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Neuroscience

Somministrazione intracerebroventricolare di metaboliti microbici derivati dall'intestino in topi che si muovono liberamente

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63972
Automatic Translation
*1,2, *2, 1,2
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Physiology, College of Medicine, National Cheng Kung University
* These authors contributed equally

Summary

I metaboliti microbici derivati dall'intestino hanno effetti sfaccettati che portano a comportamenti complessi negli animali. Miriamo a fornire un metodo passo-passo per delineare gli effetti dei metaboliti microbici derivati dall'intestino nel cervello attraverso la somministrazione intracerebroventricolare tramite una cannula guida.

Abstract

L'impatto del microbiota intestinale e dei suoi metaboliti sulla fisiologia e sul comportamento dell'ospite è stato ampiamente studiato in questo decennio. Numerosi studi hanno rivelato che i metaboliti derivati dal microbiota intestinale modulano le funzioni fisiologiche mediate dal cervello attraverso intricati percorsi intestino-cervello nell'ospite. Gli acidi grassi a catena corta (SCFA) sono i principali metaboliti derivati dai batteri prodotti durante la fermentazione delle fibre alimentari dal microbioma intestinale. Gli SCFA secreti dall'intestino possono agire in più siti nella periferia, influenzando le risposte immunitarie, endocrine e neurali a causa della vasta distribuzione dei recettori SCFA. Pertanto, è difficile differenziare gli effetti centrali e periferici degli SCFA attraverso la somministrazione orale e intraperitoneale di SCFA. Questo articolo presenta un metodo basato su video per interrogare il ruolo funzionale degli SCFA nel cervello tramite una cannula guida in topi che si muovono liberamente. La quantità e il tipo di SCFA nel cervello possono essere regolati controllando il volume e la velocità di infusione. Questo metodo può fornire agli scienziati un modo per apprezzare il ruolo dei metaboliti derivati dall'intestino nel cervello.

Introduction

Il tratto gastrointestinale umano ospita diversi microrganismi che colpiscono l'ospite 1,2,3. Questi batteri intestinali possono secernere metaboliti derivati dall'intestino durante il loro utilizzo di componenti dietetici consumati dall'ospite 4,5. È interessante notare che i metaboliti intestinali non metabolizzati nella periferia possono essere trasportati ad altri organi attraverso la circolazione6. Da notare, questi metaboliti secreti possono servire come mediatori per l'asse intestino-cervello, definito come la comunicazione bidirezionale tra il sistema nervoso centrale e l'intestino7. Studi precedenti hanno dimostrato che i metaboliti derivati dall'intestino possono modulare il comportamento complesso e le emozioni negli animali 8,9,10,11.

Gli acidi grassi a catena corta (SCFA) sono i principali metaboliti prodotti dal microbiota intestinale durante la fermentazione della fibra alimentare e dei carboidrati indigeribili6. Acetato, propionato e butirrato sono gli SCFA più abbondanti nell'intestino12. Gli SCFA servono come fonte di energia per le cellule del tratto gastrointestinale. Gli SCFA non metabolizzati nell'intestino possono essere trasportati al cervello attraverso la vena porta, modulando così il cervello e il comportamento 6,12. Studi precedenti hanno suggerito che gli SCFA potrebbero svolgere un ruolo critico nei disturbi neuropsichiatrici 6,12. Ad esempio, l'iniezione intraperitoneale di butirrato nei topi BTBR T + Itpr3tf / J (BTBR), un modello animale di disturbo dello spettro autistico (ASD), ha salvato i loro deficit sociali13. I ratti trattati con antibiotici che ricevevano microbiota da soggetti depressivi hanno mostrato un aumento dei comportamenti ansiosi e degli SCFA fecali14. Clinicamente, sono state osservate alterazioni dei livelli di SCFA fecale nelle persone con ASD rispetto ai controlli tipicamente in via di sviluppo15,16. Le persone con depressione hanno livelli di SCFA fecali più bassi rispetto ai soggetti sani17,18. Questi studi hanno suggerito che gli SCFA possono alterare il comportamento negli animali e negli esseri umani attraverso vari percorsi.

I metaboliti microbici esercitano diversi effetti su più siti nel corpo, influenzando la fisiologia e i comportamenti dell'ospite 4,19, tra cui il tratto gastrointestinale, il nervo vago e il nervo simpatico. È difficile individuare il ruolo preciso dei metaboliti derivati dall'intestino nel cervello quando si somministrano i metaboliti per vie periferiche. Questo articolo presenta un protocollo basato su video per studiare gli effetti dei metaboliti derivati dall'intestino nel cervello di un topo che si muove liberamente (Figura 1). Abbiamo dimostrato che gli SCFA potrebbero essere somministrati acutamente attraverso la cannula guida durante i test comportamentali. Il tipo, il volume e la velocità di infusione dei metaboliti possono essere modificati a seconda dello scopo. Il sito di incannulizzazione può essere regolato per esplorare l'impatto dei metaboliti intestinali in una specifica regione del cervello. Miriamo a fornire agli scienziati un metodo per esplorare il potenziale impatto dei metaboliti microbici derivati dall'intestino sul cervello e sul comportamento.

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Protocol

Tutti i protocolli sperimentali e la cura degli animali sono stati approvati dal National Cheng Kung University (NCKU) Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Preparazione per l'animale da esperimento

  1. Ottieni topi maschi selvatici C57BL / 6JNarl di 6-8 settimane da un fornitore.
  2. Ospitare i topi in una gabbia per topi standard con mouse chow standard e acqua sterilizzata ad libitum.
    NOTA: Le condizioni di alloggio per il Laboratory Animal Center di NCKU sono 22 ± 1 ° C di temperatura, 55% ± 10% di umidità e un ciclo di luce / buio di 13 ore / 11 ore.

