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Genetics

प्रतिदीप्ति-सक्रिय न्यूक्लियस सॉर्टिंग का उपयोग करके वसा ऊतकों के साथ एडिपोसाइट्स-विशिष्ट एटीएसी-सेक

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65033
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Indiana University School of Medicine

Summary

हम उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण (एटीएसी-सेक) के साथ ट्रांसपोसेज-सुलभ क्रोमैटिन के लिए परख के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, विशेष रूप से परमाणु फ्लोरेसेंस लेबलिंग के साथ ट्रांसजेनिक रिपोर्टर चूहों से अलग वसा ऊतकों के साथ न्यूक्लियस सॉर्टिंग का उपयोग करके एडिपोसाइट्स पर।

Abstract

उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण (एटीएसी-सेक) के साथ ट्रांसपोसेज-सुलभ क्रोमैटिन के लिए परख एक मजबूत तकनीक है जो जीनोम-वाइड क्रोमैटिन एक्सेसिबिलिटी प्रोफाइलिंग को सक्षम बनाती है। यह तकनीक जैविक प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला में जीन अभिव्यक्ति के नियामक तंत्र को समझने के लिए उपयोगी रही है। यद्यपि एटीएसी-सेक को विभिन्न प्रकार के नमूनों के लिए संशोधित किया गया है, लेकिन वसा ऊतकों के लिए एटीएसी-सेक विधियों के प्रभावी संशोधन नहीं हुए हैं। वसा ऊतकों के साथ चुनौतियों में जटिल सेलुलर विषमता, बड़ी लिपिड सामग्री और उच्च माइटोकॉन्ड्रियल संदूषण शामिल हैं। इन समस्याओं को दूर करने के लिए, हमने एक प्रोटोकॉल विकसित किया है जो ट्रांसजेनिक रिपोर्टर न्यूक्लियर टैगिंग और ट्रांसलेटिंग राइबोसोम एफिनिटी प्यूरीफिकेशन (एनयूटीआरएपी) माउस से वसा ऊतकों के साथ प्रतिदीप्ति-सक्रिय नाभिक छंटाई को नियोजित करके एडिपोसाइट-विशिष्ट एटीएसी-सेक की अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल न्यूक्लियस इनपुट और अभिकर्मकों की मात्रा को कम करते हुए न्यूनतम बर्बाद अनुक्रमण पढ़ने के साथ उच्च गुणवत्ता वाले डेटा का उत्पादन करता है। यह पेपर माउस वसा ऊतकों से अलग एडिपोसाइट नाभिक के उपयोग के लिए मान्य एटीएसी-सेक विधि के लिए विस्तृत चरण-दर-चरण निर्देश प्रदान करता है। यह प्रोटोकॉल विभिन्न जैविक उत्तेजनाओं पर एडिपोसाइट्स में क्रोमैटिन गतिशीलता की जांच में सहायता करेगा, जो उपन्यास जैविक अंतर्दृष्टि की अनुमति देगा।

Introduction

वसा ऊतक, जो लिपिड अणुओं के रूप में अतिरिक्त ऊर्जा के भंडारण के लिए विशिष्ट है, चयापचय विनियमन के लिए एक महत्वपूर्ण अंग है। एडिपोसाइट्स गठन और रखरखाव का सख्त नियंत्रण वसा ऊतक समारोह और पूरे शरीर की ऊर्जा होमियोस्टेसिस के लिए महत्वपूर्ण है। कई ट्रांसक्रिप्शनल नियामक एडिपोसाइट भेदभाव, प्लास्टिसिटी और फ़ंक्शन के नियंत्रण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं; इनमें से कुछ नियामकों को मनुष्यों में चयापचय संबंधी विकारों में फंसाया गया है 2,3. जीन अभिव्यक्ति और एपिजेनोमिक विश्लेषण के लिए उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण तकनीकों में हालिया प्रगति ने एडिपोसाइट्स जीव विज्ञान 4 के आणविक नियामकों की खोज को और सुविधाजनक बनायाहै। इन ऊतकों की विविधता के कारण वसा ऊतकों का उपयोग करके आणविक प्रोफाइलिंग अध्ययन करना चुनौतीपूर्ण है। वसा ऊतक में मुख्य रूप से एडिपोसाइट्स होते हैं, जो वसा भंडारण के लिए जिम्मेदार होते हैं, लेकिन इसमें विभिन्न अन्य सेल प्रकार भी होते हैं, जैसे फाइब्रोब्लास्ट, एंडोथेलियल कोशिकाएं और प्रतिरक्षा कोशिकाएं5. इसके अलावा, तापमान और पोषण संबंधी स्थिति जैसे पैथोफिजियोलॉजिकल परिवर्तनों के जवाब में वसा ऊतक की सेलुलर संरचना नाटकीय रूप से बदलजाती है। इन समस्याओं को दूर करने के लिए, हमने पहले एक ट्रांसजेनिक रिपोर्टर माउस विकसित किया था, जिसका नाम न्यूक्लियर टैगिंग एंड ट्रांसलेटिंग राइबोसोम एफिनिटी प्यूरीफिकेशन (न्यूटीआरएपी) था, जो जीएफपी-टैग किए गए राइबोसोम और एमचेरी-टैग किए गए बायोटिनिलेटेड नाभिक का उत्पादन करताहै। दोहरी लेबलिंग प्रणाली ऊतकों के साथ सेल प्रकार-विशिष्ट ट्रांसक्रिप्टोमिक और एपिजेनोमिक विश्लेषण करने में सक्षम बनाती है। एडिपोसाइट्स-विशिष्ट एडिपोनेक्टिन-क्रे लाइनों (एडिपोक-न्यूट्रैप) के साथ पार किए गए न्यूट्रैप चूहों का उपयोग करते हुए, हमने पहले विवो में शुद्ध एडिपोसाइट आबादी से जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल और क्रोमैटिन राज्यों की विशेषता बताई और निर्धारित किया कि मोटापे के दौरान वे कैसे बदल जाते हैं 7,8. इससे पहले, एनयूटीआरएपी चूहों को भूरे और बेज एडिपोसाइट्स-विशिष्ट यूसीपी 1-क्रे लाइनों (यूसीपी 1-न्यूट्रैप) के साथ पार किया गया था, जिससे हमें तापमान परिवर्तनके जवाब में दुर्लभ थर्मोजेनिक एडिपोसाइट्स आबादी, बेज एडिपोसाइट्स के एपिजेनोमिक रीमॉडेलिंग को चिह्नित करने की अनुमति मिली।

