Summary
Este protocolo descreve um método para estabelecer um modelo de silicose em camundongos através da exposição repetida a suspensões de sílica via gotejamento nasal. Este modelo pode eficiente, convenientemente e flexivelmente mimetizar o processo patológico da silicose humana com alta repetibilidade e economia.
Abstract
A silicose pode ser causada pela exposição à poeira de sílica cristalina respiratória (MSF) em ambiente industrial. A fisiopatologia, o rastreamento e o tratamento da silicose em humanos têm sido extensivamente estudados usando o modelo de silicose em camundongos. Ao fazer repetidamente camundongos inalarem refrigerante em seus pulmões, os camundongos podem imitar os sintomas clínicos da silicose humana. Essa metodologia é prática e eficiente em termos de tempo e débito e não causa lesão mecânica no trato respiratório superior devido à cirurgia. Além disso, esse modelo pode mimetizar com sucesso o processo de transformação aguda/crônica da silicose. Os principais procedimentos foram os seguintes. O pó CSD esterilizado de 1-5 μm foi totalmente triturado, suspenso em solução salina e disperso em banho-maria ultrassônico por 30 min. Camundongos sob anestesia induzida por isoflurano mudaram de respiração rápida superficial para aspiração profunda e lenta por aproximadamente 2 s. O rato foi colocado na palma de uma mão, e a ponta do polegar tocou suavemente a borda labial da mandíbula do rato para endireitar as vias aéreas. Após cada expiração, os camundongos respiraram a suspensão de sílica gota a gota através de uma narina, completando o processo dentro de 4-8 s. Depois que a respiração dos camundongos se estabilizou, seu peito foi acariciado e acariciado para evitar que o DSC inalado fosse tossido. Os camundongos foram então devolvidos à gaiola. Em conclusão, esse modelo pode quantificar DSC ao longo da passagem fisiológica típica de partículas minúsculas para o pulmão, do trato respiratório superior aos bronquíolos terminais e alvéolos. Também pode replicar a exposição recorrente dos funcionários devido ao trabalho. O modelo pode ser realizado por uma pessoa e não precisa de equipamentos caros. Simula de forma conveniente e eficaz as características da doença da silicose humana com alta repetibilidade.
Introduction
Os trabalhadores estão inevitavelmente expostos à poeira irregular de sílica cristalina (MSF), que pode ser inalada e é mais tóxica em vários contextos ocupacionais, incluindo mineração, cerâmica, vidro, processamento de quartzo e concreto 1,2. Uma condição crônica de inalação de poeira conhecida como silicose causa fibrose pulmonar progressiva3. De acordo com dados epidemiológicos, a incidência da silicose vem diminuindo globalmente nas últimas décadas, mas, nos últimos anos, vem aumentando e acometendo pessoas maisjovens4,5,6. O mecanismo subjacente da silicose representa um desafio significativo para a pesquisa científica devido ao seu início insidioso e período prolongado de incubação. Ainda não se sabe como a silicose se desenvolve. Além disso, nenhuma medicação atual pode interromper a progressão da silicose e reverter a fibrose pulmonar.
Os modelos atuais de silicose em camundongos envolvem a ingestão traqueal de uma suspensão mista de DSC. Por exemplo, a administração de DSF nos pulmões adotando o trauma da traqueia cervical após a anestesia não atende à exposição humana repetida à poeira do corante7. O impacto da exposição à poeira ambiente sobre os indivíduos pode ser estudado expondo-os ao MSC na forma de aerossóis, o que reflete com maior precisão as concentrações ambientais dessa substância tóxica8. No entanto, o DSC ambiental não pode ser simplesmente inalado diretamente para os pulmões devido à estrutura fisiológica única do nariz de camundongo9. Além disso, o equipamento associado a essa tecnologia é caro, o que fez com que os pesquisadores reavaliassem o modelo10 da silicose em camundongos. Inalando a suspensão do DSC por gotejamento nasal cinco vezes em 2 semanas, foi possível construir um modelo dinâmico de silicose. Este modelo é consistente e seguro, ao mesmo tempo que é fácil de usar. É importante notar que este estudo permite a inalação repetida de DSC em camundongos. Espera-se que o modelo de silicose em camundongos criado através desse procedimento seja mais benéfico para as necessidades de pesquisa.
