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Biology

एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेसिएन्स-नैरोलीफ प्लांटेन का आनुवंशिक परिवर्तन

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64777
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 3, 4, 1
1Department of Agronomy, Center for Plant Biology, Purdue University, 2Department of Biology, Purdue University, 3Department of Horticulture, Faculty of Agricultural Sciences, University of the Punjab, 4Department of Botany and Plant Pathology, Center for Plant Biology, Purdue University

Summary

अध्ययन के विभिन्न क्षेत्रों में एक मॉडल प्रजाति के रूप में इसके बहुमुखी अनुप्रयोग के कारण, नैरोलीफ प्लांटेन (प्लांटागो लांसोल्टा) में आनुवंशिक परिवर्तन टूलकिट की आवश्यकता है। यहां, एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेसिएन्स-मध्यस्थता परिवर्तन का उपयोग करके, एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है जिसके परिणामस्वरूप 20% की परिवर्तन दक्षता के साथ स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनें होती हैं।

Abstract

जीनस प्लांटागो में प्रजातियों में कई अद्वितीय लक्षण हैं जिनके कारण उन्हें अध्ययन के विभिन्न क्षेत्रों में मॉडल पौधों के रूप में अनुकूलित किया गया है। हालांकि, आनुवंशिक हेरफेर प्रणाली की कमी जीन फ़ंक्शन की गहन जांच को रोकती है, एक मॉडल के रूप में इस जीनस की बहुमुखी प्रतिभा को सीमित करती है। यहां, प्लांटागो लांसोलाटा के लिए एक परिवर्तन प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है, जो सबसे अधिक अध्ययन की जाने वाली प्लांटागो प्रजातियां हैं। एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेसियन्स-मध्यस्थता परिवर्तन का उपयोग करते हुए, सड़न से विकसित पी. लांसोलाटा पौधों की 3 सप्ताह पुरानी जड़ों को बैक्टीरिया से संक्रमित किया गया, 2-3 दिनों के लिए इनक्यूबेट किया गया, और फिर उचित एंटीबायोटिक चयन के साथ शूट प्रेरण माध्यम में स्थानांतरित कर दिया गया। शूट आमतौर पर 1 महीने के बाद माध्यम से उभरे, और अंकुरों को रूट इंडक्शन माध्यम में स्थानांतरित करने के 1-4 सप्ताह बाद जड़ें विकसित हुईं। पौधों को तब मिट्टी के वातावरण में अनुकूलित किया गया था और β-ग्लुकुरोनिडेस (जीयूएस) रिपोर्टर परख का उपयोग करके ट्रांसजीन की उपस्थिति के लिए परीक्षण किया गया था। वर्तमान विधि की परिवर्तन दक्षता ~ 20% है, जिसमें प्रति 10 जड़ ऊतकों में दो ट्रांसजेनिक पौधे उभर रहे हैं। नैरोलीफ प्लांटेन के लिए एक परिवर्तन प्रोटोकॉल स्थापित करने से विभिन्न क्षेत्रों में इस पौधे को एक नई मॉडल प्रजाति के रूप में अपनाने की सुविधा मिलेगी।

Introduction

पौधों के जीव विज्ञान के कई पहलुओं की जांच के लिए मॉडल प्रजातियों का उपयोग करने की अवधारणा एराबिडोप्सिस थैलियाना1 के व्यापक उपयोग के साथ उभरी। एराबिडोप्सिस को शुरू में चुना गया था क्योंकि यह कई अन्य फूलों के पौधों के साथ विशेषताओं को साझा करता है और इसमें कई लक्षण होते हैं जो प्रयोगशाला वातावरण में अध्ययन करना सुविधाजनक बनाते हैं, जैसे कि छोटा होना और छोटी पीढ़ी का चक्र होना। एक विषय के रूप में इसके साथ प्रकाशित शोध पत्रों की बड़ी मात्रा, इसके छोटे जीनोम आकार और आनुवंशिक परिवर्तनमें आसानी के साथ, इसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले प्रयोगात्मक जीव के रूप में बने रहने में सक्षम बनाती है। हालांकि, एराबिडोप्सिस को विभिन्न विशेषताओं या अद्वितीयलक्षणों वाली प्रजातियों के लिए एक मॉडल के रूप में सीमित किया जा सकता है। इसने नए मॉडल सिस्टम के विकास को प्रेरित किया है, जैसे कि मक्का (ज़िया मेस), मोनोकोट4 में विकासात्मक आनुवंशिकी के लिए एक महत्वपूर्ण पौधा, और टमाटर (सोलनम लाइकोपर्सिकम), जो विकासवादी अध्ययन, फल विकास और उत्पादन के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल है, और सब्जीफसलों के लिए एक अच्छा प्रतिनिधित्व है। आनुवंशिक परिवर्तन के लिए एक विधि एक पौधे की प्रजातियों के लिए एक मॉडल जीव के रूप में सेवा करने के लिए एक शर्त है। एक एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेसियंस-मध्यस्थता परिवर्तन पौधे जीव विज्ञान में एक विश्वसनीय उपकरण है; इसका उपयोग कुछ मॉडल प्रजातियों और प्रमुख फसलों को बदलने के लिए किया गया है, जिसमें तंबाकू (निकोटियाना टैबाकम) 6, चावल (ओरीज़ा सैटिवा) 7, कपास (गोसिपियम हिरसुटम) 8, सोयाबीन (ग्लाइसिन मैक्स)9, आलू (सोलनम ट्यूबरोसम) 10, और कैनोला (ब्रासिका नेपस)11 शामिल हैं। पौधों की प्रजातियां अत्यधिक परिवर्तनशील होती हैं कि वे ए. टुमेफेसिएन्स संक्रमण का कितनी सफलतापूर्वक जवाब देते हैं, और परिवर्तन प्रोटोकॉल को अक्सर प्रत्येक प्रजाति 6,12 के लिए व्यक्तिगत रूप से तैयार करने की आवश्यकता होती है।

