Summary
Denne protokollen beskriver en metode for å etablere en musemodell av silikose gjennom gjentatt eksponering for silikasuspensjoner via et nesedrypp. Denne modellen kan effektivt, praktisk og fleksibelt etterligne den patologiske prosessen med human silikose med høy repeterbarhet og økonomi.
Abstract
Silikose kan skyldes eksponering for respiratorisk krystallinsk silikastøv (CSD) i et industrielt miljø. Patofysiologien, screening og behandling av silikose hos mennesker har alle blitt grundig studert ved hjelp av musesilikosemodellen. Ved gjentatte ganger å få mus til å inhalere CSD i lungene, kan musene etterligne de kliniske symptomene på human silikose. Denne metoden er praktisk og effektiv når det gjelder tid og produksjon og forårsaker ikke mekanisk skade på øvre luftveier på grunn av kirurgi. Videre kan denne modellen med hell etterligne akutt / kronisk transformasjonsprosess av silikose. Hovedprosedyrene var som følger. Det steriliserte 1-5 μm CSD-pulveret ble fullstendig malt, suspendert i saltvann og dispergert i et ultralydsvannbad i 30 minutter. Mus under isoflurindusert anestesi skiftet fra grunn, rask pust til dyp, langsom aspirasjon i ca. 2 s. Musen ble plassert i håndflaten, og tommelspissen berørte forsiktig leppekanten av musens kjeve for å rette luftveiene. Etter hver utånding pustet musene inn silikasuspensjonen dråpe for dråpe gjennom ett nesebor, og fullførte prosessen innen 4-8 s. Etter at musens pust hadde stabilisert seg, ble brystet strøket og kjærtegnet for å forhindre at den inhalerte CSD ble hostet opp. Musene ble deretter returnert til buret. Avslutningsvis kan denne modellen kvantifisere CSD langs den typiske fysiologiske passasjen av små partikler i lungen, fra øvre luftveier til terminale bronkioler og alveoler. Det kan også gjenskape den tilbakevendende eksponeringen av ansatte på grunn av arbeid. Modellen kan utføres av en person og trenger ikke dyrt utstyr. Det simulerer praktisk og effektivt sykdomsegenskapene til human silikose med høy repeterbarhet.
Introduction
Arbeidere er uunngåelig utsatt for uregelmessig krystallinsk silikastøv (CSD), som kan inhaleres og er mer giftig i mange yrkesmessige sammenhenger, inkludert gruvedrift, keramikk, glass, kvartsbehandling og betong 1,2. En kronisk støvinnåndingstilstand kjent som silikose forårsaker progressiv lungefibrose3. Ifølge epidemiologiske data har forekomsten av silikose gått ned globalt de siste tiårene, men de siste årene har den økt og påvirket yngre mennesker 4,5,6. Den underliggende mekanismen for silikose gir en betydelig utfordring for vitenskapelig forskning på grunn av sin lumske begynnelse og langvarige inkubasjonsperiode. Det er fortsatt ukjent hvordan silikose utvikler seg. Videre kan ingen nåværende medisiner stoppe utviklingen av silikose og reversere lungefibrose.
De nåværende musemodellene for silikose involverer trakeal inntak av en blandet suspensjon av CSD. For eksempel, administrering av CSD i lungene ved å vedta cervical trachea trachea traumer etter anestesi ikke i samsvar med gjentatt menneskelig eksponering for fargestoffstøv 7. Virkningen av eksponering for omgivende støv på individer kan studeres ved å utsette dem for CSD i form av aerosoler, som mer nøyaktig reflekterer miljøkonsentrasjonene av dette giftige stoffet8. Imidlertid kan miljømessig CSD ikke bare inhaleres direkte inn i lungene på grunn av den unike fysiologiske strukturen til musenesen9. Dessuten er utstyret knyttet til denne teknologien dyrt, noe som har fått forskere til å revurdere musesilikosemodellen10. Ved å inhalere CSD-suspensjon gjennom et nesedrypp fem ganger innen 2 uker, var det mulig å bygge en dynamisk modell av silikose. Denne modellen er konsistent og trygg samtidig som den er enkel å bruke. Det er viktig å merke seg at denne studien tillater gjentatt innånding av CSD hos mus. Mus silikosemodellen opprettet gjennom denne prosedyren forventes å være mer gunstig for forskningskrav.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer fulgte retningslinjene i National Institutes of Health's Guide for Care and Use of Laboratory Animals (NIH publikasjon nr. 8023, revidert 1978) og ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Medical School of Anhui University of Science and Technology.
1. Administrere og mate mus
- Tilordne 20 friske C57BL/6 hannmus til eksperiment- eller kjøretøygruppene i forholdet 1:1. Akklimatiser musene til det nye miljøet i 1 uke.
- Gi en konstant lystid på 12 timer per dag. Bruk en tidskontrollbryter for presis timing.
2. Klargjøring av CSD-suspensjonen
- Minst 1 dag før nesedrypp, slip silika i en agatmørtel i 0,5 timer.
- Vær oppmerksom på størrelsen og formen på krystallpartiklene. Ta representative bilder ved hjelp av skanning elektronmikroskopi (SEM).
- Bruk ledende tape for å binde partiklene for å forberede prøven for SEM. Bruk en hårføner til å forsiktig blåse bort silisiumpartiklene som ikke er godt bundet.
- Evakuer prøvekammeret, slå på høytrykket og ta bildet.
MERK: Arbeidsavstanden (WD) mellom linsen og prøven er 5,9 mm, akselerasjonsspenningen er 2,0 kV, og forstørrelsen (Mag) er 100 000x, ved hjelp av SignalA-detektoren. Partiklene dispergeres med uregelmessig krystallisering, og ca. 80% har en diameter på 1-5 μm (figur 1A).
- Lag en 20 mg/ml steril CSD-suspensjon. Fortynn CSD med steril saltoppløsning og bland den med en ultralydshaker (40 kHz, 80 W) ved romtemperatur (RT) i 30 minutter.
- Rør og bland CSD-suspensjonen grundig på en virvelblander i 10 sekunder før du administrerer nesedryppene.
3. Administrering av nesedrypp til mus
- Bedøv mus raskt med 2 % isofluran i en dose på 3,6 ml/t i en anestesimaskin (figur 1B, venstre panel).
MERK: Anestesi bør utføres i en avtrekkshette for å unngå innånding av bedøvelsen av teknikeren. Sørg for tilstrekkelig dybde av anestesi ved å observere endringen fra rask og uregelmessig pust til en langsom og jevn tilstand hos musene. - Drypp 50 μL av CSD nasalt innen 4-8 s (figur 1B, høyre).
- For nesedryppet, plasser musens hode på forskerens metakarpofalangealleddet med spissen av pekefingeren.
- Hold musen i utsatt stilling, med fire fingre litt bøyd og tuppen av tommelen berører lett underleppen av musen for å rette luftveien. Unngå å berøre svelget for å fremkalle brekningsrefleksen.
- Aspirer 50 μl væske ved hjelp av en 200 μl pipette. Slipp væsken inn i musens nesehule i tre til fire delte doser, avhengig av musens respirasjonsfrekvens. Hver instillasjon skal bestå av 15 til 20 μl væske. Administrer dryppene en gang hver 3. dag, 5x innen 12 dager. Behandle kontrollmusen med like mye saltvann.
- Masser forsiktig musens hjerteområde 5x-10x i 5 s.
- Hold musens kropp med håndflaten, klem huden på baksiden av nakken med tommelen og pekefingeren, og fest musens bakre lemmer med de andre fingrene. Trykk deretter forsiktig på musens hjertebankende område med pekefingeren på den andre hånden 5-10 ganger i løpet av en periode på 5 s.
- Når musens pust har stabilisert seg, plasser den i et gjenopprettingsbur med en varmepute og observer til den gjenoppretter fra anestesi, og returner musen til hjemmeburet. Ofre musen på 31 dager.
4. Samle lungevevet og forberede en parafinseksjon
- Injiser 0,18 ml 10% kloralhydrat intraperitonealt, slik at musene ikke reagerer på tå- eller halestimulering (utført med tannede tang). Fortsett deretter til neste trinn.
- Fest muselemmene på et skumtestbrett og spray med 75% alkohol for å fukte pelsen. Fjern de fleste thoraxribbene på midtlinjen av kragebenet og åpne brysthulen til musene for å avsløre hjertet og lungene.
- Kutt umiddelbart opp høyre atrium med oftalmisk kirurgisk saks og injiser sakte 20 ml fosfatbuffer (PBS) fra hjertespissen ved venstre atrieslag med størst amplitude for å la hele blodet strømme. Fjern deretter den nedre av høyre lunge og oppbevar den ved -80 ° C for vestlig blottingsanalyse.
- Oppbevar 10 ml 4 % paraformaldehyd (PFA) på samme sted etter PBS-injeksjonen. Samle den gjenværende lungen og bevar prøven i 30 ml 4% PFA for patologisk analyse.
- Etter 72 timer fiksering, legg inn prøver i paraffin.
- Dehydrer vevet gjennom en gradert serie etanol (EtOH) fortynninger i avionisert vann (60%, 70%, 80%, 90%, 100%) i 1 time hver ved RT. Fjern prøven i to vasker av xylen i 1 time hver.
- Infiltrer prøvene med smeltet parafinvoks ved oppvarming til 50 °C i 2 timer. Gjenta denne prosessen i en annen sylinder. Avkjøl voksformene med vev i 1 time for å herdes.
- Etter at voksen har herdet og vevet er innebygd, bruk en parafinsnittmaskin til å skjære vevet ved 5 μm. De nøyaktige seksjonerings- og glidemonteringstrinnene ble tidligere beskrevet11.
MERK: Tilstrekkelig vevsperfusjon indikeres ved å utvikle muskelrykninger og halevridning i en "S" -form eller fleksjon etter å ha mottatt 10 ml 4% PFA.
5. Utføre hematoksylin og eosin (HE) farging
- Varm det parafininnebygde vevet på en kokeplate (60 °C) i mer enn 4 timer for å tillate vedheft til lysbildene og forbedret deparaffinering.
- Avvoks og hydrat parafinseksjoner. Bløtlegg lysbildene med prøver i xylen 2x i 30 minutter hver gang. Deretter dypper du dem i vannfri etanol, deretter 95%, 85%, 75% alkohol og avionisert vann i henholdsvis 5 minutter.
- Utfør hematoksylin og eosinfarging. Flekk vevet i en hematoksylinfargebøtte i 10 minutter. Skyll dem med forsiktig rennende vann i 5 minutter. Dypp deretter lysbildene i eosinfargebøtta i 10 s.
- Dehydrer prøvene i 75%, 85%, 95% og vannfri etanol i 5 minutter hver. Fjern vevsseksjonene ved å senke dem i xylen i 5 minutter. Forsegl seksjonen med ca. 60 μL nøytrale harpiksdråper. Plasser dekselet over seksjonen og senk det forsiktig for å unngå luftbobler.
6. Utføre Masson farging
- Avvoks og hydratiser parafinprøvene, som nevnt i trinn 5.2. Deretter farger du cellekjernene med 50% Weigerts hematoksylin i 10 minutter. Bløtlegg vevet i sur etanolflytning i 10 s og skyll vevet glir forsiktig med rennende vann for kjerneblåsing.
MERK: Forbered Weigerts hematoksylinfargeløsning umiddelbart før bruk. - Beis prøvene med dråper Lichun rød fargeløsning (40 μL for hvert vevslysbilde) i 7 minutter og vask dem med en svak syrearbeidsløsning (30% saltsyre) i 1 min for å fjerne det ubundne Lichun røde fargestoffet.
- Dypp dem i 95% alkohol i 20 s og dehydrer dem 2x med vannfri etanol i 1-3 s hver. Fjern deretter vevet med xylen og forsegl dem med 60 μL nøytrale harpiksdråper, som nevnt i trinn 5.4.
7. Utføre Sirius rødfarging
- Voks- og hydratparafinseksjoner som nevnt i trinn 5.2.
- Infiltrer seksjonene i 1 time med Sirius rødfargeløsning.
- Farg cellekjernene i prøvene i 8-10 min med Mayer hematoksylinfargeløsning. Skyll dem forsiktig med rennende vann i 10 min. Deretter dehydrerer og fjerner vevslysbildene. Forsegle dem som nevnt i trinn 5.4.
8. Utføre immunhistokjemi
- Voks og hydratiser parafinprøvene som beskrevet i trinn 5.2.
- Infiltrer prøvene med en 3 mg/ml EDTA antigenuthentingsløsning på ca. 30 ml. Kok i 20-30 min. Vask vevet med avionisert vann, og inkuber dem deretter i fosfatbufret oppløsning inneholdende 0,5% Tween-20 (PBST) i 5 minutter.
- Bløtlegg prøvene i 15 minutter med 0,3% hydrogenperoksidoppløsning for å inaktivere den endogene peroksidasen i prøvene. Vask dem 3x med PBST i 5 min hver gang.
MERK: 0,3% hydrogenperoksidoppløsningen må gjøres frisk i et lystett miljø. - Permeabiliser membranen av prøver i 15 minutter med 0,3% Triton-100 løsning. Blokker deretter med 30-40 μL 5% bovint serumalbumin (BSA) i 1 time.
- Fjern blokkeringsløsningen. Tilsett fortynnede primære antistoffer NF-κB (fortynning 1:200) og CD68 (fortynning 1:1000) og inkuber prøvene over natten ved 2-8 °C i et mikroskoplysbilde IHC våtboks for å forhindre fordampning og lys.
- Neste dag, overfør dem til RT i 1 time. Vask dem deretter med PBST 3x i 5 minutter hver.
- Inkuber prøvene i 1 time i kanin anti-mus pepperrotperoksidase-merkede sekundære antistoffer (fortynningsforhold 1:500) ved RT og vask dem med PBST 3x i 5 minutter hver.
MERK: Både primære og sekundære antistoffer ble fortynnet med 5 % BSA. - Inkuber prøver med 3,3'-diaminobenzidin (DAB) substratet som tilsvarer det enzymmerkede antistoffet i 5-20 min. Stopp reaksjonen med avionisert vann når den optimale fargeintensiteten er nådd.
MERK: DAB-løsningen må tilberedes friskt og beskyttet mot lys. Fargeutviklingsreaksjonen bør observeres i sanntid under mikroskopet for å bestemme når du skal slutte å farge. Positive prøver utviser intens farging, mens negative prøver ikke utvikler farge. - Motflekk prøvene i 30 s med Weigert hematoksylin. Skyll deretter vevet under rennende vann i 1 min. Deretter dehydrerer, fjerner og forsegler du vevslysbildene, som nevnt i trinn 5.4.
9. Utføre vestlig blottingsanalyse
- Lyse lungevevet for å trekke ut proteiner. Tilsett 200 μL RIPA arbeidsløsning til 20 mg av lungevevvet.
- Homogeniser vevet på is i 5 min ved hjelp av en håndholdt elektrisk kvern og inkuber i 1 time på is med forsiktig risting. Deretter sentrifugerer du homogenatet ved 4 °C i 15 minutter ved 14 800 x g.
- Samle supernatanten og bestem proteinkonsentrasjonen med BCA-proteinanalysesettet. Lag proteinlagringsløsningen med RIPA ved 6 μg / μL protein. Tilsett 20 μL 5x lastbuffer til 80 μL av proteinlysatet. Forstyrr den sekundære proteinstrukturen ved å varme opp de proteinholdige mikrosentrifugerørene i et metallbad (100 °C) i 20 minutter.
- Etter avkjøling, aliquot 100 μL av proteinlagringsløsningen i hver tube og lagre prøvene i et -80 ° C kjøleskap. Fortynn proteinkonsentrasjonen til 2-3 μg / μL med 1x lastbuffer før elektroforese.
MERK: Proteinekstraksjonsprosessen skal utføres på is. For RIPA-arbeidsløsningen, tilsett 1 μL 100 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) til 99 mikrol RIPA for å hemme fosforylert proteinnedbrytning. Forbered 1x lastebuffer ved å fortynne 5x lastebuffer med RIPA i forholdet 1:4. - Tilsett 20 μg prøver til hver brønn og kjør gelen. For 5% konsentrerte geler, bruk 80 V i 20 minutter for å få proteinene elektroforesert ned fra samme utgangspunkt. For 10% isolerte geler, kjør ved 100 V i 1 time for å tillate proteiner med forskjellige molekylvekter å bli separert så mye som mulig.
- Foraktiver PVDF-membranen med metanol i 20 s. Overfør proteinene til PVDF-membranen ved hjelp av våtoverføringsmetoden med 400 mA strøm i 1-2 timer.
NOTAT: Forsikre deg om at elektroforesetanken og elektrooverføringstanken er horisontale. Avkjøl hele tanken med is, da membranoverføringsprosessen genererer mye varme. - Vask membranen med TBST-oppløsning i 5 min hver gang, 5x. Blokker deretter med 5% BSA eller 5% skummet melk i 1 time. Fortynn de primære antistoffene NF-κB (1:1,000) og β-aktin (1:1,000) med 5% BSA. Senk strimlene i antistoffoppløsningen og rist strimlene forsiktig over natten ved 2-8 °C.
- Vask strimlene med PBST. Deretter fortynnes pepperrotperoksidase (HRP)-konjugert geit-antikanin sekundært antistoff (1:10.000) og inkuberer dem i det fortynnede sekundære antistoffet i 1 time ved RT med forsiktig risting.
- Forbered en forbedret kjemiluminescensutvikler (ECL), slipp den på stripen og inkuber i 3 minutter.
- Utsett stripen til en gelavbildning i 20 sekunder. Mål den grå verdien av stripen for å vurdere proteinnivået av systemprogramvare. Bruk β-aktin som internkontroll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den potensielle patogenesen av silikose hos mus ble undersøkt ved hjelp av den foreslåtte metoden. Vi fant at kroppsvekten til musene i eksperimentgruppen ble redusert signifikant i forhold til kontrollgruppen, og at kroppsvekten gjenvunnet sakte etter opphør av eksponering. På grunn av den optimaliserte dosen som ble brukt her, ble det ikke observert mortalitet hos kiseleksponerte mus i dette eksperimentet. Det tekniske veikartet for gjentatt nesedrypp til CSD er vist i (figur 1). De tidligere beskrevne prosedyrene inkluderte CSD-suspensjonspreparat, isoflurindusert anestesi, nesedrypp og thoraxmassasje12. Vi demonstrerte kollagenavleiring og myofibroblastdifferensiering etter 4 uker med statisk fôring12. Vi har brukt denne støveksponeringsmetoden for å studere den underliggende mekanismen for lungefibrose forårsaket av kullstøv. De nye undergruppene av makrofag og intervensjonseffekten av vitamin D ble funnet gjennom encellet transkriptomteknologi13. I denne studien ble progresjonen av lungefibrose hos mus signifikant akselerert ved eksponering for CSD, noe som forårsaket skade på perifere bronkiale elastiske fibre (figur 2 og figur 3). Silikose knuter er sammensatt av makrofager som inneholder CSD. Fibrose nodulær er beriket med mange CSD, og CD68-positive makrofager oppsluker disse partiklene aktivt. Disse deponerte CSDene fremmer dannelsen av fibrøse foci. Som nevnt tidligere, etter å ha blitt utsatt for CSD i 4 uker, oppnådde mus åpenbare lesjoner, for eksempel kollagenavsetning i silisiumlungeknuter og skade på lungevevstruktur. Det var også beskjeden skade på vevet rundt bronkiene12. Den biologiske prosessen med ER-stress forårsaket av CSD er relatert til NF-κB, som er involvert i den inflammatoriske responsen (se figur 4). Samlet sett viser disse funnene at den foreslåtte tilnærmingen effektivt kan simulere utviklingen av musesilikose.
Figur 1: Krystallinsk silikastøv (CSD) partikler under fem mikron ble brukt til nesedrypp. (A) Skanning elektronmikroskopi (SEM) av CSD viste at partiklene var uregelmessig formet. (B) CSD-suspensjon ble brukt til å forberede musesilikosemodellen ved nesedrypp. Maskinen til venstre brukes til isoflurananestesi, og det høyre panelet skisserer nøkkelpunktene som fører til at nesedryppet fungerer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Siriusrødfarging viste fibrose i muselunger ved nesedrypp CSD i 1 måned. (A) Sirius rødfarging ble utført for å måle kollagenavleiring i lungevev etter CSD eller saltvannsbehandling (venstre øvre og venstre nedre i rutene). Polarisasjonsmikroskopi avslørte tre forskjellige typer kollagenfibre (rød, gul og grønn), hvorav type 1 kollagenfibre vist i rødt er en risikofaktor for silikose. Det ble imidlertid ikke funnet noen signifikant fibrose i kjøretøygruppen (høyre opp- og lavpanel). (B) Fibrosescore (FS) er en semi-kvantitativ evalueringsindeks basert på Sirius rødfarging12 som er signifikant forskjellig fra kontrollen (***P < 0,0001). Skala bar = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Immunhistokjemifarging av CD68 i CSD-behandlet muselunge for å overvåke makrofagenes rolle i en silikotisk knuteforming. En typisk silikaknute er preget av flytende nekrose etter fagocytose av CSD i midten, omgitt av makrofager i periferien (HE-farging). I tillegg ble CSD beriket i knutene, ledsaget av fibrose (Masson-farging). Den immunhistokjemiske fargingen av CD68 viste at makrofager var utbredt til stede i lungevev. Videre hadde disse makrofagene inntatt CSD (sett under polarisert lysmikroskopi, høyre panel), noe som forårsaket alvorlig lungeskade. Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 NF-κB-uttrykk i CSD-behandlet muselunge. (A) Immunhistokjemifarging ble utført på lungevevet. CSD-behandlede mus lunge i høyre rute viste høy NF-κB farging sammenlignet med Kjøretøygruppen på venstre. Skala bar = 50 μm. (B) Representativ western blot viste at CSD-behandlede mus har økt NF-κB-uttrykk i lungen. Fersk lungevevslyse ble utsatt for vestlig blotting. (C) NF-κB-forskjellen mellom Sil- og Veh-gruppene var signifikant (** P < 0,01). Båndintensiteten ble målt med bilde J. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Silikose musemodeller er avgjørende for å studere patogenesen og behandling av silikose. Denne protokollen beskriver en metode for å fremstille en modell av silikose hos mus gjennom gjentatt nasal eksponering. Denne metoden tillater studier av de patologiske egenskapene til silikose indusert av forskjellige eksponeringstider. Mus ble bedøvet på respirator, og respirasjonsfrekvensen ble overvåket. Den første korte, raske pustefrekvensen ble gradvis redusert og dypere over tid. Anestesien førte til at musens muskler slappet av, noe som førte til dyp pusting og lot dem inhalere CSD i et tidsvindu med langsom, dyp pusting. Under denne prosessen holder operatøren musens kjeve med tommelen og retter nakken for å forhindre at væsken kommer inn i fordøyelseskanalen, en metode for respirabel støveksponering som ikke forårsaker smerte og er ikke-invasiv. Denne metoden kan oppfylle de individuelle behovene ved gjentatt implementering for å studere støveksponering. Kato et al. brukte i 2017 en enkelt stor dose (125 mg / ml, 40 μL) via et orofaryngealt drypp for å modellere lungefibrose, og vi refererer til denne konsentrasjonen for å prøve å utforske lungeforandringene indusert av flere små doser gjennom nesehulen14.
Det er flere utfordringer knyttet til etterbedøvelse nesedrypp fra et teknisk synspunkt. Under denne prosessen holder operatøren musens mandibel med tommelen for å rette nakken og for å forhindre at væsken kommer inn i fordøyelseskanalen. Hvis musene ikke oppnår dyp anestesi eller operatøren ikke er dyktig og savner tidsvinduet for langsom dyp pusting, vil effekten av nesedryppet og de patologiske egenskapene til modellen ikke være som forventet. Derfor, for å unngå overbedøvet død og underbedøvet modelleringsfeil, må de som jobber med isofluranbedøvede mus være tilstrekkelig opplært og mestre de kritiske egenskapene til isofluranbedøvede mus før de utfører nesedryppet. Videre presser brystet til musene etter nesedryppet, ofte kalt massasje, CSDs reise for å nå de terminale bronkiene og til og med lungens alveolære vegger. Mus bedøvet til et dypt nivå var utsatt for kvelning når de fikk en høy dose nesedrypp. Men hvis brystet ble raskt komprimert, økte overlevelsesraten. Sist men ikke minst, opprettelsen av silikosemodeller nødvendiggjør mus med et godt fysisk grunnlag, og noen studier har vist at mus eldre enn 10-12 uker har dårlig toleranse og økt dødelighet etter gjentatt eksponering for CSD. Til tross for fordelene har denne modellen flere ulemper. En ulempe er at musen ikke direkte inhalerer støvpartikler gjennom luftstrømmen. For å løse dette problemet har vi begrenset mengden CSD-suspensjon inhalert i et enkelt åndedrag og hyppigheten av gjentatt administrering av CSD. Videre har vi satt opp kjøretøygrupper. Dataene avslører at innånding av en liten mengde væske bare midlertidig forstyrrer ventilasjonen, noe som ikke vil skade lungene til musene12. Kjøretøykontrollmusene vil raskt absorbere den inhalerte saltvannsvæsken uten å påvirke musens lungefunksjon, kroppsvekt eller basal aktivitet. Tvert imot kan gjentatt eksponering for CSD gjennom neseinnånding skape den ønskede dynamiske modellen for silikose hos mus12. Fordi ulike eksponeringsfrekvenser påvirker fibroseprosessen i modeller med gjentatte eksponeringer, har vi ikke et klart tidspunkt. Vanligvis, for en engangseksponering av kiselstøv, er dag 7 fortsatt i de tidlige stadiene silikose. Dag 7-14 tilsvarer det inflammatoriske aktivitetsstadiet, dag 14-28 samsvarer med fibrosetransformasjonsstadiet, og tiden etter dag 28 tilsvarer fibrosedannelsesstadiet12,15. Imidlertid kan patologien på disse tidspunktene variere avhengig av dosen.
Den nasale dryppmetoden har flere fordeler i forhold til tradisjonelle endotrakeale drypp eller kirurgisk eksponerte trakeostomitilnærminger16,17, for eksempel å redusere trakeotomirelaterte infeksjoner og postoperativ behandling. Denne tilnærmingen kan også tilfredsstille kravet om gjentatt CSD-eksponering under ett eksperiment og krever ikke dyrt utstyr. I tillegg er nesedryppmetoden en mer realistisk representasjon av støveksponering, da små partikler kommer inn i lungene fra øvre luftveier og reiser til terminale bronkioler og alveoler. Siden vi bruker flere små doser silikadrypp, kan silikastøvdosen komme inn i lungen i maksimal grad og kontinuerlig stimulere organismen. Dermed er denne modelleringstilnærmingen utviklet for å simulere ansattes tilbakevendende eksponering for datavitenskap i arbeidsmiljøet og for å utforske den patologiske prosessen med silikose.
Opprette musemodeller av silikose via nasal eksponering for CSD kan brukes til gjentatte eksponeringer. Derfor kan denne dyremodellen brukes til å studere effekten av eksponeringsfrekvens og dosering på silikoseprogresjon og de dynamiske patologiske egenskapene og mekanismene for silikose. Videre er kombinert eksponering med andre stoffer eller medisiner også svært mulig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av University Synergy Innovation Program of Anhui Province (GXXT-2021-077) og Anhui University of Science and Technology Graduate Innovation Fund (2021CX2120).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL tube | Biosharp | BS-05-M | |
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | NA | |
| Adobe Illustrator | Adobe | NA | |
| Alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | NA | |
| CD68 | Abcam | ab125212 | |
| Citrate antigen retrieval solution | biosharp life science | BL619A | |
| DAB chromogenic kit | NJJCBio | W026-1-1 | |
| Dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | NA | |
| Enhanced BCA protein assay kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | Sa00001-2 | |
| Iceacetic acid | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | NA | |
| ImageJ | NIH | NA | |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | |
| Masson's Trichrome stain kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | NA | |
| Microtubes | Millipore | AXYMCT150CS | |
| NF-κB p65 | Cell Signaling Technology | 8242S | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | NA | |
| Paraffin embedding machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | NA | |
| Phosphate buffer (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | NA | |
| Pipettes | Eppendorf | NA | |
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| Prism7.0 | GraphPad | Version 7.0 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA lysis buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | NA | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxid | Sigma | #BCBV6865 | |
| Sirius red staining | Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd. | 181012 | |
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips (0.1–10 µL) | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips (100–1000 µL) | KIRGEN | KG1313 | |
| Universal Pipette Tips (1–200 µL) | KIRGEN | KG1212 | |
| Vortex mixer | VWR | NA | |
| ZEISS GeminiSEM 500 | Zeiss Germany | SEM 500 | |
| β-actin | Bioss | bs-0061R |
References
- Olsson, A., Kromhout, H. Occupational cancer burden: the contribution of exposure to process-generated substances at the workplace. Molecular Oncology. 15 (3), 753-763 (2021).
- The Lancet Respiratory. The world is failing on silicosis. The Lancet. Respiratory Medicine. 7 (4), 283 (2019).
- Weissman, D. N. Progressive massive fibrosis: An overview of the recent literature. Pharmacology & Therapeutics. 240, 108232 (2022).
- Lancet, C. C., Yu, I. T., Chen, W.
- Mazurek, J. M., Wood, J., Blackley, D. J., Weissman, D. N. Coal workers' pneumoconiosis-attributable years of potential life lost to life expectancy and potential life lost before age 65 years - United States, 1999-2016. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (30), 819-824 (2018).
- Voelker, R. Black Lung resurgence raises new challenges for coal country physicians. JAMA. 321 (1), 17-19 (2019).
- Nakashima, K., et al. Regulatory role of heme oxygenase-1 in silica-induced lung injury. Respiratory Research. 19 (1), 144 (2018).
- Li, Y., et al. Minute cellular nodules as early lesions in rats with silica exposure via inhalation. Veterinary Sciences. 9 (6), 251 (2022).
- Salehi, F., et al. Immunological responses in C3H/HeJ mice following nose-only inhalation exposure to different sizes of beryllium metal particles. Journal of Applied Toxicology. 29 (1), 61-68 (2009).
- Yang, T., et al. Emodin suppresses silica-induced lung fibrosis by promoting Sirt1 signaling via direct contact. Molecular Medicine Reports. 14 (5), 4643-4649 (2016).
- Cornell, W. C., et al. Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
- Mu, M., et al. Coal dust exposure triggers heterogeneity of transcriptional profiles in mouse pneumoconiosis and Vitamin D remedies. Particle and Fibre Toxicology. 19 (1), 7 (2022).
- Kato, K., et al. Muc1 deficiency exacerbates pulmonary fibrosis in a mouse model of silicosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 493 (3), 1230-1235 (2017).
- Liu, F., et al. CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells depletion may attenuate the development of silica-induced lung fibrosis in mice. PLoS One. 5 (11), 15404 (2010).
- Mansouri, N., et al. Mesenchymal stromal cell exosomes prevent and revert experimental pulmonary fibrosis through modulation of monocyte phenotypes. JCI Insight. 4 (21), 128060 (2019).
- Ohtsuka, Y., Wang, X. T., Saito, J., Ishida, T., Munakata, M. Genetic linkage analysis of pulmonary fibrotic response to silica in mice. The European Respiratory Journal. 28 (5), 1013-1019 (2006).
