Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة لإنشاء نموذج فأر من السحار السيليكي من خلال التعرض المتكرر لمعلقات السيليكا عن طريق التنقيط الأنفي. يمكن لهذا النموذج أن يحاكي بكفاءة وسهولة ومرونة العملية المرضية لداء السيليكات البشري مع قابلية عالية للتكرار والاقتصاد.
Abstract
يمكن أن يحدث السحار السيليسي بسبب التعرض لغبار السيليكا البلوري التنفسي (CSD) في بيئة صناعية. تمت دراسة الفيزيولوجيا المرضية والفحص والعلاج من السحار السيليسي في البشر على نطاق واسع باستخدام نموذج السحار السيليسي للفئران. من خلال جعل الفئران تستنشق CSD بشكل متكرر في رئتيها ، يمكن للفئران تقليد الأعراض السريرية لداء السيليكات البشري. هذه المنهجية عملية وفعالة من حيث الوقت والإخراج ولا تسبب إصابة ميكانيكية للجهاز التنفسي العلوي بسبب الجراحة. علاوة على ذلك ، يمكن لهذا النموذج أن يحاكي بنجاح عملية التحول الحاد / المزمن للسحار السيليسي. وكانت الإجراءات الرئيسية على النحو التالي. تم طحن مسحوق CSD المعقم 1-5 ميكرومتر بالكامل ، وتعليقه في محلول ملحي ، وتشتيت في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة. تحولت الفئران تحت التخدير الناجم عن الأيزوفلوران من التنفس السريع الضحل إلى الشفط العميق البطيء لمدة 2 ثانية تقريبا. تم وضع الماوس في راحة اليد ، ولمس طرف الإبهام بلطف حافة شفة فك الماوس لتقويم مجرى الهواء. بعد كل زفير ، تنفست الفئران في تعليق السيليكا قطرة قطرة من خلال فتحة أنف واحدة ، وتكمل العملية في غضون 4-8 ثوان. بعد أن استقر تنفس الفئران ، تم ضرب صدرها ومداعبتها لمنع استنشاق CSD من السعال. ثم أعيدت الفئران إلى القفص. في الختام ، يمكن لهذا النموذج تحديد CSD على طول الممر الفسيولوجي النموذجي للجزيئات الصغيرة إلى الرئة ، من الجهاز التنفسي العلوي إلى القصيبات الطرفية والحويصلات الهوائية. يمكنه أيضا تكرار التعرض المتكرر للموظفين بسبب العمل. يمكن تنفيذ النموذج من قبل شخص واحد ولا يحتاج إلى معدات باهظة الثمن. إنه يحاكي بشكل ملائم وفعال ميزات مرض السيليكات البشري مع قابلية عالية للتكرار.
Introduction
يتعرض العمال حتما لغبار السيليكا البلوري غير المنتظم (CSD) ، والذي يمكن استنشاقه وهو أكثر سمية في العديد من السياقات المهنية ، بما في ذلك التعدين والفخار والزجاج ومعالجة الكوارتز والخرسانة 1,2. تسبب حالة استنشاق الغبار المزمنة المعروفة باسم السحار السيليسي تليف الرئة التدريجي3. وفقا للبيانات الوبائية ، انخفض معدل الإصابة بداء السيليكاتيس على مستوى العالم خلال العقود القليلة الماضية ، ولكن في السنوات الأخيرة ، كان يتزايد ويؤثر على الشباب4،5،6. تمثل الآلية الأساسية لداء السيليكاتس تحديا كبيرا للبحث العلمي بسبب بدايته الخبيثة وفترة الحضانة الطويلة. لا يزال من غير المعروف كيف يتطور السحار السيليسي. علاوة على ذلك ، لا توجد أدوية حالية يمكن أن توقف تطور السحار السيليسي والتليف الرئوي العكسي.
تتضمن نماذج الفئران الحالية للسحار السيليسي ابتلاع القصبة الهوائية لتعليق مختلط من CSD. على سبيل المثال ، إعطاء CSD في الرئتين عن طريق اعتماد صدمة القصبة الهوائية العنقية بعد التخدير لا يتوافق مع التعرض البشري المتكرر لصبغالغبار 7. يمكن دراسة تأثير التعرض للغبار المحيط على الأفراد من خلال تعريضهم ل CSD في شكل الهباء الجوي ، والذي يعكس بدقة أكبر التركيزات البيئية لهذه المادةالسامة 8. ومع ذلك ، لا يمكن ببساطة استنشاق CSD البيئي مباشرة في الرئتين بسبب التركيب الفسيولوجي الفريد لأنف الفأر9. علاوة على ذلك ، فإن المعدات المرتبطة بهذه التكنولوجيا باهظة الثمن ، مما دفع الباحثين إلى إعادة تقييم نموذج السحارالسيليسي للفأر 10. عن طريق استنشاق تعليق CSD من خلال بالتنقيط الأنفي خمس مرات في غضون 2 أسابيع ، كان من الممكن بناء نموذج ديناميكي من السحار السيليسي. هذا النموذج متسق وآمن مع سهولة الاستخدام. من المهم ملاحظة أن هذه الدراسة تسمح بالاستنشاق المتكرر ل CSD في الفئران. من المتوقع أن يكون نموذج السحار السيليسي للفأر الذي تم إنشاؤه من خلال هذا الإجراء أكثر فائدة لمتطلبات البحث.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
اتبعت جميع الإجراءات المبادئ التوجيهية لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر (منشور المعاهد الوطنية للصحة رقم 8023 ، المنقح عام 1978) وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها في كلية الطب بجامعة آنهوي للعلوم والتكنولوجيا.
1. إدارة وتغذية الفئران
- قم بتعيين 20 فأرا ذكرا C57BL / 6 سليما للمجموعات التجريبية أو المركبات بنسبة 1: 1. تأقلم الفئران مع البيئة الجديدة لمدة 1 أسبوع.
- توفير وقت إضاءة ثابت يبلغ 12 ساعة في اليوم. استخدم مفتاح التحكم في الوقت للحصول على توقيت دقيق.
2. إعداد تعليق CSD
- على الأقل 1 يوم قبل قطرات الأنف ، وطحن السيليكا في هاون العقيق لمدة 0.5 ساعة.
- مراقبة حجم وشكل جزيئات الكريستال. التقط صورا تمثيلية باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM).
- استخدم شريطا موصلا لربط الجسيمات لتحضير العينة ل SEM. استخدم مجفف الشعر للتخلص برفق من جزيئات السيليكون غير المرتبطة بإحكام.
- قم بإخلاء غرفة العينة ، وقم بتشغيل الضغط العالي ، والتقط الصورة.
ملاحظة: مسافة العمل (WD) بين العدسة والعينة 5.9 مم ، والجهد المتسارع 2.0 كيلو فولت ، والتكبير (Mag) 100000 ضعف ، باستخدام كاشف SignalA. يتم تشتيت الجسيمات مع تبلور غير منتظم ، وحوالي 80 ٪ يبلغ قطرها 1-5 ميكرومتر (الشكل 1 أ).
- اصنع معلقا معقم CSD عيار 20 مجم / مل. تمييع CSD باستخدام محلول ملحي معقم ومزجه مع شاكر بالموجات فوق الصوتية (40 كيلو هرتز ، 80 واط) في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة.
- حرك واخلط معلق CSD جيدا على خلاط دوامة لمدة 10 ثوان قبل إعطاء قطرات الأنف.
3. إعطاء قطرات الأنف للفأر
- تخدير فأر بسرعة باستخدام 2٪ إيزوفلوران بجرعة 3.6 مل / ساعة في جهاز التخدير (الشكل 1 ب ، اللوحة اليسرى).
ملاحظة: يجب إجراء التخدير في غطاء دخان لتجنب استنشاق المخدر من قبل الفني. التأكد من عمق التخدير الكافي من خلال ملاحظة التغير من التنفس السريع وغير المنتظم إلى حالة بطيئة وثابتة في الفئران. - بالتنقيط 50 ميكرولتر من CSD عن طريق الأنف في غضون 4-8 ثوان (الشكل 1 ب ، يمين).
- بالنسبة للتنقيط الأنفي ، ضع رأس الماوس على مفصل مشط القدم للباحث بطرف السبابة.
- حافظ على الماوس في وضع الانبطاح ، مع ثني أربعة أصابع قليلا ولمس طرف الإبهام برفق الشفة السفلية للماوس لتقويم مجرى الهواء. تجنب لمس البلعوم لاستنباط منعكس الكمامة.
- نضح 50 ميكرولتر من السائل باستخدام ماصة 200 ميكرولتر. أسقط السائل في تجويف أنف الفأر في ثلاث إلى أربع جرعات مقسمة حسب معدل تنفس الفأر. يجب أن يتكون كل تقطير من 15 إلى 20 ميكرولتر سائل. إدارة بالتنقيط مرة واحدة كل 3 أيام ، 5x في غضون 12 يوما. علاج الماوس السيطرة مع كمية متساوية من المياه المالحة.
- تدليك بلطف منطقة القلب من الماوس 5x-10x لمدة 5 ثوان.
- امسك جسم الفأر براحة اليد ، واضغط على الجلد على الجزء الخلفي من الرقبة بالإبهام والسبابة ، وثبت الأطراف الخلفية للفأر بالأصابع الأخرى. ثم اضغط برفق على منطقة نبضات قلب الماوس بإصبع السبابة من اليد الأخرى 5-10 مرات في فترة 5 ثوان.
- عندما يستقر تنفس الفأر ، ضعه في قفص استرداد مع وسادة تدفئة وراقبه حتى يتعافى من التخدير ، ثم أعد الماوس إلى قفصه المنزلي. التضحية بالماوس في 31 يوما.
4. جمع أنسجة الرئة وإعداد قسم البارافين
- حقن 0.18 مل من 10٪ هيدرات الكلورال داخل الصفاق ، مما يضمن عدم استجابة الفئران لتحفيز إصبع القدم أو الذيل (يتم إجراؤه باستخدام ملقط مسنن). ثم انتقل إلى الخطوة التالية.
- ثبت أطراف الماوس على لوحة اختبار الرغوة ورشها بالكحول بنسبة 75٪ لترطيب الفراء. قم بإزالة معظم الأضلاع الصدرية عند خط الوسط من الترقوة وافتح التجويف الصدري للفئران لكشف القلب والرئتين.
- قم بفتح الأذين الأيمن على الفور باستخدام مقص جراحي للعيون وحقن 20 مل من محلول الفوسفات (PBS) ببطء من طرف القلب عند نبضات الأذين الأيسر بأكبر سعة للسماح بتدفق الدم كله. بعد ذلك ، قم بإزالة الفص السفلي من الرئة اليمنى وتخزينه عند -80 درجة مئوية لتحليل النشاف الغربي.
- استمر في تعطير 10 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في نفس الموقع بعد حقن PBS. جمع الرئة المتبقية والحفاظ على العينة في 30 مل من 4 ٪ PFA للتحليل المرضي.
- بعد 72 ساعة من التثبيت ، قم بتضمين العينات في البارافين.
- قم بتجفيف الأنسجة من خلال سلسلة متدرجة من تخفيفات الإيثانول (EtOH) في الماء منزوع الأيونات (60٪ ، 70٪ ، 80٪ ، 90٪ ، 100٪) لمدة 1 ساعة لكل منهما في RT. امسح العينة في غسلتين من الزيلين لمدة 1 ساعة لكل منهما.
- تسلل العينات بشمع البارافين المذاب عن طريق التسخين إلى 50 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. كرر هذه العملية في اسطوانة أخرى. تبريد قوالب الشمع مع الأنسجة لمدة 1 ساعة لتصلب.
- بعد أن يتصلب الشمع ويتم دمج الأنسجة ، استخدم آلة تقسيم البارافين لتقطيع الأنسجة عند 5 ميكرومتر. تم وصف خطوات التقسيم وتركيب الشرائح الدقيقة سابقا11.
ملاحظة: يشار إلى نضح الأنسجة الكافي عن طريق تطوير ارتعاش العضلات والتواء الذيل إلى شكل "S" أو انثناء بعد تلقي 10 مل من 4٪ PFA.
5. أداء تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (HE)
- سخني المناديل الورقية المغروسة بالبارافين على طبق ساخن (60 درجة مئوية) لأكثر من 4 ساعات للسماح بالالتصاق بالشرائح وتحسين إزالة البارافين.
- إزالة الشمع وترطيب أقسام البارافين. انقع الشرائح مع عينات في الزيلين 2x لمدة 30 دقيقة في كل مرة. بعد ذلك ، قم بغمسها في الإيثانول اللامائي ، ثم 95٪ و 85٪ و 75٪ كحول وماء منزوع الأيونات لمدة 5 دقائق على التوالي.
- أداء تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين. تلطيخ الأنسجة في دلو تلطيخ الهيماتوكسيلين لمدة 10 دقائق. اشطفها بالماء الجاري بلطف لمدة 5 دقائق. ثم ، اغمس الشرائح في دلو تلطيخ eosin لمدة 10 ثوان.
- جفف العينات في 75٪ ، 85٪ ، 95٪ ، والإيثانول اللامائي لمدة 5 دقائق لكل منهما. نظف أقسام الأنسجة عن طريق غمرها في الزيلين لمدة 5 دقائق. أغلق القسم بحوالي 60 ميكرولتر من قطرات الراتنج المحايدة. ضع شريحة الغطاء فوق القسم وقم بخفضه بعناية لتجنب فقاعات الهواء.
6. أداء تلطيخ ماسون
- إزالة الشمع وترطيب عينات البارافين ، كما هو مذكور في الخطوة 5.2. ثم ، وصمة عار نوى الخلية مع 50 ٪ من الهيماتوكسيلين Weigert لمدة 10 دقائق. نقع الأنسجة في تسييل الإيثانول الحمضي لمدة 10 ثوان وشطف شرائح الأنسجة بلطف بالماء الجاري لتبييض النوى.
ملاحظة: قم بإعداد محلول تلطيخ الهيماتوكسيلين من Weigert مباشرة قبل الاستخدام. - قم بتلطيخ العينات بقطرات من محلول تلطيخ Lichun الأحمر (40 ميكرولتر لكل شريحة أنسجة) لمدة 7 دقائق واغسلها بمحلول عمل حمضي ضعيف (30٪ حمض الهيدروكلوريك) لمدة 1 دقيقة لإزالة صبغة Lichun الحمراء غير المنضمة.
- اغمسها في 95٪ كحول لمدة 20 ثانية وقم بتجفيفها 2x بالإيثانول اللامائي لمدة 1-3 ثوان لكل منهما. بعد ذلك ، قم بمسح الأنسجة بالزيلين وختمها ب 60 ميكرولتر من قطرات الراتنج المحايدة ، كما هو مذكور في الخطوة 5.4.
7. أداء تلطيخ سيريوس الأحمر
- إزالة الشمع وترطيب أقسام البارافين كما هو مذكور في الخطوة 5.2.
- تسلل الأقسام لمدة 1 ساعة باستخدام محلول تلطيخ أحمر سيريوس.
- تلطيخ نوى الخلية من العينات لمدة 8-10 دقائق مع محلول تلطيخ ماير الهيماتوكسيلين. اشطفها بلطف بالماء الجاري لمدة 10 دقائق. ثم قم بتجفيف ومسح شرائح الأنسجة. قم بإغلاقها كما هو مذكور في الخطوة 5.4.
8. أداء الكيمياء المناعية
- قم بإزالة الشمع وترطيب عينات البارافين كما هو موضح في الخطوة 5.2.
- تسلل العينات بمحلول استرجاع مستضد EDTA 3 مجم / مل يبلغ حوالي 30 مل. تغلي لمدة 20-30 دقيقة. اغسل الأنسجة بالماء منزوع الأيونات ، ثم احتضانها في محلول مخزن بالفوسفات يحتوي على 0.5٪ Tween-20 (PBST) لمدة 5 دقائق.
- نقع العينات لمدة 15 دقيقة مع محلول بيروكسيد الهيدروجين 0.3 ٪ لتعطيل بيروكسيديز الذاتية في العينات. اغسلها 3 مرات باستخدام PBST لمدة 5 دقائق في كل مرة.
ملاحظة: يجب أن يكون محلول بيروكسيد الهيدروجين 0.3٪ طازجا في بيئة مقاومة للضوء. - تتخلل غشاء العينات لمدة 15 دقيقة بمحلول 0.3٪ Triton-100. ثم ، كتلة مع 30-40 ميكرولتر من 5 ٪ ألبومين مصل البقر (BSA) لمدة 1 ساعة.
- قم بإزالة حل الحظر. أضف الأجسام المضادة الأولية المخففة NF-κB (التخفيف 1: 200) و CD68 (التخفيف 1: 1000) واحتضان العينات طوال الليل عند 2-8 درجة مئوية في صندوق مبلل IHC منزلق مجهري لمنع التبخر والضوء.
- في اليوم التالي ، قم بنقلها إلى RT لمدة 1 ساعة. ثم اغسلها باستخدام PBST 3x لمدة 5 دقائق لكل منها.
- احتضان العينات لمدة 1 ساعة في الأجسام المضادة الثانوية التي تحمل علامة بيروكسيديز الفجل المضاد للأرانب (نسبة التخفيف 1: 500) في RT واغسلها باستخدام PBST 3x لمدة 5 دقائق لكل منها.
ملاحظة: تم تخفيف كل من الأجسام المضادة الأولية والثانوية بنسبة 5٪ BSA. - احتضان العينات باستخدام الركيزة 3،3'-Diaminobenzidine (DAB) المقابلة للجسم المضاد المسمى بالإنزيم لمدة 5-20 دقيقة. أوقف التفاعل بالماء منزوع الأيونات عند الوصول إلى كثافة التلوين المثلى.
ملاحظة: يجب تحضير محلول DAB حديثا وحمايته من الضوء. يجب ملاحظة تفاعل تطور اللون في الوقت الفعلي تحت المجهر لتحديد وقت التوقف عن التلطيخ. تظهر العينات الإيجابية تلطيخا شديدا ، في حين أن العينات السلبية لا تطور اللون. - قم بتلطيخ العينات لمدة 30 ثانية باستخدام Weigert hematoxylin. بعد ذلك ، شطف الأنسجة تحت الماء الجاري لمدة 1 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتجفيف شرائح الأنسجة ومسحها وختمها ، كما هو مذكور في الخطوة 5.4.
9. إجراء تحليل النشاف الغربي
- تحلل أنسجة الرئة لاستخراج البروتينات. أضف 200 ميكرولتر من محلول عمل RIPA إلى 20 مجم من أنسجة الرئة.
- تجانس الأنسجة على الجليد لمدة 5 دقائق باستخدام مطحنة كهربائية محمولة واحتضانها لمدة 1 ساعة على الجليد مع هز لطيف. بعد ذلك ، يقوم جهاز الطرد المركزي بالتجانس عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة عند 14800 × جم.
- اجمع المادة الطافية وحدد تركيز البروتين باستخدام مجموعة مقايسة البروتين BCA. اصنع محلول تخزين البروتين باستخدام RIPA عند 6 ميكروغرام / ميكرولتر بروتين. أضف 20 ميكرولتر من مخزن التحميل المؤقت 5x إلى 80 ميكرولتر من محلول البروتين. تعطيل بنية البروتين الثانوية عن طريق تسخين أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المحتوية على البروتين في حمام معدني (100 درجة مئوية) لمدة 20 دقيقة.
- بعد التبريد ، قم بقسمة 100 ميكرولتر من محلول تخزين البروتين في كل أنبوب وتخزين العينات في ثلاجة -80 درجة مئوية. تمييع تركيز البروتين إلى 2-3 ميكروغرام / ميكرولتر مع 1x تحميل العازلة قبل الكهربائي.
ملاحظة: يجب إجراء عملية استخراج البروتين على الجليد. بالنسبة لمحلول عمل RIPA ، أضف 1 ميكرولتر من 100 mM فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF) إلى 99 ميكرولتر من RIPA لمنع تدهور البروتين المفسفر. قم بإعداد مخزن مؤقت للتحميل 1x عن طريق تخفيف المخزن المؤقت للتحميل 5x باستخدام RIPA بنسبة 1: 4. - أضف 20 ميكروغرام من العينات إلى كل بئر وقم بتشغيل الجل. بالنسبة للمواد الهلامية المركزة بنسبة 5٪ ، استخدم 80 فولت لمدة 20 دقيقة للحصول على البروتينات الكهربائية من نفس نقطة البداية. بالنسبة للمواد الهلامية المعزولة بنسبة 10٪ ، قم بتشغيلها عند 100 فولت لمدة 1 ساعة للسماح بفصل البروتينات ذات الأوزان الجزيئية المختلفة قدر الإمكان.
- قم بتنشيط غشاء PVDF مسبقا بالميثانول لمدة 20 ثانية. نقل البروتينات إلى غشاء PVDF باستخدام طريقة النقل الرطب مع تيار 400 مللي أمبير لمدة 1-2 ساعة.
ملاحظة: تأكد من أن خزان الكهربائي وخزان النقل الكهربائي أفقيان. قم بتبريد الخزان بالكامل بالثلج ، حيث تولد عملية نقل الغشاء الكثير من الحرارة. - اغسل الغشاء بمحلول TBST لمدة 5 دقائق في كل مرة ، 5x. ثم ، يحجب مع 5 ٪ BSA أو 5 ٪ الحليب الخالي من الدسم لمدة 1 ساعة. تمييع الأجسام المضادة الأولية NF-κB (1: 1,000) و β-actin (1: 1,000) مع 5٪ BSA. اغمر الشرائط في محلول الأجسام المضادة وهز الشرائط برفق طوال الليل عند 2-8 درجة مئوية.
- اغسل الشرائط باستخدام PBST. بعد ذلك ، قم بتخفيف بيروكسيديز الفجل (HRP) - الجسم المضاد الثانوي المضاد للأرانب (1: 10000) واحتضانها في الجسم المضاد الثانوي المخفف لمدة ساعة واحدة في RT مع اهتزاز لطيف.
- قم بإعداد مطور تلألؤ كيميائي محسن (ECL) ، وقم بإسقاطه على الشريط ، واحتضانه لمدة 3 دقائق.
- فضح الشريط لتصوير هلام لمدة 20 ثانية. قم بقياس القيمة الرمادية للشريط لتقييم مستوى البروتين بواسطة برنامج النظام. استخدم β-أكتين كعنصر تحكم داخلي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم التحقيق في التسبب المحتمل للسحار السيليسي في الفئران باستخدام الطريقة المقترحة. وجدنا أن وزن جسم الفئران في المجموعة التجريبية انخفض بشكل ملحوظ بالنسبة للمجموعة الضابطة وأن وزن الجسم تعافى ببطء بعد التوقف عن التعرض. بسبب الجرعة المثلى المستخدمة هنا ، لم يلاحظ أي وفيات في الفئران المعرضة للسيليكا في هذه التجربة. تظهر خارطة الطريق الفنية للتنقيط الأنفي المتكرر إلى CSD في (الشكل 1). تضمنت الإجراءات الموصوفة سابقا إعداد تعليق CSD ، والتخدير الناجم عن الأيزوفلوران ، والتنقيط الأنفي ، وتدليك الصدر12. لقد أظهرنا ترسب الكولاجين وتمايز الخلايا الليفية العضلية بعد 4 أسابيع من التغذية الثابتة12. لقد استخدمنا طريقة التعرض للغبار هذه لدراسة الآلية الأساسية للتليف الرئوي الناجم عن غبار الفحم. تم العثور على مجموعات فرعية جديدة من البلاعم وتأثير التدخل لفيتامين (د) من خلال تقنية النسخ أحادية الخلية13. في هذه الدراسة ، تسارع تطور التليف الرئوي في الفئران بشكل كبير من خلال التعرض ل CSD ، مما تسبب في تلف الألياف المرنة الطرفية للشعب الهوائية (الشكل 2 والشكل 3). تتكون عقيدات السحار السيليسي من الضامة التي تحتوي على CSD. يتم إثراء عقيدية التليف بالعديد من CSD ، وتبتلع البلاعم الإيجابية CD68 هذه الجسيمات بنشاط. هذه CSDs المودعة تعزز تشكيل بؤر ليفية. كما ذكرنا سابقا ، بعد التعرض ل CSD لمدة 4 أسابيع ، اكتسبت الفئران آفات واضحة ، مثل ترسب الكولاجين في عقيدات الرئة السيليكونية وتلف بنية أنسجة الرئة. كانت هناك أيضا إصابة متواضعة في الأنسجة المحيطة بالشعب الهوائية12. ترتبط العملية البيولوجية لإجهاد ER الناجم عن CSD ب NF-κB ، الذي يشارك في الاستجابة الالتهابية (انظر الشكل 4). بشكل عام ، تظهر هذه النتائج أن النهج المقترح يمكن أن يحاكي بشكل فعال تطور داء السليك الفئران.
الشكل 1: تم استخدام جزيئات غبار السيليكا البلورية (CSD) التي تقل عن خمسة ميكرونات للتنقيط الأنفي. (أ) أظهر الفحص المجهري الإلكتروني الماسح (SEM) ل CSD أن الجسيمات كانت غير منتظمة الشكل. (ب) تم استخدام معلق CSD لإعداد نموذج السحار السيليسي للفأر بالتنقيط الأنفي. يتم استخدام الجهاز الموجود على اليسار لتخدير الأيزوفلوران ، وتحدد اللوحة اليمنى النقاط الرئيسية التي تؤدي إلى عمل التنقيط الأنفي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: أظهر تلطيخ سيريوس الأحمر تليف في رئتي الفأر عن طريق التنقيط الأنفي CSD لمدة شهر واحد. (أ) تم إجراء تلطيخ سيريوس الأحمر لقياس ترسب الكولاجين في أنسجة الرئة بعد CSD أو العلاج بالمحلول الملحي (الجزء العلوي الأيسر والأيسر السفلي في الأجزاء). كشف الفحص المجهري المستقطب عن ثلاثة أنواع مختلفة من ألياف الكولاجين (الأحمر والأصفر والأخضر) ، منها ألياف الكولاجين من النوع 1 الموضحة باللون الأحمر هي عامل خطر للإصابة بالسيليكا. ومع ذلك ، لم يتم العثور على تليف كبير في مجموعة المركبات (الألواح اليمنى والسفلية). (B) درجة التليف (FS) هو مؤشر تقييم شبه كمي يعتمد على تلطيخ سيريوس الأحمر12 والذي يختلف اختلافا كبيرا عن عنصر التحكم (***P < 0.0001). شريط المقياس = 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تلطيخ الكيمياء الهيستولوجية المناعية ل CD68 في رئة الفأر المعالجة ب CSD لمراقبة دور البلاعم في تكوين العقيدات السيليكاوتية. تتميز عقيدة السيليكا النموذجية بنخر مسال بعد البلعمة من CSD في المركز ، وتحيط بها الضامة في المحيط (تلطيخ HE). بالإضافة إلى ذلك ، تم إثراء CSD في العقيدات ، يرافقه تليف (تلطيخ ماسون). كشف تلطيخ الكيمياء المناعية ل CD68 أن البلاعم كانت موجودة على نطاق واسع في أنسجة الرئة. علاوة على ذلك ، ابتلعت هذه البلاعم CSD (التي تظهر تحت المجهر الضوئي المستقطب ، اللوحة اليمنى) ، مما تسبب في إصابة شديدة في الرئة. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: تعبير NF-κB في رئة الفأر المعالجة ب CSD . (أ) أجريت عملية تلطيخ الكيمياء الهيستولوجية المناعية على أنسجة الرئة. أظهرت رئة الفئران المعالجة ب CSD في الجزء الأيمن تلطيخا عاليا ل NF-κB مقارنة بمجموعة المركبات الموجودة على اليسار. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (B) أظهرت اللطخة الغربية التمثيلية أن الفئران المعالجة ب CSD لديها تعبير NF-κB متزايد في الرئة. تعرض تحلل أنسجة الرئة الطازجة للنشاف الغربي. (ج) كان الفرق NF-κB بين مجموعتي Sil و Veh كبيرا (** P < 0.01). تم قياس شدة النطاق باستخدام الصورة J. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تعتبر نماذج فأر السحار ضرورية لدراسة التسبب في مرض السيليكا. يصف هذا البروتوكول طريقة لإعداد نموذج من السحار السيليسي في الفئران من خلال التعرض المتكرر للأنف. تسمح هذه الطريقة بدراسة الخصائص المرضية للسحار السيليسي الناجم عن أوقات التعرض المختلفة. تم تخدير الفئران على جهاز التنفس الصناعي ، وتم مراقبة معدل تنفسها. تباطأ معدل التنفس الأولي القصير والسريع تدريجيا وتعمق بمرور الوقت. تسبب التخدير في استرخاء عضلات الفئران ، مما أدى إلى التنفس العميق والسماح لهم باستنشاق CSD خلال نافذة زمنية من التنفس البطيء والعميق. خلال هذه العملية ، يمسك المشغل الفك السفلي للفأر بإبهامه ويعدل رقبته لمنع السائل من دخول الجهاز الهضمي ، وهي طريقة للتعرض للغبار القابل للتنفس والتي لا تسبب الألم وغير الغازية. يمكن أن تلبي هذه الطريقة الاحتياجات الفردية للتنفيذ المتكرر لدراسة التعرض للغبار. استخدم Kato et al. في عام 2017 جرعة واحدة كبيرة (125 مجم / مل ، 40 ميكرولتر) عبر التنقيط الفموي البلعومي لنمذجة التليف الرئوي ، ونشير إلى هذا التركيز لمحاولة استكشاف التغيرات الرئوية التي تسببها جرعات صغيرة متعددة من خلال تجويف الأنف14.
هناك العديد من التحديات المرتبطة بالتنقيط الأنفي بعد التخدير من وجهة نظر فنية. خلال هذه العملية ، يمسك المشغل الفك السفلي للفأر بإبهامه لتقويم رقبته ومنع السائل من دخول الجهاز الهضمي. إذا لم تحقق الفئران تخديرا عميقا أو لم يكن المشغل ماهرا ويفتقد النافذة الزمنية للتنفس العميق البطيء ، فلن يكون تأثير التنقيط الأنفي والخصائص المرضية للنموذج كما هو متوقع. لذلك ، لتجنب الموت المفرط للتخدير وفشل النمذجة تحت التخدير ، يجب تدريب أولئك الذين يعملون مع الفئران المخدرة بالإيزوفلوران بشكل كاف وإتقان الخصائص الحرجة للفئران المخدرة بالإيزوفلوران قبل إجراء التنقيط الأنفي. علاوة على ذلك ، فإن الضغط على صدر الفئران بعد التنقيط الأنفي ، والذي يطلق عليه عادة التدليك ، يعزز سفر CSD للوصول إلى القصبات الهوائية وحتى الجدران السنخية للرئتين. كانت الفئران التي تم تخديرها إلى مستوى عميق عرضة للاختناق عندما تلقت جرعة عالية من قطرات الأنف. ومع ذلك ، إذا تم ضغط صدرهم بسرعة ، زاد معدل البقاء على قيد الحياة. أخيرا وليس آخرا ، يتطلب إنشاء نماذج السحار السيليسي الفئران ذات الأساس المادي السليم ، وقد أوضحت بعض الدراسات أن الفئران التي يزيد عمرها عن 10-12 أسبوعا لديها تحمل ضعيف وزيادة معدل الوفيات بعد التعرض المتكرر ل CSD. على الرغم من مزاياه ، فإن هذا النموذج له عيوب عديدة. عيب واحد هو أن الماوس لا يستنشق جزيئات الغبار مباشرة من خلال تدفق الهواء. لمعالجة هذه المشكلة ، قمنا بالحد من كمية تعليق CSD التي يتم استنشاقها في نفس واحد وتكرار الإدارة المتكررة ل CSD. علاوة على ذلك ، أنشأنا مجموعات المركبات. تكشف البيانات أن استنشاق كمية صغيرة من السائل يعطل التهوية مؤقتا فقط ، مما لن يضر رئتي الفئران12. سوف تمتص فئران التحكم في السيارة السائل الملحي المستنشق بسرعة دون التأثير على وظيفة الرئة في الفئران أو وزن الجسم أو النشاط الأساسي. على العكس من ذلك ، فإن التعرض المتكرر ل CSD من خلال استنشاق الأنف يمكن أن يخلق النموذج الديناميكي المطلوب من السحار السيليسي في الفئران12. نظرا لأن ترددات التعرض المختلفة تؤثر على عملية التليف في النماذج ذات التعرضات المتكررة ، فليس لدينا نقطة زمنية واضحة. عادة ، بالنسبة للتعرض لمرة واحدة لغبار السيليكا ، لا يزال اليوم 7 في المراحل المبكرة من السحار السيليسي. تتوافق الأيام 7-14 مع مرحلة النشاط الالتهابي ، وتتطابق الأيام 14-28 مع مرحلة تحول التليف ، والوقت بعد اليوم 28 يتوافق مع مرحلة تكوين التليف12,15. ومع ذلك ، يمكن أن تختلف الأمراض في هذه النقاط الزمنية اعتمادا على الجرعة.
تتميز طريقة التنقيط الأنفي بالعديد من المزايا مقارنة بالقطرات الرغامية التقليدية أو طرق فغر القصبة الهوائية المكشوفة جراحيا16,17 ، مثل تقليل الالتهابات المرتبطة ببضع القصبة الهوائية والرعاية بعد العملية الجراحية. يمكن أن يلبي هذا النهج أيضا متطلبات التعرض المتكرر ل CSD أثناء تجربة واحدة ولا يتطلب معدات باهظة الثمن. بالإضافة إلى ذلك ، فإن طريقة التنقيط الأنفي هي تمثيل أكثر واقعية للتعرض للغبار ، حيث تدخل جزيئات صغيرة إلى الرئتين من الجهاز التنفسي العلوي وتنتقل إلى القصيبات الطرفية والحويصلات الهوائية. نظرا لأننا نستخدم جرعات صغيرة متعددة من قطرات السيليكا ، يمكن أن تدخل جرعة غبار السيليكا إلى الرئة إلى أقصى حد وتحفز الكائن الحي باستمرار. وبالتالي ، تم تطوير نهج النمذجة هذا لمحاكاة التعرض المتكرر للموظفين ل CS في بيئة عملهم واستكشاف العملية المرضية للسحار السيليسي.
يمكن تطبيق إنشاء نماذج فأر من السحار السيليسي عن طريق التعرض الأنفي ل CSD على التعرضات المتكررة. لذلك ، يمكن استخدام هذا النموذج الحيواني لدراسة آثار تكرار التعرض والجرعات على تطور السحار السيليسي والسمات المرضية الديناميكية وآليات السحار السيليسي. علاوة على ذلك ، فإن التعرض المشترك لمواد أو أدوية أخرى أمر ممكن للغاية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة من قبل برنامج الابتكار التآزري الجامعي لمقاطعة آنهوي (GXXT-2021-077) وصندوق ابتكار الخريجين بجامعة آنهوي للعلوم والتكنولوجيا (2021CX2120).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL tube | Biosharp | BS-05-M | |
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | NA | |
| Adobe Illustrator | Adobe | NA | |
| Alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | NA | |
| CD68 | Abcam | ab125212 | |
| Citrate antigen retrieval solution | biosharp life science | BL619A | |
| DAB chromogenic kit | NJJCBio | W026-1-1 | |
| Dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | NA | |
| Enhanced BCA protein assay kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | Sa00001-2 | |
| Iceacetic acid | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | NA | |
| ImageJ | NIH | NA | |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | |
| Masson's Trichrome stain kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | NA | |
| Microtubes | Millipore | AXYMCT150CS | |
| NF-κB p65 | Cell Signaling Technology | 8242S | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | NA | |
| Paraffin embedding machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | NA | |
| Phosphate buffer (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | NA | |
| Pipettes | Eppendorf | NA | |
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| Prism7.0 | GraphPad | Version 7.0 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA lysis buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | NA | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxid | Sigma | #BCBV6865 | |
| Sirius red staining | Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd. | 181012 | |
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips (0.1–10 µL) | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips (100–1000 µL) | KIRGEN | KG1313 | |
| Universal Pipette Tips (1–200 µL) | KIRGEN | KG1212 | |
| Vortex mixer | VWR | NA | |
| ZEISS GeminiSEM 500 | Zeiss Germany | SEM 500 | |
| β-actin | Bioss | bs-0061R |
References
- Olsson, A., Kromhout, H. Occupational cancer burden: the contribution of exposure to process-generated substances at the workplace. Molecular Oncology. 15 (3), 753-763 (2021).
- The Lancet Respiratory. The world is failing on silicosis. The Lancet. Respiratory Medicine. 7 (4), 283 (2019).
- Weissman, D. N. Progressive massive fibrosis: An overview of the recent literature. Pharmacology & Therapeutics. 240, 108232 (2022).
- Lancet, C. C., Yu, I. T., Chen, W.
- Mazurek, J. M., Wood, J., Blackley, D. J., Weissman, D. N. Coal workers' pneumoconiosis-attributable years of potential life lost to life expectancy and potential life lost before age 65 years - United States, 1999-2016. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (30), 819-824 (2018).
- Voelker, R. Black Lung resurgence raises new challenges for coal country physicians. JAMA. 321 (1), 17-19 (2019).
- Nakashima, K., et al. Regulatory role of heme oxygenase-1 in silica-induced lung injury. Respiratory Research. 19 (1), 144 (2018).
- Li, Y., et al. Minute cellular nodules as early lesions in rats with silica exposure via inhalation. Veterinary Sciences. 9 (6), 251 (2022).
- Salehi, F., et al. Immunological responses in C3H/HeJ mice following nose-only inhalation exposure to different sizes of beryllium metal particles. Journal of Applied Toxicology. 29 (1), 61-68 (2009).
- Yang, T., et al. Emodin suppresses silica-induced lung fibrosis by promoting Sirt1 signaling via direct contact. Molecular Medicine Reports. 14 (5), 4643-4649 (2016).
- Cornell, W. C., et al. Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
- Mu, M., et al. Coal dust exposure triggers heterogeneity of transcriptional profiles in mouse pneumoconiosis and Vitamin D remedies. Particle and Fibre Toxicology. 19 (1), 7 (2022).
- Kato, K., et al. Muc1 deficiency exacerbates pulmonary fibrosis in a mouse model of silicosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 493 (3), 1230-1235 (2017).
- Liu, F., et al. CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells depletion may attenuate the development of silica-induced lung fibrosis in mice. PLoS One. 5 (11), 15404 (2010).
- Mansouri, N., et al. Mesenchymal stromal cell exosomes prevent and revert experimental pulmonary fibrosis through modulation of monocyte phenotypes. JCI Insight. 4 (21), 128060 (2019).
- Ohtsuka, Y., Wang, X. T., Saito, J., Ishida, T., Munakata, M. Genetic linkage analysis of pulmonary fibrotic response to silica in mice. The European Respiratory Journal. 28 (5), 1013-1019 (2006).
