Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Intracerebroventrikulær levering av tarmavledede mikrobielle metabolitter i fritt bevegelige mus

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63972
Automatic Translation
*1,2, *2, 1,2
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Physiology, College of Medicine, National Cheng Kung University
* These authors contributed equally

Summary

Tarmavledede mikrobielle metabolitter har mangefasetterte effekter som fører til kompleks oppførsel hos dyr. Vi tar sikte på å gi en trinnvis metode for å avgrense effekten av tarmavledede mikrobielle metabolitter i hjernen via intracerebroventrikulær levering via en guidekanyle.

Abstract

Virkningen av tarmmikrobiota og deres metabolitter på vertsfysiologi og oppførsel har blitt grundig undersøkt i dette tiåret. Tallrike studier har vist at tarmmikrobiota-avledede metabolitter modulerer hjernemedierte fysiologiske funksjoner gjennom intrikate tarm-hjerneveier i verten. Kortkjedede fettsyrer (SCFA) er de viktigste bakterieavledede metabolittene produsert under kostfiberfermentering av tarmmikrobiomet. Utskilte SCFAer fra tarmen kan virke på flere steder i periferien, noe som påvirker immun-, endokrine og nevrale responser på grunn av den enorme fordelingen av SCFA-reseptorer. Det er derfor utfordrende å differensiere de sentrale og perifere effektene av SCFAs gjennom oral og intraperitoneal administrering av SCFAs. Dette papiret presenterer en videobasert metode for å forhøre den funksjonelle rollen til SCFAs i hjernen via en guidekanyle i fritt bevegelige mus. Mengden og typen SCFAer i hjernen kan justeres ved å kontrollere infusjonsvolum og -hastighet. Denne metoden kan gi forskere en måte å sette pris på rollen som tarmavledede metabolitter i hjernen.

Introduction

Den menneskelige mage-tarmkanalen har forskjellige mikroorganismer som påvirker verten 1,2,3. Disse tarmbakteriene kan utskille tarmavledede metabolitter under bruk av diettkomponenter som forbrukes av verten 4,5. Interessant nok kan tarmmetabolittene som ikke metaboliseres i periferien transporteres til andre organer via sirkulasjon6. Merk at disse utskilte metabolittene kan tjene som mediatorer for tarm-hjerneaksen, definert som toveis kommunikasjon mellom sentralnervesystemet og tarmen7. Tidligere studier har vist at tarmavledede metabolitter kan modulere kompleks oppførsel og følelser hos dyr 8,9,10,11.

Kortkjedede fettsyrer (SCFA) er hovedmetabolittene produsert av tarmmikrobiota under gjæring av kostfiber og ufordøyelige karbohydrater6. Acetat, propionat og butyrat er de mest tallrike SCFAene i tarmen12. SCFAs tjener som energikilde for celler i mage-tarmkanalen. Unmetabolized SCFAs i tarmen kan transporteres til hjernen gjennom portalvenen, og dermed modulere hjernen og atferd 6,12. Tidligere studier har antydet at SCFAs kan spille en kritisk rolle i nevropsykiatriske lidelser 6,12. For eksempel reddet intraperitoneal injeksjon av butyrat i BTBR T + Itpr3tf / J (BTBR) mus, en dyremodell av autismespektrumforstyrrelse (ASD), deres sosiale underskudd13. Antibiotikabehandlede rotter som fikk mikrobiota fra depressive personer viste en økning i angstlignende atferd og fekale SCFAs14. Klinisk ble endringer i fekale SCFA-nivåer observert hos personer med ASD sammenlignet med typisk utviklende kontroller15,16. Personer med depresjon har lavere fekale SCFAs nivåer enn friske personer17,18. Disse studiene antydet at SCFAs kan endre atferd hos dyr og mennesker gjennom ulike ruter.

Mikrobielle metabolitter utøver ulike effekter på flere steder i kroppen, og påvirker vertsfysiologi og atferd 4,19, inkludert mage-tarmkanalen, vagusnerven og sympatisk nerve. Det er vanskelig å fastslå den nøyaktige rollen til tarmavledede metabolitter i hjernen når metabolittene administreres via perifere ruter. Denne artikkelen presenterer en videobasert protokoll for å undersøke effekten av tarmavledede metabolitter i hjernen til en mus i fri bevegelse (figur 1). Vi viste at SCFAer kunne gis akutt gjennom guidekanylen under atferdstester. Type, volum og infusjonshastighet for metabolitter kan modifiseres avhengig av formålet. Stedet for kanylisering kan justeres for å undersøke virkningen av tarmmetabolitter i en bestemt hjernegruppe. Vi tar sikte på å gi forskere en metode for å undersøke den potensielle effekten av tarmavledede mikrobielle metabolitter på hjernen og atferden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle protokoller og dyrenes omsorg ble godkjent av National Cheng Kung University (NCKU) Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Forberedelse for forsøksdyret

  1. Få 6-8 uker gamle villtype C57BL/6JNarl hannmus fra en leverandør.
  2. Hus musene i et standard musebur med standard musesuppe og sterilisert vann ad libitum.
    MERK: Husforholdene for laboratoriedyrsenteret i NCKU er 22 ± 1 ° C temperatur, 55% ± 10% fuktighet og en 13 t / 11 t lys / mørk syklus.

2. Stereotaksisk kirurgi

  1. Forbered og steriliser stereotaksisk instrument, kirurgiske instrumenter og relaterte gjenstander.
    MERK: Alle gjenstander som kommer i direkte kontakt med operasjonsstedet, bør steriliseres for å unngå infeksjon.
  2. Bedøv musen ved å plassere den i pleksiglassburet med 1% -5% isofluran i oksygen.
    MERK: Observer musen nøye for å sikre at pustefrekvensen holdes på rundt ett pust per sekund.
  3. Ta musen ut av anestesikammeret. Barber operasjonsstedet (musehodet) med en kjæledyrtrimmer. Plasser musen på den stereotaksiske rammen ved å feste musesnittene på fortennstangen i den stereotaksiske snittholderen. Dekk nesen med nosecone masken.
  4. Bedøv musen med 1% -2,5% isofluran i oksygen gjennom hele stereotaksoperasjonen. Evaluer musens nociception via tåens klyperefleks og sørg for en konstant pustefrekvens før du inkuserer operasjonsstedet.
  5. Plasser en varmepute (37,0 °C) under musen på stereotaksrammen for å opprettholde kroppstemperaturen under operasjonen. Alternativt kan du opprettholde kjernetemperaturen ved hjelp av en rektal termisk sonde som forbinder den programmerte varmeren og varmeputen.
  6. Fjern den trimmede pelsen på hodet ved hjelp av tape. Injiser musen med smertestillende Ketoprofen (5 mg/kg) subkutant for å lindre smerte. Påfør øyesalve for å unngå tørre øyne.
  7. Sett den spisse ørestangen i øregangen for å fikse hodet.
  8. Sentrer hodet ved å justere skalaen på ørestangen.
  9. Stram neseklemmen på snittholderen for å unngå vertikal bevegelse. Trykk forsiktig på hodet for å kontrollere at hodet er festet og unngå at hodet løsner under påfølgende operasjon.
  10. Desinfiser hodebunnen med tre vekslende skrubber av klorhexidin ved hjelp av en bomullspinne. Start hver skrubb fra midten mot yttersiden (fra det mest desinfiserte sentrale området til det minst desinfiserte området).
    MERK: Bruken av skrubber fra midten til utsiden kan hjelpe forskere med å minimere infeksjon og forurensning fra pelsen. Det ytre området ligger nær det ubarberte hodeområdet, som fortsatt har mye pels og ikke er lett å desinfisere grundig.
  11. Snitt hodebunnen på fremre/bakre måte (<1 cm) ved hjelp av et kirurgisk blad. Åpne snittet og tørk skallen med en bomullspinne holdt av mikrodissekerende tang.
    MERK: Mikrodissekerende tang, kirurgisk blad og bomullspinner må steriliseres ved autoklavering før kirurgi. Under den kirurgiske prosessen, steriliser alt kirurgisk utstyr ved hjelp av en glassperlesterilisator (150 ° C) i minst 5 sekunder før og etter hvert dyr. Forbered et sterilisert beger for å holde det kirurgiske bladet og tangen under den kirurgiske prosessen og mellom dyr.
  12. Identifiser Bregma og Lambda på skallen. Bruk Bregma som referanse for å finne interesseområdet.
    1. Valgfritt: Monter den stereotaksiske bormaskinen på den stereotaksiske borholderen, og bruk spissen av boret til å peke Bregma som referanse. Steriliser det stereotaksiske boret med glassperlesterilisatoren (150 °C) i minst 5 s.
  13. Kalibrer og juster det flate skallehorisontale planet i venstre/høyre og fremre/bakre plan ved Bregma/Lambda.
    MERK: Hvis den ikke er i riktig horisontalplan, monterer du musen på stereotaksinstrumentet på nytt.

3. Kommersiell tilpasset guide kanyleimplantasjon

  1. Identifiser og merk posisjonen til høyre laterale ventrikel, basert på de stereotaksiske koordinatene: Avstand til Bregma, fremre/bakre (A/P): 0,26 mm, medial/lateral (M/L): -1,0 mm, dorsal/ventral (D/V): -2,0 mm20.
    MERK: Koordinatene kan endres basert på interesseområdet. Koordinatene for lateral ventrikkel var basert på voksne C57BL/6J mus med et vektområde på 26-30 g. Hvis yngre mus brukes, se diskusjonen.
  2. Bor et hull (diameter = 1,5 mm) gjennom skallen på det merkede stedet ved hjelp av en stereotaksisk drill for implantasjon av en kommersiell føringskanyle.
  3. Bor to til fire hull til (diameter = 1,5 mm) på skallen ved hjelp av en stereotaksisk bor for montering av rustfrie stålskruer.
    MERK: Steriliser stereotaksboret ved hjelp av en glassperlesterilisator (150 °C) i minst 5 sekunder før og etter hvert dyr.
  4. Tørk av beinrester og stopp blødningen med en bomullspinne.
  5. Tørk skallen med lidokain (1 mg/kg) ved hjelp av en bomullspinne for lokalbedøvelse, antipruritisk og smertelindrende effekt. Hvis blødningen ikke stopper etter boring, legg forsiktig en bomullspinne på hullet for hemostase.
  6. Monter to til fire rustfrie skruer på hullene for å gi ankre for dental akryl.
  7. Plasser den kommersielle guidekanylen på den stereotaksiske kanyleholderen og desinfiser med glassperlesterilisatoren (150 °C).
    MERK: Den kommersielle veiledningskanylen, kommersiell dummy og kommersiell injektor (figur 2A) ble tilpasset med spesifikasjonene vist i materialtabellen.
  8. Flytt den stereotaksiske kanyleholderen til hullet som er boret for sideventrikkelen, og sett sakte den kommersielle føringskanylen inn i hullet til ønsket dybde (2,5 mm).
    MERK: Den dorsale/ventrale koordinaten kan defineres ved å sette spissen av den kommersielle føringskanylen som referanse når spissen knapt er satt inn i hullet.
  9. Påfør 10 μL n-butylcyanoakrylatlim (vevlimlim) for å fikse den kommersielle føringskanylen i det borede hullet og vent i 3-4 min. Slipp den kommersielle guidekanylen forsiktig fra den stereotaksiske kanyleholderen og flytt holderen bort.
  10. Påfør dental akryl til den innskårne hodebunnen for å fikse den kommersielle guidekanylen og vent i minst 5 minutter. Implanter den kommersielle dummyen i den kommersielle guidekanylen for å unngå tilstopping av kanyle av blod eller kroppsvæske (figur 2B).
  11. Slipp ørestangen fra øregangen og fjern musen fra stereotaksrammen.
  12. Plasser musen i et nytt bur med en varmepute under for gjenoppretting fra anestesi og observer kontinuerlig til musen våkner helt.
    MERK: Ikke la dyret være uten tilsyn før det har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal tilbakeholdenhet. Et dyr som har gjennomgått kirurgi, bør ikke gå tilbake til selskap med andre dyr før det er fullstendig gjenopprettet.
  13. Returner musen til enkelthus eller gruppehus, avhengig av den institusjonelle IACUC-protokollen og den eksperimentelle utformingen. For gruppeboliger, sørg for at færre mus er plassert i et bur for å minimere uønskede skader eller løsningen av kanylen.
  14. Administrer Ibuprofen (0,2 mg / ml) i drikkevannet i minst 3 dager for postoperativ behandling, og overvåk to ganger daglig for tegn på smerte og nød i minst 3 dager.
    1. Under postoperativ omsorg, bruk roxitromycin salve rundt huden for å forhindre betennelse og infeksjon hos musene.
    2. Fortsett å overvåke dyrets tilstand og gi en rettidig intraperitoneal injeksjon av 5% glukose og / eller 0,9% natriumklorid for å gi nok energi.
    3. Hvis tilstanden av smerte, nød eller infeksjon forverres jevnt, avliver musen ved CO2 -innånding.
  15. Vent til 1 uke etter operasjonen for musen å være klar for intracerebroventrikulær levering av SCFAs og atferdstesting.

4. Forberedelse av SCFAer

  1. Løs opp natriumacetatet, natriumbutyrat og natriumpropionat i kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) (se materialtabellen).
  2. Forsikre deg om at kjemikaliene er fullstendig oppløst, juster deretter pH til 7,4, og filtrer SCFAs-blandingen gjennom et 0,22 μm filter for sterilisering.

5. Sett opp infusjonssystemet for intracerebroventrikulær levering av SCFAer under atferdstesting

  1. Monter et takkamera for å registrere oppførselen. Koble kameraet til en datamaskin for å styre programvaren for videoopptak (figur 3).
  2. Fyll en 10 μL sprøyte med destillert vann.
    MERK: Unngå luftbobler i mikrolitersprøyten.
  3. Koble en mikroinjeksjonspumpe til mikroinjeksjonskontrolleren.
  4. Monter mikrolitersprøyten på mikroinjeksjonspumpen. For å installere sprøyten, trykk på knappen for å løsne klemmen og installer sprøyten på den tilsvarende posisjonen. Lukk klemmen og stram stempelholderskruen på mikroinjeksjonspumpen (figur 4A).
  5. Sett den kommersielle injektoren inn i polyetylenrøret (figur 2A).
  6. Heng polyetylenrøret på takkameraet over testarenaen.
  7. Fyll polyetylenrøret med destillert vann ved hjelp av en insulinsprøyte. Koble mikrolitersprøyten til det hengende polyetylenrøret.
    MERK: Forsikre deg om at polyetylenrøret er langt nok til at musen kan bevege seg fritt gjennom testarenaen.

6. Systeminnstillinger for mikroinjeksjonskontrolleren

  1. Slå på mikroinjeksjonskontrolleren og trykk på Vis alle kanaler for å få tilgang til kommandoskjermen (figur 4C). Trykk på Konfigurasjon og sett Volummål til 9 800 nL med Leveringshastighet til 100 nL/s. Tilfør 9 800 ml destillert vann fra polyetylenrøret som er koblet til mikrolitersprøyten (trykk på Retning for å bytte til infuse-modus og trykk på RUN) (se røde firkanter i kommandoskjermbildet i figur 4C).
  2. Trykk på Konfigurasjon og sett Volummål til 3 000 nL med Leveringshastighet til 100 nL/s. Ta ut 3000 nL mineralolje (trykk på Retning for å bytte til Uttak-modus og trykk RUN) (se røde firkanter i kommandoskjermbildet i figur 4C).
    MERK: En klar separasjon mellom olje og vann-fase bør observeres på polyetylenrøret.
  3. Demonter polyetylenrøret fra mikroliter sprøytekanylen. Spytt ut 3000 nL destillert vann fra mikroliter sprøytekanylen (trykk på Retning for å bytte til infuse-modus og trykk på RUN).
  4. Sett mikrolitersprøyten tilbake i polyetylenrøret. Trykk på Konfigurasjon og sett Volummål til 9 500 nL med Leveringshastighet til 100 nL/s. Ta ut 9 500 nL SCFA-er (trykk på Retning for å bytte til Uttak-modus og trykk RUN). Merk olje-SCFAs-fasen for å validere om SCFA-ene er infundert.
  5. Trykk på Konfigurasjon og sett ønsket volummål med leveringshastighet til 7 nL/s. Trykk på Retning for å bytte til infuse-modus (se røde firkanter i kommandoskjermbildet i figur 4C).
    MERK: Bestem volumet basert på infusjonstiden. For eksempel, hvis infusjonstiden er 3 minutter for leveringshastigheten på 7 nL/s, er målvolumet = 1 260 nL.
  6. Trykk på RUN for å infisere mikrolitersprøyten fremover til væsken kommer ut på forsiden av den kommersielle injektoren før du setter injektoren inn i kanylen for SCFA-injeksjon.

7. Infusjon av SCFAer i lateral ventrikel gjennom den kommersielle føringskanylen i fritt bevegelige mus

  1. Bedøv musen ved å plassere den i pleksiglassburet med 1% -5% isofluran i oksygen.
    MERK: Observer musen nøye for å sikre at pustefrekvensen holdes på rundt ett pust per sekund.
  2. Skrubb musen og sett den kommersielle injektoren inn i den kommersielle guidekanylen (figur 4B).
    MERK: Hvis den kommersielle guidekanylen er plugget av blod eller kroppsvæske, må du forsiktig tømme den med pinsett.
  3. La musen komme seg fra anestesi i 15 minutter i et bur før atferdstesting.
  4. For den grunnleggende bevegelsestesten, plasser musen i et nytt bur og la den fritt utforske i 35 minutter. Bruk SCFA-er ved hjelp av en leveringshastighet på 7 nL/s for et målvolum på 2 100 nL i løpet av de første 5 minuttene (trykk på Direction to the Infuse mode (trykk på Direction to the Infuse mode (Infuse mode) og trykk på RUN).
    MERK: Bevegelsen i det nye buret kan analyseres ved hjelp av dyreadferdsvideosporingsprogramvare21,22.
  5. Bedøv musen (gjentatt trinn 7.1) og fjern den kommersielle injektoren fra den kommersielle veiledningskanylen.
    MERK: Musen kan injiseres gjentatte ganger med forskjellige kontroller/metabolitter etter å ha gitt riktig tid til å vaske ut den forrige injeksjonen. Så lenge kanylen er festet på musehodet, kan musen testes gjentatte ganger med forskjellige metabolitter.

8. Restaurering av mikroinjeksjonssystemet

  1. Demonter polyetylenrøret fra mikrolitersprøyten.
  2. Injiser luft inn i slangen ved hjelp av insulinsprøyten for å kaste det destillerte vannet i polyetylenrøret. Tøm mikrolitersprøyten.
  3. Trykk på Reset Pos (Tilbakestill pos) på konfigurasjonsskjermen for å åpne skjermbildet Sprøytestoppdefinisjon (figur 4C).
  4. Trykk på Trekk ut til det oppstår en pipelyd for å tilbakestille mikroinjeksjonspumpen til fullstendig tilbaketrukket posisjon (figur 4C).
  5. Gå tilbake til kommandoskjermen og slå av mikroinjeksjonskontrolleren hvis det er et ** END REACHED**- tegn på dette skjermbildet (figur 4C).

9. Valgfritt: Validering av intracerebroventrikulær injeksjon med nevral tracer

  1. Tilfør 2 100 nL av det nevrale sporstoffet med en leveringshastighet på 7 nL/s for å verifisere infusjonsstedet.
    MERK: La injektoren ligge i føringskanylen i 5 minutter for å forhindre tilbakestrømning.
  2. Bedøv musen ved en overdose isofluran (5%) 30 minutter etter infusjon av nevral tracer.
  3. Kontroller pustefrekvensen og hale-/poteklemmerefleksen i den bedøvede musen.
    MERK: Mus må ikke svare før neste trinn.
  4. Lag et 4-5 cm snitt gjennom huden, muskelen og bukveggen under brystkassen.
  5. Flytt leveren litt bort fra membranen forsiktig.
  6. Snitt membranen for å eksponere hjertet av musen.
  7. Perfuse musen gjennom hjertet med fosfatbufret saltvann (PBS) og iskaldt 4% paraformaldehyd i PBS.
  8. Halshugg musen og disseker hjernen forsiktig med mikrodissekerende tang og mikrodissekerende saks for å ta ut hele hjernen23. Plasser hjerneprøvene i iskaldt 4% paraformaldehyd i PBS i 3-4 dager og vask dem 3 x 5 min med PBS.
  9. Skjær hjernen i to deler i musens hjerneskiveholder ved det åttende kuttet av musens hjerneskiveholder (1 mm / seksjon) fra fremre til bakre retning. Plasser hjernen i den innebygde formen og legg inn hjerneprøvene i lavsmeltepunktagarose (4% i PBS).
  10. Lim hjernen innebygd i agarose på scenen av vibratomen ved hjelp av superlim. Seksjon hjernen koronalt i 50 μm hjerneskiver ved hjelp av vibratomet.
  11. Inkuber hjerneskivene i antistoffet rettet mot nevrale sporstoffet fortynnet i blokkerende buffer (1:1,000 fortynning) over natten ved romtemperatur.
    MERK: Blokkeringsbufferen inneholdt 10 % hesteserum, 0,1 % Triton X-100 og 0,02 % natriumazid.
  12. Vask skivene 3 x 5 min med PBST (PBS med 0,1% triton X-100).
  13. Inkuber hjerneskivene i fluorescens-fargestoff konjugert sekundært antistoff fortynnet i blokkerende buffer (1:500 fortynning) i 2 timer ved romtemperatur.
  14. Vask skivene 3 x 5 min med PBS.
  15. Monter hjerneskivene på lysbildet med et monteringsmedium som inneholder 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI).
  16. Dekk lysbildet med et mikroskopdeksel.
  17. Påfør neglelakk på glidekanten for å unngå lekkasje av monteringsmediet.
  18. Etter nattlig inkubasjon ved romtemperatur, beskyttet mot lys, avbilde fluorescenssignalet på infusjonsstedet ved hjelp av et fluorescensmikroskop.

10. Valgfritt: Infusjon av metabolitter gjennom en tilpasset føringskanyle i rustfritt stål i lateral ventrikel hos mus

  1. Følg protokollens avsnitt 1-8 og erstatt den kommersielle guidekanylen med en føringskanyle i rustfritt stål for å infisere kjemikalier gjennom en injektor i rustfritt stål i musen.
    MERK: Fordeler og ulemper med de forskjellige kommersielle og rustfrie stålkanylene er utdypet i diskusjonsdelen.
  2. Utfør den kirurgiske protokollen på samme måte som beskrevet i protokollavsnitt 2 og 3, bortsett fra å huske å erstatte den kommersielle guidekanylen med en føringskanyle i rustfritt stål (figur 5B).
    MERK: Føringskanylen i rustfritt stål, dummy i rustfritt stål og injektor i rustfritt stål (figur 5A) ble tilpasset med spesifikasjonene vist i materialtabellen. Sett den tilpassede føringskanylen i rustfritt stål inn i hullet til ønsket dybde (2,0 mm).
  3. Tilfør SCFA-er via føringskanylen i rustfritt stål ved hjelp av mikroinjeksjonssystemet som består av mikroinjeksjonskontrolleren og mikroinjeksjonspumpen (figur 4B) (samme som protokollavsnitt 4-7). For den rustfrie ståldukken på føringskanylen i rustfritt stål, bøy den ene siden av injektoren i rustfritt stål forsiktig til spissen på den andre siden er 1 mm lengre enn føringskanylen i rustfritt stål.
  4. Tilfør 2,100 nL av nevrale sporstoffet gjennom føringskanylen i rustfritt stål i lateral ventrikel hos mus (samme som protokollavsnitt 9).
  5. Samle prøven i 30 minutter etter nevral tracerinfusjon (samme som protokollavsnitt 9).
  6. Utfør bildeinnhenting i nevrale sporstoffer infundert hjerneskiver (samme som protokoll seksjon 9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Musen ble infundert med SCFAs 1 uke etter utvinning fra guidekanyleimplantasjonen for å evaluere lokomotorisk aktivitet i et nytt bur. Musen ble plassert i et nytt bur og infundert med 2,100 nL SCFAs eller ACSF i de første 5 minuttene (leveringshastighet på 7 nL / s) inn i hjernen gjennom den kommersielle guidekanylen implantert i hjernens laterale ventrikel. Den lokomotoriske aktiviteten i et nytt bur ble registrert i ytterligere 30 minutter etter infusjon. Det ble ikke observert noen forskjell i den lokomotoriske aktiviteten i det nye buret mellom infusjon av SCFAs og ACSF (figur 6) (n = 2 mus per gruppe; data er vist som gjennomsnittlig ± s.e.m. og analysert med toveis ANOVA).

For å validere nøyaktigheten av implantasjonen av føringskanylen i hjerneregionene, ble en fluorescerende nevral tracer infundert i musene via føringskanylen med samme volum og leveringshastighet som SCFAene (2,100 nL på 5 min; 7 nL / s). Hjernene ble samlet for histologi 30 min senere. Det fluorescerende fargestoffet ble påvist i lateral ventrikkel og omkringliggende områder av musehjernen (figur 7A). En føringskanyle i rustfritt stål ble implantert i hjernens laterale ventrikel for infusjon av nevral tracer under de samme forholdene. I likhet med styrekanylen viste resultatene at et fluorescerende fargestoffsignal ble detektert i lateral ventrikel og de omkringliggende områdene i musehjernen selv etter infusjon gjennom føringskanylen i rustfritt stål (figur 7B).

Figure 1
Figur 1: Prosedyren for intracerebroventrikulær infusjon hos mus i fritt bevegelse. Flytskjemaet for intracerebroventrikulær levering av tarmavledede mikrobielle metabolitter i fritt bevegelige mus. Forkortelse: SCFAs = kortkjedede fettsyrer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Implantasjon av den kommersielle guidekanylen hos mus . (A) Det representative bildet av kommersiell guidekanyle, dummy og injektor. (B) Det representative bildet av kommersiell guide kanyle og dummy implantert i hjernen til mus ved fiksering med dental akryl. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Den intracerebroventrikulære infusjonsriggen for atferdstesting. Diagrammet over mikroinjeksjonssystem, videoopptakssystem og atferdsapparat. Forkortelse: SCFAs = kortkjedede fettsyrer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Mikroinjeksjonssystemet . (A) Installasjon av mikrolitersprøyten ved hjelp av en mikroinjeksjonspumpe. (B) Innsetting av den kommersielle injektoren forbundet med polyetylenrør i den kommersielle føringskanylen (C) Berøringsskjermen til mikroinjeksjonskontrolleren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Implantasjon av føringskanyle i rustfritt stål i lateral ventrikel hos mus . (A) Det representative bildet av føringskanyle, dummy og injektor i rustfritt stål. (B) Det representative bildet av rustfritt stål guide kanyle og dummy implantert i hjernen til mus ved fiksering med dental akryl. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Lokomotorisk aktivitet av SCFA-infunderte mus i det nye buret . (A) Tidslinjeskjematisk for førerkanyleimplantasjon og ny burbevegelse ved ACSF- eller SCFA-infusjon. (B) Tidslinjeskjema for plassering av infusjonssprøyte, infusjonsvindu (blå skygge) og den nye buratferdstestingen. (C) Total avstand flyttet av ACSF- og SCFAs-infunderte mus i et nytt bur i 35 minutter. Tidsvinduet for infusjon er indikert med blå skygge (0-5 min). (D) Representative bilder av baner for ACSF- og SCFA-infunderte mus i et nytt bur. n = 2 mus per gruppe. Data vist som gjennomsnittlig ± s.e.m. og analysert med toveis ANOVA. NS: Ikke signifikant. Forkortelser: SCFAs = kortkjedede fettsyrer; ACSF = kunstig cerebrospinalvæske. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: Histologien til hjerneinfundert fluorescerende fargestoff. Infusjon gjennom den tilpassede (A) kommersielle og (B) rustfritt stål guide kanyle implantert i lateral ventrikkel (LV) av mus. Skalastenger = 1 mm (venstre) og 500 μm (høyre). Blå: DAPI-farging; Grønn: Anti-fluorescerende gullmerking. Forkortelser: LV = lateral ventrikel; AC = fremre kommissur; CPu = caudate putamen; LS = lateral septum; MS = mediale septum. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tarmavledede metabolitter har vært assosiert med hjernemedierte sykdommer uten mye presis mekanisme, delvis på grunn av deres flere bindingssteder i kroppen 6,12,24. Tidligere rapporter indikerte at SCFAer kunne tjene som ligander for G-proteinkoblede reseptorer, epigenetiske regulatorer og kilder til energiproduksjon på flere steder i kroppen 6,12. For å omgå de forstyrrende faktorene som stammer fra periferien (som immunceller, hormoner og autonomt nervesystem), ble det utviklet en metode ved å vedta intracerebroventrikulær injeksjon av SCFAer i hjernen gjennom en guidekanyle i fritt bevegelige mus. I tillegg ble kanyliserings- og infusjonsstedene validert for å utforske hjerneområdene som potensielt kan påvirkes av SCFAer. Til sammen presenterer dette papiret en presis, grundig og validert metode for å levere tarmavledede metabolitter i hjernen for tarm-hjerneakseforskning.

Den intracerebroventrikulære leveransen av medisiner og kjemikalier gjennom en guidekanyle til dyr er veletablert 25,26,27,28,29 for ulike legemiddeltester29, sykdomsmodellering 26,28 og spesifikk utforming av atferdstester 27 . Viktigst, flere studier har levert tarmmikrobielle metabolitter inn i hjernen gjennom intracerebroventrikulær injeksjon og testet deres effekter på fysiologiske funksjoner30,31,32,33. Denne protokollen gir et tilleggsattributt ved administrering av tarmmetabolitter på en akutt måte til hjernen i sanntid, noe som vil tillate forskere å forstå de dynamiske effektene av tarmmetabolitter på hjernen og oppførselen.

Leveringshastigheten for metabolittinfusjonen er avgjørende for å simulere flyten av cerebrospinalvæske i hjernens ventrikler. En studie indikerte at cerebrospinalvæskeproduksjonen hos mus er 5,3 nL/s34. For å kontrollere strømningshastigheten til SCFAer naturlig i fritt bevegelige mus, har vi evaluert strømningshastigheten for dette mikroinjeksjonssystemet (figur 3 og figur 4). SCFA-ene kunne infunderes jevnt uten mye motstand, selv når det 350 cm lange polyetylenrøret ble brukt til å infisere SCFAer i en mus i fri bevegelse. Ved påfylling av destillert vann og mineralolje for å redusere væskemotstanden i polyetylenrøret (se protokollavsnitt 5 og 6), kan strømningshastigheten senkes til 7 nL/s fra 100 nL/s. Infusjon av SCFAs eller ACSF ved en strømningshastighet på 7 nL/s resulterte ikke i noen unormal oppførsel hos musene.

Mengden og doseringen av tarmavledede metabolitter for intracerebroventrikulær injeksjon er kritisk. Det er fortsatt utfordrende å analysere de absolutte nivåene av tarmavledede metabolitter i ulike hjernegrupper. For eksempel har svært få studier vist påvisning av de fysiologiske nivåene av SCFAer i hjernen35,36. En studie viste at konsentrasjonene av acetat, propionat og butyrat i hjernen til mus er omtrent 1640,6-3281,2 μg / g, 288,18-384,24 μg / g og 44,036-66,054 μg / g, henholdsvis36. En annen studie rapporterte imidlertid lavere nivåer av SCFAer i hjernen (acetat 128,1 μg / g, propionat 0,3883 μg / g og butyrat 0,1640 μg / g) 35. Mengden infundert acetat, propionat og butyrat vedtatt i denne protokollen var henholdsvis 5,81385 μg/g, 4,62378 μg/g og 2,6124 μg/g. Derfor er konsentrasjonene av SCFAene som er infundert i denne protokollen sammenlignbare med fysiologiske konsentrasjoner. Vi kunne imidlertid ikke utelukke at konsentrasjonene av SCFAer kan variere i forskjellige hjernegrupper. Flere studier viste at levering av propionat i hjernens ventrikel ved intracerebroventrikulær injeksjon (4 μL 0,26 M propionsyre på 1 min; ca. 249,756 μg / g) svekket sosial atferd og kognisjon hos rotter30,31. Doseringen og strømningshastigheten til det infunderte propionatet var relativt høy, som rapportert hos mus35 og rotter37. Derfor vil fremskritt innen metabolittanalyse og metabolomisk profilering i hjernen og periferien hjelpe forskere bedre å forstå de romlige og tidsmessige dynamiske endringene i tarmavledede metabolitter.

To typer guide kanyler har blitt presentert i denne protokollen for intracerebroventrikulær injeksjon i mus-en kommersiell guide kanyle og en rustfritt stål guide kanyle. Den kommersielle guidekanylen og dummyen er godt designet for implantasjon. Det er ikke lett for mus å fjerne den tilpassede dummyen på grunn av hetten. Tvert imot kan den rustfrie ståldukken lett fjernes fra føringskanylen i rustfritt stål av mus under 1-ukers gjenoppretting, noe som forårsaker koagulering av blod / cerebrospinalvæske i kanylen. Imidlertid er den kommersielle tilpassede kanylen 64 mg, og dummyen for denne kanylen er 86 mg. Dermed er totalvekten av den kommersielle tilpassede kanylen og dummyen 150 mg. I kontrast er den tilpassede føringskanylen i rustfritt stål 18,3 mg, og dummyen til denne kanylen er 8,5 mg. Dermed er totalvekten av den tilpassede føringskanylen i rustfritt stål 26,8 mg. Teoretisk sett vil den lave vekten av kanylesettet i rustfritt stål minimere kanylens innvirkning på dyrets bevegelse og hjernen. Dessuten er kostnaden for den kommersielle guidekanylen høyere enn føringskanylen og injektoren i rustfritt stål. Derfor anbefaler vi guidekanylen i rustfritt stål for uerfarne forskere som utfører stereotaksisk kirurgi hos mus.

Den implanterte kanylen kan være tilstoppet av blod og cerebrospinalvæske på grunn av hjerneskade. Denne tilstopping av kanylen kan forekomme oftere i kanylen i rustfritt stål over den kommersielle kanylen. Smokken kan gjenges for å stramme den kommersielle kanylen sikkert (figur 2A), men ikke for kanylen i rustfritt stål (figur 5A). Derfor vil sikring av festing av dummyen i gjenopprettingsperioden minimere tilstopping av kanylen. En ny dummy må settes inn hvis det oppstår løsrivelse i løpet av 1 ukes gjenoppretting. Videre må en engangssterilisert injektor settes inn flere ganger for å rense kanylen før montering av injektoren som forbinder polyetylenrøret.

Valget av bedøvelsesmidler vil i stor grad påvirke kirurgi og atferdstesting. Her ble inhalasjonsbedøvelsen isofluran valgt fremfor injiserte anestetika fordi restitusjonstiden er kortere og den av humane årsaker er mindre skadelig for dyrene. Doseringen ved inhalasjon av isofluran kan imidlertid varieres avhengig av musens status og kroppsvekt. Derfor må anestesistatus observeres nøye under hele den kirurgiske prosedyren, og isofluranfordamperen justeres tilsvarende. Den optimaliserte pustefrekvensen bør være ett pust per sekund under alle prosedyrer. Videre bør gassfilterbeholderen fylt med aktivert karbon kobles til anestesikammeret og nesekonmasken for å tømme isofluran- og eksosgassforurensningen i driftsområdet. Dette vil beskytte kirurgen mot den toksiske effekten av isofluran.

De representative resultatene viste at SCFAs infusjon ikke ga noen dramatisk effekt på bevegelse i et nytt bur. Dette kan skyldes at et lite antall dyr ble brukt for å oppnå dette resultatet (figur 6). Videre tilførte vi bare SCFA-ene de første 5 minuttene av den nye burbevegelsesatferdstesten, men ikke hele testingen fordi det meste av oppførselen ble testet innen et kort tidsvindu (5-15 min). Tidsvinduet for tarmavledede mikrobielle metabolitter bør justeres basert på forskernes hypotese.

Tiden for anestesi og gjenvinne bevissthet fra anestesi er kritisk for atferdstester. Her ble musene bedøvet kort for injektorimplantasjon og SCFA-infusjon, og atferdstesting ble utført etter 15 minutter. Tiden for å gjenopprette etter opphør av inhalasjonsbedøvelse ble bestemt basert på en tidligere studie38. En pilotstudie sørget for at musene var aktive, fritt bevegelige og ikke ubehagelige 15 minutter etter anestesi. Vi introduserte anestesitrinnet for montering av injektoren av følgende grunner. For det første er injektormåleren 33 G; Det er veldig utfordrende å sette inn en så delikat injektor i kanylen når dyret beveger seg aktivt. I tillegg kan scruffing av bevisste mus produsere stress på musene39, forvirrende atferdsresultatene. For det andre er kanylen av og til tilstoppet på grunn av koagulering av blod/cerebrospinalvæske. Tilstopping av kanylen forsiktig før montering av injektoren vil være ideelt for metabolittinfusjon. Basert på disse to grunnene anbefales det å bedøve musene kort for montering av injektoren. Etterforskere kan vente lenger (30 min) hvis det er noen bekymring for dyrets utvinning fra innåndingsbedøvelsen. Videre kan et eget sett med infusjonsinjektor som forbinder polyetylenrøret settes opp for å akselerere forsøkene.

Denne protokollen har flere begrensninger. For det første vil implantasjonen av føringskanylen og det tilkoblede polyetylenrøret begrense det kirurgiske området for implantering av optiske fibre for optogenetisk og fiberfotometri i samme koordinat, det omkringliggende området eller til og med den samme hjernehalvdelen. Det vil være enda mer utfordrende å implantere linsen for mikroendoskopi på musehodet sammen med den implanterte føringskanylen. For det andre kan implantasjonen av føringskanylen generere en betydelig vekt på musehodet. Den totale vekten av et tilpasset kanylesett er 26,8-150 mg, en skrue er ~ 48 mg, og den monterte dentale akrylen er 450-500 mg. Hele installasjonssettet kan begrense musenes bevegelser. Nylige studier har imidlertid implantert et miniskop for overvåking av kalsiumsignaler i fritt bevegelige mus40,41. Vekten på miniskopet varierer fra 1,6 g til 4,5 g, unntatt skruer og dental akryl. Derfor kan vekten av guidekanylen betraktes som relativt akseptabel for testing av museadferd. For det tredje er det tilkoblede polyetylenrøret for infusjonen ~ 350 cm langt, noe som kan begrense bevegelsen av mus under oppførselstesten. For å løse denne bekymringen kan det være nødvendig med pretesting for bevegelse i en åpen felttest for å evaluere virkningen av det tilkoblede polyetylenrøret på musemotorfunksjonen. For det fjerde kan dental akryl gi en nevrotoksisk effekt på musene. Det er imidlertid nødvendig å feste føringskanylen til musehodet i testperioden. For å redusere den potensielle nevrotoksiske effekten av dental akryl på mus, må operatørene være kjent med bruken av dental akryl. Dental akryl er bedre brukt når dental akryl blanding (pulver og væske) er litt størknet for å redusere penetrasjon av dental akryl væske inn i hjernen.

Mikrobiota og deres metabolitter er assosiert med atferdsfunksjon ved forskjellige utviklingsmilepæler. Selv om denne protokollen er basert på voksne C57BL / 6 mus med kroppsvekter fra 26 g til 30 g, kan den også brukes på mus i forskjellige aldre og størrelser. Tidligere studier har vedtatt stereotaksisk kirurgi hos unge mus42,43,44,45. Koordinatene for hjernegrupper kan imidlertid variere avhengig av musens størrelse og alder. Vi anbefaler at du refererer til alderstilsvarende atlas eller nettressurs (http://mouse.brain-map.org/static/atlas). Videre må koordinatene valideres ved å injisere trypanblått eller fluorescensfargestoff i de unge kullmusene, og dermed optimalisere metoden før den utføres på de eksperimentelle musene. Guidekanylene som brukes i denne protokollen er alle tilpasset og kan justeres etter validering av koordinatene for forskjellige størrelser av mus.

Denne protokollen vil være kompatibel med de fleste gnagere atferd testing med en åpen arena på toppen av apparatet uten store endringer. Gnageradferdstester kan utføres med en polyetylenrørledning på toppen av musehodet uten hindring, inkludert åpen felttest, forhøyet pluss / null labyrint, trinntest, direkte sosial interaksjon, voksen ultralydvokalisering, tvungen svømmetest, halefjæring, vann labyrint, T eller Y labyrint, roman objektgjenkjenning, marmorgraving, selvpleie test, strålekryssing, pole test, og vann unngå stress eksponering. Tester ved hjelp av lukkede kamre eller rør må modifiseres slik at polyetylenrøret fritt kan bevege seg sammen med musene, for eksempel trekammer sosial test, lys-mørk boks, fryktkondisjonering, sukrosepreferanse, fastspenning, skremmende test og prepuls-pulshemming. Vi foreslår at du forhåndstester og estimerer lengden som trengs for polyetylenrøret på kullmusene før testing.

Tarmmikrobielle metabolitter har vist seg å påvirke vertsadferd 8,46,47,48,49. Forskere kan vedta denne metoden for å direkte undersøke de tidsmessige og romlige effektene av tarmmikrobiota-avledede metabolitter på hjernen og atferdene hos mus. For eksempel var den mikrobielle metabolitten 4-etylfenylsulfat (4EPS) økt i prekliniske musemodeller av ASD og personer med ASD46,48,49. Injeksjon av 4EPS og kolonisering av bakteriene som produserer 4EPS økte angstlignende oppførsel og nedsatt oligodendrocyttermodning i den paraventrikulære kjernen til thalamus (PVT) hos mus46,48. Det ville være fascinerende å evaluere den direkte effekten av 4EPS på PVT av mus under angstlignende atferdstesting. Den absolutte konsentrasjonen av 4EPS i PVT er imidlertid fortsatt ukjent. Derfor kan en dose-respons test være avgjørende for å bestemme tilstrekkelige nivåer av 4EPS i PVT. Et lignende konsept kan vedtas for effekten av andre mikrobielle metabolitter på hjernen og oppførselen.

Kretsbaserte nevroteknologier, som optogenetikk, kjemogenetikk og in vivo kalsiumavbildning, er kritiske metoder som gjør det mulig for forskere å forstå nevralkretsen i kontrollen av atferd50,51,52. Tarm-hjerneaksen er en komplisert forbindelse som er kritisk for tarmmikroberene og deres metabolitter for å formidle vertsadferd. Et økende antall studier har ansatt kretsbaserte nevroteknologier for å forstå den spennende krysstalen mellom tarmen og hjernen 33,53,54,55,56,57,58,59. Denne protokollen vil gi en alternativ måte å forstå hjerneregionbasert kontroll av atferd forårsaket av tarmmetabolitter. Kombinere denne protokollen med kretsbaserte nevroteknologier vil tillate forskere å få innsikt i kretsbasert kontroll av atferd og hjerneaktivitet bidratt av tarmmetabolitter.

Avslutningsvis er begrepet tarm-hjerneaksen godt akseptert i det vitenskapelige samfunn og fremmer muligheten for involvering av tarmavledede metabolitter i nevropsykiatriske lidelser 11,13,60,61,62,63,64,65 . For å undersøke hvordan og hvilke tarmavledede metabolitter som påvirker hjernen og oppførselen til mus, vil det være behov for en omfattende og fysiologisk basert metodikk i feltet. Denne artikkelen gir en trinnvis protokoll for å levere tarmavledede metabolitter direkte inn i hjernen, viktigst, i en mus i fri bevegelse. Dette designet kan tilpasses ytterligere for å undersøke de regionspesifikke effektene ved levering av tarmavledede metabolitter i forskjellige hjernegrupper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter knyttet til dette arbeidet.

Acknowledgments

Vi anerkjenner laboratoriedyrsenterets ansatte ved National Cheng Kung University (NCKU) for omsorg for dyrene. Dette arbeidet ble støttet av stipendet fra prof. Kun-Yen Huang Education Fund of CHENG-HSING Medical Foundation til C.-W.L.; midlene fra departementet for vitenskap og teknologi (MOST) i Taiwan: (Undergraduate Research MOST 109-2813-C-006-095-B) til T.-H.Y.; (MOST 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) til W.-L.W.; og Higher Education Sprout Project, Utdanningsdepartementet til hovedkvarteret for universitetsutvikling ved NCKU til W.-L.W.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41 Pfizer n/a
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit ThermoFisher Scientific A-21206
Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal) Millipore AB153-I
Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μm, PES, Sterile NEST 121921LA01
CaCl2  Sigma-Aldrich C1016 ACSF: 0.14 g/L
Chlorhexidine scrub 2% Phoenix NDC 57319-611-09
Chlorhexidine solution Phoenix NDC 57319-599-09
Commercial dummy RWD Life Science 62004 Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm
Commercial guide cannul RWD Life Science 62104 Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm 
Commercial injector RWD Life Science 62204 Single_OD 0.21 mm-33G/ Mates with M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 ACSF: 0.61 g/L
Dental acrylic HYGENIC n/a
Fixing screws RWD Life Science 62521
Fluoroshield mounting medium with DAPI Abcam AB104139
Horse serum ThermoFisher Scientific 16050130
Insulin syringes BBraun XG-LBB-9151133S-1BX 1 mL
Isoflurane  Panion & BF biotech DG-4900-250D
KCl  Sigma-Aldrich P3911 ACSF: 0.19 g/L
Ketoprofen  Swiss Pharmaceutical n/a
Lidocaine  AstraZeneca n/a
Low melting point agarose Invitrogen 16520
MgCl2  Sigma-Aldrich M8266 ACSF: 0.19 g/L
Microscope cover slips MARIENFELD 101242
Microscope slides ThermoFisher Scientific 4951PLUS-001E
Mineral oil light, white NF Macron Fine Chemicals MA-6358-04
NaCl  Sigma-Aldrich S9888 ACSF: 7.46 g/L
NaH2PO4  Sigma-Aldrich S8282 ACSF: 0.18 g/L
NaHCO3  Sigma-Aldrich S5761 ACSF: 1.76 g/L
n-butyl cyanoacrylate adhesive (tissue adhesive glue) 3M 1469SB 3M Vetbond
Neural tracer  Santa Cruz SC-358883 FluoroGold
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Polyethylene tube RWD Life Science 62329 OD 1.50, I.D 0.50 mm and OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (eye) Ointment Dechra  12920060
Sodium acetate  Sigma-Aldrich S2889 SCFAs: 13.5 mM
Sodium azide  Sigma-Aldrich S2002
Sodium butyrate  Sigma-Aldrich B5887 SCFAs: 8 mM
Sodium propionate  Sigma-Aldrich P1880 SCFAs: 5.18 mM
Stainless guide cannula Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.63 mm; Local vendor
Stainless injector Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.3 mm; dummy is made from injector; local vendor
Superglue Krazy Glue KG94548R
Triton X-100 Merck 1.08603.1000
Equipment
Cannula holder RWD Life Science B485-68217
Ceiling camera FOSCAM R2
Digital stereotaxic instruments Stoelting 51730D
Dissecting microscope INNOVIEW SEM-HT/TW
Glass Bead Sterilizer RWD Life Science RS1501
Heating pad Stoelting 53800M
Leica microscope  Leica DM2500
Micro Dissecting Forceps ROBOZ RS-5136 Serrated, Slight Curve; Extra Delicate; 0.5mm Tip Width; 4" Length 
Micro Dissecting Scissors ROBOZ RS-5918 4.5" Angled Sharp
Microinjection controller World Precision Instruments (WPI) MICRO2T SMARTouch Controller
Microinjection syringe pump World Precision Instruments (WPI) UMP3T-1 UltraMicroPump3  
Microliter syringe Hamilton 80014 10 µL
Optical Fiber Cold Light with double Fiber Step LGY-150 Local vendor
Pet trimmer WAHL 09962-2018
Vaporiser for Isoflurane Step AS-01 Local vendor
Vibratome Leica VT1000S
Software
Animal behavior video tracking software Noldus EthoVision Version: 15.0.1416
Leica Application Suite X software Leica LASX Version: 3.7.2.22383

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lynch, J. B., Hsiao, E. Y. Microbiomes as sources of emergent host phenotypes. Science. 365 (6460), 1405-1409 (2019).
  2. Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome-gut-brain axis in health and disease. Gastroenterology Clinics of North America. 46 (1), 77-89 (2017).
  3. Sharon, G., Sampson, T. R., Geschwind, D. H., Mazmanian, S. K. The central nervous system and the gut microbiome. Cell. 167 (4), 915-932 (2016).
  4. Krautkramer, K. A., Fan, J., Backhed, F. Gut microbial metabolites as multi-kingdom intermediates. Nature Reviews: Microbiology. 19 (2), 77-94 (2021).
  5. Lavelle, A., Sokol, H. Gut microbiota-derived metabolites as key actors in inflammatory bowel disease. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. 17 (4), 223-237 (2020).
  6. Dalile, B., Van Oudenhove, L., Vervliet, B., Verbeke, K. The role of short-chain fatty acids in microbiota-gut-brain communication. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. 16 (8), 461-478 (2019).
  7. Morais, L. H., Schreiber, H. L. T., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews: Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
  8. Sharon, G., et al. Human gut microbiota from autism spectrum disorder promote behavioral symptoms in mice. Cell. 177 (6), 1600-1618 (2019).
  9. St Laurent, R., O'Brien, L. M., Ahmad, S. T. Sodium butyrate improves locomotor impairment and early mortality in a rotenone-induced Drosophila model of Parkinson's disease. Neuroscience. 246, 382-390 (2013).
  10. Govindarajan, N., Agis-Balboa, R. C., Walter, J., Sananbenesi, F., Fischer, A. Sodium butyrate improves memory function in an Alzheimer's disease mouse model when administered at an advanced stage of disease progression. Journal of Alzheimer's Disease. 26 (1), 187-197 (2011).
  11. Needham, B. D., et al. A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice. Nature. 602 (7898), 647-653 (2022).
  12. Silva, Y. P., Bernardi, A., Frozza, R. L. The role of short-chain fatty acids from gut microbiota in gut-brain communication. Frontiers in Endocrinology. 11, 25 (2020).
  13. Kratsman, N., Getselter, D., Elliott, E. Sodium butyrate attenuates social behavior deficits and modifies the transcription of inhibitory/excitatory genes in the frontal cortex of an autism model. Neuropharmacology. 102, 136-145 (2016).
  14. Kelly, J. R., et al. Transferring the blues: Depression-associated gut microbiota induces neurobehavioural changes in the rat. Journal of Psychiatric Research. 82, 109-118 (2016).
  15. Wang, L., et al. Elevated fecal short chain fatty acid and ammonia concentrations in children with autism spectrum disorder. Digestive Diseases and Sciences. 57 (8), 2096-2102 (2012).
  16. Adams, J. B., Johansen, L. J., Powell, L. D., Quig, D., Rubin, R. A. Gastrointestinal flora and gastrointestinal status in children with autism--comparisons to typical children and correlation with autism severity. BMC Gastroenterology. 11, 22 (2011).
  17. Skonieczna-Zydecka, K., et al. Faecal short chain fatty acids profile is changed in Polish depressive women. Nutrients. 10 (12), 1939 (2018).
  18. Szczesniak, O., Hestad, K. A., Hanssen, J. F., Rudi, K. Isovaleric acid in stool correlates with human depression. Nutritional Neuroscience. 19 (7), 279-283 (2016).
  19. Martin, A. M., Sun, E. W., Rogers, G. B., Keating, D. J. The influence of the gut microbiome on host metabolism through the regulation of gut hormone release. Frontiers in Physiology. 10, 428 (2019).
  20. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. Paxinos and Franklin's The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2013).
  21. York, J. M., Blevins, N. A., McNeil, L. K., Freund, G. G. Mouse short- and long-term locomotor activity analyzed by video tracking software. Journal of Visualized Experiments. (76), e50252 (2013).
  22. Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice. Journal of Visualized Experiments. (164), e61023 (2020).
  23. Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments. (168), e61941 (2021).
  24. Needham, B. D., Kaddurah-Daouk, R., Mazmanian, S. K. Gut microbial molecules in behavioural and neurodegenerative conditions. Nature Reviews: Neuroscience. 21 (12), 717-731 (2020).
  25. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880 (2008).
  26. Xiaoguang, W., et al. Establishment of a valuable mimic of Alzheimer's disease in rat animal model by intracerebroventricular injection of composited amyloid beta protein. Journal of Visualized Experiments. (137), e56157 (2018).
  27. Venniro, M., Shaham, Y. An operant social self-administration and choice model in rats. Nature Protocols. 15 (4), 1542-1559 (2020).
  28. Ucal, M., et al. Rat model of widespread cerebral cortical demyelination induced by an intracerebral injection of pro-inflammatory cytokines. Journal of Visualized Experiments. (175), e57879 (2021).
  29. Oberrauch, S., et al. Intraventricular drug delivery and sampling for pharmacokinetics and pharmacodynamics study. Journal of Visualized Experiments. (181), e63540 (2022).
  30. Shultz, S. R., et al. Intracerebroventricular injections of the enteric bacterial metabolic product propionic acid impair cognition and sensorimotor ability in the Long-Evans rat: further development of a rodent model of autism. Behavioural Brain Research. 200 (1), 33-41 (2009).
  31. Shultz, S. R., et al. Intracerebroventricular injection of propionic acid, an enteric metabolite implicated in autism, induces social abnormalities that do not differ between seizure-prone (FAST) and seizure-resistant (SLOW) rats. Behavioural Brain Research. 278, 542-548 (2015).
  32. Perry, R. J., et al. Acetate mediates a microbiome-brain-beta-cell axis to promote metabolic syndrome. Nature. 534 (7606), 213-217 (2016).
  33. Muller, P. A., et al. Microbiota modulate sympathetic neurons via a gut-brain circuit. Nature. 583 (7816), 441-446 (2020).
  34. Pardridge, W. M. CSF, blood-brain barrier, and brain drug delivery. Expert Opinion on Drug Delivery. 13 (7), 963-975 (2016).
  35. Wu, J. -T., et al. Oral short-chain fatty acids administration regulates innate anxiety in adult microbiome-depleted mice. Neuropharmacology. , (2022).
  36. Lee, J., et al. Gut microbiota-derived short-chain fatty acids promote poststroke recovery in aged mice. Circulation Research. 127 (4), 453-465 (2020).
  37. Chiu, C., et al. Temporal course of cerebrospinal fluid dynamics and amyloid accumulation in the aging rat brain from three to thirty months. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 3 (2012).
  38. Schuler, B., Rettich, A., Vogel, J., Gassmann, M., Arras, M. Optimized surgical techniques and postoperative care improve survival rates and permit accurate telemetric recording in exercising mice. BMC Veterinary Research. 5, 28 (2009).
  39. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
  40. Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
  41. de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
  42. Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).
  43. Wolter, J. M., et al. Cas9 gene therapy for Angelman syndrome traps Ube3a-ATS long non-coding RNA. Nature. 587 (7833), 281-284 (2020).
  44. Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses for combinatorial cell-subclass-specific labeling. Neuron. 109 (9), 1449-1464 (2021).
  45. Xie, M., et al. TREM2 interacts with TDP-43 and mediates microglial neuroprotection against TDP-43-related neurodegeneration. Nature Neuroscience. 25 (1), 26-38 (2022).
  46. Hsiao, E. Y., et al. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell. 155 (7), 1451-1463 (2013).
  47. Bermudez-Martin, P., et al. The microbial metabolite p-Cresol induces autistic-like behaviors in mice by remodeling the gut microbiota. Microbiome. 9 (1), 157 (2021).
  48. Needham, B. D., et al. A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice. Nature. 602 (7898), 647-653 (2022).
  49. Stewart Campbell, A., et al. Safety and target engagement of an oral small-molecule sequestrant in adolescents with autism spectrum disorder: an open-label phase 1b/2a trial. Nature Medicine. 28 (3), 528-534 (2022).
  50. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  51. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  52. Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
  53. Kaelberer, M. M., et al. A gut-brain neural circuit for nutrient sensory transduction. Science. 361 (6408), (2018).
  54. Needham, B. D., Tang, W., Wu, W. L. Searching for the gut microbial contributing factors to social behavior in rodent models of autism spectrum disorder. Developmental Neurobiology. 78 (5), 474-499 (2018).
  55. Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).
  56. Chu, C., et al. The microbiota regulate neuronal function and fear extinction learning. Nature. 574 (7779), 543-548 (2019).
  57. Wu, W. L., et al. Microbiota regulate social behaviour via stress response neurons in the brain. Nature. 595 (7867), 409-414 (2021).
  58. Buchanan, K. L., et al. The preference for sugar over sweetener depends on a gut sensor cell. Nature Neuroscience. 25 (2), 191-200 (2022).
  59. Han, W., et al. A neural circuit for gut-induced reward. Cell. 175 (3), 665-678 (2018).
  60. Yamawaki, Y., et al. Antidepressant-like effect of sodium butyrate (HDAC inhibitor) and its molecular mechanism of action in the rat hippocampus. World Journal of Biological Psychiatry. 13 (6), 458-467 (2012).
  61. Ho, L., et al. Protective roles of intestinal microbiota derived short chain fatty acids in Alzheimer's disease-type beta-amyloid neuropathological mechanisms. Expert Review of Neurotherapeutics. 18 (1), 83-90 (2018).
  62. Liu, J., et al. Anti-neuroinflammatory effect of short-chain fatty acid acetate against Alzheimer's disease via upregulating GPR41 and inhibiting ERK/JNK/NF-kappaB. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (27), 7152-7161 (2020).
  63. van de Wouw, M., et al. Short-chain fatty acids: microbial metabolites that alleviate stress-induced brain-gut axis alterations. Jounal of Physiology. 596 (20), 4923-4944 (2018).
  64. Olson, C. A., et al. The gut microbiota mediates the anti-seizure effects of the ketogenic diet. Cell. 173 (7), 1728-1741 (2018).
  65. Stewart Campbell, A., et al. Safety and target engagement of an oral small-molecule sequestrant in adolescents with autism spectrum disorder: an open-label phase 1b/2a trial. Nature Medicine. 28 (3), 528-534 (2022).

Tags

Nevrovitenskap utgave 184
Intracerebroventrikulær levering av tarmavledede mikrobielle metabolitter i fritt bevegelige mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liou, C. W., Yao, T. H., Wu, W. L.… More

Liou, C. W., Yao, T. H., Wu, W. L. Intracerebroventricular Delivery of Gut-Derived Microbial Metabolites in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (184), e63972, doi:10.3791/63972 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter