדיאלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מטבוליטים שמקורם במעיים נקשרו למחלות המתווכות על ידי המוח ללא מנגנון מדויק רב, בין היתר בשל אתרי הקשירה המרובים שלהם בגוף 6,12,24. דיווחים קודמים הצביעו על כך ש-SCFAs יכולים לשמש כליגנדים לקולטנים מצומדים לחלבון G, לווסתים אפיגנטיים ולמקורות לייצור אנרגיה במספר אתרים בגוף 6,12. כדי לעקוף את הגורמים המבלבלים שמקורם בפריפריה (כגון תאי מערכת החיסון, הורמונים ומערכת העצבים האוטונומית), פותחה שיטה על ידי אימוץ הזרקה תוך-חדרית של SCFAs למוח דרך צינורית מנחה בעכברים הנעים בחופשיות. בנוסף, אתרי הקנוליזציה והעירוי אומתו כדי לחקור את אזורי המוח שעשויים להיות מושפעים מ-SCFAs. בסך הכל, מאמר זה מציג שיטה מדויקת, מוקפדת ומאומתת להעברת מטבוליטים שמקורם במעיים למוח לצורך מחקר על ציר המעיים-מוח.

ההעברה התוך-חדרית של תרופות וכימיקלים באמצעות צינורית מדריך לבעלי חיים התבססה היטב 25,26,27,28,29 לבדיקות סמים שונות 29, מידול מחלות26,28, ותכנון ספציפי של בדיקות התנהגותיות 27 . והכי חשוב, מספר מחקרים העבירו מטבוליטים מיקרוביאליים של המעיים למוח באמצעות הזרקה תוך-מוחית ובדקו את השפעתם על תפקודים פיזיולוגיים30,31,32,33. פרוטוקול זה מספק תוספת במתן מטבוליטים במעיים באופן חריף למוח בזמן אמת, מה שיאפשר למדענים להבין את ההשפעות הדינמיות של מטבוליטים במעיים על המוח ועל ההתנהגות.

קצב האספקה של עירוי מטבוליטים הוא חיוני כדי לדמות את זרימת הנוזל השדרתי בחדרי המוח. מחקר אחד הצביע על כך שקצב ייצור הנוזל השדרתי בעכברים הוא 5.3 nL/s34. כדי לשלוט בקצב הזרימה של SCFAs באופן טבעי בעכברים הנעים בחופשיות, הערכנו את קצב הזרימה של מערכת המיקרו-הזרקות הזו (איור 3 ואיור 4). ניתן היה להחדיר את ה- SCFAs בצורה חלקה ללא התנגדות רבה גם כאשר צינור הפוליאתילן באורך 350 ס"מ שימש להחדרת SCFAs בעכבר הנע בחופשיות. עם מילוי מים מזוקקים ושמן מינרלי כדי להפחית את עמידות הנוזלים בצינור הפוליאתילן (ראה פרוטוקול סעיפים 5 ו-6), ניתן להוריד את קצב הזרימה ל-7 nL/s מ-100 nL/s. החדרת SCFAs או ACSF בקצב זרימה של 7 nL/s לא גרמה להתנהגות חריגה של העכברים.

הכמות והמינון של מטבוליטים שמקורם במעיים להזרקה תוך-מוחית הם קריטיים. עדיין מאתגר לנתח באופן מקיף את הרמות האבסולוטיות של מטבוליטים שמקורם במעיים באזורי מוח שונים. לדוגמה, מעט מאוד מחקרים הראו זיהוי של רמות פיזיולוגיות של SCFAs במוח35,36. מחקר אחד הראה כי הריכוזים של אצטט, פרופיונאט ובוטיראט במוחם של עכברים הם בערך 1640.6-3281.2 מיקרוגרם/גרם, 288.18-384.24 מיקרוגרם/גרם, ו-44.036-66.054 מיקרוגרם/גרם,בהתאמה 36. עם זאת, מחקר אחר דיווח על רמות נמוכות יותר של SCFAs במוח (אצטט 128.1 מיקרוגרם/גרם, פרופיונאט 0.3883 מיקרוגרם/גרם, ובוטיראט 0.1640 מיקרוגרם/גרם)35. הכמויות של אצטט, פרופיונאט ובוטיראט שהוחדרו בפרוטוקול זה היו 5.81385 מיקרוגרם/גרם, 4.62378 מיקרוגרם/גרם ו-2.6124 מיקרוגרם/גרם, בהתאמה. לכן, הריכוזים של SCFAs החדורים בפרוטוקול זה דומים לריכוזים פיזיולוגיים. עם זאת, לא יכולנו לשלול את האפשרות שריכוזי ה-SCFAs עשויים להשתנות באזורי מוח שונים. מספר מחקרים הראו כי העברת פרופיונאט לחדר המוח על ידי הזרקה תוך-חדרית (4 μL של 0.26 M חומצה פרופיונית תוך דקה אחת; כ-249.756 מיקרוגרם/גרם) פגעה בהתנהגות החברתית ובקוגניציה בחולדות30,31. המינון וקצב הזרימה של הפרופיונאט המוחדר היו גבוהים יחסית, כפי שדווח בעכברים35 ובחולדות37. לכן, התקדמות בניתוח מטבוליטים ובפרופיל מטבולי במוח ובפריפריה תסייע לחוקרים להבין טוב יותר את השינויים הדינמיים המרחביים והזמניים במטבוליטים שמקורם במעיים.

שני סוגים של צינוריות מדריך הוצגו בפרוטוקול זה להזרקה תוך-חדרית בעכברים - צינורית מדריך מסחרית וצינורית מדריך מנירוסטה. המדריך המסחרי צינורית ודמה מתוכננים היטב להשתלה. לא קל לעכברים להסיר את הדמה המותאמת אישית בגלל הכובע. להיפך, בובת הנירוסטה ניתנת להסרה בקלות מצינורית הנירוסטה על ידי עכברים במהלך ההחלמה של שבוע, מה שגורם לקרישת הדם/הנוזל השדרתי בצינורית. עם זאת, הצינורית המסחרית המותאמת אישית היא 64 מ"ג, והדמה לצינורית זו היא 86 מ"ג. לפיכך, המשקל הכולל של צינורית מותאמת אישית מסחרית דמה הוא 150 מ"ג. לעומת זאת, הצינורית המותאמת אישית מפלדת אל-חלד היא 18.3 מ"ג, והבובה לצינורית זו היא 8.5 מ"ג. לפיכך, המשקל הכולל של צינורית מדריך הנירוסטה המותאמת אישית הוא 26.8 מ"ג. באופן תיאורטי, המשקל הנמוך של ערכת צינוריות ההנחיה מפלדת אל-חלד ימזער את השפעת הצינורית על תנועת החיה ועל המוח. יתר על כן, העלות של צינורית המדריך המסחרי גבוהה יותר מאשר צינורית מדריך נירוסטה ומזרק. לפיכך, אנו ממליצים על צינורית מדריך נירוסטה לחוקרים חסרי ניסיון המבצעים ניתוחים סטריאוטקסיים בעכברים.

הצינורית המושתלת יכולה להיסתם על ידי דם ונוזל מוחי עקב נזק מוחי. סתימה זו של הצינורית עלולה להתרחש בתדירות גבוהה יותר בצינורית הנירוסטה מעל הצינורית המסחרית. ניתן להשחיל את הבובה כדי להדק היטב את הצינורית המסחרית (איור 2A), אך לא עבור צינורית הנירוסטה (איור 5A). לכן, הבטחת ההתקשרות של הדמה במהלך תקופת ההחלמה תמזער את סתימת הצינורית. יש להכניס דמה חדשה אם הניתוק מתרחש במהלך ההתאוששות של שבוע. יתר על כן, מזרק מעוקר חד פעמי חייב להיות מוכנס מספר פעמים כדי לפתוח את הצינורית לפני הרכבת המזרק המחבר את צינור הפוליאתילן.

הבחירה בתרופות הרדמה תשפיע מאוד על הניתוח ובדיקת ההתנהגות. כאן, איזופלורן הרדמה בשאיפה נבחר על פני חומרי הרדמה מוזרקים מכיוון שזמן ההחלמה קצר יותר והוא פחות מזיק לבעלי החיים מסיבות הומאניות. עם זאת, המינון של שאיפת איזופלורן יכול להיות מגוון בהתאם למצב העכבר ומשקל הגוף. לכן, יש לעקוב מקרוב אחר מצב ההרדמה במהלך כל ההליך הכירורגי, ומכשיר האידוי איזופלורן מותאם בהתאם. קצב הנשימה האופטימלי צריך להיות נשימה אחת לשנייה במהלך כל ההליכים. יתר על כן, יש לחבר את מיכל מסנן הגז המלא בפחם פעיל לתא ההרדמה ולמסכת האף כדי לבטל את זיהום האיזופלורן וגזי הפליטה באזור ההפעלה. זה יגן על המנתח מפני ההשפעה הרעילה של isoflurane.