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Protocol
Todos os procedimentos seguiram as diretrizes do National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publication No. 8023, revisado em 1978) e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade de Ciência e Tecnologia de Anhui.
1. Manejo e alimentação de camundongos
- Atribuir 20 camundongos machos C57BL/6 saudáveis aos grupos experimental ou veículo em uma proporção de 1:1. Aclimatar os ratos ao novo ambiente por 1 semana.
- Forneça um tempo de luz constante de 12 h por dia. Use um interruptor de controle de tempo para um tempo preciso.
2. Preparação da suspensão da CDT
- Pelo menos 1 dia antes de gotejar nasalmente, triture a sílica em uma argamassa de ágata por 0,5 h.
- Observe o tamanho e a forma das partículas de cristal. Tire fotografias representativas usando microscopia eletrônica de varredura (MEV).
- Use uma fita condutora para prender as partículas para preparar a amostra para MEV. Use um secador de cabelo para soprar suavemente as partículas de silício que não estão firmemente ligadas.
- Evacue a câmara de amostra, ligue a alta pressão e capture a imagem.
NOTA: A distância de trabalho (WD) entre a lente e a amostra é de 5,9 mm, a tensão de aceleração é de 2,0 kV e a ampliação (Mag) é de 100.000x, usando o detector SignalA. As partículas são dispersas com cristalização irregular, e aproximadamente 80% têm um diâmetro de 1-5 μm (Figura 1A).
- Fazer uma suspensão de DSC estéril de 20 mg/mL. Diluir o refrigerante com soro fisiológico estéril e misturá-lo com um agitador ultrassônico (40 kHz, 80 W) à temperatura ambiente (TR) por 30 min.
- Mexa e misture bem a suspensão de refrigerante num misturador de vórtices durante 10 s antes de administrar os gotejamentos nasais.
3. Administração de gotejamentos nasais em camundongos
- Anestesiar rapidamente um camundongo com isoflurano a 2% na dose de 3,6 mL/h em um aparelho de anestesia (Figura 1B, painel esquerdo).
OBS: A anestesia deve ser realizada em exaustor para evitar a inalação do anestésico pelo técnico. Certifique-se da profundidade adequada da anestesia, observando a mudança de respiração rápida e irregular para um estado lento e estável nos camundongos. - Gotejamento de 50 μL do DSC por via nasal dentro de 4-8 s (Figura 1B, direita).
- Para o gotejamento nasal, coloque a cabeça do camundongo na articulação metacarpofalangeana do pesquisador com a ponta do dedo indicador.
- Mantenha o mouse em decúbito ventral, com quatro dedos levemente flexionados e a ponta do polegar tocando levemente o lábio inferior do mouse para endireitar as vias aéreas. Evite tocar a faringe para provocar o reflexo de vômito.
- Aspirar 50 μl de líquido utilizando uma pipeta de 200 μl. Solte o líquido na cavidade nasal do rato em três a quatro doses divididas, dependendo da frequência respiratória do rato. Cada instilação deve consistir de 15 a 20 μl de líquido. Administrar os gotejamentos uma vez a cada 3 dias, 5x dentro de 12 dias. Trate o rato de controlo com uma quantidade igual de soro fisiológico.
- Massageie suavemente a área cardíaca do mouse 5x-10x por 5 s.
- Segure o corpo do mouse com a palma da mão, aperte a pele na parte de trás do pescoço com o polegar e o indicador e fixe os membros posteriores do mouse com os outros dedos. Em seguida, pressione suavemente a área de batimento cardíaco do mouse com o dedo indicador da outra mão 5-10 vezes em um período de 5 s.
- Quando a respiração do rato tiver estabilizado, coloque-o numa gaiola de recuperação com uma almofada de aquecimento e observe até que se recupere da anestesia e, em seguida, devolva o rato à sua gaiola de casa. Sacrifique o rato aos 31 dias.
4. Coleta dos tecidos pulmonares e preparação de um corte de parafina
- Injetar 0,18 mL de hidrato de cloral a 10% por via intraperitoneal, garantindo que os camundongos não respondam à estimulação dos dedos dos pés ou da cauda (realizada com a pinça dentada). Em seguida, prossiga para a próxima etapa.
- Fixe os membros do rato em uma placa de teste de espuma e borrife com álcool 75% para umedecer o pelo. Remova a maioria das costelas torácicas na linha média da clavícula e abra a cavidade torácica dos ratos para expor o coração e os pulmões.