एटीएसी-सेक जीनोम-वाइड क्रोमैटिन पहुंच का आकलन करने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विश्लेषणात्मक विधि है। एटीएसी-सेक में उपयोग किया जाने वाला हाइपर-रिएक्टिव टीएन 5 ट्रांसपोसेस नाभिक 10 के क्रोमैटिन-सुलभ क्षेत्र में अनुक्रमण एडाप्टर को टैग करके खुले क्रोमैटिन क्षेत्रों की पहचान करने की अनुमतिदेता है। एटीएसी-सेक एक सरल विधि है, फिर भी यह मजबूत परिणाम प्रदान करता है और कम इनपुट नमूनों के साथ भी अत्यधिक कुशल है। इस प्रकार, यह सबसे लोकप्रिय एपिजेनोमिक प्रोफाइलिंग विधियों में से एक बन गया है और विभिन्न जैविक संदर्भों के भीतर जीन अभिव्यक्ति के नियामक तंत्र की समझ में योगदान दिया है। चूंकि मूल एटीएसी-सेक प्रोटोकॉल बनाया गया था, इसलिए विभिन्न प्रकार के नमूनों के लिए प्रोटोकॉल को संशोधित और अनुकूलित करने के लिए विभिन्न एटीएसी-सेक-व्युत्पन्न तकनीकों को आगे विकसित किया गया है। उदाहरण के लिए, फास्ट-एटीएसी को रक्त कोशिका के नमूनों का विश्लेषण करने के लिए डिज़ाइन किया गया है11, ओमनी-एटीएसी जमे हुए ऊतक नमूने12 के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है, और मिनीएटीएसी-सेक प्रारंभिक चरण भ्रूण विश्लेषण13 के लिए प्रभावी है। हालांकि, एडिपोसाइट्स के लिए एटीएसी-सेक विधि को लागू करना, विशेष रूप से ऊतक के नमूनों से, अभी भी चुनौतीपूर्ण है। वसा ऊतक की विविधता के अलावा, इसकी उच्च लिपिड सामग्री नाभिक अलगाव के बाद भी टीएन 5 ट्रांसपोसेस द्वारा कुशल पुनर्संयोजन प्रतिक्रियाओं में हस्तक्षेप कर सकती है। इसके अलावा, एडिपोसाइट्स में उच्च माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री, विशेष रूप से भूरे और बेज एडिपोसाइट्स में, उच्च माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए संदूषण और बर्बाद अनुक्रमण का कारण बनती है। यह पेपर एडिपोक-न्यूट्रैप चूहों (चित्रा 1) का उपयोग करके एडिपोसाइट-विशिष्ट एटीएसी-सेक के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। प्रतिदीप्ति-लेबल न्यूक्लियस सॉर्टिंग का लाभ उठाकर, यह प्रोटोकॉल अन्य भ्रामक सेल प्रकारों से दूर एडिपोसाइट नाभिक की शुद्ध आबादी के संग्रह और लिपिड, माइटोकॉन्ड्रिया और ऊतक मलबे के कुशल निष्कासन की अनुमति देता है। इसलिए, यह प्रोटोकॉल सेल प्रकार-विशिष्ट उच्च गुणवत्ता वाले डेटा उत्पन्न कर सकता है और मानक प्रोटोकॉल की तुलना में इनपुट और अभिकर्मकों की कम मात्रा का उपयोग करते हुए माइटोकॉन्ड्रियल रीड से अपशिष्ट को कम कर सकता है।

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Protocol

पशु देखभाल और प्रयोग इंडियाना यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रक्रियाओं के अनुसार किया गया था।

1. प्रयोग शुरू करने से पहले तैयारी

  1. ऊतक तैयार करना
    1. एडिपोसाइट न्यूक्लियस लेबलिंग के लिए, एडिपोक-विशिष्ट एडिपोनेक्टिन-क्रे लाइनों (एडिपोक-सीआरई) के साथ न्यूट्रैप चूहों को पार करें ताकि एडिपोक-न्यूट्राप चूहों को उत्पन्न किया जा सके, जो एडिपोक-क्रे और न्यूट्रैप दोनों के लिए हेमिजिगोस हैं।
    2. एडिपोक-न्यूट्रैप चूहों से रुचि के वसा ऊतकों का विच्छेदन करें जैसा कि पहलेवर्णित है।
    3. तरल नाइट्रोजन में ऊतकों को स्नैप-फ्रीज करें, और उपयोग होने तक उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: प्रत्येक वसा पैड को एक पूरे के रूप में संग्रहीत किया जा सकता है, और जमे हुए ऊतकों को बाद में प्रयोगों के लिए सूखे बर्फ पर छोटे टुकड़ों (~ 50 मिलीग्राम) में काटा जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, वसा ऊतकों को भंडारण के लिए ट्यूबों में काटा, एलिकोट और जमे हुए किया जा सकता है (~ 50 मिलीग्राम प्रति ट्यूब)। जमे हुए नमूनों को उपयोग तक ठंड के बाद पिघलने की अनुमति नहीं दी जाती है।
  2. बफर तैयारी
    नोट: प्रयोग के दौरान बर्फ पर बफर रखें।
    1. न्यूक्लियस तैयारी बफर (एनपीबी): 250 एमएम सुक्रोज, 10 एमएम एचईपीईएस (पीएच 7.5), 10 एमएम केसीएल, 1.5 एमएम एमजीसीएल2, और 0.1% एनपी 40। प्रति नमूना 7 एमएल एनपीबी तैयार करें। उपयोग से पहले एनपीबी में ताजा 100x प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल (अंतिम 1x), DTT (अंतिम 1 mM), और Hoechst (अंतिम 1 μg / mL) जोड़ें।
      नोट: ताजा एनपीबी तैयार करने की सिफारिश की जाती है, लेकिन इसे 1 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. 0.1% एनपी -40 (पीबीएस-एन) के साथ 1 एक्स फॉस्फेट-बफर्ड खारा तैयार करें।