התוצאות המייצגות הראו כי עירוי SCFAs לא יצר השפעה דרמטית על התנועה בכלוב חדש. ייתכן שהסיבה לכך היא שמספר קטן של בעלי חיים שימש כדי להשיג את התוצאה הזו (איור 6). יתר על כן, החדרנו את ה- SCFAs רק במשך 5 הדקות הראשונות של מבחן התנהגות התנועה בכלוב החדש, אך לא את כל הבדיקה מכיוון שרוב ההתנהגות נבדקה תוך חלון זמן קצר (5-15 דקות). יש להתאים את חלון הזמן למטבוליטים המיקרוביאליים שמקורם במעיים על סמך השערת החוקרים.

הזמן להרדמה וחזרה להכרה מההרדמה הם קריטיים למבחנים התנהגותיים. כאן, העכברים הורדו לזמן קצר להשתלת המזרק ועירוי SCFAs, ובדיקות התנהגות בוצעו לאחר 15 דקות. הזמן להתאושש לאחר הפסקת ההרדמה באינהלציה נקבע על סמך מחקר קודם38. מחקר פיילוט הבטיח שהעכברים פעילים, נעים בחופשיות ולא מרגישים בנוח 15 דקות לאחר ההרדמה. הצגנו את שלב ההרדמה להרכבת המזרק מהסיבות הבאות. ראשית, מד המזרק הוא 33 גרם; זה מאוד מאתגר להכניס מזרק עדין כזה לתוך הצינורית כאשר החיה נעה באופן פעיל. בנוסף, קשקוש של עכברים מודעים עלול לגרום ללחץ על העכברים39, ולבלבל את התוצאות ההתנהגותיות. שנית, הצינורית נסתמת מדי פעם עקב קרישת הדם/הנוזל השדרתי. פתיחת הצינורית בעדינות לפני הרכבת המזרק תהיה אידיאלית לעירוי מטבוליטים. בהתבסס על שתי סיבות אלה, מומלץ להרדים בקצרה את העכברים להרכבת המזרק. החוקרים יכולים להמתין זמן רב יותר (30 דקות) אם יש חשש להחלמה של החיה מההרדמה בשאיפה. יתר על כן, קבוצה נפרדת של מזרק עירוי המחבר את צינור פוליאתילן ניתן להגדיר כדי להאיץ את הניסויים.

לפרוטוקול זה מספר מגבלות. ראשית, השתלת צינורית המדריך וצינור הפוליאתילן המחבר יגבילו את שטח הניתוח להשתלת סיבים אופטיים לפוטומטריה אופטוגנטית וסיבים לאותה קואורדינטות, הסביבה, או אפילו אותה חצי כדור של המוח. יהיה מאתגר עוד יותר להשתיל את העדשה למיקרואנדוסקופיה על ראש העכבר יחד עם צינורית ההנחיה המושתלת. שנית, השתלת צינורית המדריך עשויה ליצור משקל משמעותי על ראש העכבר. המשקל הכולל של סט צינוריות מותאם אישית הוא 26.8-150 מ"ג, בורג הוא ~ 48 מ"ג, ואת אקריליק שיניים רכוב הוא 450-500 מ"ג. ערכת ההתקנה כולה עשויה להגביל את תנועות העכברים. עם זאת, מחקרים אחרונים השתילו מיניסקופ לניטור אותות סידן בעכברים הנעים בחופשיות40,41. משקל המיניסקופ נע בין 1.6 גרם ל -4.5 גרם, לא כולל הברגים ואקריליק דנטלי. לכן, משקלה של צינורית המדריך עשוי להיחשב מקובל יחסית לבדיקת התנהגות עכברים. שלישית, צינור הפוליאתילן המחבר עבור עירוי הוא ~ 350 ס"מ אורך, אשר עשוי להגביל את התנועה של עכברים במהלך מבחן ההתנהגות. כדי לענות על חשש זה, ייתכן שיהיה צורך בבדיקה מקדימה לתנועה בבדיקת שדה פתוח כדי להעריך את ההשפעה של צינור הפוליאתילן המחבר על תפקוד מנוע העכבר. רביעית, אקריל דנטלי עשוי לייצר השפעה נוירוטוקסית על העכברים. עם זאת, נדרש לחבר את צינורית המדריך לראש העכבר במהלך תקופת הבדיקה. כדי להפחית את ההשפעה הנוירוטוקסית הפוטנציאלית של אקריל דנטלי על עכברים, המפעילים חייבים להכיר את השימוש באקריל דנטלי. אקריל דנטלי מיושם טוב יותר כאשר תערובת האקריל הדנטלי (אבקה ונוזל) מתמצקת מעט כדי להפחית את החדירה של נוזל אקריל דנטלי למוח.