जीनस प्लांटागो में कुल 256 पौधों की प्रजातियां शामिल हैं, जो दुनिया भर में व्यापक रूप से वितरितहैं। इस जीनस की प्रजातियों में अक्सर अनूठी विशेषताएं होती हैं जो उन्हें आनुवंशिकी, पारिस्थितिकी, तनाव शरीर विज्ञान, माध्यमिक मेटाबोलाइट्स, औषधीय रसायन विज्ञान, पौधे-माइक्रोब इंटरैक्शन, पौधे के विकास और विकास के अध्ययन के लिए मॉडल प्रजातियों के रूप में वांछनीय बनाती हैं। प्लांटागो लांसोलाटा, जिसे नैरोलीफ या रिबवर्ट प्लांटेन भी कहा जाता है, 19वीं शताब्दी के बाद से रुचि का एक लोकप्रिय पौधा रहा है, जब इसका उपयोग पहली बार पुरुष बाँझपन14 की घटना का वर्णन करने के लिए किया गया था। इसके जीनस के अन्य पौधों की तरह, इसका उपयोग विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों में अध्ययन में किया गया है। हाल ही में, इसे संवहनी जीव विज्ञान के लिए एक मॉडल के रूप में प्रस्तावित किया गया है, क्योंकि इसके संवहनी ऊतक को आसानी से एकत्र किया जा सकताहै। लांसोलाटा जीनस प्लांटागो में सबसे अधिक अध्ययन की जाने वाली प्रजाति है; 2021 के एक लेख में बताया गया है कि उस समय16 > इस प्रजाति सहित या उससे संबंधित > 1,400 प्रकाशन थे, और 9 दिसंबर 2022 को किए गए PubMed खोज के अनुसार, 2022 की शुरुआत से अतिरिक्त 102 लेख प्रकाशित किए गए हैं। जीनस में अगला सबसे अधिक अध्ययन किया गया पौधा, पी मेजर, एक ही तारीख पर समान मानदंडों का उपयोग करके खोजे जाने पर केवल 414 लेखों का विषय है।

लांसोलाटा में अनुसंधान रुचि के बावजूद, अध्ययन, विशेष रूप से जीन फ़ंक्शन लक्षण वर्णन पर, अक्सर प्रजातियों के लिए आनुवंशिक हेरफेर टूलकिट की कमी से सीमित होते हैं। पोमेरिनिग एट अल ने पुष्प डिप तकनीक17 का उपयोग करके पी मेजर के लिए एक परिवर्तन प्रोटोकॉल विकसित करने के प्रयास किए। हालांकि, इस प्रजाति18,19 की नर बाँझपन विशेषता के कारण इस विधि को पी लांसोलाटा पर लागू नहीं किया जा सकता है। हमारे ज्ञान के लिए, पी लांसोलाटा के परिवर्तन के लिए कोई मौजूदा प्रोटोकॉल नहीं है।

यह अध्ययन पी. लांसोल्टा के ए. टुमेफेसिएन्स-मध्यस्थता परिवर्तन के लिए एक सरल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। जड़ ऊतकों को लक्षित करके, पूरी तरह से विकसित ट्रांसजेनिक पौधों को परिवर्तन के 3 महीने के भीतर उत्पन्न किया जा सकता है।

Protocol

नोट: चरण 1.4-1.8, 2.3-2.5, 3.3-3.6, 4.1-4.6, 5.1-5.7, और 6.1-6.3 को सड़न रोकनेवाली स्थितियों में किया जाना चाहिए, संदूषण को रोकने के लिए एक साफ हुड का उपयोग करके।

1. परिवर्तन के लिए पादप सामग्री प्रसार

  1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) प्लांटागो लांसोलाटा बीज ( सामग्री की तालिका देखें) को वांछित पौधों की संख्या के आधार पर 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 5 एमएल लाइन तक रखें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एक 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब का उपयोग तब किया जा सकता है जब बीज की थोड़ी संख्या की आवश्यकता होती है, लेकिन इसे 0.1 एमएल से अधिक मात्रा में नहीं भरा जाना चाहिए, क्योंकि बहुत सारे बीज नसबंदी की दक्षता को कम कर सकते हैं।
  2. बीज को 60 सेकंड के लिए 75% इथेनॉल में डुबोएं।
  3. इथेनॉल को त्याग दें, फिर बीज को 40 मिनट के लिए 20% सोडियम हाइपोक्लोराइट (20% NaClO, 80% बाँझ पानी) में डुबोएं, धीरे से ट्यूब को उलट दें ताकि सभी बीज घोल के संपर्क में आ जाएं।
    नोट: सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान इष्टतम परिणामों के लिए ताजा बनाया जाना चाहिए।
  4. एक लामिनार प्रवाह हुड के तहत, सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान को छोड़ दें, फिर बीज को आसुत पानी (पांच बार) से धो लें। अंतिम कुल्ला के बाद बीज में पानी की एक छोटी मात्रा जोड़ें, क्योंकि इससे प्लेटों पर पौधों के आंदोलन में सहायता मिल सकती है।
  5. निष्फल बल का उपयोग करके, बीज को ठोस एमएस माध्यम के साथ पूर्व-तैयार 95 मिमी x 100 मिमी पेट्री व्यंजनों पर स्थानांतरित करें (तालिका 1)। अंकुरित रोपाई की भीड़भाड़ को रोकने के लिए प्रत्येक बीज के बीच लगभग 1 सेमी के साथ प्लेट की सतह पर समान रूप से बीज फैलाएं (चित्रा 1 ए)।
  6. संदूषण को रोकने के लिए पैराफिन फिल्म की दो परतों के साथ प्लेटों को सील करें, फिर कमरे के तापमान (50 μmol m-2 s-1, 12 घंटे के साथ 22 डिग्री सेल्सियस) पर एक शांत सफेद वृद्धि प्रकाश (सामग्री की तालिका देखें) के तहत इनक्यूबेट करें। बीज आमतौर पर 5-6 दिनों के भीतर अंकुरित होते हैं।
  7. जब रोपाई अंकुरित हो जाती है और स्थानांतरित करने के लिए पर्याप्त बड़ी होती है (चित्रा 1 बी), आमतौर पर अंकुरण के 2 या 3 दिन बाद, अंकुरों को 50-100 एमएल एमएस माध्यम के साथ बाँझ बक्से में स्थानांतरित करने के लिए निष्फल बल का उपयोग करें (तालिका 1)। आदर्श रूप से, सर्वोत्तम गुणवत्ता वाली जड़ें प्राप्त करने के लिए प्रति बॉक्स केवल पांच रोपाई लगाएं।
  8. सर्जिकल टेप के साथ बक्से को सील करें, फिर पौधों को एक शांत सफेद बढ़ते प्रकाश के तहत बढ़ने दें (सामग्री की तालिका देखें), चरण 1.6 में उल्लिखित समान स्थितियों में। पौधों को लगभग 3-4 सप्ताह में परिवर्तन के लिए तैयार होना चाहिए, या जब मुख्य जड़ें लंबाई में लगभग 2 सेमी बढ़ जाती हैं और पार्श्व जड़ें सफेद दिखाई देती हैं।
    नोट: मध्यम तैयारी व्यंजनों और विटामिन स्टॉक तालिका 1 और तालिका 2 में शामिल हैं।