2. न्यूक्लियस अलगाव

  1. बर्फ पर प्रति नमूने एक ग्लास डौंस के साथ ग्लास डौंस होमोजेनाइज़र को ठंडा करें। फिर, प्रत्येक ग्लास डौंस में एनपीबी मिश्रण के 7 एमएल जोड़ें।
    नोट: प्रत्येक प्रयोग में आठ नमूने तक उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। आठ से अधिक नमूनों के साथ काम करने से सभी चरणों में काफी देरी होगी, और यह विशेष रूप से छंटाई के दौरान नाभिक की गुणवत्ता को कम कर सकता है।
  2. जमे हुए वसा ऊतक (50-100 मिलीग्राम) को ग्लास डौंस में डालें, और कैंची की एक लंबी जोड़ी का उपयोग करके तुरंत इसे कुछ छोटे टुकड़ों में काट लें। स्ट्रोक 10x सभी नमूनों के लिए एक ढीले मूसल के साथ, और फिर एक तंग मूसल के साथ 10x।
    नोट: वसा ऊतक नरम होते हैं, इसलिए उन्हें कुछ छोटे टुकड़ों में काटना पर्याप्त होना चाहिए। दुर्लभ नमूनों के लिए, छोटे टुकड़ों (10-20 मिलीग्राम) का उपयोग किया जा सकता है, हालांकि एकत्र किए गए एडिपोसाइट्स नाभिक संख्या भिन्न हो सकती है।
  3. एक नई 50 एमएल ट्यूब में 100 μm छन्नी के माध्यम से फ़िल्टर करें। फ़िल्टर किए गए होमोजेनेट्स को डालकर एक नई 15 एमएल ट्यूब में ले जाएं। स्विंग-बकेट सेंट्रीफ्यूज में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर स्पिन करें। जितना संभव हो सके सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
    नोट: एस्पिरेट पहले वैक्यूम का उपयोग करके, और फिर माइक्रोपिपेट का उपयोग करके शेष मात्रा को हटा दें।
  4. हल्के लेकिन पूरी तरह से उंगली टैपिंग द्वारा पीबीएस-एन के 500 μL में गोली को फिर से निलंबित करें।
    नोट: पिपेटिंग से बचें, क्योंकि इससे नाभिक को नुकसान हो सकता है।
  5. कोमल पिपेटिंग का उपयोग करके एक नई 50 एमएल ट्यूब में 40 μm छन्नी के माध्यम से फ़िल्टर करें। पीबीएस-एन के 250 μL के साथ छन्नी को धो लें। फ़िल्टर किए गए परमाणु पुन: निलंबन को माइक्रोपिपेट का उपयोग करके प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: यदि उपलब्ध हो, तो नमूना हानि को कम करने के लिए ट्यूब और सेल स्ट्रेनर का उपयोग छोटी मात्रा के लिए किया जा सकता है।

3. न्यूक्लियस सॉर्टिंग

  1. संग्रह ट्यूब तैयारी
    1. नए 1.5 एमएल ट्यूबों में पीबीएस-एन के 500 μL जोड़ें, और बफर के साथ सभी आंतरिक सतहों को गीला करने के लिए कुछ बार उलटा करें।
    2. सभी तरल को नीचे लाने के लिए ट्यूबों को संक्षेप में घुमाएं, और फिर उन्हें छंटाई तक बर्फ पर ठंडा करें।
  2. FACS (चित्र 2)
    1. सिंगल्स के लिए एफएससी-ए/एफएससी-एच गेटिंग और छोटे या बड़े मलबे को हटाने के लिए एफएससी-ए/एसएससी-ए का उपयोग करें।
    2. जीएफपी पॉजिटिव एडिपोसाइट्स न्यूक्लियस आबादी के लिए गेट।
    3. चरण 3.1 में तैयार प्रत्येक संग्रह ट्यूब में 10,000 नाभिक एकत्र करें।
  3. पोस्ट-सॉर्टिंग न्यूक्लियस की तैयारी
    1. प्रत्येक संग्रह ट्यूब में पीबीएस-एन का 500 μL जोड़ें, और मिश्रण करने के लिए कुछ बार उलटा करें।
    2. एक स्विंग-बकेट सेंट्रीफ्यूज में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर संग्रह ट्यूबों को घुमाएं। सुपरनैटेंट को पूरी तरह से हटा दें।
      नोट: बुलबुले को हटाने के लिए पहले वैक्यूम का उपयोग करें, सतह पर तैरने वाले को डालें, और शेष तरल को पूरी तरह से हटाने के लिए पेपर वाइप्स का उपयोग करें। इस बिंदु पर गोली अदृश्य है। सेंट्रीफ्यूजेशन चरण के दौरान टीएन 5 मास्टर मिश्रण तैयार करें जैसा कि नीचे वर्णित है।

4. Tn5 टैगमेंटेशन (तालिका 1)

  1. टीएन 5 मास्टर मिश्रण के 25 μL तैयार करने के लिए, 2x टैगमेंटेशन डीएनए बफर (TD बफर) के 12.5 μL, Tn5 ट्रांसपोसेस (TDE I एंजाइम) के 1.25 μL और न्यूक्लियस-मुक्त पानी के 11.25 μL मिलाएं।
  2. प्रत्येक नाभिक गोली में Tn5 मास्टर मिश्रण का 25 μL जोड़ें, और कोमल पाइपिंग द्वारा पुन: निलंबित करें। थर्मोमिक्सर का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 600 आरपीएम पर इनक्यूबेट करें।

5. डीएनए शुद्धिकरण

नोट: निम्नलिखित प्रक्रिया सामग्री की तालिका में उल्लिखित पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग करती है। किसी भी अन्य समान डीएनए शुद्धिकरण विधियों का उपयोग किया जा सकता है।

  1. चरण 4.2 के बाद प्राप्त Tn5 न्यूक्लियस रिसस्पेंशन के मिश्रण के 25 μL में न्यूक्लियस-मुक्त पानी का 25 μL जोड़ें। अंतिम मात्रा प्रति नमूना 50 μL है।
  2. बफर पीबी के 250 μL जोड़ें।
  3. 3 एम सोडियम एसीटेट (NaOAC) (pH 5.2) का 5 μL जोड़ें।
  4. मिश्रण को एक कॉलम (संदर्भित किट के साथ प्रदान किया गया) में स्थानांतरित करें, और कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 मिनट के लिए 17,900 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. प्रवाह को छोड़ दें, और स्पिन कॉलम को उसी संग्रह ट्यूब में वापस रखें। पूर्ण इथेनॉल (ईटीओएच) युक्त बफर पीई के 750 μL जोड़ें, और RT पर 1 मिनट के लिए 17,900 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज जोड़ें।
  6. प्रवाह को छोड़ दें, और स्पिन कॉलम को उसी संग्रह ट्यूब में वापस रखें। आरटी में 1 मिनट के लिए 17,900 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें, और प्रवाह के साथ संग्रह ट्यूब को छोड़ दें।
  7. डीएनए के टुकड़ों को अलग करने के लिए, कॉलम को एक नई 1.5 एमएल ट्यूब से लैस करें, बफर ईबी के 10 μL जोड़ें, और 3 मिनट के लिए RT पर छोड़ दें। आरटी पर 1 मिनट के लिए 17,900 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
    नोट: नमूने दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या हफ्तों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

6. पीसीआर प्रवर्धन (तालिका 2)

नोट: इस अध्ययन में उपयोग किए गए प्राइमर तालिका 3 में सूचीबद्ध हैं।

  1. डीएनए के टुकड़ों को बढ़ाने के लिए, एक अद्वितीय एडी 2.एन बारकोडिंग प्राइमर (प्राइमर # 2) को जोड़े बिना पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार करें। प्रति नमूना पीसीआर मास्टर मिश्रण के 38 μL का उपयोग करें: न्यूक्लियस-मुक्त पानी का 11 μL, प्राइमर Ad1_noMX प्राइमर (प्राइमर # 1) का 2 μL, और 2x PCR मास्टर मिक्स का 25 μL।
  2. 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब में पीसीआर मास्टर मिश्रण के 38 μL जोड़ें।
  3. चरण 5.7 से 10 μL एलेटेड डीएनए टुकड़े जोड़ें।
  4. 25 μM प्राइमर # 2 का 2 μL जोड़ें, जिसे प्रत्येक नमूने के लिए विशिष्ट होना चाहिए।
  5. तालिका 2 में दर्शाई गई साइकिल िंग स्थितियों के अनुसार पीसीआर चलाएं।

7. रियल-टाइम क्वांटिटेटिव पीसीआर (क्यूपीसीआर) टेस्ट (तालिका 4)

नोट: इस चरण का उद्देश्य डीएनए को बढ़ाने के लिए आवश्यक अतिरिक्त चक्रों को निर्धारित करना है। यह वैकल्पिक है लेकिन अत्यधिक अनुशंसित है, खासकर नए प्रयोगों के लिए।

  1. प्राइमर # 2 को जोड़े बिना क्यूपीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार करें। प्रति नमूना QPCR मास्टर मिश्रण के 9.975 μL का उपयोग करें: न्यूक्लियस मुक्त पानी का 4.41 μL, 25 μM प्राइमर # 1 का 0.25 μL, 2x PCR मास्टर मिक्स का 5 μL, और 0.09 μL 100x SYBR Green I।
    नोट: 100x SYBR Green I तैयार करने के लिए, न्यूक्लियस मुक्त पानी के साथ 10,000x स्टॉक को पतला करें। चूंकि क्यूपीसीआर मास्टर मिश्रण के लिए उपयोग किए जाने वाले 100x SYBR ग्रीन I की मात्रा नगण्य है, इसलिए पतला 100x SYBR Green I (उदाहरण के लिए, 8-10 नमूनों के लिए) का एक अतिरिक्त मास्टर मिश्रण बनाना आसान है।
  2. QPCR प्लेट के प्रत्येक कुएं में QPCR मास्टर मिश्रण का 9.975 μL जोड़ें।
  3. प्रत्येक कुएं में 25 μM प्राइमर # 2 का 0.25 μL जोड़ें।
    नोट: चरण 6.4 में प्रत्येक विशिष्ट नमूने में जो जोड़ा गया था उससे मेल खाने के लिए एक ही प्राइमर # 2 जोड़ना सुनिश्चित करें।
  4. चरण 6.5 में पीसीआर प्रवर्धन के बाद प्राप्त पीसीआर प्रतिक्रिया का 5 μL जोड़ें, और पाइप द्वारा मिलाएं।
    नोट: पीसीआर प्रतिक्रिया के शेष 45 μL का उपयोग दूसरे पीसीआर प्रवर्धन के लिए किया जाएगा।
  5. तालिका 5 में दर्शाई गई साइकिल िंग स्थितियों के अनुसार QPCR चलाएं।
  6. प्रवर्धन वक्रों की जांच करें, और अधिकतम के ~ 35% तक पहुंचने वाले चक्रों की संख्या का अनुमान लगाकर आवश्यक अतिरिक्त पीसीआर चक्रों की संख्या की पहचान करें (चित्रा 3 ए)।
    नोट: आमतौर पर, 10,000 नाभिक को पांच से आठ अतिरिक्त पीसीआर चक्रों की आवश्यकता होती है।

8. अतिरिक्त पीसीआर प्रवर्धन

  1. चरण 7.6 (तालिका 6) से गणना के अनुसार पीसीआर प्रतिक्रिया के शेष 45 μL का उपयोग करके पीसीआर चलाएं।
    नोट: प्रत्येक नमूने को प्रवर्धन चक्रों की एक अलग संख्या की आवश्यकता हो सकती है।

9. पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग करके दूसरा डीएनए शुद्धिकरण

  1. धारा 5 के समान प्रक्रियाओं का उपयोग करें, लेकिन बफर ईबी के 20 μL के साथ प्रवर्धित डीएनए टुकड़ों का उपयोग करें।