מיקרוביוטה והמטבוליטים שלהם קשורים לתפקוד התנהגותי באבני דרך שונות בהתפתחות. למרות שפרוטוקול זה מבוסס על עכברי C57BL/6 בוגרים עם משקל גוף הנע בין 26 גרם ל-30 גרם, ניתן ליישם אותו גם על עכברים בגילאים ובגדלים שונים. מחקרים קודמים אימצו ניתוחים סטריאוטקסיים בעכברים צעירים42,43,44,45. עם זאת, הקואורדינטות עבור אזורי מוח עשויות להשתנות בהתאם לגודל ולגיל של עכברים. אנו ממליצים להתייחס לאטלס המתאים לגיל או למשאב המקוון (http://mouse.brain-map.org/static/atlas). יתר על כן, יש לאמת את הקואורדינטות על ידי הזרקת צבע כחול טריפן או פלואורסצנטי לעכברי השחף הצעירים, ובכך לייעל את השיטה לפני ביצועה על עכברי הניסוי. הצינוריות המשמשות בפרוטוקול זה מותאמות אישית וניתן לכוונן אותן לאחר אימות הקואורדינטות לגדלים שונים של עכברים.

פרוטוקול זה יהיה תואם לרוב בדיקות התנהגות המכרסמים עם זירה פתוחה על גבי המנגנון ללא שינוי רב. ניתן לבצע בדיקות התנהגות מכרסמים עם חיווט צינור פוליאתילן על גבי ראש העכבר ללא כל מכשול, כולל בדיקת שדה פתוח, מבוך פלוס / אפס מוגבה, מבחן צעד למטה, אינטראקציה חברתית ישירה, ווקאליזציה קולית למבוגרים, מבחן שחייה כפוי, מתלה זנב, מבוך מים, מבוך T או Y, זיהוי עצמי, קבורת שיש, מבחן טיפוח עצמי, חציית קרן, בדיקת מוט, וחשיפה ללחץ הימנעות ממים. בדיקות באמצעות תאים סגורים או צינורות יהיה צורך לשנות כדי לאפשר את צינור פוליאתילן לנוע בחופשיות יחד עם העכברים, כגון בדיקה חברתית תלת תאית, תיבת אור כהה, מיזוג פחד, העדפת סוכרוז, מתח איפוק, מבחן הבהלה, ועיכוב דופק prepulse. אנו מציעים לבדוק מראש ולהעריך את האורך הדרוש לצינור הפוליאתילן על עכברי השחף לפני הבדיקה.

הודגם כי מטבוליטים מיקרוביאליים במעיים משפיעים על התנהגות המארחים 8,46,47,48,49. מדענים יכולים לאמץ שיטה זו כדי לחקור ישירות את ההשפעות הטמפורליות והמרחביות של מטבוליטים שמקורם במיקרוביוטה של המעיים על המוח ועל ההתנהגויות בעכברים. לדוגמה, המטבוליט המיקרוביאלי 4-אתילפניל סולפט (4EPS) הוגדל במודלים פרה-קליניים של ASD בעכבר ובאנשים עם ASD46,48,49. הזרקה של 4EPS והתיישבות של החיידקים המייצרים 4EPS הגבירו את ההתנהגות דמוית החרדה ופגעו בהבשלת אוליגודנדרוציטים בגרעין הפרה-חדרי של התלמוס (PVT) בעכברים46,48. זה יהיה מרתק להעריך את ההשפעה הישירה של 4EPS על PVT של עכברים במהלך בדיקות התנהגות דמויות חרדה. עם זאת, הריכוז המוחלט של 4EPS ב- PVT עדיין לא ידוע. לכן, בדיקת מינון-תגובה עשויה להיות קריטית כדי לקבוע את הרמות הנאותות של 4EPS ב-PVT. ניתן לאמץ תפיסה דומה לגבי ההשפעות של מטבוליטים מיקרוביאליים אחרים על המוח ועל ההתנהגות.

נוירוטכנולוגיות מבוססות מעגלים, כגון אופטוגנטיקה, כימוגנטיקה והדמיית סידן in vivo, הן שיטות קריטיות המאפשרות למדענים להבין את המעגל העצבי בבקרת התנהגות50,51,52. ציר המעי-מוח הוא קשר מסובך החיוני למיקרובי המעיים ולמטבוליטים שלהם כדי לתווך את התנהגות המארח. מספר גדל והולך של מחקרים השתמשו בנוירוטכנולוגיות מבוססות מעגלים כדי להבין את ההצלבה המסקרנת בין המעיים למוח 33,53,54,55,56,57,58,59. פרוטוקול זה יספק דרך חלופית להבין שליטה מבוססת אזור במוח על התנהגות הנגרמת על-ידי מטבוליטים במעיים. שילוב פרוטוקול זה עם נוירוטכנולוגיות מבוססות מעגלים יאפשר לחוקרים לקבל תובנה לגבי השליטה מבוססת המעגלים בהתנהגות ובפעילות המוחית שתורמים מטבוליטים במעיים.

לסיכום, הרעיון של ציר המעיים-מוח מקובל היטב בקהילה המדעית ומקדם את האפשרות של מעורבות של מטבוליטים שמקורם במעיים בהפרעות נוירופסיכיאטריות 11,13,60,61,62,63,64,65 . כדי לחקור כיצד ואילו מטבוליטים שמקורם במעיים משפיעים על מוחם והתנהגותם של עכברים, יהיה צורך במתודולוגיה מקיפה ומבוססת פיזיולוגית בשטח. מאמר זה מספק פרוטוקול שלב אחר שלב להעברת מטבוליטים שמקורם במעיים למוח ישירות, והכי חשוב, בעכבר שנע בחופשיות. ניתן להתאים את העיצוב הזה עוד יותר כדי לחקור את ההשפעות הספציפיות לאזור על-ידי העברת המטבוליטים שמקורם במעיים לאזורי מוח שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים הקשורים לעבודה זו.