2. Chirurgia stereotassica

  1. Preparare e sterilizzare lo strumento stereotassico, gli strumenti chirurgici e gli oggetti correlati.
    NOTA: Tutti gli articoli che entreranno direttamente in contatto con il sito chirurgico devono essere sterilizzati per evitare l'infezione.
  2. Anestetizzare il topo mettendolo nella gabbia di plexiglas con isoflurano all'1%-5% in ossigeno.
    NOTA: Osservare attentamente il mouse per assicurarsi che la frequenza respiratoria sia mantenuta a circa un respiro al secondo.
  3. Togliere il mouse dalla camera di anestesia. Rasare il sito chirurgico (testa di topo) con un trimmer per animali domestici. Posizionare il mouse sul telaio stereotassico fissando gli incisivi del mouse sulla barra incisiva nel supporto dell'incisivo stereotassico. Coprire il naso con la maschera nasale.
  4. Anestetizzare il topo con isoflurano all'1% -2,5% in ossigeno durante l'intervento chirurgico stereotassico. Valutare la nocicezione del topo attraverso il riflesso del pizzicamento della punta e garantire una frequenza respiratoria costante prima di incidere il sito chirurgico.
  5. Posizionare una piastra riscaldante (37,0 °C) sotto il mouse sul telaio stereotassico per mantenere la temperatura corporea durante l'intervento chirurgico. In alternativa, mantenere la temperatura interna con l'aiuto di una sonda termica rettale che collega il riscaldatore programmato e il termoforo.
  6. Rimuovere la pelliccia tagliata sulla testa usando del nastro adesivo. Iniettare nel topo Ketoprofene analgesico (5 mg/kg) per via sottocutanea per alleviare il dolore. Applicare unguento per gli occhi per evitare secchezza oculare.
  7. Inserire la barra auricolare appuntita nel condotto uditivo per fissare la testa.
  8. Centrare la testa regolando la scala della barra auricolare.
  9. Stringere il morsetto del naso sul supporto dell'incisivo per evitare movimenti verticali. Premere delicatamente la testa per verificare che la testa sia fissa ed evitare che la testa si allenti durante l'intervento chirurgico successivo.
  10. Disinfettare il cuoio capelluto con tre scrub alternati di clorexidina usando un batuffolo di cotone. Inizia ogni scrub dal centro verso il lato esterno (dall'area centrale più disinfettata all'area meno disinfettata).
    NOTA: L'uso di scrub dal centro verso l'esterno potrebbe aiutare gli scienziati a ridurre al minimo l'infezione e la contaminazione dalla pelliccia. L'area esterna è vicina alla regione della testa non rasata, che ha ancora una grande quantità di pelliccia e non è facile da disinfettare a fondo.
  11. Incidere il cuoio capelluto in modo anteriore/posteriore (<1 cm) utilizzando una lama chirurgica. Aprire l'incisione e pulire il cranio con un batuffolo di cotone tenuto da una pinza microdissecante.
    NOTA: La pinza microdissecante, la lama chirurgica e i tamponi di cotone devono essere sterilizzati in autoclave prima dell'intervento chirurgico. Durante il processo chirurgico, sterilizzare tutte le attrezzature chirurgiche utilizzando uno sterilizzatore a perline di vetro (150 °C) per almeno 5 secondi prima e dopo ogni animale. Preparare un becher sterilizzato per contenere la lama chirurgica e la pinza durante il processo chirurgico e tra gli animali.
  12. Identifica il Bregma e la Lambda sul cranio. Utilizzare il Bregma come riferimento per individuare la regione di interesse.
    1. Facoltativo: montare il trapano stereotassico sul supporto del trapano stereotassico e utilizzare la punta del trapano per puntare Bregma come riferimento. Sterilizzare il trapano stereotassico utilizzando lo sterilizzatore a perline di vetro (150 °C) per almeno 5 s.
  13. Calibrare e allineare il piano orizzontale del cranio piatto nei piani sinistro/destro e anteriore/posteriore di Bregma/Lambda.
    NOTA: se non su un piano orizzontale corretto, rimontare il mouse sullo strumento stereotassico.

3. Impianto di cannule guida personalizzata commerciale

  1. Identificare ed etichettare la posizione del ventricolo laterale destro, in base alle coordinate stereotassiche: Distanza da Bregma, anteriore/posteriore (A/P): 0,26 mm, mediale/laterale (M/L): -1,0 mm, dorsale/ventrale (D/V): -2,0 mm20.
    NOTA: Le coordinate possono essere modificate in base alla regione di interesse. Le coordinate per il ventricolo laterale erano basate su topi adulti C57BL / 6J con un intervallo di peso di 26-30 g. Se vengono utilizzati topi più giovani, fare riferimento alla discussione.
  2. Praticare un foro (diametro = 1,5 mm) attraverso il cranio nel sito etichettato utilizzando un trapano stereotassico per l'impianto di una cannula guida commerciale.
  3. Praticare da due a quattro fori in più (diametro = 1,5 mm) sul cranio utilizzando un trapano stereotassico per il montaggio di viti in acciaio inossidabile.
    NOTA: Sterilizzare il trapano stereotassico utilizzando uno sterilizzatore a perline di vetro (150 °C) per almeno 5 secondi prima e dopo ogni animale.
  4. Pulire gli scarti ossei e smettere di sanguinare con un batuffolo di cotone.
  5. Pulire il cranio con Lidocaina (1 mg/kg) usando un batuffolo di cotone per effetti anestetici locali, antipruriginosi e antidolorifici. Se il sanguinamento non si ferma dopo la perforazione, posizionare delicatamente un batuffolo di cotone sul foro per l'emostasi.
  6. Montare da due a quattro viti in acciaio inossidabile sui fori per fornire ancoraggi per acrilico dentale.
  7. Posizionare la cannula guida commerciale sul supporto della cannula stereotassica e disinfettare con lo sterilizzatore a perline di vetro (150 °C).
    NOTA: La cannula guida commerciale, il manichino commerciale e l'iniettore commerciale (Figura 2A) sono stati personalizzati con le specifiche mostrate nella tabella dei materiali.
  8. Spostare il supporto della cannula stereotassica sul foro praticato per il ventricolo laterale e inserire lentamente la cannula di guida commerciale nel foro fino alla profondità desiderata (2,5 mm).
    NOTA: La coordinata dorsale/ventrale può essere definita impostando la punta della cannula di guida commerciale come riferimento quando la punta è appena inserita nel foro.
  9. Applicare 10 μL di adesivo n-butile cianoacrilato (colla adesiva per tessuti) per fissare la cannula guida commerciale nel foro praticato e attendere 3-4 minuti. Rilasciare delicatamente la cannula guida commerciale dal supporto della cannula stereotassica e allontanare il supporto.
  10. Applicare l'acrilico dentale sul cuoio capelluto inciso per fissare la cannula della guida commerciale e attendere almeno 5 minuti. Impiantare il manichino commerciale nella cannula guida commerciale per evitare l'intasamento della cannula da parte del sangue o del fluido corporeo (Figura 2B).
  11. Rilasciare la barra auricolare dal condotto uditivo e rimuovere il mouse dal telaio stereotassico.
  12. Posizionare il topo in una nuova gabbia con una piastra riscaldante sotto per il recupero dall'anestesia e osservare continuamente fino a quando il topo non si risveglia completamente.
    NOTA: Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la recumenza sternale. Un animale che ha subito un intervento chirurgico non dovrebbe tornare in compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ripreso.
  13. Riportare il mouse in alloggiamento singolo o di gruppo, a seconda del protocollo IACUC istituzionale e del disegno sperimentale. Per gli alloggi di gruppo, assicurarsi che meno topi siano alloggiati in una gabbia per ridurre al minimo le lesioni indesiderate o il distacco della cannula.
  14. Somministrare ibuprofene (0,2 mg/ml) nell'acqua potabile per almeno 3 giorni per le cure postoperatorie e monitorare due volte al giorno i segni di dolore e angoscia per almeno 3 giorni.
    1. Durante la cura postoperatoria, applicare l'unguento alla roxitromicina sulla pelle per prevenire l'infiammazione e l'infezione nei topi.
    2. Continuare a monitorare lo stato dell'animale e somministrare un'iniezione intraperitoneale tempestiva di glucosio al 5% e/o cloruro di sodio allo 0,9% per fornire energia sufficiente.
    3. Se lo stato di dolore, angoscia o infezione si deteriora costantemente, eutanasia il topo per inalazione di CO2 .
  15. Attendere 1 settimana dopo l'operazione affinché il topo sia pronto per la consegna intracerebroventricolare di SCFA e test comportamentali.

4. Preparazione degli SCFA

  1. Sciogliere l'acetato di sodio, il butirrato di sodio e il propionato di sodio nel liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) (vedere la tabella dei materiali).
  2. Assicurarsi che le sostanze chimiche siano completamente sciolte, quindi regolare il pH a 7,4 e filtrare la miscela SCFA attraverso un filtro da 0,22 μm per la sterilizzazione.

5. Impostare il sistema di infusione per la somministrazione intracerebroventricolare di SCFA durante i test comportamentali

  1. Montare una telecamera a soffitto per registrare il comportamento. Collegare la fotocamera a un computer per controllare il software di registrazione video (Figura 3).
  2. Riempire una siringa da 10 μL con acqua distillata.
    NOTA: Evitare bolle d'aria nella siringa da microlitri.
  3. Collegare una pompa di microiniezione con il controller di microiniezione.
  4. Montare la siringa da microlitro sulla pompa di microiniezione. Per installare la siringa, premere il pulsante per allentare il morsetto e installare la siringa nella posizione corrispondente. Chiudere il morsetto e serrare la vite di ritenuta dello stantuffo sulla pompa di microiniezione (Figura 4A).
  5. Inserire l'iniettore commerciale nel tubo di polietilene (Figura 2A).
  6. Appendere il tubo di polietilene alla telecamera a soffitto sopra l'arena di prova.
  7. Riempire il tubo di polietilene con acqua distillata utilizzando una siringa da insulina. Collegare la siringa da microlitri al tubo di polietilene sospeso.
    NOTA: Assicurarsi che il tubo in polietilene sia abbastanza lungo da consentire al mouse di muoversi liberamente in tutta l'arena di prova.

6. Impostazioni di sistema del controller di microiniezione

  1. Accendere il controller di microiniezione e premere Display All Channels (Visualizza tutti i canali) per accedere alla schermata di comando (Figura 4C). Premere Configurazione e impostare Volume Target su 9.800 nL con Delivery Rate su 100 nL/s. Infondere 9.800 nL di acqua distillata dal tubo di polietilene collegato alla siringa da microlitri (premere Direzione per passare alla modalità Infusione e premere RUN) (vedere quadrati rossi nella schermata di comando della Figura 4C).
  2. Premere Configurazione e impostare Volume Target su 3.000 nL con Delivery Rate su 100 nL/s. Prelevare 3.000 nL di olio minerale (premere Direzione per passare alla modalità Prelievo e premere ESEGUI) (vedere i quadrati rossi nella schermata di comando della Figura 4C).
    NOTA: Sul tubo di polietilene deve essere osservata una netta separazione di fase olio-acqua.
  3. Smontare il tubo di polietilene dall'ago della siringa da microlitri. Sputare 3.000 nL di acqua distillata dall'ago della siringa da microlitri (premere Direzione per passare alla modalità Infusione e premere RUN).
  4. Inserire nuovamente la siringa da microlitro nel tubo di polietilene. Premere Configurazione e impostare Volume Target su 9.500 nL con Delivery Rate su 100 nL/s. Prelevare 9.500 nL di SCFA (premere Direzione per passare alla modalità di prelievo e premere RUN). Etichettare la fase degli SCFA dell'olio per verificare se gli SCFA sono stati infusi correttamente.
  5. Premere Configuration e impostare il Volume Target desiderato con Delivery Rate su 7 nL/s. Premere Direzione per passare alla modalità Infuse (vedere i quadrati rossi nella schermata di comando della Figura 4C).
    NOTA: Determinare il volume in base al tempo di infusione. Ad esempio, se il tempo di infusione è di 3 minuti per la velocità di erogazione di 7 nL/s, volume target = 1.260 nL.
  6. Premere RUN per infondere la siringa da microlitro in avanti fino a quando il liquido esce all'estremità anteriore dell'iniettore commerciale prima di inserire l'iniettore nella cannula per l'iniezione di SCFA.

7. Infusione di SCFA nel ventricolo laterale attraverso la cannula guida commerciale nel topo che si muove liberamente

  1. Anestetizzare il topo mettendolo nella gabbia di plexiglas con isoflurano all'1%-5% in ossigeno.
    NOTA: Osservare attentamente il mouse per assicurarsi che la frequenza respiratoria sia mantenuta a circa un respiro al secondo.
  2. Collottola e inserire l'iniettore commerciale nella cannula guida commerciale (Figura 4B).
    NOTA: Se la cannula della guida commerciale è ostruita dal sangue o dal fluido corporeo, aprirla delicatamente con una pinzetta.
  3. Consentire al topo di riprendersi dall'anestesia per 15 minuti in una gabbia prima del test comportamentale.
  4. Per il test di locomozione di base, posizionare il topo in una nuova gabbia e lasciarlo esplorare liberamente per 35 minuti. Infondere SCFA utilizzando una velocità di consegna di 7 nL/s per un volume target di 2.100 nL nei primi 5 minuti (premere Direzione per la modalità di infusione e premere RUN).
    NOTA: La locomozione nella nuova gabbia può essere analizzata utilizzando il software di tracciamento video del comportamento animale21,22.
  5. Anestetizzare il mouse (ripetendo il passaggio 7.1) e rimuovere l'iniettore commerciale dalla cannula della guida commerciale.
    NOTA: Il topo può essere iniettato ripetutamente con diversi controlli/metaboliti dopo aver dato il tempo appropriato per lavare l'iniezione precedente. Finché la cannula è fissata sulla testa del topo, il topo può essere ripetutamente testato con diversi metaboliti.

8. Ripristino del sistema di microiniezione

  1. Smontare il tubo di polietilene dalla siringa da microlitri.
  2. Iniettare aria nel tubo usando la siringa da insulina per eliminare l'acqua distillata nel tubo di polietilene. Svuotare la siringa da microlitri.
  3. Premere Reset Pos nella schermata Configuration (Configurazione per aprire la schermata Syringe Stop Definition ) (Figura 4C).
  4. Premere Ritira fino a quando non si verifica un segnale acustico per ripristinare la pompa di microiniezione nella posizione completamente ritirata (Figura 4C).
  5. Tornare alla schermata di comando e spegnere il controller di microiniezione se è presente un segno ** END REACH** su questa schermata (Figura 4C).

9. Facoltativo: Validazione dell'iniezione intracerebroventricolare mediante tracciante neurale

  1. Infondere 2.100 nL del tracciante neurale con la velocità di erogazione di 7 nL/s per verificare il sito di infusione.
    NOTA: Lasciare l'iniettore nella cannula guida per 5 minuti per evitare il riflusso.
  2. Anestetizzare il topo con un sovradosaggio di isoflurano (5%) 30 minuti dopo l'infusione del tracciante neurale.
  3. Controllare la frequenza respiratoria e il riflesso di pizzicamento coda/zampa nel mouse anestetizzato.
    NOTA: i mouse devono non rispondere prima del passaggio successivo.
  4. Fai un'incisione di 4-5 cm attraverso la pelle, i muscoli e la parete addominale sotto la gabbia toracica.
  5. Allontanare leggermente il fegato dal diaframma con attenzione.
  6. Incidi il diaframma per esporre il cuore del mouse.
  7. Perfondere il topo attraverso il cuore con soluzione salina tamponata fosfato (PBS) e paraformaldeide ghiacciata al 4% in PBS.
  8. Decapitare il topo e sezionare attentamente il cervello con una pinza microdissecante e forbici microdissecanti per eliminare l'intero cervello23. Posizionare i campioni di cervello in paraformaldeide ghiacciata al 4% in PBS per 3-4 giorni e lavarli 3 x 5 minuti con PBS.
  9. Tagliare il cervello in due parti nel supporto della fetta di cervello del topo all'ottavo taglio del supporto della fetta di cervello del topo (1 mm / sezione) dalla direzione anteriore a quella posteriore. Posizionare il cervello nello stampo incorporato e incorporare i campioni di cervello nell'agarosio a basso punto di fusione (4% in PBS).
  10. Incolla il cervello incorporato nell'agarosio sul palco del vibratomo usando la supercolla. Sezionare il cervello coronalmente in fette cerebrali da 50 μm usando il vibratomo.
  11. Incubare le fette di cervello nell'anticorpo che prende di mira il tracciante neurale diluito nel tampone bloccante (diluizione 1:1.000) durante la notte a temperatura ambiente.
    NOTA: il tampone bloccante conteneva il 10% di siero di cavallo, lo 0,1% di Triton X-100 e lo 0,02% di azoturo di sodio.
  12. Lavare le fette 3 x 5 minuti con PBST (PBS con 0,1% triton X-100).
  13. Incubare le fette di cervello in anticorpi secondari coniugati con colorante fluorescenza diluiti in tampone bloccante (diluizione 1:500) per 2 ore a temperatura ambiente.
  14. Lavare le fette 3 x 5 minuti con PBS.
  15. Montare le fette di cervello sul vetrino con un supporto di montaggio contenente 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI).
  16. Coprire il vetrino con un coprivetrino del microscopio.
  17. Applicare lo smalto sul bordo della slitta per evitare perdite del mezzo di montaggio.
  18. Dopo l'incubazione notturna a temperatura ambiente, al riparo dalla luce, visualizzare il segnale di fluorescenza nel sito di infusione utilizzando un microscopio a fluorescenza.

10. Facoltativo: infusione di metaboliti attraverso una cannula guida personalizzata in acciaio inossidabile nel ventricolo laterale nei topi

  1. Seguire le sezioni 1-8 del protocollo e sostituire la cannula di guida commerciale con una cannula di guida in acciaio inossidabile per infondere sostanze chimiche attraverso un iniettore in acciaio inossidabile nel mouse.
    NOTA: I pro e i contro delle diverse cannule commerciali e in acciaio inossidabile sono elaborati nella sezione di discussione.
  2. Eseguire il protocollo chirurgico nello stesso modo descritto nelle sezioni 2 e 3 del protocollo, tranne che ricordarsi di sostituire la cannula guida commerciale con una cannula di guida in acciaio inossidabile (Figura 5B).
    NOTA: La cannula di guida in acciaio inossidabile, il manichino in acciaio inossidabile e l'iniettore in acciaio inossidabile (Figura 5A) sono stati personalizzati con le specifiche mostrate nella tabella dei materiali. Inserire la cannula di guida personalizzata in acciaio inox nel foro fino alla profondità desiderata (2,0 mm).
  3. Infondere gli SCFA tramite la cannula di guida in acciaio inossidabile utilizzando il sistema di microiniezione costituito dal controller di microiniezione e dalla pompa di microiniezione (Figura 4B) (come le sezioni 4-7 del protocollo). Per il manichino in acciaio inossidabile della cannula di guida in acciaio inossidabile, piegare delicatamente un lato dell'iniettore in acciaio inossidabile fino a quando la punta dell'altro lato è 1 mm più lunga della cannula di guida in acciaio inossidabile.
  4. Infondere 2.100 nL del tracciante neurale attraverso la cannula guida in acciaio inossidabile nel ventricolo laterale nei topi (come nella sezione 9 del protocollo).
  5. Raccogliere il campione per 30 minuti dopo l'infusione del tracciante neurale (come nella sezione 9 del protocollo).
  6. Eseguire l'acquisizione di immagini nelle fette di cervello infuse con tracciante neurale (come la sezione 9 del protocollo).

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Representative Results

Il topo è stato infuso con SCFA 1 settimana dopo il recupero dall'impianto della cannula guida per valutare l'attività locomotoria in una nuova gabbia. Il topo è stato posto in una nuova gabbia e infuso con 2.100 nL di SCFA o ACSF nei primi 5 minuti (velocità di consegna di 7 nL / s) nel cervello attraverso la cannula guida commerciale impiantata nel ventricolo laterale del cervello. L'attività locomotoria in una nuova gabbia è stata registrata per altri 30 minuti dopo l'infusione. Nessuna differenza è stata osservata nell'attività locomotoria nella nuova gabbia tra infusione di SCFA e ACSF (Figura 6) (n = 2 topi per gruppo; i dati sono mostrati come media ± s.e.m. e analizzati da ANOVA a due vie).