10. डीएनए टुकड़ा आकार चयन

नोट: ठोस चरण प्रतिवर्ती स्थिरीकरण मोतियों का उपयोग करें, जैसा कि नीचे वर्णित है। निर्माता के निर्देशों के अनुसार किसी भी अन्य समान डीएनए शुद्धिकरण मोतियों का उपयोग किया जा सकता है। एसपीआरआई बीड सस्पेंशन को उपयोग से पहले रोटेशन के साथ आरटी पर पूरी तरह से पुन: निलंबित और समतुल्य किया जाना चाहिए।

  1. एक नए पीसीआर ट्यूब में एल्यूटेड डीएनए को स्थानांतरित करें, और 100 μL की अंतिम मात्रा बनाने के लिए बफर ईबी के 80 μL जोड़ें।
  2. एसपीआरआई मोतियों का 55 μL जोड़ें (0.55x नमूना मात्रा), और पाइप द्वारा मिलाएं। आरटी में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और फिर 5 मिनट के लिए पीसीआर 8-ट्यूब स्ट्रिप्स के लिए एक मिनी चुंबकीय स्टैंड पर अलग करें।
  3. सुपरनैटेंट के 150 μL को एक नई पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें। 95 μL SPRI मोती जोड़ें, और पाइप द्वारा मिलाएं।
    नोट: सतह पर तैरने वाले में लगभग 500 बीपी या उससे छोटे डीएनए होते हैं।
  4. आरटी में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और फिर मिनी चुंबकीय स्टैंड पर 5 मिनट के लिए अलग करें। सुपरनैटेंट को सावधानी से छोड़ दें।
  5. मोतियों को 1 मिनट के लिए 70% ईटीओएच के 200 μL के साथ धो लें। कुल मिलाकर तीन धोने के लिए दो बार दोहराएं।
    नोट: धोने के दौरान चुंबकीय स्टैंड से पीसीआर ट्यूबों को न ले जाएं।
  6. अंतिम धोने के बाद, ट्यूबों को 1 मिनट के लिए 1,000 × ग्राम पर घुमाएं, और शेष ईटीओएच को बाहर निकालें। पीसीआर मशीन पर 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ढक्कन के साथ गोली को सुखाएं।
    नोट: मोती के छर्रों को सूखने के बाद केवल कुछ मामूली दरारें प्रदर्शित करनी चाहिए। अधिक सूखने से बचें।
  7. पेलेट को पाइपिंग द्वारा 20 μL बफर EB के साथ पुन: निलंबित करें, और RT पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। मिनी चुंबकीय स्टैंड पर 5 मिनट के लिए अलग करें, और फिर अंतिम लाइब्रेरी वाले सुपरनैटेंट के 18 μL को एक नए 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट गुणवत्ता जांच करते समय लाइब्रेरी को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

11. फ्लोरोमीटर का उपयोग करके डीएनए परिमाणीकरण

  1. मास्टर मिश्रण तैयार करने के लिए, डीएसडीएनए एचएस बफर के साथ 200x डीएसडीएनए उच्च संवेदनशीलता (एचएस) अभिकर्मक को 1x की अंतिम सांद्रता तक पतला करें।
  2. मानकों के लिए, फ्लोरोमीटर ट्यूब में 1x मास्टर मिश्रण का 190 μL और मानक 1 या मानक 2 का 10 μL जोड़ें।
    नोट: परिमाणीकरण शुरू करने से पहले अंधेरे में आरटी में मानकों को बराबर करें।
  3. पुस्तकालय के नमूनों के लिए, एक अलग फ्लोरोमीटर ट्यूब में 1x मास्टर मिश्रण के 198 μL और प्रत्येक नमूने के 2 μL जोड़ें।
    नोट: यदि नमूना मात्रा सीमित है, तो नमूना मात्रा को 1 μL तक कम किया जा सकता है, और 1x मास्टर मिश्रण की मात्रा को 199 μL तक बढ़ाया जा सकता है।
  4. भंवर या फ्लोरोमीटर ट्यूबों को हिलाएं, और उन्हें अंधेरे में आरटी में 5 मिनट के लिए बैठने दें। फ्लोरोमीटर के डीएसडीएनए एचएस परख का उपयोग करके डीएनए एकाग्रता को मापें।

12. उच्च संवेदनशीलता वैद्युतकणसंचलन प्रणालियों द्वारा पुस्तकालय गुणवत्ता की जांच

  1. एटीएसी-सेक लाइब्रेरी लें, और न्यूक्लियस मुक्त पानी के साथ 1-5 एनजी / μL की अंतिम एकाग्रता तक पतला करें।
  2. निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद उच्च-संवेदनशीलता, स्वचालित वैद्युतकणसंचलन प्रणालियों का उपयोग करके एटीएसी-सेक पुस्तकालयों के आकार वितरण का विश्लेषण करें।

13. लक्षित क्यूपीसीआर का उपयोग करके एटीएसी-सेक लाइब्रेरी की गुणवत्ता की जांच

  1. एटीएसी-सेक लाइब्रेरी के 5-10 एनजी लें, और न्यूक्लियस-मुक्त पानी के 50 μL के साथ पतला करें।
  2. तालिका 7 में दर्शाई गई साइक्लिंग स्थितियों के अनुसार एडिपोसाइट्स में सक्रिय होने वाले प्रमोटरों और एन्हांसरों को लक्षित करने वाले प्राइमरों का उपयोग करके क्यूपीसीआर चलाएं।
  3. बंद/मूक जीनोमिक क्षेत्रों को लक्षित करने वाले नकारात्मक नियंत्रण प्राइमरों का उपयोग करें (तालिका 7)।
  4. नकारात्मक नियंत्रणों पर प्रमोटर/एन्हांसर के संवर्धन की गणना करें (तालिका 8)।
    नोट: सफल नमूनों के साथ ≥10-20 गुना संवर्धन देखने की उम्मीद है।

14. अनुक्रमण

  1. अनुक्रमण के लिए एटीएसी-सेक पुस्तकालयों को सबमिट करें। प्रति नमूने 10-30 मिलियन रीडिंग की औसत पठन संख्या के साथ युग्मित-अंत अनुक्रमण (2 x 34 बीपी, 2 x 50 बीपी या उससे अधिक) का उपयोग करें।

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Representative Results

इस एटीएसी-सेक प्रोटोकॉल का उपयोग करके वसा ऊतक का विश्लेषण करने के लिए, हमने एडिपोक-न्यूट्रैप चूहों को उत्पन्न किया जिन्हें चाउ आहार खिलाया गया था; फिर हमने फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके एपिडीडिमल सफेद वसा ऊतक (ईडब्ल्यूएटी), इंगुइनल सफेद वसा ऊतक (आईडब्ल्यूएटी), और भूरे रंग के वसा ऊतक (बीएटी) से एडिपोसाइट नाभिक को अलग किया। पृथक नाभिक का उपयोग टैगमेंटेशन के लिए किया गया था, इसके बाद डीएनए शुद्धिकरण, पीसीआर प्रवर्धन, गुणवत्ता जांच चरण, अनुक्रमण और डेटा विश्लेषण, जैसा कि ऊपर वर्णित है। इस प्रतिनिधि प्रयोग का उद्देश्य विभिन्न वसा डिपो से अलग शुद्ध एडिपोसाइट आबादी की क्रोमैटिन पहुंच को प्रोफाइल करना था।

हमने देखा कि एमचेरी-लेबल और जीएफपी-लेबल एडिपोसाइट नाभिक प्रवाह साइटोमेट्री (चित्रा 2 ए-सी) का उपयोग करके एडिपोक-न्यूट्राप माउस के वसा ऊतकों से अलग अन्य सेल प्रकारों के नाभिक से स्पष्ट रूप से अलग थे। एडीपोज डिपो के प्रकार के आधार पर एडिपोसाइट्स अंशों में अंतर थे: ईडब्ल्यूएटी में ~ 50%, आईडब्ल्यूएटी में ~ 30%, और बीएटी में ~ 65% (चित्रा 2 डी)7। हमने प्रति नमूने 2-10 मिनट के भीतर 10,000 नाभिक एकत्र किए और उन्हें एटीएसी-सेक प्रक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया। हमने कुल 10-13 पीसीआर चक्र (पहले पीसीआर के पांच चक्र और दूसरे पीसीआर के पांच से आठ चक्र, चित्रा 3 ए) चलाए। यदि नमूनों को कुल 15 पीसीआर चक्रों से अधिक की आवश्यकता होती है, तो यह कम गुणवत्ता वाले नमूनों का संकेत दे सकता है (चित्रा 3 बी)। एटीएसी-सेक पुस्तकालयों के आकार वितरण विश्लेषण ने न्यूक्लियोसोम-मुक्त क्षेत्र (एनएफआर) और मोनो, डीआई और मल्टी-न्यूक्लियोसोम (चित्रा 4 ए-सी) के अनुरूप कई चोटियों का प्रदर्शन किया, जिनका औसत आकार ~ 500-800 बीपी था। खराब गुणवत्ता वाले नमूने आमतौर पर ज्यादातर एनएफआर दिखाते हैं, जिनमें कोई या कुछ न्यूक्लियोसोमल चोटियां नहीं होती हैं (चित्रा 4 डी)। क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण द्वारा गुणवत्ता जांच परीक्षणों ने एडिपोक, फैब 4, प्लिन 1 और पीएनपीएलए 2 जैसे एडिपोसाइट मार्कर जीन के पास सकारात्मक जीनोमिक तत्वों के साथ 10-20 गुना संवर्धन दिखाया, जबकि नकारात्मक नियंत्रण के साथ कोई संवर्धन नहीं दिखाया गया था (चित्रा 5)। हमने थर्मोजेनिक जीन यूसीपी 1 के साथ संवर्धन को विशेष रूप से बीएटी में भी देखा, लेकिन ईडब्ल्यूएटी या आईडब्ल्यूएटी (चित्रा 5) में नहीं।

अनुक्रमण और विश्लेषण के बाद, हमने तीन अलग-अलग वसा डिपो (eWAT, iWAT और BAT) से संयुक्त ~ 55,000 चोटियों की पहचान की। माइटोकॉन्ड्रियल रीडिंग <2% थे, और चोटियों के नीचे का अंश ~ 18% -44% था (चित्रा 6 ए, बी)। खराब गुणवत्ता वाले नमूनों में चरम क्षेत्रों में माइटोकॉन्ड्रिया पढ़ने और / या पढ़ने का कम अंश हो सकता है। एटीएसी-सेक लाइब्रेरी ट्रैक के दृश्य निरीक्षण ने सभी वसा डिपो (चित्रा 7 ए-सी) से एडिपोक, प्लिन 1 और फैब 4 जैसे एडिपोसाइट मार्कर जीन के पास उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ कई मजबूत चोटियों का खुलासा किया। हमने बैट नमूने में भूरे रंग के एडिपोसाइट निर्माता यूसीपी 1 लोकस पर मजबूत एटीएसी-सेक चोटियों को भी देखा, लेकिन इन चोटियों को ईडब्ल्यूएटी या आईडब्ल्यूएटी नमूनों (चित्रा 7 डी) में नहीं देखा गया था। ये सभी डेटा एडिपोसाइट नाभिक से उत्पन्न सफल एटीएसी-सेक डेटा का संकेत देते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: न्यूट्रैप चूहों का उपयोग करके एडिपोसाइट-विशिष्ट एटीएसी-सेक का एक योजनाबद्ध फ्लोचार्ट। इस प्रोटोकॉल के लिए अद्वितीय चरणों को लाल छायांकित बक्से में हाइलाइट किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: प्रतिनिधि एफएसीएस गेटिंग एक एडिपोक-न्यूट्रैप माउस के वसा ऊतकों से एमचेरी / जीएफपी-टैग किए गए एडिपोसाइट नाभिक के अलगाव को दर्शाता है। (ए-सी) "एडिपोक-न्यूट्रैप माउस के ईडब्ल्यूएटी, आईडब्ल्यूएटी और बीएटी से पृथक नाभिक का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण"। (डी) एडिपोक-न्यूट्रैप माउस के ईडब्ल्यूएटी, आईडब्ल्यूएटी और बीएटी में एडिपोसाइट्स और गैर-एडिपोसाइट्स से नाभिक का मात्रात्मक विश्लेषण। डेटा एसईएम (एन = 3) ± माध्य हैं। ये नाभिक गणना डेटा रोह एट अल.7 से हैं। संक्षेप: एफएसीएस = प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग; जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; eWAT = एपिडीडिमल सफेद वसा ऊतक; iWAT = इनगुइनल सफेद वसा ऊतक; बीएटी = भूरा वसा ऊतक; न्यूट्रैप = परमाणु टैगिंग और राइबोसोम आत्मीयता शुद्धिकरण का अनुवाद; एडिपोक-न्यूट्रैप = न्यूट्रैप माउस एडिपोसाइट-विशिष्ट एडिपोनेक्टिन-क्रे लाइन के साथ पार किया गया; एफएससी-ए = आगे स्कैटर-पीक क्षेत्र; एफएससी-एच = आगे स्कैटर-पीक ऊंचाई; एसएससी-ए = साइड स्कैटर-पीक क्षेत्र; एफआईटीसी-ए = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट-पीक क्षेत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: क्यूआरटी-पीसीआर से प्रतिनिधि प्रवर्धन वक्र। (ए) अच्छी गुणवत्ता वाला नमूना जिसे सात अतिरिक्त प्रवर्धन चक्रों की आवश्यकता होती है। (बी) खराब गुणवत्ता वाले नमूने जिन्हें ≥15 अतिरिक्त चक्रों की आवश्यकता होती है। संक्षिप्त नाम: क्यूआरटी-पीसीआर = मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: एटीएसी-सेक पुस्तकालयों के आकार वितरण प्रोफाइल। (A-C) अच्छी गुणवत्ता और (D) खराब गुणवत्ता वाले पुस्तकालयों को प्रतिनिधि परिणामों के रूप में दिखाया गया है। संक्षेप: एटीएसी-सेक = उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के साथ ट्रांसपोसेस-सुलभ क्रोमैटिन के लिए परख; एफयू = प्रतिदीप्ति इकाइयाँ; बीपी = आधार जोड़े; एनएफआर = न्यूक्लियोसोम मुक्त क्षेत्र; eWAT = एपिडीडिमल सफेद वसा ऊतक; iWAT = इनगुइनल सफेद वसा ऊतक; बीएटी = भूरा वसा ऊतक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: एटीएसी-सेक पुस्तकालयों का गुणवत्ता नियंत्रण क्यूपीसीआर विश्लेषण। सामान्य एडिपोसाइट मार्करों के पास प्रमोटरों और एन्हांसरों के लिए संवर्धन एडिपोक, फैब 4, प्लिन 1, और पीएनपीएलए 2 या ब्राउन एडिपोसाइट मार्कर यूसीपी 1। संक्षेप: एटीएसी-सेक = उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के साथ ट्रांसपोसेस-सुलभ क्रोमैटिन के लिए परख; एनसी = नकारात्मक नियंत्रण; eWAT = एपिडीडिमल सफेद वसा ऊतक; iWAT = इनगुइनल सफेद वसा ऊतक; बीएटी = भूरा वसा ऊतक। डेटा एसईएम (एन = 2) ± माध्य हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: माइटोकॉन्ड्रिया एटीएसी-सेक पुस्तकालयों की चोटियों के नीचे पढ़ता है और अंशों को पढ़ता है। (A) माइटोकॉन्ड्रिया eWAT, iWAT और BAT से चोटियों (%) के नीचे (%) और (B) अंश पढ़ता है। संक्षेप: एटीएसी-सेक = उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के साथ ट्रांसपोसेस-सुलभ क्रोमैटिन के लिए परख; eWAT = एपिडीडिमल सफेद वसा ऊतक; iWAT = इनगुइनल सफेद वसा ऊतक; बीएटी = भूरा वसा ऊतक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: एटीएसी-सेक सिग्नल प्रतिनिधि जीन के लोकी पर ट्रैक करता है। (ए-सी) सामान्य एडिपोसाइट मार्कर जीन। (बी) ब्राउन एडिपोसाइट्स-विशिष्ट मार्कर। संक्षेप: एटीएसी-सेक = उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के साथ ट्रांसपोसेस-सुलभ क्रोमैटिन के लिए परख; eWAT = एपिडीडिमल सफेद वसा ऊतक; iWAT = इनगुइनल सफेद वसा ऊतक; बीएटी = भूरा वसा ऊतक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: Tn5 मास्टर मिश्रण के घटक। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: पीसीआर मास्टर मिश्रण के घटक और प्रारंभिक पीसीआर साइकिलिंग स्थितियां। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 3: पीसीआर प्रवर्धन के लिए बारकोडेड प्राइमरों की सूची। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 4: क्यूपीसीआर मास्टर मिश्रण के घटक। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 5: क्यूपीसीआर साइकिल चलाने की स्थिति। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 6: अतिरिक्त प्रवर्धन के लिए दूसरी पीसीआर साइकिलिंग की स्थिति। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 7: एटीएसी-सेक लाइब्रेरी की गुणवत्ता की जांच के लिए प्राइमर अनुक्रम और लक्षित क्यूपीसीआर साइकिलिंग स्थितियां। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 8: गुणवत्ता जांच के लिए क्यूपीसीआर परिणामों का विश्लेषण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस पेपर में, हमने विवो में एडिपोसाइट्स-विशिष्ट क्रोमैटिन पहुंच का आकलन करने के लिए एक अनुकूलित एटीएसी-सेक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है। एडिपोक-न्यूट्रैप माउस का उपयोग करके इस एटीएसी-सेक प्रोटोकॉल ने सफलतापूर्वक एडिपोसाइट-विशिष्ट क्रोमैटिन एक्सेसिबिलिटी प्रोफाइल उत्पन्न किए। सफल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एटीएसी-सेक प्रयोगों के लिए सबसे महत्वपूर्ण कारक नाभिक की गुणवत्ता है। तरल नाइट्रोजन में विच्छेदित वसा ऊतकों को तुरंत स्नैप-फ्रीज करना और उपयोग तक पिघलने के बिना उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर सुरक्षित रूप से स्टोर करना महत्वपूर्ण है। न्यूक्लियस अलगाव और छंटाई के दौरान एडिपोसाइट्स न्यूक्लियस क्षति को रोकना भी महत्वपूर्ण है। नाभिक अलगाव की पूरी प्रक्रिया के दौरान नमूनों को कम गति वाले सेंट्रीफ्यूजेशन और न्यूनतम पाइपिंग के माध्यम से धीरे से संभाला जाना चाहिए।