Acknowledgments

אנו מודים לצוות מרכז חיות המעבדה באוניברסיטת נשיונל צ'נג קונג (NCKU) על הטיפול בבעלי החיים. עבודה זו נתמכה על ידי מלגה מקרן החינוך של פרופ' קון-ין הואנג מקרן צ'נג-סינג לרפואה ל- C.-W.L.; הכספים ממשרד המדע והטכנולוגיה (MOST) בטייוואן: (מחקר לתואר ראשון MOST 109-2813-C-006-095-B) ל- T.-H.Y.; (רוב 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) ל W.-L.W.; ופרויקט נבטי ההשכלה הגבוהה, משרד החינוך למטה קידום האוניברסיטה ב- NCKU ל- W.-L.W.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41 Pfizer n/a
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit ThermoFisher Scientific A-21206
Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal) Millipore AB153-I
Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μm, PES, Sterile NEST 121921LA01
CaCl2  Sigma-Aldrich C1016 ACSF: 0.14 g/L
Chlorhexidine scrub 2% Phoenix NDC 57319-611-09
Chlorhexidine solution Phoenix NDC 57319-599-09
Commercial dummy RWD Life Science 62004 Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm
Commercial guide cannul RWD Life Science 62104 Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm 
Commercial injector RWD Life Science 62204 Single_OD 0.21 mm-33G/ Mates with M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 ACSF: 0.61 g/L
Dental acrylic HYGENIC n/a
Fixing screws RWD Life Science 62521
Fluoroshield mounting medium with DAPI Abcam AB104139
Horse serum ThermoFisher Scientific 16050130
Insulin syringes BBraun XG-LBB-9151133S-1BX 1 mL
Isoflurane  Panion & BF biotech DG-4900-250D
KCl  Sigma-Aldrich P3911 ACSF: 0.19 g/L
Ketoprofen  Swiss Pharmaceutical n/a
Lidocaine  AstraZeneca n/a
Low melting point agarose Invitrogen 16520
MgCl2  Sigma-Aldrich M8266 ACSF: 0.19 g/L
Microscope cover slips MARIENFELD 101242
Microscope slides ThermoFisher Scientific 4951PLUS-001E
Mineral oil light, white NF Macron Fine Chemicals MA-6358-04
NaCl  Sigma-Aldrich S9888 ACSF: 7.46 g/L
NaH2PO4  Sigma-Aldrich S8282 ACSF: 0.18 g/L
NaHCO3  Sigma-Aldrich S5761 ACSF: 1.76 g/L
n-butyl cyanoacrylate adhesive (tissue adhesive glue) 3M 1469SB 3M Vetbond
Neural tracer  Santa Cruz SC-358883 FluoroGold
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Polyethylene tube RWD Life Science 62329 OD 1.50, I.D 0.50 mm and OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (eye) Ointment Dechra  12920060
Sodium acetate  Sigma-Aldrich S2889 SCFAs: 13.5 mM
Sodium azide  Sigma-Aldrich S2002
Sodium butyrate  Sigma-Aldrich B5887 SCFAs: 8 mM
Sodium propionate  Sigma-Aldrich P1880 SCFAs: 5.18 mM
Stainless guide cannula Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.63 mm; Local vendor
Stainless injector Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.3 mm; dummy is made from injector; local vendor
Superglue Krazy Glue KG94548R
Triton X-100 Merck 1.08603.1000
Equipment
Cannula holder RWD Life Science B485-68217
Ceiling camera FOSCAM R2
Digital stereotaxic instruments Stoelting 51730D
Dissecting microscope INNOVIEW SEM-HT/TW
Glass Bead Sterilizer RWD Life Science RS1501
Heating pad Stoelting 53800M
Leica microscope  Leica DM2500
Micro Dissecting Forceps ROBOZ RS-5136 Serrated, Slight Curve; Extra Delicate; 0.5mm Tip Width; 4" Length 
Micro Dissecting Scissors ROBOZ RS-5918 4.5" Angled Sharp
Microinjection controller World Precision Instruments (WPI) MICRO2T SMARTouch Controller
Microinjection syringe pump World Precision Instruments (WPI) UMP3T-1 UltraMicroPump3  
Microliter syringe Hamilton 80014 10 µL
Optical Fiber Cold Light with double Fiber Step LGY-150 Local vendor
Pet trimmer WAHL 09962-2018
Vaporiser for Isoflurane Step AS-01 Local vendor
Vibratome Leica VT1000S
Software
Animal behavior video tracking software Noldus EthoVision Version: 15.0.1416
Leica Application Suite X software Leica LASX Version: 3.7.2.22383

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lynch, J. B., Hsiao, E. Y. Microbiomes as sources of emergent host phenotypes. Science. 365 (6460), 1405-1409 (2019).
  2. Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome-gut-brain axis in health and disease. Gastroenterology Clinics of North America. 46 (1), 77-89 (2017).
  3. Sharon, G., Sampson, T. R., Geschwind, D. H., Mazmanian, S. K. The central nervous system and the gut microbiome. Cell. 167 (4), 915-932 (2016).
  4. Krautkramer, K. A., Fan, J., Backhed, F. Gut microbial metabolites as multi-kingdom intermediates. Nature Reviews: Microbiology. 19 (2), 77-94 (2021).
  5. Lavelle, A., Sokol, H. Gut microbiota-derived metabolites as key actors in inflammatory bowel disease. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. 17 (4), 223-237 (2020).
  6. Dalile, B., Van Oudenhove, L., Vervliet, B., Verbeke, K. The role of short-chain fatty acids in microbiota-gut-brain communication. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. 16 (8), 461-478 (2019).
  7. Morais, L. H., Schreiber, H. L. T., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews: Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
  8. Sharon, G., et al. Human gut microbiota from autism spectrum disorder promote behavioral symptoms in mice. Cell. 177 (6), 1600-1618 (2019).
  9. St Laurent, R., O'Brien, L. M., Ahmad, S. T. Sodium butyrate improves locomotor impairment and early mortality in a rotenone-induced Drosophila model of Parkinson's disease. Neuroscience. 246, 382-390 (2013).
  10. Govindarajan, N., Agis-Balboa, R. C., Walter, J., Sananbenesi, F., Fischer, A. Sodium butyrate improves memory function in an Alzheimer's disease mouse model when administered at an advanced stage of disease progression. Journal of Alzheimer's Disease. 26 (1), 187-197 (2011).
  11. Needham, B. D., et al. A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice. Nature. 602 (7898), 647-653 (2022).
  12. Silva, Y. P., Bernardi, A., Frozza, R. L. The role of short-chain fatty acids from gut microbiota in gut-brain communication. Frontiers in Endocrinology. 11, 25 (2020).
  13. Kratsman, N., Getselter, D., Elliott, E. Sodium butyrate attenuates social behavior deficits and modifies the transcription of inhibitory/excitatory genes in the frontal cortex of an autism model. Neuropharmacology. 102, 136-145 (2016).
  14. Kelly, J. R., et al. Transferring the blues: Depression-associated gut microbiota induces neurobehavioural changes in the rat. Journal of Psychiatric Research. 82, 109-118 (2016).
  15. Wang, L., et al. Elevated fecal short chain fatty acid and ammonia concentrations in children with autism spectrum disorder. Digestive Diseases and Sciences. 57 (8), 2096-2102 (2012).
  16. Adams, J. B., Johansen, L. J., Powell, L. D., Quig, D., Rubin, R. A. Gastrointestinal flora and gastrointestinal status in children with autism--comparisons to typical children and correlation with autism severity. BMC Gastroenterology. 11, 22 (2011).
  17. Skonieczna-Zydecka, K., et al. Faecal short chain fatty acids profile is changed in Polish depressive women. Nutrients. 10 (12), 1939 (2018).
  18. Szczesniak, O., Hestad, K. A., Hanssen, J. F., Rudi, K. Isovaleric acid in stool correlates with human depression. Nutritional Neuroscience. 19 (7), 279-283 (2016).
  19. Martin, A. M., Sun, E. W., Rogers, G. B., Keating, D. J. The influence of the gut microbiome on host metabolism through the regulation of gut hormone release. Frontiers in Physiology. 10, 428 (2019).
  20. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. Paxinos and Franklin's The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2013).
  21. York, J. M., Blevins, N. A., McNeil, L. K., Freund, G. G. Mouse short- and long-term locomotor activity analyzed by video tracking software. Journal of Visualized Experiments. (76), e50252 (2013).
  22. Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice. Journal of Visualized Experiments. (164), e61023 (2020).
  23. Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments. (168), e61941 (2021).
  24. Needham, B. D., Kaddurah-Daouk, R., Mazmanian, S. K. Gut microbial molecules in behavioural and neurodegenerative conditions. Nature Reviews: Neuroscience. 21 (12), 717-731 (2020).
  25. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880 (2008).
  26. Xiaoguang, W., et al. Establishment of a valuable mimic of Alzheimer's disease in rat animal model by intracerebroventricular injection of composited amyloid beta protein. Journal of Visualized Experiments. (137), e56157 (2018).
  27. Venniro, M., Shaham, Y. An operant social self-administration and choice model in rats. Nature Protocols. 15 (4), 1542-1559 (2020).
  28. Ucal, M., et al. Rat model of widespread cerebral cortical demyelination induced by an intracerebral injection of pro-inflammatory cytokines. Journal of Visualized Experiments. (175), e57879 (2021).
  29. Oberrauch, S., et al. Intraventricular drug delivery and sampling for pharmacokinetics and pharmacodynamics study. Journal of Visualized Experiments. (181), e63540 (2022).
  30. Shultz, S. R., et al. Intracerebroventricular injections of the enteric bacterial metabolic product propionic acid impair cognition and sensorimotor ability in the Long-Evans rat: further development of a rodent model of autism. Behavioural Brain Research. 200 (1), 33-41 (2009).
  31. Shultz, S. R., et al. Intracerebroventricular injection of propionic acid, an enteric metabolite implicated in autism, induces social abnormalities that do not differ between seizure-prone (FAST) and seizure-resistant (SLOW) rats. Behavioural Brain Research. 278, 542-548 (2015).
  32. Perry, R. J., et al. Acetate mediates a microbiome-brain-beta-cell axis to promote metabolic syndrome. Nature. 534 (7606), 213-217 (2016).
  33. Muller, P. A., et al. Microbiota modulate sympathetic neurons via a gut-brain circuit. Nature. 583 (7816), 441-446 (2020).
  34. Pardridge, W. M. CSF, blood-brain barrier, and brain drug delivery. Expert Opinion on Drug Delivery. 13 (7), 963-975 (2016).
  35. Wu, J. -T., et al. Oral short-chain fatty acids administration regulates innate anxiety in adult microbiome-depleted mice. Neuropharmacology. , (2022).
  36. Lee, J., et al. Gut microbiota-derived short-chain fatty acids promote poststroke recovery in aged mice. Circulation Research. 127 (4), 453-465 (2020).
  37. Chiu, C., et al. Temporal course of cerebrospinal fluid dynamics and amyloid accumulation in the aging rat brain from three to thirty months. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 3 (2012).
  38. Schuler, B., Rettich, A., Vogel, J., Gassmann, M., Arras, M. Optimized surgical techniques and postoperative care improve survival rates and permit accurate telemetric recording in exercising mice. BMC Veterinary Research. 5, 28 (2009).
  39. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
  40. Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
  41. de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
  42. Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).
  43. Wolter, J. M., et al. Cas9 gene therapy for Angelman syndrome traps Ube3a-ATS long non-coding RNA. Nature. 587 (7833), 281-284 (2020).
  44. Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses for combinatorial cell-subclass-specific labeling. Neuron. 109 (9), 1449-1464 (2021).
  45. Xie, M., et al. TREM2 interacts with TDP-43 and mediates microglial neuroprotection against TDP-43-related neurodegeneration. Nature Neuroscience. 25 (1), 26-38 (2022).
  46. Hsiao, E. Y., et al. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell. 155 (7), 1451-1463 (2013).
  47. Bermudez-Martin, P., et al. The microbial metabolite p-Cresol induces autistic-like behaviors in mice by remodeling the gut microbiota. Microbiome. 9 (1), 157 (2021).
  48. Needham, B. D., et al. A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice. Nature. 602 (7898), 647-653 (2022).
  49. Stewart Campbell, A., et al. Safety and target engagement of an oral small-molecule sequestrant in adolescents with autism spectrum disorder: an open-label phase 1b/2a trial. Nature Medicine. 28 (3), 528-534 (2022).
  50. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  51. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  52. Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
  53. Kaelberer, M. M., et al. A gut-brain neural circuit for nutrient sensory transduction. Science. 361 (6408), (2018).
  54. Needham, B. D., Tang, W., Wu, W. L. Searching for the gut microbial contributing factors to social behavior in rodent models of autism spectrum disorder. Developmental Neurobiology. 78 (5), 474-499 (2018).
  55. Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).
  56. Chu, C., et al. The microbiota regulate neuronal function and fear extinction learning. Nature. 574 (7779), 543-548 (2019).
  57. Wu, W. L., et al. Microbiota regulate social behaviour via stress response neurons in the brain. Nature. 595 (7867), 409-414 (2021).
  58. Buchanan, K. L., et al. The preference for sugar over sweetener depends on a gut sensor cell. Nature Neuroscience. 25 (2), 191-200 (2022).
  59. Han, W., et al. A neural circuit for gut-induced reward. Cell. 175 (3), 665-678 (2018).
  60. Yamawaki, Y., et al. Antidepressant-like effect of sodium butyrate (HDAC inhibitor) and its molecular mechanism of action in the rat hippocampus. World Journal of Biological Psychiatry. 13 (6), 458-467 (2012).
  61. Ho, L., et al. Protective roles of intestinal microbiota derived short chain fatty acids in Alzheimer's disease-type beta-amyloid neuropathological mechanisms. Expert Review of Neurotherapeutics. 18 (1), 83-90 (2018).
  62. Liu, J., et al. Anti-neuroinflammatory effect of short-chain fatty acid acetate against Alzheimer's disease via upregulating GPR41 and inhibiting ERK/JNK/NF-kappaB. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (27), 7152-7161 (2020).
  63. van de Wouw, M., et al. Short-chain fatty acids: microbial metabolites that alleviate stress-induced brain-gut axis alterations. Jounal of Physiology. 596 (20), 4923-4944 (2018).
  64. Olson, C. A., et al. The gut microbiota mediates the anti-seizure effects of the ketogenic diet. Cell. 173 (7), 1728-1741 (2018).
  65. Stewart Campbell, A., et al. Safety and target engagement of an oral small-molecule sequestrant in adolescents with autism spectrum disorder: an open-label phase 1b/2a trial. Nature Medicine. 28 (3), 528-534 (2022).

Tags

מדעי המוח גיליון 184
העברה תוך-מוחית של מטבוליטים מיקרוביאליים שמקורם במעיים בעכברים הנעים בחופשיות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liou, C. W., Yao, T. H., Wu, W. L.… More

Liou, C. W., Yao, T. H., Wu, W. L. Intracerebroventricular Delivery of Gut-Derived Microbial Metabolites in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (184), e63972, doi:10.3791/63972 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter