Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor het opstellen van een muismodel van silicose door herhaalde blootstelling aan silicasuspensies via een neusinfuus. Dit model kan efficiënt, gemakkelijk en flexibel het pathologische proces van menselijke silicose nabootsen met een hoge herhaalbaarheid en economie.
Abstract
Silicose kan worden veroorzaakt door blootstelling aan respiratoir kristallijn silicastof (CSD) in een industriële omgeving. De pathofysiologie, screening en behandeling van silicose bij mensen zijn allemaal uitgebreid bestudeerd met behulp van het muissilicosemodel. Door muizen herhaaldelijk CSD in hun longen te laten inhaleren, kunnen de muizen de klinische symptomen van menselijke silicose nabootsen. Deze methodologie is praktisch en efficiënt in termen van tijd en output en veroorzaakt geen mechanisch letsel aan de bovenste luchtwegen als gevolg van een operatie. Bovendien kan dit model met succes het acute/chronische transformatieproces van silicose nabootsen. De belangrijkste procedures waren als volgt. Het gesteriliseerde CSD-poeder van 1-5 μm werd volledig gemalen, gesuspendeerd in zoutoplossing en gedurende 30 minuten in een ultrasoon waterbad gedispergeerd. Muizen onder isofluraan-geïnduceerde anesthesie schakelden gedurende ongeveer 2 seconden over van oppervlakkige snelle ademhaling naar diepe, langzame aspiratie. De muis werd in de palm van een hand geplaatst en de duimtop raakte zachtjes de liprand van de kaak van de muis om de luchtweg recht te trekken. Na elke uitademing ademden de muizen de silicasuspensie druppel voor druppel in door één neusgat, waardoor het proces binnen 4-8 s werd voltooid. Nadat de ademhaling van de muizen was gestabiliseerd, werd hun borst gestreeld en gestreeld om te voorkomen dat de geïnhaleerde CSD zou worden opgehoest. De muizen werden vervolgens teruggebracht naar de kooi. Concluderend kan dit model CSD kwantificeren langs de typische fysiologische doorgang van kleine deeltjes in de longen, van de bovenste luchtwegen naar de terminale bronchiolen en longblaasjes. Het kan ook de terugkerende blootstelling van werknemers als gevolg van het werk nabootsen. Het model kan door één persoon worden uitgevoerd en heeft geen dure apparatuur nodig. Het simuleert handig en effectief de ziektekenmerken van menselijke silicose met een hoge herhaalbaarheid.
Introduction
Werknemers worden onvermijdelijk blootgesteld aan onregelmatig kristallijn silicastof (CSD), dat kan worden ingeademd en giftiger is in tal van beroepscontexten, waaronder mijnbouw, aardewerk, glas, kwartsverwerking en beton 1,2. Een chronische aandoening bij het inademen van stof, bekend als silicose, veroorzaakt progressieve longfibrose3. Volgens epidemiologische gegevens is de incidentie van silicose de afgelopen decennia wereldwijd afgenomen, maar de laatste jaren neemt het toe en treft het jongere mensen 4,5,6. Het onderliggende mechanisme van silicose vormt een grote uitdaging voor wetenschappelijk onderzoek vanwege het sluipende begin en de langdurige incubatietijd. Het is nog onbekend hoe silicose ontstaat. Bovendien kan geen enkel huidig medicijn de progressie van silicose en omgekeerde longfibrose stoppen.
De huidige muismodellen voor silicose omvatten tracheale inname van een gemengde suspensie van CSD. Bijvoorbeeld, het toedienen van CSD in de longen door het cervicale luchtpijptrauma na anesthesie over te nemen, voldoet niet aan herhaalde menselijke blootstelling aan kleurstof. Het effect van blootstelling aan omgevingsstof op personen kan worden bestudeerd door hen bloot te stellen aan koolzuurhoudende stoffen in de vorm van aerosolen, die de concentraties van deze giftige stof in het milieu nauwkeuriger weergeven8. CSD uit de omgeving kan echter niet zomaar rechtstreeks in de longen worden ingeademd vanwege de unieke fysiologische structuur van de muizenneus9. Bovendien is de apparatuur die aan deze technologie is gekoppeld duur, wat ertoe heeft geleid dat onderzoekers het muizensilicosemodel10 opnieuw hebben geëvalueerd. Door binnen 2 weken vijf keer CSD-suspensie via een neusinfuus te inhaleren, was het mogelijk om een dynamisch model van silicose op te bouwen. Dit model is consistent en veilig en toch gebruiksvriendelijk. Het is belangrijk op te merken dat deze studie herhaalde inhalatie van CSD bij muizen mogelijk maakt. Het silicosemodel voor muizen dat via deze procedure wordt gemaakt, zal naar verwachting gunstiger zijn voor onderzoeksvereisten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures volgden de richtlijnen van de National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH-publicatie nr. 8023, herzien in 1978) en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Medical School van de Anhui University of Science and Technology.
1. Muizen beheren en voeren
- Wijs 20 gezonde C57BL/6 mannelijke muizen toe aan de experimentele of voertuiggroepen in een verhouding van 1:1. Laat de muizen 1 week wennen aan de nieuwe omgeving.
- Zorg voor een constante lichttijd van 12 uur per dag. Gebruik een tijdschakelaar voor nauwkeurige timing.
2. Voorbereiding van de CSD-schorsing
- Maal het silica ten minste 1 dag voor neusdruppels gedurende 0,5 uur in een agaatvijzel.
- Let op de grootte en vorm van de kristaldeeltjes. Maak representatieve foto's met behulp van scanning-elektronenmicroscopie (SEM).
- Gebruik geleidende tape om de deeltjes te binden om het monster voor te bereiden op SEM. Gebruik een föhn om de siliciumdeeltjes die niet stevig zijn gehecht voorzichtig weg te blazen.
- Evacueer de monsterkamer, zet de hoge druk aan en leg het beeld vast.
NOTITIE: De werkafstand (WD) tussen de lens en het monster is 5.9 mm, de acceleratiespanning is 2.0 kV en de vergroting (Mag) is 100.000x, met behulp van de SignalA-detector. De deeltjes worden onregelmatig gekristalliseerd en hebben voor ongeveer 80% een diameter van 1-5 μm (Figuur 1A).
- Maak een steriele CSD-suspensie van 20 mg/ml. Verdun de CSD met steriele zoutoplossing en meng het met een ultrasone shaker (40 kHz, 80 W) bij kamertemperatuur (RT) gedurende 30 min.
- Roer en meng de CSD-suspensie grondig op een vortexmixer gedurende 10 seconden voordat u de neusdruppels toedient.
3. Toedienen van neusdruppels aan muizen
- Verdoof een muis snel met 2% isofluraan in een dosis van 3,6 ml/uur in een anesthesieapparaat (Figuur 1B, linkerpaneel).
NOTITIE: Anesthesie moet worden uitgevoerd in een zuurkast om inademing van het verdovingsmiddel door de technicus te voorkomen. Zorg voor voldoende diepte van anesthesie door de verandering van snelle en onregelmatige ademhaling naar een langzame en stabiele toestand bij de muizen te observeren. - Druppel 50 μL van de CSD nasaal binnen 4-8 s (Figuur 1B, rechts).
- Plaats voor het neusinfuus de kop van de muis met het topje van de wijsvinger op het metacarpofalangeale gewricht van de onderzoeker.
- Houd de muis in buikligging, met vier vingers licht gebogen en het topje van de duim lichtjes de onderlip van de muis aanrakend om de luchtweg recht te trekken. Vermijd het aanraken van de keelholte om de kokhalsreflex op te wekken.
- Zuig 50 μl vloeistof op met een pipet van 200 μl. Laat de vloeistof in de neusholte van de muis vallen in drie tot vier verdeelde doses, afhankelijk van de ademhalingsfrequentie van de muis. Elke instillatie moet bestaan uit 15 tot 20 μl vloeistof. Dien de druppels eens in de 3 dagen toe, 5x binnen 12 dagen. Behandel de controlemuis met een gelijke hoeveelheid zoutoplossing.
- Masseer zachtjes het hartgebied van de muis 5x-10x gedurende 5 s.
- Houd het lichaam van de muis vast met de handpalm, knijp met de duim en wijsvinger in de huid aan de achterkant van de nek en fixeer de achterpoten van de muis met de andere vingers. Druk vervolgens zachtjes met de wijsvinger van de andere hand 5-10 keer in een periode van 5 seconden op het hartkloppende gebied van de muis.
- Wanneer de ademhaling van de muis is gestabiliseerd, plaatst u hem in een herstelkooi met een verwarmingskussen en observeert u totdat hij herstelt van de anesthesie, en brengt u de muis terug naar zijn thuiskooi. Offer de muis na 31 dagen.
4. Het verzamelen van het longweefsel en het voorbereiden van een paraffinesectie
- Injecteer 0,18 ml 10% chloraalhydraat intraperitoneaal en zorg ervoor dat de muizen niet reageren op teen- of staartstimulatie (uitgevoerd met behulp van de getande pincet). Ga dan verder met de volgende stap.
- Bevestig de muizenledematen op een schuimrubberen testbord en spuit met 75% alcohol om de vacht te bevochtigen. Verwijder het grootste deel van de thoracale ribben in de middellijn van het sleutelbeen en open de borstholte van de muizen om het hart en de longen bloot te leggen.
- Knip onmiddellijk het rechter atrium open met een oogheelkundige chirurgische schaar en injecteer langzaam 20 ml fosfaatbuffer (PBS) uit de hartpunt bij de linker boezemslag met de grootste amplitude om het hele bloed te laten stromen. Verwijder vervolgens de onderste kwab van de rechterlong en bewaar deze bij -80 °C voor western blotting-analyse.
- Blijf na de PBS-injectie 10 ml 4% paraformaldehyde (PFA) op dezelfde plaats doorbloeden. Verzamel de resterende long en bewaar het monster in 30 ml 4% PFA voor pathologische analyse.
- Na 72 uur fixatie de monsters in paraffine inbedden.
- Dehydrateer de weefsels door middel van een graduele reeks ethanol (EtOH)-verdunningen in gedeïoniseerd water (60%, 70%, 80%, 90%, 100%) gedurende elk 1 uur bij RT. Verwijder het monster in twee wasbeurten xyleen gedurende elk 1 uur.
- Infiltreer de monsters met de gesmolten paraffinewas door verhitting tot 50 °C gedurende 2 uur. Herhaal dit proces in een andere cilinder. Koel de wasvormen met tissues gedurende 1 uur om uit te harden.
- Nadat de was is uitgehard en het weefsel is ingebed, gebruikt u een paraffinesnijmachine om het weefsel op 5 μm te snijden. De precieze stappen voor het doorsnijden en monteren van de sledes werden eerder beschreven11.
OPMERKING: Voldoende weefselperfusie wordt aangegeven door het ontwikkelen van spiertrekkingen en het draaien van de staart in een "S"-vorm of flexie na ontvangst van 10 ml 4% PFA.
5. Hematoxyline- en eosine (HE)-kleuring uitvoeren
- Verwarm de in paraffine ingebedde weefsels gedurende meer dan 4 uur op een hete plaat (60 °C) om hechting aan de objectglaasjes mogelijk te maken en de deparaffinatie te verbeteren.
- Dewax en hydrateer paraffinesecties. Week de objectglaasjes met monsters telkens 2x gedurende 30 minuten in xyleen. Dompel ze vervolgens in watervrije ethanol en vervolgens in respectievelijk 95%, 85%, 75% alcohol en gedeïoniseerd water gedurende 5 minuten.
- Voer hematoxyline- en eosinekleuring uit. Kleur de weefsels gedurende 10 minuten in een hematoxylinekleuringsemmer. Spoel ze af met zacht stromend water gedurende 5 minuten. Dompel de objectglaasjes vervolgens 10 s in de eosinekleuringsemmer.
- Dehydrateer de monsters in 75%, 85%, 95% en watervrije ethanol gedurende elk 5 minuten. Maak de weefselsecties vrij door ze gedurende 5 minuten onder te dompelen in xyleen. Sluit de sectie af met ongeveer 60 μL neutrale harsdruppels. Plaats de schuif van het deksel over het gedeelte en laat het voorzichtig zakken om luchtbellen te voorkomen.
6. Masson-kleuring uitvoeren
- Ontwas en hydrateer de paraffinemonsters, zoals vermeld in stap 5.2. Kleur vervolgens de celkernen gedurende 10 minuten met 50% Hematoxyline van Weigert. Week het weefsel gedurende 10 s in zure ethanolliquefactie en spoel de weefselglaasjes voorzichtig af met stromend water om de kernen blauw te maken.
NOTITIE: Bereid de hematoxylinekleuringsoplossing van de Weigert onmiddellijk voor gebruik. - Kleur de monsters gedurende 7 minuten met druppels Lichun rode kleuringsoplossing (40 μL voor elk weefselglaasje) en was ze gedurende 1 minuut met een zwakzure werkoplossing (30% zoutzuur) om de ongebonden rode kleurstof Lichun te verwijderen.
- Dompel ze 20 s in 95% alcohol en dehydrateer ze 2x met watervrije ethanol gedurende 1-3 s elk. Maak daarna de weefsels schoon met xyleen en sluit ze af met 60 μL neutrale harsdruppels, zoals vermeld in stap 5.4.
7. Sirius roodkleuring uitvoeren
- Dewax en hydrateer paraffinesecties zoals vermeld in stap 5.2.
- Infiltreer de secties gedurende 1 uur met Sirius rode kleuringsoplossing.
- Kleuring van de celkernen van de monsters gedurende 8-10 minuten met Mayer hematoxylinekleuringsoplossing. Spoel ze voorzichtig af met stromend water gedurende 10 minuten. Droog vervolgens de weefselglaasjes uit en verwijder ze. Verzegel ze zoals vermeld in stap 5.4.
8. Uitvoeren van immunohistochemie
- Ontwas en hydrateer de paraffinemonsters zoals beschreven in stap 5.2.
- Infiltreer de monsters met een 3 mg/ml EDTA-antigeenoplossing van ongeveer 30 ml. Kook gedurende 20-30 min. Was de weefsels met gedeïoniseerd water en incubeer ze vervolgens gedurende 5 minuten in een fosfaatgebufferde oplossing met 0,5% Tween-20 (PBST).
- Week de monsters gedurende 15 minuten met 0,3% waterstofperoxide-oplossing om het endogene peroxidase in de monsters te inactiveren. Was ze 3x met PBST gedurende 5 minuten per keer.
NOTITIE: De 0.3% waterstofperoxide-oplossing moet vers worden gemaakt in een lichtdichte omgeving. - Permeabiliseer het membraan van monsters gedurende 15 minuten met 0,3% Triton-100-oplossing. Blokkeer vervolgens met 30-40 μL 5% runderserumalbumine (BSA) gedurende 1 uur.
- Verwijder de blokkerende oplossing. Voeg verdunde primaire antilichamen NF-κB (verdunning 1:200) en CD68 (verdunning 1:1.000) toe en incubeer de monsters een nacht bij 2-8 °C in een IHC-natte doos met microscoopglaasje om verdamping en licht te voorkomen.
- Breng ze de volgende dag 1 uur over naar RT. Was ze vervolgens 3x met PBST gedurende 5 minuten elk.
- Incubeer de monsters gedurende 1 uur in met mierikswortelperoxidase gelabelde secundaire antilichamen van konijnen tegen mierikswortelperoxidase (verdunningsverhouding 1:500) bij RT en was ze 3x gedurende 5 minuten met PBST.
OPMERKING: Zowel primaire als secundaire antilichamen werden verdund met 5% BSA. - Incubeer monsters met het 3,3'-diaminobenzidine (DAB)-substraat dat overeenkomt met het enzym-gelabelde antilichaam gedurende 5-20 minuten. Stop de reactie met gedeïoniseerd water wanneer de optimale kleurintensiteit is bereikt.
OPMERKING: De DAB-oplossing moet vers worden bereid en tegen licht worden beschermd. De kleurontwikkelingsreactie moet in realtime onder de microscoop worden geobserveerd om te bepalen wanneer de kleuring moet worden gestopt. Positieve exemplaren vertonen intense kleuring, terwijl negatieve exemplaren geen kleur ontwikkelen. - Kleuring van de monsters gedurende 30 s met Weigert hematoxyline. Spoel de tissues vervolgens 1 minuut onder stromend water. Droog, verwijder en verzegel vervolgens de weefselglaasjes, zoals vermeld in stap 5.4.
9. Uitvoeren van western blotting analyse
- Lyseer het longweefsel om eiwitten te extraheren. Voeg 200 μL RIPA werkoplossing toe aan 20 mg longweefsel.
- Homogeniseer het weefsel gedurende 5 minuten op ijs met behulp van een elektrische handmolen en incubeer gedurende 1 uur op ijs met zacht schudden. Centrifugeer het homogenaat daarna gedurende 15 minuten bij 4 °C bij 14.800 x g.
- Verzamel het supernatans en bepaal de eiwitconcentratie met de BCA-eiwittestkit. Maak de eiwitopslagoplossing met RIPA bij 6 μg/μL eiwit. Voeg 20 μL 5x laadbuffer toe aan de 80 μL van het eiwitlysaat. Verstoor de secundaire eiwitstructuur door de eiwithoudende microcentrifugebuisjes gedurende 20 minuten in een metalen bad (100 °C) te verwarmen.
- Na afkoeling 100 μl van de eiwitopslagoplossing in elke buis gieten en de monsters in een koelkast van -80 °C bewaren. Verdun de eiwitconcentratie tot 2-3 μg/μL met 1x laadbuffer vóór elektroforese.
NOTITIE: Het eiwitextractieproces moet op ijs worden uitgevoerd. Voeg voor de RIPA werkoplossing 1 μL 100 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) toe aan 99 μL RIPA om de afbraak van gefosforyleerd eiwit te remmen. Bereid 1x laadbuffer voor door 5x laadbuffer te verdunnen met RIPA in een verhouding van 1:4. - Voeg 20 μg monsters toe aan elk putje en laat de gel lopen. Gebruik voor 5% geconcentreerde gels 80 V gedurende 20 minuten om de eiwitten vanaf hetzelfde startpunt te elektroforeren. Voor 10% geïsoleerde gels, gedurende 1 uur op 100 V laten draaien om de eiwitten met verschillende molecuulgewichten zoveel mogelijk te kunnen scheiden.
- Activeer het PVDF-membraan vooraf met methanol gedurende 20 s. Breng de eiwitten over naar het PVDF-membraan met behulp van de natte overdrachtsmethode met een stroom van 400 mA gedurende 1-2 uur.
NOTITIE: Zorg ervoor dat de elektroforesetank en de elektrotransfertank horizontaal staan. Koel de hele tank met ijs, want het membraanoverdrachtsproces genereert veel warmte. - Was het membraan met TBST-oplossing gedurende 5 minuten per keer, 5x. Blokkeer vervolgens met 5% BSA of 5% magere melk gedurende 1 uur. Verdun de primaire antilichamen NF-κB (1:1.000) en β-actine (1:1.000) met 5% BSA. Dompel de strips onder in de antilichaamoplossing en schud de strips een nacht zachtjes bij 2-8 °C.
- Was de strips met PBST. Verdun vervolgens mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerd geit anti-konijn secundair antilichaam (1:10.000) en incubeer ze in het verdunde secundaire antilichaam gedurende 1 uur bij RT met zacht schudden.
- Bereid een verbeterde chemiluminescentieontwikkelaar (ECL) voor, laat deze op de strip vallen en incubeer gedurende 3 minuten.
- Stel de strip gedurende 20 seconden bloot aan een gelimager. Meet de grijswaarde van de strip om het eiwitniveau te beoordelen met behulp van systeemsoftware. Gebruik β-actine als interne controle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De potentiële pathogenese van silicose bij muizen werd onderzocht met behulp van de voorgestelde methode. We ontdekten dat het lichaamsgewicht van de muizen in de experimentele groep significant afnam ten opzichte van de controlegroep en dat het lichaamsgewicht langzaam herstelde na stopzetting van de blootstelling. Vanwege de geoptimaliseerde dosis die hier werd gebruikt, werd in dit experiment geen sterfte waargenomen bij aan silica blootgestelde muizen. Het technische stappenplan van herhaalde neusdruppel naar CSD wordt weergegeven in (Figuur 1). De eerder beschreven procedures omvatten CSD-suspensiepreparaat, isofluraan-geïnduceerde anesthesie, neusinfuus en thoracale massage12. We toonden collageenafzetting en myofibroblastdifferentiatie aan na 4 weken statische voeding12. We hebben deze methode van blootstelling aan stof gebruikt om het onderliggende mechanisme van longfibrose veroorzaakt door kolenstof te bestuderen. De nieuwe subsets van macrofagen en het interventie-effect van vitamine D werden gevonden door middel van single-cell transcriptoomtechnologie13. In deze studie werd de progressie van longfibrose bij muizen aanzienlijk versneld door blootstelling aan CSD, wat schade aan bronchiale perifere elastische vezels veroorzaakte (Figuur 2 en Figuur 3). Silicose-knobbeltjes zijn samengesteld uit macrofagen die CSD bevatten. Fibrosis nodulair is verrijkt met veel CSD, en CD68-positieve macrofagen overspoelen deze deeltjes actief. Deze afgezette CSD's bevorderen de vorming van fibreuze haarden. Zoals eerder vermeld, kregen muizen na 4 weken blootstelling aan CSD duidelijke laesies, zoals collageenafzetting in siliciumlongknobbeltjes en schade aan de longweefselstructuur. Er was ook een bescheiden beschadiging van het weefsel rond de bronchiën12. Het biologische proces van ER-stress veroorzaakt door CSD is gerelateerd aan NF-κB, dat betrokken is bij de ontstekingsreactie (zie figuur 4). Over het algemeen tonen deze bevindingen aan dat de voorgestelde aanpak de ontwikkeling van silicose bij muizen effectief kan simuleren.
Figuur 1: Kristallijn silicastof (CSD) deeltjes van minder dan vijf micron werden gebruikt voor neusdruppels. (A) Scanning elektronenmicroscopie (SEM) van CSD toonde aan dat de deeltjes onregelmatig gevormd waren. (B) CSD-suspensie werd gebruikt om het silicosemodel van de muis te bereiden door middel van een neusinfuus. De machine aan de linkerkant wordt gebruikt voor isofluraan-anesthesie en het rechterpaneel schetst de belangrijkste punten die leiden tot de werking van het neusinfuus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Sirius rode kleuring toonde fibrose in muizenlongen door neusinfuus CSD gedurende 1 maand. (A) Sirius-roodkleuring werd uitgevoerd om collageenafzetting in longweefsel te meten na behandeling met CSD of zoutoplossing (linksboven en linksonder in ruiten). Polariserende microscopie onthulde drie verschillende soorten collageenvezels (rood, geel en groen), waarvan type 1 collageenvezels in rood een risicofactor zijn voor silicose. Er werd echter geen significante fibrose gevonden in de voertuiggroep (recht boven en lage panelen). (B) Fibrosescore (FS) is een semi-kwantitatieve evaluatie-index op basis van Sirius-roodkleuring12 die significant verschilt van de controlegroep (***P < 0,0001). Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Immunohistochemische kleuring van CD68 in met CSD behandelde muizenlong om de rol van macrofagen bij de vorming van een silicotische knobbel te monitoren. Een typische silicaknobbel wordt gekenmerkt door vloeibare necrose na fagocytose van CSD in het midden, omgeven door macrofagen in de periferie (HE-kleuring). Bovendien werd CSD verrijkt in de knobbeltjes, vergezeld van fibrose (Masson-kleuring). De immunohistochemische kleuring van CD68 onthulde dat macrofagen op grote schaal aanwezig waren in longweefsel. Bovendien hadden deze macrofagen CSD ingeslikt (te zien onder de gepolariseerde lichtmicroscopie, rechterpaneel), wat ernstig longletsel veroorzaakte. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: De NF-KB-expressie in de met CSD behandelde muizenlong . (A) Immunohistochemische kleuring werd uitgevoerd op het longweefsel. De met CSD behandelde muizenlong op het rechterpaneel vertoonde een hoge NF-KB-kleuring in vergelijking met de voertuiggroep aan de linkerkant. Schaalbalk = 50 μm. (B) Representatieve western blot toonde aan dat de met CSD behandelde muizen een verhoogde NF-κB-expressie in de longen hebben. Verse lysis van longweefsel werd onderworpen aan western blotting. (C) Het NF-κB-verschil tussen de Sil- en Veh-groepen was significant (** P < 0,01). De intensiteit van de band werd gemeten met behulp van afbeelding J. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Silicose muismodellen zijn cruciaal voor het bestuderen van de pathogenese en behandeling van silicose. Dit protocol beschrijft een methode voor het opstellen van een model van silicose bij muizen door herhaalde nasale blootstelling. Deze methode maakt het mogelijk om de pathologische kenmerken van silicose geïnduceerd door verschillende blootstellingstijden te bestuderen. Muizen werden verdoofd aan een beademingsapparaat en hun ademhalingsfrequentie werd gecontroleerd. De aanvankelijke korte, snelle ademhaling vertraagde en verdiepte zich geleidelijk in de loop van de tijd. De anesthesie zorgde ervoor dat de spieren van de muizen ontspanden, wat leidde tot een diepe ademhaling en hen in staat stelde CSD in te ademen tijdens een tijdvenster van langzame, diepe ademhaling. Tijdens dit proces houdt de operator de onderkaak van de muis met zijn duim vast en strekt hij zijn nek om te voorkomen dat de vloeistof het spijsverteringskanaal binnendringt, een methode van blootstelling aan inadembaar stof die geen pijn veroorzaakt en niet-invasief is. Deze methode kan voldoen aan de individuele behoeften van herhaalde toepassing om de blootstelling aan stof te bestuderen. Kato et al. gebruikten in 2017 een enkele grote dosis (125 mg/ml, 40 μL) via een orofaryngeaal infuus om longfibrose te modelleren, en we verwijzen naar deze concentratie om te proberen de pulmonale veranderingen te onderzoeken die worden veroorzaakt door meerdere kleine doses door de neusholte14.
Vanuit technisch oogpunt zijn er verschillende uitdagingen verbonden aan neusdruppels na anesthesie. Tijdens dit proces houdt de operator de onderkaak van de muis met zijn duim vast om zijn nek te strekken en te voorkomen dat de vloeistof het spijsverteringskanaal binnendringt. Als de muizen geen diepe anesthesie bereiken of als de operator niet bekwaam is en het tijdvenster voor langzame diepe ademhaling mist, zullen het effect van de neusdruppel en de pathologische kenmerken van het model niet zijn zoals verwacht. Daarom, om oververdoofde dood en onderverdoofde modellering te voorkomen, moeten degenen die werken met isofluraan-verdoofde muizen adequaat worden opgeleid en de kritieke kenmerken van isofluraan-verdoofde muizen beheersen voordat ze het neusinfuus uitvoeren. Bovendien bevordert het drukken op de borst van de muizen na het neusinfuus, gewoonlijk masseren genoemd, de reis van CSD om de terminale bronchiën en zelfs de alveolaire wanden van de longen te bereiken. Muizen die tot op een diep niveau werden verdoofd, waren vatbaar voor verstikking wanneer ze een hoge dosis neusdruppels kregen. Als hun borstkas echter snel werd samengedrukt, nam het overlevingspercentage toe. Last but not least vereist het maken van silicosemodellen muizen met een solide fysieke basis, en sommige onderzoeken hebben aangetoond dat muizen ouder dan 10-12 weken een slechte tolerantie en een verhoogd sterftecijfer hebben na herhaalde blootstelling aan CSD. Ondanks zijn voordelen heeft dit model verschillende nadelen. Een nadeel is dat de muis stofdeeltjes niet direct inademt via de luchtstroom. Om dit probleem aan te pakken, hebben we de hoeveelheid CSD-suspensie die in één ademteug wordt geïnhaleerd en de frequentie van herhaalde toediening van CSD beperkt. Verder hebben we voertuiggroepen opgezet. Uit de gegevens blijkt dat het inademen van een kleine hoeveelheid vloeistof de ventilatie slechts tijdelijk verstoort, wat de longen van de muizen niet zal beschadigen12. De voertuigcontrolemuizen zullen de ingeademde zoutoplossing snel absorberen zonder de longfunctie, het lichaamsgewicht of de basale activiteit van de muizen te beïnvloeden. Integendeel, herhaalde blootstelling aan CSD door inademing van de neus kan het gewenste dynamische model van silicose bij muizen creëren12. Omdat verschillende blootstellingsfrequenties het fibroseproces beïnvloeden in modellen met herhaalde blootstellingen, hebben we geen duidelijk tijdstip. Meestal, voor een eenmalige blootstelling aan silicastof, is dag 7 nog in de vroege stadia van de silicose. Dag 7-14 komt overeen met het stadium van de ontstekingsactiviteit, dag 14-28 komt overeen met het stadium van fibrosetransformatie en de tijd na dag 28 komt overeen met het stadium van fibrosevorming12,15. De pathologie op deze tijdstippen kan echter variëren, afhankelijk van de dosis.
De nasale infuusmethode heeft verschillende voordelen ten opzichte van traditionele endotracheale infusen of chirurgisch blootgestelde tracheostomiebenaderingen16,17, zoals het verminderen van tracheotomie-gerelateerde infecties en postoperatieve zorg. Deze aanpak kan ook voldoen aan de eis van herhaalde blootstelling aan CSD tijdens één experiment en vereist geen dure apparatuur. Bovendien is de nasale druppelmethode een meer realistische weergave van blootstelling aan stof, aangezien kleine deeltjes vanuit de bovenste luchtwegen de longen binnendringen en naar de terminale bronchiolen en longblaasjes reizen. Omdat we meerdere kleine doses silicadruppels gebruiken, kan de dosis silicastof maximaal in de longen terechtkomen en het organisme continu stimuleren. Daarom is deze modelleringsbenadering ontwikkeld om de terugkerende blootstelling van werknemers aan CS in hun werkomgeving te simuleren en om het pathologische proces van silicose te onderzoeken.
Het maken van muismodellen van silicose via nasale blootstelling aan CSD kan worden toegepast op herhaalde blootstellingen. Daarom kan dit diermodel worden gebruikt om de effecten van blootstellingsfrequentie en dosering op de progressie van silicose en de dynamische pathologische kenmerken en mechanismen van silicose te bestuderen. Bovendien is gecombineerde blootstelling met andere stoffen of medicijnen ook heel goed mogelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door het University Synergy Innovation Program van de provincie Anhui (GXXT-2021-077) en het Anhui University of Science and Technology Graduate Innovation Fund (2021CX2120).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL tube | Biosharp | BS-05-M | |
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | NA | |
| Adobe Illustrator | Adobe | NA | |
| Alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | NA | |
| CD68 | Abcam | ab125212 | |
| Citrate antigen retrieval solution | biosharp life science | BL619A | |
| DAB chromogenic kit | NJJCBio | W026-1-1 | |
| Dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | NA | |
| Enhanced BCA protein assay kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | Sa00001-2 | |
| Iceacetic acid | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | NA | |
| ImageJ | NIH | NA | |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | |
| Masson's Trichrome stain kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | NA | |
| Microtubes | Millipore | AXYMCT150CS | |
| NF-κB p65 | Cell Signaling Technology | 8242S | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | NA | |
| Paraffin embedding machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | NA | |
| Phosphate buffer (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | NA | |
| Pipettes | Eppendorf | NA | |
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| Prism7.0 | GraphPad | Version 7.0 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA lysis buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | NA | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxid | Sigma | #BCBV6865 | |
| Sirius red staining | Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd. | 181012 | |
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips (0.1–10 µL) | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips (100–1000 µL) | KIRGEN | KG1313 | |
| Universal Pipette Tips (1–200 µL) | KIRGEN | KG1212 | |
| Vortex mixer | VWR | NA | |
| ZEISS GeminiSEM 500 | Zeiss Germany | SEM 500 | |
| β-actin | Bioss | bs-0061R |
References
- Olsson, A., Kromhout, H. Occupational cancer burden: the contribution of exposure to process-generated substances at the workplace. Molecular Oncology. 15 (3), 753-763 (2021).
- The Lancet Respiratory. The world is failing on silicosis. The Lancet. Respiratory Medicine. 7 (4), 283 (2019).
- Weissman, D. N. Progressive massive fibrosis: An overview of the recent literature. Pharmacology & Therapeutics. 240, 108232 (2022).
- Lancet, C. C., Yu, I. T., Chen, W.
- Mazurek, J. M., Wood, J., Blackley, D. J., Weissman, D. N. Coal workers' pneumoconiosis-attributable years of potential life lost to life expectancy and potential life lost before age 65 years - United States, 1999-2016. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (30), 819-824 (2018).
- Voelker, R. Black Lung resurgence raises new challenges for coal country physicians. JAMA. 321 (1), 17-19 (2019).
- Nakashima, K., et al. Regulatory role of heme oxygenase-1 in silica-induced lung injury. Respiratory Research. 19 (1), 144 (2018).
- Li, Y., et al. Minute cellular nodules as early lesions in rats with silica exposure via inhalation. Veterinary Sciences. 9 (6), 251 (2022).
- Salehi, F., et al. Immunological responses in C3H/HeJ mice following nose-only inhalation exposure to different sizes of beryllium metal particles. Journal of Applied Toxicology. 29 (1), 61-68 (2009).
- Yang, T., et al. Emodin suppresses silica-induced lung fibrosis by promoting Sirt1 signaling via direct contact. Molecular Medicine Reports. 14 (5), 4643-4649 (2016).
- Cornell, W. C., et al. Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
- Mu, M., et al. Coal dust exposure triggers heterogeneity of transcriptional profiles in mouse pneumoconiosis and Vitamin D remedies. Particle and Fibre Toxicology. 19 (1), 7 (2022).
- Kato, K., et al. Muc1 deficiency exacerbates pulmonary fibrosis in a mouse model of silicosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 493 (3), 1230-1235 (2017).
- Liu, F., et al. CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells depletion may attenuate the development of silica-induced lung fibrosis in mice. PLoS One. 5 (11), 15404 (2010).
- Mansouri, N., et al. Mesenchymal stromal cell exosomes prevent and revert experimental pulmonary fibrosis through modulation of monocyte phenotypes. JCI Insight. 4 (21), 128060 (2019).
- Ohtsuka, Y., Wang, X. T., Saito, J., Ishida, T., Munakata, M. Genetic linkage analysis of pulmonary fibrotic response to silica in mice. The European Respiratory Journal. 28 (5), 1013-1019 (2006).