- Cortar imediatamente o átrio direito com tesoura cirúrgica oftálmica e injetar lentamente 20 mL de tampão fosfato (PBS) da ponta do coração no batimento atrial esquerdo com a maior amplitude para permitir que todo o sangue flua. Em seguida, remova o lobo inferior do pulmão direito e armazene-o a -80 °C para análise de western blotting.
- Manter a perfusão de 10 mL de paraformaldeído (PFA) a 4% no mesmo local após a injeção de PBS. Coletar o pulmão remanescente e preservar a amostra em 30 mL de PFA a 4% para análise anatomopatológica.
- Após 72 h de fixação, embutir os espécimes em parafina.
- Desidratar os tecidos através de uma série graduada de diluições de etanol (EtOH) em água deionizada (60%, 70%, 80%, 90%, 100%) por 1 h cada em TR. Limpar a amostra em duas lavagens de xileno por 1 h cada.
- Infiltrar-se nas amostras com a cera de parafina fundida aquecendo a 50 °C durante 2 h. Repita esse processo em outro cilindro. Resfriar os moldes de cera com lenços por 1 h para endurecer.
- Depois que a cera endurecer e o tecido tiver sido incorporado, use uma máquina de corte de parafina para cortar o tecido a 5 μm. Os passos precisos de seccionamento e montagem das lâminas foram descritospreviamente11.
NOTA: A perfusão tecidual suficiente é indicada pelo desenvolvimento de contração muscular e torção da cauda em forma de "S" ou flexão após receber 10 mL de PFA a 4%.
5. Realização da coloração de hematoxilina e eosina (HE)
- Aqueça os tecidos embebidos em parafina em uma placa quente (60 °C) por mais de 4 h para permitir a adesão às lâminas e melhorar a desparafinação.
- Descerpar e hidratar seções de parafina. Mergulhe as lâminas com amostras em xileno 2x por 30 min de cada vez. Em seguida, mergulhe-os em etanol anidro, depois álcool 95%, 85%, 75% e água deionizada por 5 min, respectivamente.
- Realizar coloração de hematoxilina e eosina. Manchar os tecidos em um balde de coloração de hematoxilina por 10 min. Enxágue com água corrente suave por 5 min. Em seguida, mergulhe as lâminas no balde de coloração de eosina por 10 s.
- Desidratar as amostras em etanol anidro 75%, 85%, 95% e anidro por 5 min cada. Limpe os cortes de tecido mergulhando-os em xileno por 5 min. Sele a seção com aproximadamente 60 μL de gotas de resina neutra. Coloque a tampa deslize sobre a seção e abaixe-a cuidadosamente para evitar bolhas de ar.
6. Realização da coloração de Masson
- Desencenar e hidratar as amostras de parafina, conforme mencionado na etapa 5.2. Em seguida, corar os núcleos celulares com hematoxilina de Weigert a 50% por 10 min. Mergulhe o tecido em liquefação ácida de etanol por 10 s e lave suavemente as lâminas de tecido com água corrente para o rubor dos núcleos.
NOTA: Preparar a solução corante de hematoxilina de Weigert imediatamente antes do uso. - Manchar as amostras com gotas de solução corante vermelha de Lichun (40 μL para cada lâmina de tecido) por 7 min e lavá-las com uma solução de trabalho de ácido fraco (ácido clorídrico a 30%) por 1 min para remover o corante vermelho Lichun não ligado.
- Mergulhá-los em álcool 95% por 20 s e desidratá-los 2x com etanol anidro por 1-3 s cada. Em seguida, limpar os tecidos com xileno e selá-los com 60 μL de gotas de resina neutra, conforme mencionado no passo 5.4.
7. Realização da coloração vermelha do Sirius
- Descerpar e hidratar as secções de parafina, tal como referido no passo 5.2.
- Infiltrar-se nos cortes por 1 h com solução corante Sirius red.
- Manchar os núcleos celulares das amostras por 8-10 min com solução de coloração de hematoxilina Mayer. Enxágue suavemente com água corrente por 10 min. Em seguida, desidrate e limpe as lâminas de tecido. Selá-los conforme mencionado no passo 5.4.
8. Realização de imunohistoquímica
- Descerpar e hidratar as amostras de parafina, tal como descrito no passo 5.2.
- Infiltrar-se nos espécimes com uma solução de recuperação de antígeno EDTA de 3 mg/mL de cerca de 30 mL. Ferva por 20-30 min. Lave os tecidos com água deionizada e, em seguida, incube-os em solução tamponada com fosfato contendo Tween-20 a 0,5% (PBST) por 5 min.
- Deixar as amostras de molho por 15 min com solução de peróxido de hidrogênio a 0,3% para inativar a peroxidase endógena nos espécimes. Lave-os 3x com PBST por 5 min de cada vez.
NOTA: A solução de peróxido de hidrogénio a 0,3% deve ser fresca num ambiente à prova de luz. - Permeabilizar a membrana dos espécimes por 15 min com solução de Triton-100 a 0,3%. Em seguida, bloquear com 30-40 μL de albumina de soro bovino (BSA) a 5% por 1 h.
- Remova a solução de bloqueio. Adicionar anticorpos primários diluídos NF-κB (diluição 1:200) e CD68 (diluição 1:1.000) e incubar os espécimes durante a noite a 2-8 °C em uma caixa úmida IHC de lâmina de microscópio para evitar evaporação e luz.
- No dia seguinte, transfira-os para RT por 1 h. Em seguida, lave-os com PBST 3x por 5 min cada.
- Incubar as amostras durante 1 h em anticorpos secundários de peroxidase de rábano de coelho anti-rato (razão de diluição 1:500) em RT e lavá-las com PBST 3x durante 5 minutos cada.
NOTA: Ambos os anticorpos primários e secundários foram diluídos com BSA a 5%. - Incubar as amostras com o substrato 3,3'-Diaminobenzidina (DAB) correspondente ao anticorpo marcado com enzima por 5-20 min. Pare a reação com água deionizada quando a intensidade de coloração ideal for atingida.
NOTA: A solução DAB precisa ser preparada na hora e protegida da luz. A reação de desenvolvimento de cor deve ser observada em tempo real sob o microscópio para determinar quando parar de colorir. Espécimes positivos exibem coloração intensa, enquanto espécimes negativos não desenvolvem cor. - Contra-corar as amostras por 30 s com hematoxilina de Weigert. Em seguida, enxágue os tecidos em água corrente por 1 min. Em seguida, desidrate, limpe e sele as lâminas de tecido, conforme mencionado no passo 5.4.
9. Realização de análise de western blotting
- Lisar os tecidos pulmonares para extrair proteínas. Adicionar 200 μL de solução de trabalho RIPA a 20 mg de tecido pulmonar.
- Homogeneizar o tecido no gelo por 5 min usando um moedor elétrico portátil e incubar por 1 h no gelo com agitação suave. Em seguida, centrifugar o homogeneizado a 4 °C por 15 min a 14.800 x g.
- Coletar o sobrenadante e determinar a concentração de proteína com o kit de ensaio de proteína BCA. Fazer a solução de armazenamento de proteína com RIPA a 6 μg/μL de proteína. Adicionar 20 μL de tampão de carga 5x aos 80 μL do lisado proteico. Interromper a estrutura da proteína secundária aquecendo os tubos de microcentrífuga contendo proteínas em um banho de metal (100 °C) por 20 min.
- Após arrefecimento, aliquotar 100 μL da solução de armazenamento de proteínas em cada tubo e armazenar as amostras num frigorífico de -80 °C. Diluir a concentração de proteína para 2–3 μg/μL com 1x tampão de carga antes da eletroforese.
NOTA: O processo de extração de proteínas deve ser realizado em gelo. Para a solução de trabalho RIPA, adicionar 1 μL de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) a 100 mM a 99 μL de RIPA para inibir a degradação de proteínas fosforiladas. Prepare 1x buffer de carregamento diluindo 5x buffer de carregamento com RIPA na proporção de 1:4. - Adicione 20 μg de amostras a cada poço e passe o gel. Para géis concentrados a 5%, use 80 V por 20 min para que as proteínas sejam eletroforadas a partir do mesmo ponto de partida. Para géis isolados a 10%, correr a 100 V durante 1 h para permitir que as proteínas de diferentes pesos moleculares sejam separadas tanto quanto possível.
- Pré-ativar a membrana de PVDF com metanol por 20 s. Transferir as proteínas para a membrana de PVDF usando o método de transferência úmida com corrente de 400 mA por 1-2 h.
NOTA: Certifique-se de que o tanque de eletroforese e o tanque de eletrotransferência estejam horizontais. Resfrie todo o tanque com gelo, pois o processo de transferência de membrana gera muito calor. - Lave a membrana com solução de TBST durante 5 min de cada vez, 5x. Em seguida, bloqueie com 5% de BSA ou 5% de leite desnatado por 1 h. Diluir os anticorpos primários NF-κB (1:1.000) e β-actina (1:1.000) com BSA a 5%. Submergir as tiras na solução de anticorpos e agitá-las suavemente durante a noite a 2-8 °C.
- Lave as tiras com PBST. Em seguida, diluir o anticorpo secundário de cabra anticoelho conjugado à horseradish peroxidase (HRP) (1:10.000) e incubá-los no anticorpo secundário diluído por 1 h na RT com agitação suave.
- Prepare um revelador de quimioluminescência aprimorada (ECL), solte-o na tira e incube por 3 min.
- Exponha a tira a um imageador de gel por 20 s. Meça o valor de cinza da tira para avaliar o nível de proteína pelo software do sistema. Use β-actina como controle interno.
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Representative Results
A patogênese potencial da silicose em camundongos foi investigada usando o método proposto. Verificamos que o peso corporal dos camundongos do grupo experimental diminuiu significativamente em relação ao grupo controle e que o peso corporal se recuperou lentamente após a cessação da exposição. Devido à dose otimizada usada aqui, nenhuma mortalidade foi observada em camundongos expostos à sílica neste experimento. O roteiro técnico de gotejamento nasal repetido para DSC é mostrado em (Figura 1). Os procedimentos descritos anteriormente incluíram preparo da suspensão do DSF, anestesia induzida por isoflurano, gotejamento nasal e massagem torácica12. Demonstramos deposição de colágeno e diferenciação miofibroblástica após 4 semanas de alimentação estática12. Usamos este método de exposição à poeira para estudar o mecanismo subjacente da fibrose pulmonar causada pela poeira de carvão. Os novos subtipos de macrófagos e o efeito de intervenção da vitamina D foram encontrados através da tecnologia do transcriptoma de célula única13. Neste estudo, a progressão da fibrose pulmonar em camundongos foi significativamente acelerada pela exposição ao DSC, que causou danos às fibras elásticas periféricas brônquicas (Figura 2 e Figura 3). Os nódulos de silicose são compostos por macrófagos que contêm DSC. A fibrose nodular é enriquecida com muitos DSC, e macrófagos CD68-positivos engolem ativamente essas partículas. Esses DSCs depositados promovem a formação de focos fibrosos. Como mencionado anteriormente, após serem expostos ao DSC por 4 semanas, os camundongos adquiriram lesões óbvias, como deposição de colágeno em nódulos pulmonares de silício e danos à estrutura do tecido pulmonar. Havia também modesta lesão do tecido ao redor dos brônquios12. O processo biológico de estresse de RE causado pelo DSC está relacionado ao NF-κB, que está envolvido na resposta inflamatória (ver Figura 4). De modo geral, esses achados mostram que a abordagem proposta pode efetivamente simular o desenvolvimento da silicose em camundongos.
Figura 1: Partículas de poeira de sílica cristalina (CSD) abaixo de cinco mícrons foram usadas para gotejamento nasal. (A) A microscopia eletrônica de varredura (MEV) do MSC mostrou que as partículas estavam de forma irregular. (B) A suspensão do DSC foi utilizada para preparar o modelo de silicose de camundongo por gotejamento nasal. A máquina à esquerda é usada para anestesia com isoflurano, e o painel direito descreve os pontos-chave que levam ao funcionamento do gotejamento nasal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A coloração Sirius red mostrou fibrose em pulmões de camundongos por gotejamento nasal CSD por 1 mês. (A) A coloração Sirius red foi realizada para medir a deposição de colágeno no tecido pulmonar após DSC ou tratamento com solução salina (superior esquerda e inferior esquerda em painéis). A microscopia polarizadora revelou três tipos diferentes de fibras colágenas (vermelha, amarela e verde), das quais as fibras colágenas tipo 1 mostradas em vermelho são um fator de risco para silicose. No entanto, nenhuma fibrose significativa foi encontrada no grupo veículo (painéis direito para cima e para baixo). (B) O escore de fibrose (EF) é um índice de avaliação semiquantitativo baseado na coloração Sirius red12 que difere significativamente do controle (***P < 0,0001). Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Coloração imunoistoquímica de CD68 em pulmão de camundongos tratados com DSC para monitorar o papel dos macrófagos na formação de um nódulo silicótico. Um nódulo típico de sílica é caracterizado por necrose liquefeito após fagocitose de MSC no centro, circundado por macrófagos na periferia (coloração HE). Além disso, o DSC foi enriquecido nos nódulos, acompanhado de fibrose (coloração de Masson). A coloração imunoistoquímica de CD68 revelou que os macrófagos estavam amplamente presentes no tecido pulmonar. Além disso, esses macrófagos haviam ingerido DSC (visto sob a microscopia de luz polarizada, painel direito), o que causou lesão pulmonar grave. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Expressão de NF-κB no pulmão de camundongos tratados com DSC . (A) A coloração imunoistoquímica foi realizada no tecido pulmonar. O pulmão de camundongos tratados com DSC no painel direito mostrou alta coloração de NF-κB em comparação com o grupo Vehicle à esquerda. Barra de escala = 50 μm. (B) Western blot representativo mostrou que os camundongos tratados com DSC têm uma expressão aumentada de NF-κB no pulmão. A lise do tecido pulmonar fresco foi submetida a western blotting. (C) A diferença do NF-κB entre os grupos Sil e Veh foi significativa (** P < 0,01). A intensidade da banda foi medida usando a Imagem J. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Modelos de silicose em camundongos são cruciais para o estudo da patogênese e tratamento da silicose. Este protocolo descreve um método para preparar um modelo de silicose em camundongos através de exposição nasal repetida. Este método permite o estudo das características patológicas da silicose induzida por diferentes tempos de exposição. Os camundongos foram anestesiados em um ventilador e sua frequência respiratória foi monitorada. A frequência respiratória inicial curta e rápida diminuiu gradualmente e se aprofundou ao longo do tempo. A anestesia fez com que os músculos dos ratos relaxassem, levando à respiração profunda e permitindo que eles inspirassem DSC durante uma janela de tempo de respiração lenta e profunda. Durante esse processo, o operador segura a mandíbula do camundongo com o polegar e endireitar o pescoço para evitar que o líquido entre no trato digestivo, um método de exposição à poeira respirável que não causa dor e não é invasivo. Este método pode atender às necessidades individuais de implementação repetida para estudar a exposição à poeira. Kato e col. em 2017 utilizaram uma única grande dose (125 mg/mL, 40 μL) via gotejamento orofaríngeo para modelar a fibrose pulmonar, e nos referimos a essa concentração para tentar explorar as alterações pulmonares induzidas por múltiplas pequenas doses através da cavidade nasal14.
Vários são os desafios associados ao gotejamento nasal pós-anestésico do ponto de vista técnico. Durante esse processo, o operador segura a mandíbula do mouse com o polegar para endireitar o pescoço e impedir que o líquido entre no trato digestivo. Se os camundongos não conseguirem anestesia profunda ou o operador não for habilidoso e perder a janela de tempo para respiração lenta e profunda, o efeito do gotejamento nasal e as características patológicas do modelo não serão os esperados. Portanto, para evitar morte superanestesiada e falha de modelagem subanestesiada, aqueles que trabalham com camundongos anestesiados com isoflurano devem ser adequadamente treinados e dominar as características críticas dos camundongos anestesiados com isoflurano antes de realizar o gotejamento nasal. Além disso, pressionar o tórax dos camundongos após o gotejamento nasal, comumente chamado de massagem, promove o deslocamento do DSC para atingir os brônquios terminais e até mesmo as paredes alveolares dos pulmões. Camundongos anestesiados em nível profundo eram propensos à asfixia quando recebiam uma alta dose de gotejamento nasal. No entanto, se o tórax fosse rapidamente comprimido, a taxa de sobrevida aumentava. Por último, mas não menos importante, a criação de modelos de silicose requer camundongos com uma base física sólida, e alguns estudos ilustraram que camundongos com mais de 10-12 semanas de idade têm baixa tolerância e uma taxa de mortalidade aumentada após exposição repetida a DSC. Apesar de suas vantagens, este modelo tem várias desvantagens. Uma desvantagem é que o rato não inala diretamente partículas de poeira através do fluxo de ar. Para resolver essa questão, limitamos a quantidade de suspensão de DSC inalada em uma única respiração e a frequência de administração repetida de DSC. Além disso, criamos grupos de veículos. Os dados revelam que a inalação de uma pequena quantidade de líquido apenas interrompe temporariamente a ventilação, o que não danificará os pulmões dos camundongos12. Os camundongos de controle do veículo absorverão rapidamente o líquido salino inalado sem afetar a função pulmonar, o peso corporal ou a atividade basal dos camundongos. Ao contrário, a exposição repetida ao MSD por inalação nasal pode criar o modelo dinâmico desejado de silicose em camundongos12. Como diferentes frequências de exposição afetam o processo de fibrose em modelos com exposições repetidas, não temos um ponto de tempo claro. Normalmente, para uma exposição única de poeira de sílica, o dia 7 ainda está nos estágios iniciais da silicose. Os dias 7-14 correspondem ao estágio de atividade inflamatória, os dias 14-28 correspondem ao estágio de transformação da fibrose e o tempo após o dia 28 corresponde ao estágio de formação dafibrose12,15. No entanto, a patologia nesses momentos pode variar dependendo da dose.
O método do gotejamento nasal apresenta várias vantagens em relação aos métodos tradicionais de gotejamento endotraqueal ou traqueostomia exposta cirurgicamente16,17, como a redução de infecções traqueostomias e cuidados pós-operatórios. Essa abordagem também pode satisfazer a exigência de exposição repetida a DSC durante um experimento e não requer equipamentos caros. Além disso, o método de gotejamento nasal é uma representação mais realista da exposição à poeira, pois pequenas partículas entram nos pulmões a partir do trato respiratório superior e viajam para os bronquíolos terminais e alvéolos. Como usamos várias pequenas doses de gotejamentos de sílica, a dose de poeira de sílica pode entrar no pulmão ao máximo e estimular continuamente o organismo. Assim, esta abordagem de modelagem é desenvolvida para simular a exposição recorrente de funcionários à CE em seu ambiente de trabalho e explorar o processo patológico da silicose.
A criação de modelos de silicose em camundongos via exposição nasal a DSC pode ser aplicada a exposições repetidas. Portanto, este modelo animal pode ser usado para estudar os efeitos da frequência de exposição e da dosagem na progressão da silicose e as características patológicas dinâmicas e os mecanismos da silicose. Além disso, a exposição combinada com outras substâncias ou medicamentos também é muito viável.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo Programa de Inovação de Sinergia Universitária da Província de Anhui (GXXT-2021-077) e pelo Fundo de Inovação de Pós-Graduação da Universidade de Ciência e Tecnologia de Anhui (2021CX2120).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL tube | Biosharp | BS-05-M | |
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | NA | |
| Adobe Illustrator | Adobe | NA | |
| Alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | NA | |
| CD68 | Abcam | ab125212 | |
| Citrate antigen retrieval solution | biosharp life science | BL619A | |
| DAB chromogenic kit | NJJCBio | W026-1-1 | |
| Dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | NA | |
| Enhanced BCA protein assay kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | Sa00001-2 | |
| Iceacetic acid | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | NA | |
| ImageJ | NIH | NA | |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | |
| Masson's Trichrome stain kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | NA | |
| Microtubes | Millipore | AXYMCT150CS | |
| NF-κB p65 | Cell Signaling Technology | 8242S | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | NA | |
| Paraffin embedding machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | NA | |
| Phosphate buffer (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | NA | |
| Pipettes | Eppendorf | NA | |
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| Prism7.0 | GraphPad | Version 7.0 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA lysis buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | NA | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxid | Sigma | #BCBV6865 | |
| Sirius red staining | Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd. | 181012 | |
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips (0.1–10 µL) | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips (100–1000 µL) | KIRGEN | KG1313 | |
| Universal Pipette Tips (1–200 µL) | KIRGEN | KG1212 | |
| Vortex mixer | VWR | NA | |
| ZEISS GeminiSEM 500 | Zeiss Germany | SEM 500 | |
| β-actin | Bioss | bs-0061R |
References
- Olsson, A., Kromhout, H. Occupational cancer burden: the contribution of exposure to process-generated substances at the workplace. Molecular Oncology. 15 (3), 753-763 (2021).
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