2. प्लास्मिड निर्माण और ई कोलाई परिवर्तन

नोट: सटीक प्लास्मिड निर्माण प्रक्रिया रुचि के जीन के आधार पर भिन्न होती है। इस प्रक्रिया में, मानक क्लोनिंग प्रक्रिया 20 का उपयोग करके, जीयूएस के साथ बाइनरी प्लास्मिड पीबीआई 101 (सामग्री की तालिका देखें) में 1.5 केबी एटीपीपी 2 प्रमोटर को डालने के लिए प्रतिबंध एंजाइम हिंदIII और सालII का उपयोग किया गया था। ATPP2 (फ्लोएम प्रोटीन 2) एक जीन है जिसे विशेष रूप से फ्लोएम21 में व्यक्त किया जाता है।

  1. एराबिडोप्सिस से प्राइमर जोड़े 5'-AGTCAAGCTCAGTCTCCCTGTGGCTACTGAAC-3' (फॉरवर्ड) और 5'-AGTCGTCGACACACACACACAGATATGTATTTTTTG-3' (रिवर्स) का उपयोग करके प्रमोटर को क्लोन करें। चित्रा 2 एटीपीपी 2: जीयूएस सम्मिलित के साथ बाइनरी प्लास्मिड वेक्टर का एक आरेख दिखाता है।
  2. प्लास्मिड निर्माण के बाद, हीट शॉक विधि22 का उपयोग करके प्लास्मिड को डीएच 5 ए ई कोलाई (सामग्री की तालिका देखें) सक्षम कोशिकाओं में बदल दें, और फिर झटकों (150 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. प्रत्येक परिवर्तन संस्कृति का 150 μL लें, उचित चयन के साथ LB Agar मीडिया प्लेटों (तालिका 1) पर प्लेट करें (इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए तनाव के लिए 50 मिलीग्राम / L कनामाइसिन; सामग्री की तालिका देखें), और फिर प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 16-24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: इस अध्ययन में उपयोग किया जाने वाला जीवाणु तनाव ए. टुमेफेसिएन्स जीवी 3101 है।
  4. इसके बाद, सकारात्मक पुनः संयोजकों के लिए कॉलोनियों की जांच करने के लिए कॉलोनी पीसीआर काउपयोग करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, लक्षित जीन को बढ़ाने के लिए निम्नलिखित प्राइमरों का उपयोग किया गया था; 5'-ATGTTACTCTGTAGAAACCCA-3'(फॉरवर्ड) और 5'-TCATTGTTTGCCCCCCCTGCTGC-3' (रिवर्स)।
    1. प्रतिक्रिया को थर्मोसाइक्लर में चलाएं ( सामग्री की तालिका देखें) जिसमें 95 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट की साइकिल िंग स्थितियां हैं, इसके बाद 35 चक्र: 95 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड, 55 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड, 72 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट और 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम 10 मिनट बढ़ाव चरण है।
    2. एलबी शोरबा (तालिका 1) के 6 एमएल में सकारात्मक कॉलोनियों को उपयुक्त एंटीबायोटिक (50 मिलीग्राम / एल कनामाइसिन) के साथ टीका लगाएं और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर 200-250 आरपीएम पर बढ़ें।
  5. रात भर के विकास के बाद,मानक प्रक्रियाओं का उपयोग करके बैक्टीरिया से प्लास्मिड निकालें।

3. प्लास्मिड के साथ ए. ट्यूमेफेसियंस परिवर्तन

  1. प्लास्मिड निष्कर्षण के बाद, संशोधित प्लास्मिड को सक्षम कोशिकाओं के वांछित तनाव में बदलने के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग करें। इस प्रक्रिया में, ए टुमेफेसिएन्स स्ट्रेन जीवी 3101 का उपयोग किया गया था। इलेक्ट्रोपोरेशन तकनीकों के लिए मानकीकृत तरीकों का पालन करें 25.
  2. इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद, एलबी शोरबा के 1 एमएल में सक्षम कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और फिर 100 आरपीएम पर 28 डिग्री सेल्सियस पर 2-4 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. कमरे के तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) पर टेबलटॉप माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ( सामग्री की तालिका देखें) में 3 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से कोशिकाओं को इकट्ठा करें, फिर एक उपयुक्त चयन एजेंट (इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले प्लास्मिड के लिए 50 मिलीग्राम / एल कनामाइसिन) के साथ एलबी एगर प्लेट पर 50-100 μL फैलाएं।
  4. कोशिकाओं को 28 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए इनक्यूबेट करने के बाद, कॉलोनी पीसीआर के उपयोग के माध्यम से रुचि के जीन वाले सकारात्मक उपनिवेशों की पहचान करें। इस प्रोटोकॉल में, चरण 2.4 में उल्लिखित प्राइमरों और शर्तों का उपयोग करें।
  5. इसके बाद, एलबी एगर मीडिया + चयन के साथ स्टॉक प्लेट को लकीर करने के लिए सकारात्मक कॉलोनियों का उपयोग करें। प्लेट को 1 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  6. वैकल्पिक रूप से, दीर्घकालिक भंडारण के लिए, उचित चयन के साथ एलबी की एक छोटी मात्रा के साथ एक सकारात्मक कॉलोनी का टीकाकरण करें। 200 आरपीएम पर 28 डिग्री सेल्सियस पर रात भर टीका कल्चर को हिलाएं, फिर ग्लिसरॉल स्टॉक (बैक्टीरिया और ग्लिसरॉल के 50:50 मिश्रण में 50% डब्ल्यू / वी ग्लिसरॉल) तैयार करें, जिसे 10 साल तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

4 . ए. ट्यूमेफेसियंस की तैयारी

  1. स्ट्रीक ए. ट्यूमेफेसियंस जिसमें वांछित प्लास्मिड होता है, ने उपयुक्त चयन एजेंट के साथ 95 मिमी x 100 मिमी ठोस एलबी प्लेटों को तैयार किया। इस प्रोटोकॉल में, प्लास्मिड इंसर्ट एटीपीपी 2: जीयूएस के साथ बैक्टीरियल स्ट्रेन जीवी 3101 का उपयोग किया गया था, जिसमें चयन के लिए 50 मिलीग्राम / एल कनामाइसिन जोड़ा गया था।
  2. पैराफिन फिल्म के साथ प्लेटों को सील करें, फिर 48 घंटे तक 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, या जब तक कि बैक्टीरिया चुनने के लिए पर्याप्त बड़ा न हो जाए।
  3. परिवर्तन से 2 दिन पहले एक बैक्टीरिया कॉलोनी चुनने के लिए एक पिपेट टिप का उपयोग करें, और इसे उचित चयन के साथ 6 एमएल तरल एलबी युक्त 15 एमएल गोल तल ट्यूब में टीका लगाएं। रात भर 28 डिग्री सेल्सियस टेबलटॉप शेकर में 200 आरपीएम पर हिलाएं, जब तककि ओडी 600 0.6-0.7 तक न पहुंच जाए।
    नोट: प्लेट्स और 6 एमएल बैक्टीरियल टीकाकरण को 1 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. जब बैक्टीरिया सही ओडी600 तक पहुंच जाता है, तो ए. टुमेफेसिएन्स को एक बाँझ फ्लास्क में स्थानांतरित करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें जिसमें एक चयन एजेंट के साथ 100 एमएल तरल एलबी होता है। आमतौर पर, प्रसार के लिए प्रति 100 एमएल एलबी में बैक्टीरिया के 200 μL उपयुक्त है। रात भर 28 डिग्री सेल्सियस पर 200 आरपीएम पर हिलाएं, जब तककि ओडी 600 0.6-0.7 तक न पहुंच जाए।
  5. बैक्टीरिया को इकट्ठा करने के लिए टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज में कमरे के तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) पर 10 मिनट के लिए बैक्टीरिया को 50 एमएल बाँझ सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें, और सेंट्रीफ्यूज को 2,200 एक्सजी पर स्थानांतरित करें।
  6. पिपेट का उपयोग करके सुपरनैटेंट को छोड़ दें। बैक्टीरिया की गोली को 5 एमएल कमरे के तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) तरल निलंबन समाधान (एसएस) (तालिका 1) में पाइपिंग द्वारा पुन: निलंबित करें, फिर एसएस के 50 एमएल तक जोड़ें और मिश्रण करने के लिए कई बार उलटा करें। बैक्टीरिया अब परिवर्तन के लिए तैयार है।
    नोट: तरल एसएस को परिवर्तन के 1 सप्ताह के भीतर ताजा तैयार किया जाना चाहिए।
    सावधानी: ए. टुमेफेसिएन्स के संपर्क में आने वाली सभी सामग्री को बायोहाजार्ड वेस्ट बिन में छोड़ दिया जाना चाहिए। बैक्टीरियल संस्कृतियों के बचे हुए तरल पदार्थों को सोडियम हाइपोक्लोराइट (ब्लीच) के साथ 20% या उससे अधिक की एकाग्रता पर निष्फल किया जा सकता है।

5. प्लांटागो की जड़ों का परिवर्तन

  1. जब पौधे परिवर्तन के लिए आदर्श चरण तक पहुंचते हैं (रोपाई 3 सप्ताह पुरानी होती है) (चित्रा 1 सी), तो जड़ों को बाकी पौधे से अलग करने के लिए बाँझ बल और कैंची का उपयोग करें (चित्रा 3 ए)। पत्ती और तने की सामग्री को त्याग दें।
  2. काटने के तुरंत बाद, जड़ के टुकड़ों को बाँझ बल का उपयोग करके बाँझ पानी युक्त बाँझ बक्से में स्थानांतरित करें। यह कदम जड़ों को हाइड्रेटेड रहने की अनुमति देता है जबकि सभी ऊतक एकत्र किए जाते हैं।
  3. जब सभी जड़ें कट जाती हैं, तो ए. टुमेफेसिएन्स/एसएस सस्पेंशन को बाँझ 150 मिमी x 15 मिमी डिस्पोजेबल पेट्री व्यंजनों में डालें। जड़ों को ए. टुमेफेसिएन्स संस्कृति में स्थानांतरित करें और कम से कम 20 मिनट के लिए टीका लगाएं (चित्रा 3 बी)।
  4. इनक्यूबेशन दौरान, जड़ों को 1 सेमी टुकड़ों में काटने के लिए तेज ब्लेड के साथ बाँझ स्केलपेल का उपयोग करें, जो प्राथमिक जड़ों को पार्श्व जड़ों से अलग करता है। बैक्टीरिया को पौधे को संक्रमित करने की अनुमति देने के लिए जड़ों की सतह पर पतले, उथले कट बनाएं।
    नोट: यदि बड़ी संख्या में पौधों से निपट रहे हैं, तो जड़ के टुकड़ों को बैचों में जीवाणु संस्कृति में स्थानांतरित करें, यह सुनिश्चित करने के लिए कि टीकाकरण के दौरान सभी जड़ें डूब गई हैं।
  5. इनक्यूबेशन के बाद, अतिरिक्त बैक्टीरिया को हटाने के लिए जड़ के टुकड़ों को बाँझ पेपर तौलिए में स्थानांतरित करने के लिए बाँझ बल का उपयोग करें। 60 सेकंड से अधिक समय तक जड़ों को सुखाने से बचें, क्योंकि इससे निर्जलीकरण हो सकता है और जड़ ऊतक को नुकसान हो सकता है। आदर्श रूप से, 10-15 जड़ों को एक साथ सुखाया जा सकता है (चित्रा 3 सी)।
  6. जड़ों के आकार के आधार पर सूखे जड़ों को ठोस सह-संस्कृति मीडिया (तालिका 1), प्रति प्लेट लगभग 10-20 जड़ों के साथ तैयार 95 मिमी x 15 मिमी पेट्री व्यंजनों में स्थानांतरित करें (चित्रा 3 डी)।
  7. पारदर्शी प्लास्टिक फिल्म की दो परतों के साथ प्लेटों को सील करें, फिर एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करें। 3 दिनों के लिए कमरे के तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) पर इनक्यूबेट करें। यह चरण एंटीबायोटिक चयन (चित्रा 3 ई) की उपस्थिति के बिना बैक्टीरिया को जड़ों को संक्रमित करने के लिए समय प्रदान करता है।

6. चयन और पूरे पौधे पुनर्जनन

  1. सह-संस्कृति मीडिया में इनक्यूबेशन के बाद, रूट टुकड़ों को ठोस शूट इंडक्शन मीडिया (सिम) (तालिका 1) के साथ टिमेंटिन (500 मिलीग्राम / एल; सामग्री की तालिका देखें) और उचित एंटीबायोटिक चयन के साथ तैयार 95 मिमी x 15 मिमी पेट्री व्यंजनों में स्थानांतरित करें। इस प्रोटोकॉल में, हमने कनामाइसिन (100 मिलीग्राम / एल) का उपयोग किया।
    नोट: जड़ों के निचले हिस्से को माध्यम के साथ पूर्ण संपर्क में आना चाहिए। जड़ें जो माध्यम की सतह को नहीं छूती हैं, वे बहुत लंबी होती हैं और ऊतक को चयन से बचने से रोकने के लिए काटा जाना चाहिए।
  2. पारदर्शी प्लास्टिक फिल्म की दो परतों के साथ प्लेटों को सील करें, फिर 1 महीने के लिए बढ़ते प्रकाश के तहत बढ़ें (उचित परिस्थितियों के लिए चरण 1.6 देखें), या जब तक शूट उभरना शुरू न हो।
    नोट: आमतौर पर, शूट आद्याक्षर विकास के 2 सप्ताह के बाद देखे जा सकते हैं, और शूट आमतौर पर 1 महीने के बाद दिखाई देते हैं।
  3. जब प्लांटलेट 1.5-2.0 सेमी लंबे होते हैं (चित्रा 1 डी), तो उन्हें ठोस रूट इंडक्शन मीडिया (तालिका 1) के साथ तैयार बाँझ बक्से में स्थानांतरित करें।
  4. पौधों को कई हफ्तों तक उगते हुए प्रकाश के तहत उगाएं (स्थितियों के लिए चरण 1.6 देखें) जब तक कि जड़ें न बन जाएं। जड़ें आमतौर पर पहली बार 1 सप्ताह के बाद देखी जा सकती हैं।
    नोट: मिट्टी में जाने से पहले जड़ों को कई हफ्तों तक बढ़ने की अनुमति देने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि बड़ी जड़ प्रणालियों वाले पौधों में मिट्टी में उच्च जीवित रहने की दर होती है।

7. मृदा अंतरण

  1. जब जड़ प्रणालियां स्थानांतरित करने के लिए पर्याप्त बड़ी हो जाती हैं (चित्रा 1 ई), आमतौर पर विकास के 1 महीने के बाद, पौधों को पूर्व-गीले ऑल-पर्पस मिट्टी (बीएम 7) वाले वर्ग बर्तनों में 3.5 में स्थानांतरित करें। इस प्रोटोकॉल में, बीएम 7 छाल मिश्रण का उपयोग किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।
    1. जड़ों से चिपकने वाले किसी भी माध्यम को पानी में धीरे-धीरे धोकर हटा दें।
      नोट: पौधों को ग्रीनहाउस में 600 डब्ल्यू उच्च सोडियम दबाव रोशनी (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके ग्रीनहाउस में परिपक्वता के लिए उगाया जा सकता है, या कमरे के तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) पर एक विकास कक्ष में 50 μmol m-2 s-1, 12 घंटे दिनों पर शांत सफेद रोशनी के साथ।
  2. पौधों को प्लास्टिक पॉटिंग कवर के साथ कवर करें, फिर उन्हें एक स्पष्ट प्लास्टिक बैग के साथ कवर करें। यह कदम पौधों को आर्द्र वातावरण में रहने की अनुमति देता है क्योंकि वे मिट्टी के अनुकूल होते हैं।
  3. लगभग 3-5 दिनों के बाद, प्लास्टिक बैग को हटा दें, फिर बाहरी वातावरण में अनुकूलन की अनुमति देने के लिए धीरे-धीरे ढक्कन हटा दें।
    नोट: वर्ष के समय और जिस वातावरण में पौधों को स्थानांतरित किया जाता है, उसके आधार पर, पौधों को अनुकूलित करने का समय अलग-अलग हो सकता है। पौधों की रोजाना जांच करना और आवश्यकतानुसार बर्तनों में पानी जोड़ने की सिफारिश की जाती है।
  4. पौधों को नियमित रूप से पानी दें और आवश्यकतानुसार उर्वरक जोड़ें। पौधों को आगे के विकास के लिए बड़े बर्तनों में भी स्थानांतरित किया जा सकता है (चित्रा 1 एफ)।

8. β-ग्लुकुरोनिडेस (जीयूएस) हिस्टोकेमिकल धुंधलापन

  1. प्रकाशित प्रोटोकॉल15 के अनुसार, β-ग्लूकुरोनिडेस (जीयूएस) धुंधला समाधान तैयार करें।
  2. जब शूट आद्याक्षर लगभग 0.5-1 सेमी लंबा हो, तो एक युवा, पूरी तरह से विस्तारित पत्ती की एक छोटी सी नोक को हटा दें (<5 मिमी लंबाई आमतौर पर पर्याप्त होती है) और तुरंत 1.5 या 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 0.5-1 एमएल जीयूएस स्टेनिंग घोल में स्थानांतरित करें। समाधान को पूरी तरह से पौधे के ऊतकों को कवर करना चाहिए।
  3. खोले गए ट्यूबों को वैक्यूम डेसिकेटर में रखें और वैक्यूम को 5-10 मिनट के लिए 20-25 केपीए पर रखें। वैक्यूम प्रक्रिया के दौरान समाधान में छोटे बुलबुले दिखाई देने चाहिए। यह समाधान को पौधे की कोशिकाओं में प्रवेश करने की अनुमति देता है।
  4. हवा को वैक्यूम डेसिकेटर में वापस फ़िल्टर करने दें। ट्यूबों को बंद करें और रात भर (12 घंटे) 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, या जब तक नीला रंग दिखाई न दे।
    नोट: इस अध्ययन में, जीयूएस गतिविधि को फ्लोएम के लिए स्थानीयकृत किया गया था, जिसका अर्थ है कि सकारात्मक रूप से रूपांतरित पौधों में, नीला धुंधलापन केवल फ्लोएम ऊतक में दिखाई देना चाहिए। ट्रांसजीन के बिना पौधे धुंधला होने का अनुभव नहीं करते हैं (चित्रा 4)।
  5. दाग को बेहतर ढंग से देखने के लिए, क्लोरोफिल को हटाने के लिए पौधों को 100% इथेनॉल में स्थानांतरित करें। क्लोरोफिल हटाने की प्रक्रिया की दक्षता बढ़ाने के लिए, ट्यूबों को 10 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: पत्ती के आकार के आधार पर, सभी क्लोरोफिल को हटाने से पहले इथेनॉल को कई बार बदलने की आवश्यकता हो सकती है।

Representative Results

ए. टुमेफेसिएन्स-मध्यस्थता परिवर्तन का उपयोग करके ट्रांसजेनिक पी. लांसोलाटा पौधों को प्राप्त करने के लिए यहां एक सरल प्रोटोकॉल की सूचना दी गई है। रिपोर्टर जीन जीयूएस (एन्कोडिंग β-ग्लूकोरोनिडेस) को एटीपीपी 2 के फ्लोएम-व्यक्त प्रमोटर द्वारा संचालित, ए. टुमेफेसिएन्स स्ट्रेन जीवी 3101 (चित्रा 2) के माध्यम से 3 सप्ताह पुराने पी. लांसोलाटा जड़ों में बदल दिया जाता है। एक फ्लोएम-विशिष्ट प्रमोटर चुना गया था क्योंकि हमारी मुख्य रुचि पौधे संवहनी ऊतकों, विशेष रूप से फ्लोएम के कार्यात्मक जीनोमिक्स के लिए एक प्रणाली स्थापित करना था। प्रारंभिक प्रयोग में जड़, पत्ती और पेटियोल ऊतक पर विधि का परीक्षण किया गया था। यद्यपि कैलस को सभी ऊतक प्रकारों में प्रेरित किया जा सकता है, केवल रूट ऊतक ने सिम में 1 महीने के बाद शूट आद्याक्षर (चित्रा 5 ए) का उत्पादन किया; पत्ती और पेटियोल भूरे रंग के हो गए और मर गए (चित्रा 5 बी)। इससे यह निष्कर्ष निकला कि परिवर्तन विधि में उपयोग के लिए जड़ ऊतक इष्टतम ऊतक प्रकार था। जड़ों को तैयार बैक्टीरिया में कम से कम 20 मिनट के लिए निलंबन समाधान (एसएस) (तालिका 1) में पुन: निलंबित किया गया था, फिर अंधेरे में 3 दिनों तक ठोस एसएस प्लेटों पर कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट किया गया था (चित्रा 3 ई)। जड़ों को तब शूट इंडक्शन माध्यम (सिम) में स्थानांतरित कर दिया गया था और प्रोटोकॉल (चरण 1.6) में इंगित शर्तों में एक बढ़ती रोशनी के तहत रखा गया था। चित्रा 1 और चित्रा 3 संदर्भ के लिए प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण की प्रतिनिधि छवियां दिखाते हैं।

चित्रा 6 रूपांतरित ऊतक से उभरने वाले शूट आद्याक्षरों की प्रगति को दर्शाता है, पहले दिन से जड़ों को सिम (चित्रा 6 ए) पर रखा गया था जब शूट रूट होने के लिए तैयार थे (चित्रा 6 डी)। 1 सप्ताह के बाद, जड़ ऊतक ने कैलस (चित्रा 6 बी) का गठन किया, और शूट आद्याक्षरों की शुरुआत देखी जा सकती है (चित्रा 6 बी 1)। सप्ताह 2 और 3 (चित्रा 6 सी) के दौरान शूट उभरते रहे, और 4 सप्ताह के बाद, शूट रूट इंडक्शन माध्यम (चित्रा 6 डी) में स्थानांतरित होने के लिए तैयार थे।

कथित ट्रांसजेनिक पौधों की पहचान β-ग्लुकुरोनिडेस (जीयूएस) हिस्टोकेमिकल परख का उपयोग करके की गई थी, जिसमें लगभग 0.5 सेमी लंबा होने के बाद ली गई पत्ती खंडों का उपयोग किया गया था। सकारात्मक ट्रांसजेनिक पौधों ने फ्लोएम स्थानीयकृत ऊतक में अपेक्षित धुंधला पैटर्न दिखाया, जो चित्र 4 में प्रदर्शित किया गया है। सकारात्मक जीयूएस-दाग वाले शूट को रूट इंडक्शन माध्यम में स्थानांतरित कर दिया गया था, जिसमें उन्होंने 4 सप्ताह के बाद मजबूत रूटिंग सिस्टम विकसित किए (चित्रा 1 ई)। जड़ वाले पौधों को तब मिट्टी में स्थानांतरित कर दिया गया था। चित्रा 4 तुलना के लिए एटीपीपी 2 प्रमोटर और β-ग्लुकुरोनिडेस (जीयूएस) जीन के साथ रूपांतरित एक संकीर्णलीफ प्लांटेन में धुंधलापन के परिणाम को दर्शाता है। उभरने वाले सभी शूट को ट्रांसजेनिक के रूप में पुष्टि की गई थी। परिवर्तन दक्षता औसतन 20% निर्धारित की गई थी, जिसमें प्रत्येक 10 जड़ों के लिए लगभग दो शूट उभर रहे थे जो बदल गए थे। पुष्टि किए गए ट्रांसजेनिक पौधों को बड़े बर्तनों में स्थानांतरित कर दिया गया और वयस्क चरण तक पहुंचने तक 4-8 सप्ताह तक उगाया गया (चित्रा 1 एफ)।

Figure 1
चित्र 1: प्लांटागो लांसोलाटा परिवर्तन की समयरेखा। प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण की प्रतिनिधि छवियां। (ए) एमएस प्लेट पर चढ़ाए गए अजार्मिनेटेड बीज। (बी) बीज 1 सप्ताह के बाद अंकुरित होते हैं, जो मैजेंटा बक्से में स्थानांतरित होने के लिए तैयार होते हैं। (सी) विकास के 3 सप्ताह के बाद एमएस बक्से में पौधे। जड़ें हरे और स्वस्थ हैं, परिवर्तन के लिए आदर्श चरण में। (डी) 4 सप्ताह के बाद शूट इंडक्शन मीडिया में शूट रूटिंग माध्यम में स्थानांतरित होने के लिए तैयार हैं। इस स्तर पर, यदि लागू हो तो β-ग्लुकुरोनिडेस (जीयूएस) हिस्टोकेमिकल धुंधला किया जा सकता है। (ई) जड़ प्रेरण मीडिया वाले बक्से में पौधे, जहां जड़ें 4 सप्ताह के विकास के बाद बनती हैं। (च) ट्रांसजेनिक पौधों को मिट्टी में वृद्धि के 4 सप्ताह बाद पूर्ण लंबाई तक उगाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: बाइनरी वेक्टर प्लास्मिड pBI101 + β-ग्लूकुरोनिडेस (GUS) का आरेख सम्मिलित फ्लोएम-विशिष्ट प्रमोटर ATPP2 के साथ। कृपया इस आंकड़े के बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: परिवर्तन के कदम। परिवर्तन के प्रत्येक चरण की प्रतिनिधि छवियां। (ए) परिवर्तन के दौरान अंकुरों से जड़ों को अलग करना। (बी) बैक्टीरिया / एसएस निलंबन में जड़ों को भिगोना। (सी) अतिरिक्त बैक्टीरिया को हटाने के लिए कागज के तौलिए पर जड़ों को सुखाना। (घ) जड़ें सह-संस्कृति माध्यम पर चढ़ाई जाती हैं। (ई) एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटी गई एसएस प्लेटें। पौधों को शूटिंग माध्यम में स्थानांतरित करने से पहले 2-3 दिनों के लिए इनक्यूबेट किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: जीयूएस-धुंधलापन। β-ग्लुकुरोनिडेस (जीयूएस) संकीर्ण पत्ती के पत्ती खंडों के धुंधला परिणाम। (ए) जंगली प्रकार। (बी) नैरोलीफ प्लांटेन प्लास्मिड के साथ बदल जाता है जो एटीपीपी 2 प्रमोटर (खाली वेक्टर) को परेशान करता है। (सी) नैरोलीफ प्लांटेन प्लास्मिड के साथ परिवर्तित हो जाता है जो एटीपीपी 2 प्रमोटर और β-ग्लूकोरोनिडेस (जीयूएस) जीन को परेशान करता है। प्रत्येक पत्ती को जीयूएस हिस्टोकेमिकल स्टेनिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके दाग दिया गया था, फिर एक सूक्ष्म कैमरे के साथ चित्रित किया गया था। छवियां (बी) और (सी) जीयूएस जीन की अनुपस्थिति के कारण कोई धुंधला पैटर्न नहीं दिखाती हैं। सही छवि नसों में एक स्पष्ट नीले धब्बेदार पैटर्न दिखाती है, यह पुष्टि करती है कि पौधे ट्रांसजेनिक हैं। पट्टी 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करती है, जिसमें प्रत्येक पत्ती खंड लंबाई में लगभग 1 सेमी मापता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: शूटिंग मीडिया पर >1 महीने के बाद विभिन्न ऊतक प्रकारों की परिवर्तन दक्षता की तुलना इनक्यूबेशन। जड़ों ने विस्तारित कैलस का अनुभव किया है, और शूट आद्याक्षर उभरे हैं। एंटीबायोटिक चयन के जवाब में गैर-रूपांतरित कैलस ने मरना शुरू कर दिया है। (बी) 1 महीने से अधिक की वृद्धि के बाद पत्ती और पेटियोल ऊतक। ऊतकों ने कुछ कैलस विस्तार का अनुभव किया लेकिन एंटीबायोटिक के जवाब में जल्द ही मर गए। किसी भी ऊतक से कोई शूट नहीं निकला। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: परिवर्तित ऊतक पर कैलस और शूट का उद्भव। इनक्यूबेशन की विभिन्न लंबाई के बाद शूटिंग माध्यम पर रखे गए ऊतकों की प्रतिनिधि छवियां। (ए) शूटिंग माध्यम पर चढ़ाए जाने के तुरंत बाद जड़ ऊतक। (बी) शूटिंग माध्यम पर 1 सप्ताह के बाद जड़ ऊतक। कैलस विस्तार देखा जा सकता है, और (बी 1) पहले शूट आद्याक्षर उभरने लगे हैं। (सी) शूटिंग माध्यम पर 3 सप्ताह के बाद जड़ ऊतक। अधिक शूट आद्याक्षर सामने आए हैं। (C1) बी 1 शूट से उभरा शूट शुरू हुआ। (डी) इनक्यूबेशन के 4 सप्ताह के बाद जड़ ऊतक। गैर-रूपांतरित ऊतक काले / भूरे रंग में बदलना और मरना शुरू हो गया है, और उभरते हुए अंकुर बढ़ते जा रहे हैं। इस स्तर पर, शूट को रूटिंग माध्यम में ले जाने के लिए तैयार हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: मीडिया तैयारी व्यंजनों। परिवर्तन के लिए माध्यमों को तैयार करने के तरीके का वर्णन। जोड़े गए विटामिन की मात्रा की गणना संकेतित स्टॉक समाधान एकाग्रता के आधार पर की जाती है। विटामिन स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए तालिका 2 देखें। सभी माध्यमों के लिए, 900 एमएल डबल-डिस्टिल्ड एच2ओ में अभिकर्मकों को जोड़ें, संकेतित स्तर पर पीएच, और फिर 1,000 एमएल की अंतिम मात्रा में पानी जोड़ें। * = नसबंदी के बाद जोड़ें। ** = 1 M KOH के साथ pH। = 1 M NaOH के साथ pH। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: प्लांटागो माध्यमों के लिए विटामिन स्टॉक। भंडारण से पहले सभी विटामिनों को फ़िल्टर किया जाना चाहिए और सटीक रूप से लेबल किया जाना चाहिए। जहां संकेत दिया गया है, पाउडर को पहले 1 N NaOH में घोलें, फिर डबल डिस्टिल्डH2O के साथ वांछित मात्रा बनाएं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

जीनस प्लांटागो में पौधों के लिए एक परिवर्तन प्रोटोकॉल की कमी इन पौधों के उपयोग को मॉडल के रूप में सीमित करती है, खासकर जब शोधकर्ता जीन कार्यों की खोज में रुचि रखते हैं। लांसोलाटा को आनुवंशिक परिवर्तन प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए चुना गया था क्योंकि यह अपने जीनस16 का सबसे अधिक अध्ययन किया जाने वाला पौधा है। जो प्रोटोकॉल विकसित किया गया है, उसका उपयोग संवहनी जीव विज्ञान, पारिस्थितिकी, पौधे-कीट इंटरैक्शन और अजैविक तनाव शरीर विज्ञान से संबंधित अध्ययनों को आगे बढ़ाने के लिए एक उपकरण के रूप में किया जाएगा।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल स्पष्ट रूप से उन चरणों को रेखांकित करता है जो उपयोगकर्ता को ट्रांसजेनिक पौधों को प्राप्त करने की अनुमति देते हैं। एक ऊतक संस्कृति वातावरण में पनपने के लिए पी लांसोलाटा की क्षमता के अलावा, कई कारकों ने हमारी परिवर्तन विधि की सफलता में योगदान दिया। सबसे पहले, परिवर्तन के लिए उच्च गुणवत्ता वाले, बाँझ पौधे की जड़ ऊतक का उपयोग करने का महत्व देखा गया था। जड़ों में उच्चतम परिवर्तन दर थी जब उन्हें 3-4 सप्ताह पुराने पौधों से लिया गया था, और हरे या हल्के सफेद दिखाई दिए थे। बैक्टीरिया या फंगल संदूषण की किसी भी मात्रा के साथ बक्से से ली गई जड़ें अक्सर दूषित शूटिंग संस्कृतियों के परिणामस्वरूप होती हैं, और भूरे रंग की दिखाई देने वाली पुरानी जड़ें सफल परिवर्तन का परिणाम नहीं देती हैं। जड़ ऊतक वर्तमान विधि का उपयोग करके परिवर्तन के लिए सबसे कुशल ऊतक प्रकार था, क्योंकि पत्ती और पेटियोल ऊतक शूट विकसित करने में असफल रहे थे।

एक और महत्वपूर्ण अवलोकन यह था कि परिवर्तन के लिए जड़ ऊतक एकत्र करने का इष्टतम तरीका बाँझ पानी में ताजा कटी हुई जड़ सामग्री रखना था। इस कदम ने प्रभावी रूप से जड़ सामग्री को हाइड्रेटेड रहने की अनुमति दी, जबकि शेष ऊतक एकत्र किया गया था, क्योंकि जड़ें अपने विकास कंटेनरों से हटाए जाने पर जल्दी से सूख जाती हैं। इस कदम ने परिवर्तन की सफलता दर को बढ़ाने में भी मदद की, क्योंकि इसने एक समय में बैक्टीरिया में अधिक जड़ों को इनक्यूबेट करने की अनुमति दी।

इस प्रोटोकॉल को उस समय को कम करके संशोधित किया जा सकता है जो जड़ ऊतक सह-संस्कृति मीडिया में 2 दिनों तक सेते हैं। यह देखा गया कि 2 या 3 दिन की इनक्यूबेशन अवधि संक्रमण की अनुमति देने के लिए पर्याप्त है जिसके परिणामस्वरूप शूट आद्याक्षर होते हैं। हालांकि, लंबे समय तक इनक्यूबेशन समय की सिफारिश नहीं की जाती है, क्योंकि यह देखा गया था कि मीडिया में एंटीबायोटिक अवरोधक की अनुपस्थिति के परिणामस्वरूप अक्सर ए ट्यूमेफेसियन्स अतिवृद्धि होती है , जो उभरते ऊतक को मार सकती है।

इस अध्ययन की एक सीमा तुलना के लिए पी. लांसोलाटा परिवर्तन में ए. टुमेफेसियन्स के अन्य तरीकों या प्रजातियों के प्रदर्शन पर उपलब्ध आंकड़ों की कमी है। हमारी जानकारी के लिए, यह प्रोटोकॉल नया है। प्रारंभिक परीक्षणों के दौरान, ए. टुमेफेसिएन्स जीवी 3101 के साथ एक उच्च परिवर्तन दक्षता का उल्लेख किया गया था, और हमने अन्य उपभेदों के साथ प्रयोग करने के बजाय इस तनाव का उपयोग करके तकनीक को परिष्कृत करने पर ध्यान केंद्रित किया। पौधे परिवर्तन के लिए 20% की हमारी परिवर्तन दक्षता अपेक्षाकृत अधिक है- कई पारंपरिक तरीके किसी भी चीज़ को सफल मानते हैं >1% सफल 26,27,28। हालांकि, ए. टुमेफेसिएन्स के एक अन्य तनाव का उपयोग करना, जैसे कि ए राइजोजेन्स, जो कई प्रजातियों 29,30,31 में जड़ परिवर्तन में इसके उपयोग के लिए जाना जाता है, के परिणामस्वरूप और भी अधिक सफलता दर हो सकती है। पी लांसोलाटा में बढ़ी हुई परिवर्तन दक्षता को बढ़ावा देने के लिए अन्य उपभेदों का उपयोग करने के प्रभाव का आकलन करने के लिए आगे के प्रयोग की आवश्यकता होगी।

लांसोलाटा के सफल परिवर्तन से अध्ययन के कई क्षेत्रों को लाभ होगा। उच्च परिवर्तन दक्षता, और ऊतक संवर्धन मीडिया में पौधे की तेजी से वृद्धि, पी लांसोलाटा को जीन फ़ंक्शन अध्ययन15 के लिए एक व्यवहार्य उम्मीदवार बनाती है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल साइंस फाउंडेशन (EDGE IOS-1923557 से C.Z. और Y.Z.) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
14 mL Round Bottom TubeA4A2:A34 ThermoFisher Scientific 150268
1-Naphthylacetic acid Gold Biotechnology N-780
3M Micropore Surgical Paper Tape ThermoFisher Scientific 19-027761
50 mL Centrifuge Tubes Research Products International Corp. 163227LC
600 Watt High Pressure Sodium Lights Plantmax PX-LU600
6-Benzylaminopurine (6-BAP) Gold Biotechnology B-110
Aluminum Foil  ThermoFisher Scientific 01-213-100
Bacto Agar  Thermofisher Scientific 214010
Binary Plasmid pBI101 Clontech, USA  632522
Cool White Grow Light Sylvania LLC Home Depot 315952205
D-biotin ThermoFisher Scientific BP232-1
ddH2O
DH5a E. coli  Invitrogen, USA  18258012
Disposable Petri Dishes, Sterile 150 x 16 mm ThermoFisher Scientific FB0875712
Disposable Petri Dishes, Sterile 95 x 15 mm ThermoFisher Scientific FB0875714G
Dissecting Scissors Leica Biosystems 38DI12044
Ethanol 200 Proof Decon Labs 2705
Folic Acid Fisher Scientific BP2519-5
Forceps Leica Biosystems 38DI18031
Gelrite Research Products International Corp. G35020-1000
Glycerol ThermoFisher Scientific 17904
Glycine Sigma  241261
Incubated Tabletop Orbital Shaker ThermoFisher Scientific SHKE420HP
Indole-3-Acetic Acid (IAA) Gold Biotechnology I-110
Indole-3-Butyric Acid (IBA) Gold Biotechnology I-180
Kanamycin Monosulfate Gold Biotechnology K-120
Macrocentrifuge  ThermoFisher Scientific 75007210
Magenta Boxes ThermoFisher Scientific 50255176
Micro Pipet Tips 1000 µL Corning 4140
Micro Pipet Tips 200 µL Corning 4138
Micro Pipette Tips 10 µL Corning 4135
Microcentrifuge  ThermoFisher Scientific 75002410
Micropipettor 0.5-10 µL Corning 4071
Micropipettor 100-1000 µL Corning 4075
Micropipettor 20-200 µL Corning 4074
Micropipettor 2-20 µL Corning 4072
Murashige & Skooge Basal Medium with Vitamins PhytoTech M519
Murashige & Skooge Basal Salt Mixture PhytoTech M524
myo-Inositol Gold Biotechnology I-25
Nicotinic acid Sigma N0761-100g
Parafilm (paraffin film)  ThermoFisher Scientific S37440
Potassium Hydroxide (KOH) Research Products International Corp. P44000
Pyridoxine HCl Sigma P6280-10g
Scalpel Blade Handle Leica Biosystems 38DI36419
Scalpel Blades Leica Biosystems 3802181
Sodium Chloride, Crystal (NaCl) Mallinckrodt Chemicals 7581-06
Sodium Hydroxide (NaOH) Research Products International Corp. S24000
Sodium Hypochlorite Walmart 23263068401
Soil- Bark Mix Berger, USA BM7
Square Pots (3.5 inches squared) Greenhouse Megastore CN-TRK-1835
Sucrose Research Products International Corp. S24060
Thermocycler ThermoFisher Scientific A24811
Thiamine HCl Sigma T4625-5G
Timentin Ticarcillin/Clavulanate (15/1) (Timentin) Gold Biotechnology T-104
trans-Zeatin Riboside (ZR) Gold Biotechnology Z-100
Tryptone Thermofisher Scientific 211705
Wild Type Plantago lanceolata seeds Outsidepride Seed Source, OR, USA F1296 Outsidepride.com
Yeast Extract Granulated Research Products International Corp. Y20025-1000 

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<em>एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेसिएन्स-नैरोलीफ</em> प्लांटेन का आनुवंशिक परिवर्तन
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