Per convalidare l'accuratezza dell'impianto della cannula guida nelle regioni del cervello, un tracciante neurale fluorescente è stato infuso nei topi attraverso la cannula guida allo stesso volume e velocità di consegna degli SCFA (2.100 nL in 5 min; 7 nL / s). I cervelli sono stati raccolti per l'istologia 30 minuti dopo. Il colorante fluorescente è stato rilevato nel ventricolo laterale e nelle regioni circostanti del cervello del topo (Figura 7A). Una cannula di guida in acciaio inossidabile è stata impiantata nel ventricolo laterale del cervello per l'infusione di tracciante neurale nelle stesse condizioni. Analogamente alla cannula guida, i risultati hanno mostrato che un segnale di colorante fluorescente è stato rilevato nel ventricolo laterale e nelle regioni circostanti del cervello del topo anche dopo l'infusione attraverso la cannula di guida in acciaio inossidabile (Figura 7B).

Figure 1
Figura 1: La procedura per l'infusione intracerebroventricolare in topi che si muovono liberamente. Il diagramma di flusso per la consegna intracerebroventricolare di metaboliti microbici derivati dall'intestino in topi che si muovono liberamente. Abbreviazione: SCFAs = acidi grassi a catena corta. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Impianto della cannula guida commerciale nei topi. (A) L'immagine rappresentativa della cannula guida commerciale, del manichino e dell'iniettore. (B) L'immagine rappresentativa della cannula guida commerciale e del manichino impiantati nel cervello dei topi mediante fissazione con acrilico dentale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Il rig di infusione intracerebroventricolare per i test comportamentali. Lo schema del sistema di microiniezione, del sistema di registrazione video e dell'apparato comportamentale. Abbreviazione: SCFAs = acidi grassi a catena corta. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Il sistema di microiniezione. (A) L'installazione della siringa da microlitro utilizzando una pompa di microiniezione. (B) L'inserimento dell'iniettore commerciale collegato con tubo di polietilene nella cannula di guida commerciale (C) Il touch screen del controller di microiniezione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Impianto di cannula guida in acciaio inossidabile nel ventricolo laterale dei topi. (A) L'immagine rappresentativa della cannula di guida, del manichino e dell'iniettore in acciaio inossidabile. (B) L'immagine rappresentativa della cannula di guida e del manichino in acciaio inossidabile impiantati nel cervello dei topi mediante fissazione con acrilico dentale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Attività locomotoria di topi infusi con SCFA nella nuova gabbia. (A) Schema cronologico dell'impianto della cannula guida e della nuova locomozione della gabbia dopo infusione di ACSF o SCFA. (B) Schema temporale per il posizionamento della siringa per infusione, finestra di infusione (ombra blu) e nuovo test di comportamento della gabbia. (C) Distanza totale percorsa da topi infusi con ACSF e SCFA in una nuova gabbia per 35 minuti. La finestra temporale per l'infusione è indicata con ombra blu (0-5 min). (D) Immagini rappresentative di traiettorie per topi infusi con ACSF e SCFA in una nuova gabbia. n = 2 topi per gruppo. Dati mostrati come media ± s.e.m. e analizzati da ANOVA bidirezionale. NS: Non significativo. Abbreviazioni: SCFAs = acidi grassi a catena corta; ACSF = liquido cerebrospinale artificiale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 7
Figura 7: L'istologia del colorante fluorescente infuso nel cervello. Infusione attraverso la cannula di guida commerciale personalizzata (A) e (B) in acciaio inossidabile impiantata nel ventricolo laterale (LV) dei topi. Barre della scala = 1 mm (sinistra) e 500 μm (destra). Blu: colorazione DAPI; Verde: etichettatura anti-fluorescente oro. Abbreviazioni: LV = ventricolo laterale; AC = commissura anteriore; CPu = putamen caudato; LS = setto laterale; SM = setto mediale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

I metaboliti derivati dall'intestino sono stati associati a malattie mediate dal cervello senza un meccanismo molto preciso, in parte a causa dei loro molteplici siti di legame nel corpo 6,12,24. Rapporti precedenti hanno indicato che gli SCFA potrebbero servire come ligandi per i recettori accoppiati alle proteine G, regolatori epigenetici e fonti per la produzione di energia in più siti nel corpo 6,12. Per bypassare i fattori confondenti che provengono dalla periferia (come le cellule immunitarie, gli ormoni e il sistema nervoso autonomo), è stato sviluppato un metodo adottando l'iniezione intracerebroventricolare di SCFA nel cervello attraverso una cannula guida nei topi che si muovono liberamente. Inoltre, i siti di incannulizzazione e infusione sono stati convalidati per esplorare le aree cerebrali potenzialmente colpite dagli SCFA. Nel complesso, questo documento presenta un metodo preciso, meticoloso e convalidato per fornire metaboliti derivati dall'intestino nel cervello per la ricerca sull'asse intestino-cervello.

La somministrazione intracerebroventricolare di farmaci e sostanze chimiche attraverso una cannula guida negli animali è stata ben stabilita 25,26,27,28,29 per vari test antidroga 29, modelli di malattia 26,28 e progettazione specifica di test comportamentali 27 . Ancora più importante, diversi studi hanno consegnato metaboliti microbici intestinali nel cervello attraverso l'iniezione intracerebroventricolare e testato i loro effetti sulle funzioni fisiologiche30,31,32,33. Questo protocollo fornisce un attributo aggiuntivo nella somministrazione di metaboliti intestinali in modo acuto al cervello in tempo reale, che consentirebbe agli scienziati di comprendere gli effetti dinamici dei metaboliti intestinali sul cervello e sul comportamento.

La velocità di consegna per l'infusione del metabolita è fondamentale per simulare il flusso di liquido cerebrospinale nei ventricoli cerebrali. Uno studio ha indicato che il tasso di produzione di liquido cerebrospinale nei topi è 5,3 nL / s34. Per controllare la portata degli SCFA naturalmente nei topi che si muovono liberamente, abbiamo valutato la portata per questo sistema di microiniezione (Figura 3 e Figura 4). Gli SCFA potevano essere infusi senza troppa resistenza anche quando il tubo di polietilene lungo 350 cm veniva utilizzato per infondere SCFA in un mouse che si muoveva liberamente. Con il riempimento di acqua distillata e olio minerale per diminuire la resistenza ai liquidi nel tubo di polietilene (vedere le sezioni 5 e 6 del protocollo), la portata potrebbe essere abbassata a 7 nL / s da 100 nL / s. L'infusione di SCFA o ACSF a una velocità di flusso di 7 nL / s non ha provocato alcun comportamento anomalo dei topi.

La quantità e il dosaggio dei metaboliti derivati dall'intestino per l'iniezione intracerebroventricolare sono critici. Rimane difficile analizzare in modo completo i livelli assoluti di metaboliti derivati dall'intestino in varie regioni del cervello. Ad esempio, pochissimi studi hanno dimostrato la rilevazione dei livelli fisiologici di SCFA nel cervello35,36. Uno studio ha dimostrato che le concentrazioni di acetato, propionato e butirrato nel cervello dei topi sono circa 1640,6-3281,2 μg / g, 288,18-384,24 μg / g e 44,036-66,054 μg / g, rispettivamente36. Tuttavia, un altro studio ha riportato livelli più bassi di SCFA nel cervello (acetato 128,1 μg / g, propionato 0,3883 μg / g e butirrato 0,1640 μg / g) 35. Le quantità di acetato, propionato e butirrato infusi adottate in questo protocollo erano rispettivamente 5,81385 μg/g, 4,62378 μg/g e 2,6124 μg/g. Pertanto, le concentrazioni degli SCFA infusi in questo protocollo sono paragonabili alle concentrazioni fisiologiche. Tuttavia, non abbiamo potuto escludere la possibilità che le concentrazioni di SCFA possano variare in regioni cerebrali distinte. Diversi studi hanno dimostrato che la somministrazione di propionato nel ventricolo cerebrale mediante iniezione intracerebroventricolare (4 μL di acido propionico 0,26 M in 1 minuto; circa 249,756 μg/g) ha alterato il comportamento sociale e la cognizione nei ratti30,31. Il dosaggio e la portata del propionato infuso erano relativamente alti, come riportato nei topi35 e nei ratti37. Pertanto, i progressi nell'analisi dei metaboliti e nella profilazione metabolomica nel cervello e nella periferia aiuteranno i ricercatori a comprendere meglio i cambiamenti dinamici spaziali e temporali nei metaboliti derivati dall'intestino.

Due tipi di cannule guida sono stati presentati in questo protocollo per l'iniezione intracerebroventricolare nei topi: una cannula guida commerciale e una cannula guida in acciaio inossidabile. La cannula e il manichino di guida commerciale sono ben progettati per l'impianto. Non è facile per i topi rimuovere il manichino personalizzato a causa del cappuccio. Al contrario, il manichino in acciaio inossidabile può essere facilmente rimosso dalla cannula di guida in acciaio inossidabile dai topi durante il recupero di 1 settimana, causando la coagulazione del sangue / liquido cerebrospinale nella cannula. Tuttavia, la cannula personalizzata commerciale è di 64 mg e il manichino per questa cannula è di 86 mg. Pertanto, il peso totale della cannula e del manichino personalizzati commerciali è di 150 mg. Al contrario, la cannula di guida personalizzata in acciaio inossidabile è di 18,3 mg e il manichino per questa cannula è di 8,5 mg. Pertanto, il peso totale della cannula di guida personalizzata in acciaio inossidabile è di 26,8 mg. In teoria, il peso ridotto del set di cannule di guida in acciaio inossidabile ridurrebbe al minimo l'impatto della cannula sul movimento dell'animale e sul cervello. Inoltre, il costo della cannula di guida commerciale è superiore alla cannula di guida e all'iniettore in acciaio inossidabile. Quindi, raccomandiamo la cannula di guida in acciaio inossidabile per i ricercatori inesperti che eseguono interventi chirurgici stereotassici nei topi.

La cannula impiantata può essere ostruita dal sangue e dal liquido cerebrospinale a causa di danni cerebrali. Questo intasamento della cannula potrebbe verificarsi più frequentemente nella cannula in acciaio inossidabile sopra la cannula commerciale. Il manichino può essere filettato per stringere saldamente la cannula commerciale (Figura 2A) ma non per la cannula in acciaio inossidabile (Figura 5A). Pertanto, garantire l'attacco del manichino durante il periodo di recupero ridurrebbe al minimo l'intasamento della cannula. Un nuovo manichino deve essere inserito se si verifica il distacco durante il recupero di 1 settimana. Inoltre, un iniettore sterilizzato monouso deve essere inserito più volte per sbloccare la cannula prima di montare l'iniettore che collega il tubo in polietilene.

La scelta dei farmaci anestetici influenzerà notevolmente la chirurgia e i test comportamentali. Qui, l'isoflurano anestetico per inalazione è stato scelto rispetto agli anestetici iniettati perché il tempo di recupero è più breve ed è meno dannoso per gli animali per ragioni umane. Tuttavia, il dosaggio per l'inalazione di isoflurano può essere variato a seconda dello stato e del peso corporeo del topo. Pertanto, lo stato dell'anestesia deve essere osservato attentamente durante l'intera procedura chirurgica e il vaporizzatore isoflurano regolato di conseguenza. La frequenza respiratoria ottimizzata dovrebbe essere di un respiro al secondo durante tutte le procedure. Inoltre, il contenitore del filtro del gas riempito con carbone attivo deve essere collegato alla camera di anestesia e alla maschera del naso per annullare l'isoflurano e l'inquinamento dei gas di scarico nell'area operativa. Ciò proteggerà il chirurgo dall'effetto tossico dell'isoflurano.

I risultati rappresentativi hanno dimostrato che l'infusione di SCFA non ha prodotto alcun effetto drammatico sulla locomozione in una nuova gabbia. Ciò potrebbe essere dovuto al fatto che un piccolo numero di animali è stato utilizzato per ottenere questo risultato (Figura 6). Inoltre, abbiamo infuso gli SCFA solo per i primi 5 minuti del nuovo test di comportamento della locomozione in gabbia, ma non l'intero test perché la maggior parte del comportamento è stata testata entro una breve finestra temporale (5-15 minuti). La finestra temporale per i metaboliti microbici derivati dall'intestino deve essere regolata in base all'ipotesi dei ricercatori.

Il tempo per l'anestesia e il recupero della coscienza dall'anestesia sono fondamentali per i test comportamentali. Qui, i topi sono stati anestetizzati brevemente per l'impianto dell'iniettore e l'infusione di SCFA, e il test comportamentale è stato eseguito dopo 15 minuti. Il tempo di recupero dopo la cessazione dell'anestesia per inalazione è stato determinato sulla base di uno studio precedente38. Uno studio pilota ha assicurato che i topi fossero attivi, in movimento libero e non a disagio 15 minuti dopo l'anestesia. Abbiamo introdotto la fase di anestesia per il montaggio dell'iniettore per i seguenti motivi. Innanzitutto, il calibro dell'iniettore è 33 G; È molto impegnativo inserire un iniettore così delicato nella cannula quando l'animale si muove attivamente. Inoltre, il traslauso dei topi coscienti può produrre stress sui topi39, confondendo i risultati comportamentali. In secondo luogo, la cannula è occasionalmente ostruita a causa della coagulazione del sangue / liquido cerebrospinale. Sganciare delicatamente la cannula prima di montare l'iniettore sarebbe ideale per l'infusione di metaboliti. Sulla base di questi due motivi, si consiglia di anestetizzare brevemente i topi per il montaggio dell'iniettore. Gli investigatori possono aspettare più a lungo (30 minuti) se c'è qualche preoccupazione per il recupero dell'animale dall'anestesia per inalazione. Inoltre, è possibile impostare un set separato di iniettore di infusione che collega il tubo di polietilene per accelerare gli esperimenti.

Questo protocollo ha diverse limitazioni. In primo luogo, l'impianto della cannula guida e del tubo di polietilene di collegamento limiterebbe l'area chirurgica per l'impianto di fibre ottiche per la fotometria optogenetica e delle fibre nella stessa coordinata, nell'area circostante o persino nello stesso emisfero del cervello. Sarà ancora più difficile impiantare la lente per la microendoscopia sulla testa del topo insieme alla cannula guida impiantata. In secondo luogo, l'impianto della cannula guida può generare un peso significativo sulla testa del topo. Il peso totale di un set di cannule personalizzato è 26,8-150 mg, una vite è ~ 48 mg e l'acrilico dentale montato è 450-500 mg. L'intero set di installazione può limitare i movimenti dei mouse. Tuttavia, studi recenti hanno impiantato un miniscopio per monitorare i segnali di calcio in topi che si muovono liberamente40,41. Il peso del miniscopio varia da 1,6 g a 4,5 g, escluse le viti e l'acrilico dentale. Pertanto, il peso della cannula guida può essere considerato relativamente accettabile per i test di comportamento del topo. In terzo luogo, il tubo di collegamento in polietilene per l'infusione è lungo ~ 350 cm, il che può limitare il movimento dei topi durante il test di comportamento. Per affrontare questa preoccupazione, può essere necessario un test preliminare per la locomozione in un test in campo aperto per valutare l'impatto del tubo di collegamento in polietilene sulla funzione del motore del mouse. In quarto luogo, l'acrilico dentale può produrre un effetto neurotossico sui topi. Tuttavia, è necessario collegare la cannula di guida alla testa del mouse durante il periodo di prova. Per ridurre il potenziale effetto neurotossico dell'acrilico dentale sui topi, gli operatori devono avere familiarità con l'uso dell'acrilico dentale. L'acrilico dentale viene applicato meglio quando la miscela di acrile dentale (polvere e liquido) viene leggermente solidificata per ridurre la penetrazione del liquido acrilico dentale nel cervello.

Il microbiota e i loro metaboliti sono associati alla funzione comportamentale in fasi distinte dello sviluppo. Sebbene questo protocollo sia basato su topi adulti C57BL / 6 con pesi corporei compresi tra 26 g e 30 g, può essere applicato anche a topi di diverse età e dimensioni. Studi precedenti hanno adottato la chirurgia stereotassica nei topi giovani42,43,44,45. Tuttavia, le coordinate per le regioni del cervello possono variare a seconda delle dimensioni e dell'età dei topi. Si consiglia di fare riferimento all'atlante corrispondente all'età o alla risorsa online (http://mouse.brain-map.org/static/atlas). Inoltre, le coordinate devono essere validate iniettando blu tripano o colorante fluorescenza nei giovani topi di abbattimento, ottimizzando così il metodo prima di eseguirlo sui topi sperimentali. Le cannule guida utilizzate in questo protocollo sono tutte personalizzate e possono essere regolate dopo aver convalidato le coordinate per diverse dimensioni di mouse.

Questo protocollo sarà compatibile con la maggior parte dei test di comportamento dei roditori con un'arena aperta sulla parte superiore dell'apparato senza molte modifiche. I test di comportamento dei roditori possono essere condotti con un cablaggio del tubo di polietilene sulla parte superiore della testa del mouse senza alcun ostacolo, tra cui test in campo aperto, labirinto elevato più / zero, test step down, interazione sociale diretta, vocalizzazione ultrasonica per adulti, test di nuoto forzato, sospensione della coda, labirinto d'acqua, labirinto T o Y, riconoscimento di nuovi oggetti, seppellimento di marmo, test di auto-toelettatura, attraversamento del fascio, pole test ed esposizione allo stress da evitare l'acqua. I test che utilizzano camere o tubi chiusi dovranno essere modificati per consentire al tubo di polietilene di muoversi liberamente insieme ai topi, come test sociale a tre camere, scatola chiara-scura, condizionamento della paura, preferenza di saccarosio, stress di contenzione, test di startle e inibizione dell'impulso prepulso. Suggeriamo di pretestare e stimare la lunghezza necessaria per il tubo di polietilene sui topi di abbattimento prima del test.

I metaboliti microbici intestinali hanno dimostrato di influenzare i comportamenti dell'ospite 8,46,47,48,49. Gli scienziati possono adottare questo metodo per studiare direttamente gli effetti temporali e spaziali dei metaboliti derivati dal microbiota intestinale sul cervello e i comportamenti nei topi. Ad esempio, il metabolita microbico 4-etilfenilsolfato (4EPS) è aumentato nei modelli murini preclinici di ASD e nelle persone con ASD46,48,49. L'iniezione di 4EPS e la colonizzazione dei batteri che producono 4EPS hanno aumentato il comportamento ansioso e alterato la maturazione degli oligodendrociti nel nucleo paraventricolare del talamo (PVT) nei topi46,48. Sarebbe affascinante valutare l'effetto diretto di 4EPS sul PVT dei topi durante i test comportamentali di tipo ansioso. Tuttavia, la concentrazione assoluta di 4EPS nel PVT è ancora sconosciuta. Pertanto, un test dose-risposta potrebbe essere fondamentale per determinare i livelli adeguati di 4EPS nel PVT. Un concetto simile può essere adottato per gli effetti di altri metaboliti microbici sul cervello e sul comportamento.

Le neurotecnologie basate sui circuiti, come l'optogenetica, la chemiogenetica e l'imaging del calcio in vivo, sono metodi critici che consentono agli scienziati di comprendere il circuito neurale nel controllo del comportamento50,51,52. L'asse intestino-cervello è una connessione complicata critica per i microbi intestinali e i loro metaboliti per mediare il comportamento dell'ospite. Un numero crescente di studi ha impiegato neurotecnologie basate su circuiti per comprendere l'intrigante diafonia tra l'intestino e il cervello 33,53,54,55,56,57,58,59. Questo protocollo fornirà un modo alternativo per comprendere il controllo basato sulla regione cerebrale del comportamento causato dai metaboliti intestinali. La combinazione di questo protocollo con neurotecnologie basate su circuiti consentirà ai ricercatori di ottenere informazioni sul controllo basato sul circuito del comportamento e dell'attività cerebrale apportato dai metaboliti intestinali.

In conclusione, il concetto dell'asse intestino-cervello è ben accettato nella comunità scientifica e promuove la possibilità del coinvolgimento di metaboliti di derivazione intestinale nei disturbi neuropsichiatrici 11,13,60,61,62,63,64,65 . Per interrogarsi su come e quali metaboliti derivati dall'intestino influenzano il cervello e il comportamento dei topi, sarà necessaria una metodologia completa e fisiologica sul campo. Questo articolo fornisce un protocollo passo-passo per fornire metaboliti derivati dall'intestino nel cervello direttamente, soprattutto, in un topo che si muove liberamente. Questo disegno può essere ulteriormente adattato per studiare gli effetti specifici della regione mediante la consegna dei metaboliti derivati dall'intestino in varie regioni del cervello.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse relativi a questo lavoro.

Acknowledgments

Riconosciamo il personale del Laboratory Animal Center della National Cheng Kung University (NCKU) per la cura degli animali. Questo lavoro è stato sostenuto dalla borsa di studio del Prof. Kun-Yen Huang Education Fund della CHENG-HSING Medical Foundation a C.-W.L.; i fondi del Ministero della Scienza e della Tecnologia (MOST) di Taiwan: (Ricerca universitaria MOST 109-2813-C-006-095-B) a T.-H.Y.; (MOST 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) a W.-L.W.; e l'Higher Education Sprout Project, Ministero della Pubblica Istruzione alla sede dell'avanzamento universitario presso NCKU a W.-L.W.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41 Pfizer n/a
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit ThermoFisher Scientific A-21206
Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal) Millipore AB153-I
Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μm, PES, Sterile NEST 121921LA01
CaCl2  Sigma-Aldrich C1016 ACSF: 0.14 g/L
Chlorhexidine scrub 2% Phoenix NDC 57319-611-09
Chlorhexidine solution Phoenix NDC 57319-599-09
Commercial dummy RWD Life Science 62004 Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm
Commercial guide cannul RWD Life Science 62104 Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm 
Commercial injector RWD Life Science 62204 Single_OD 0.21 mm-33G/ Mates with M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 ACSF: 0.61 g/L
Dental acrylic HYGENIC n/a
Fixing screws RWD Life Science 62521
Fluoroshield mounting medium with DAPI Abcam AB104139
Horse serum ThermoFisher Scientific 16050130
Insulin syringes BBraun XG-LBB-9151133S-1BX 1 mL
Isoflurane  Panion & BF biotech DG-4900-250D
KCl  Sigma-Aldrich P3911 ACSF: 0.19 g/L
Ketoprofen  Swiss Pharmaceutical n/a
Lidocaine  AstraZeneca n/a
Low melting point agarose Invitrogen 16520
MgCl2  Sigma-Aldrich M8266 ACSF: 0.19 g/L
Microscope cover slips MARIENFELD 101242
Microscope slides ThermoFisher Scientific 4951PLUS-001E
Mineral oil light, white NF Macron Fine Chemicals MA-6358-04
NaCl  Sigma-Aldrich S9888 ACSF: 7.46 g/L
NaH2PO4  Sigma-Aldrich S8282 ACSF: 0.18 g/L
NaHCO3  Sigma-Aldrich S5761 ACSF: 1.76 g/L
n-butyl cyanoacrylate adhesive (tissue adhesive glue) 3M 1469SB 3M Vetbond
Neural tracer  Santa Cruz SC-358883 FluoroGold
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Polyethylene tube RWD Life Science 62329 OD 1.50, I.D 0.50 mm and OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (eye) Ointment Dechra  12920060
Sodium acetate  Sigma-Aldrich S2889 SCFAs: 13.5 mM
Sodium azide  Sigma-Aldrich S2002
Sodium butyrate  Sigma-Aldrich B5887 SCFAs: 8 mM
Sodium propionate  Sigma-Aldrich P1880 SCFAs: 5.18 mM
Stainless guide cannula Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.63 mm; Local vendor
Stainless injector Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.3 mm; dummy is made from injector; local vendor
Superglue Krazy Glue KG94548R
Triton X-100 Merck 1.08603.1000
Equipment
Cannula holder RWD Life Science B485-68217
Ceiling camera FOSCAM R2
Digital stereotaxic instruments Stoelting 51730D
Dissecting microscope INNOVIEW SEM-HT/TW
Glass Bead Sterilizer RWD Life Science RS1501
Heating pad Stoelting 53800M
Leica microscope  Leica DM2500
Micro Dissecting Forceps ROBOZ RS-5136 Serrated, Slight Curve; Extra Delicate; 0.5mm Tip Width; 4" Length 
Micro Dissecting Scissors ROBOZ RS-5918 4.5" Angled Sharp
Microinjection controller World Precision Instruments (WPI) MICRO2T SMARTouch Controller
Microinjection syringe pump World Precision Instruments (WPI) UMP3T-1 UltraMicroPump3  
Microliter syringe Hamilton 80014 10 µL
Optical Fiber Cold Light with double Fiber Step LGY-150 Local vendor
Pet trimmer WAHL 09962-2018
Vaporiser for Isoflurane Step AS-01 Local vendor
Vibratome Leica VT1000S
Software
Animal behavior video tracking software Noldus EthoVision Version: 15.0.1416
Leica Application Suite X software Leica LASX Version: 3.7.2.22383

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Neuroscienze Numero 184
Somministrazione intracerebroventricolare di metaboliti microbici derivati dall'intestino in topi che si muovono liberamente
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Liou, C. W., Yao, T. H., Wu, W. L.… More

Liou, C. W., Yao, T. H., Wu, W. L. Intracerebroventricular Delivery of Gut-Derived Microbial Metabolites in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (184), e63972, doi:10.3791/63972 (2022).

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