नाभिक छंटाई के दौरान सावधानीपूर्वक गेटिंग एमचेरी / जीएफपी-टैग किए गए एडिपोसाइट नाभिक को चुनिंदा रूप से अलग करने के लिए महत्वपूर्ण है (चित्रा 1)। जीएफपी-पॉजिटिव और नकारात्मक आबादी के बीच एक स्पष्ट अलगाव सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है। इसी तरह, नाभिक में क्रोमैटिन की प्रकृति को संरक्षित करने के लिए कोमल हैंडलिंग और तेजी से छंटाई आवश्यक है। यदि प्रतिदीप्ति कमजोर है, छंटाई में बहुत लंबा समय लगता है, और / या एडिपोसाइट्स अंश प्रत्याशित सीमाओं से बाहर होते हैं, तो यह इंगित करता है कि नाभिक अलगाव प्रक्रियाओं के दौरान नमूनों या समस्याओं के साथ समस्याएं हो सकती हैं। इस प्रोटोकॉल को प्रयोगात्मक परिस्थितियों के आधार पर संशोधित किया जा सकता है। सबसे पहले, एटीएसी-सेक के लिए आवश्यक नाभिक की संख्या 1,000 या 100,000 तक जा सकती है। यदि 5,000 से कम नाभिक हैं, तो टीडीई आई एंजाइम की एक और कम मात्रा (0.6 μL) का उपयोग करने से ओवर-टैगमेंटेशन को रोका जा सकता है। 50,000 के बराबर या उससे अधिक नाभिक की संख्या के लिए, Tn5 मास्टर मिश्रण की मात्रा को 50 μL तक दोगुना किया जा सकता है, जो मूल प्रोटोकॉल10 में उपयोग की जाने वाली मात्रा के समान है।

दूसरा, अन्य न्यूक्लियस लेबलिंग सिस्टम, जैसे कि बरकरार (विशिष्ट सेल प्रकारों में टैग किए गए नाभिक का अलगाव) चूहों का उपयोग न्यूट्रैप चूहों16 के बजाय किया जा सकता है। जैसा कि बरकरार चूहे जीएफपी-टैग किए गए सन 1 परमाणु झिल्ली प्रोटीन को व्यक्त करते हैं, जीएफपी-टैग किए गए नाभिक को इस प्रोटोकॉल में वर्णित समान तरीकों का उपयोग करके एटीएसी-सेक के लिए छंटाई और उपयोग करके अलग किया जा सकता है। किसी भी अन्य परमाणु लेबलिंग विधियों को भी अपनाया जा सकता है। अंत में, इन विट्रो-सुसंस्कृत एडिपोसाइट्स का उपयोग इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए एटीएसी-सेक के लिए भी किया जा सकता है। इसके लिए, व्यंजनों / प्लेटों पर उगाई गई कोशिकाओं को स्क्रैप किया जाता है, एनपीबी का उपयोग करके एकत्र किया जाता है, और फिर उसी डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं के अधीन किया जाता है- सिवाय इसके कि छंटाई केवल आकार, जटिलता और होचस्ट के आधार पर की जानी चाहिए, न कि एमचेरी / जीएफपी जैसा कि पहलेवर्णित है।

न्यूट्रैप तकनीक का उपयोग करके यह एडिपोसाइट-विशिष्ट एटीएसी-सेक प्रोटोकॉल एक सीमा पैदा करता है क्योंकि यह फ्लोरोसेंट लेबलिंग के बिना काम नहीं करता है; इस प्रकार, मानव नमूनों का विश्लेषण इस तकनीक के साथ काम नहीं करेगा। हालांकि, ऊतक पाचन और प्लवनशीलता विधियों द्वारा पृथक एडिपोसाइट्स के साथ एटीएसी-सेक करना अभी भी संभव है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि मानव फ्लोटर एडिपोसाइट्स के साथ काम करने की कुछ सीमाएं हैं, जैसे कि कम गति वाले सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करते समय अन्य सेल प्रकारों द्वारा संदूषण और उच्च गति सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करते समय बड़े एडिपोसाइट्स का नुकसान। इस प्रोटोकॉल को किसी भी सेल प्रकार पर लागू किया जा सकता है जिसके लिए विशिष्ट सीआरई लाइनें उपलब्ध हैं, जिससे सीमित सेल इनपुट17 के साथ भी कुशल सेल प्रकार-विशिष्ट क्रोमैटिन प्रोफाइलिंग की अनुमति मिलती है। अंत में, यह बेहतर एटीएसी-सेक प्रोटोकॉल उन शोधकर्ताओं के लिए सहायक होगा जो विषम ऊतकों के भीतर विशिष्ट सेल प्रकारों से क्रोमैटिन पहुंच का मूल्यांकन करना चाहते हैं, इसके अलावा हमने यहां चर्चा की है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास इस पत्र में वर्णित अनुसंधान से संबंधित कोई प्रासंगिक या भौतिक वित्तीय हित नहीं हैं।

Acknowledgments

इस काम को IUSM शोआल्टर रिसर्च ट्रस्ट फंड (H.C.R.), मधुमेह और मेटाबोलिक रोग पायलट और व्यवहार्यता अनुदान (H.C.R.), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डायबिटीज एंड डाइजेस्टिव एंड किडनी डिजीज (R01DK129289 से H.C.R.), और अमेरिकन डायबिटीज एसोसिएशन जूनियर फैकल्टी अवार्ड (7-21-JDF-056 से H.C.R.) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animals
Adiponectin-Cre mouse The Jackson Laboratory 28020
NuTRAP mouse The Jackson Laboratory 29899
Reagents & Materials
1.5 mL DNA-LoBind tubes Eppendorf 86-923
100 µm cell strainer Falcon 352-360
15 mL tubes VWR 525-1071
2x TD buffer Illumina 15027866
384-well PCR plate Applied biosystem 4483285
40 µm cell strainer Falcon 352-340
50 mL tubes VWR 525-1077
AMPure XP reagent (SPRI beads) Beckman Coulter A63881
Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit Agilent Technologies 5067-4626
Clear adhesive film Applied biosystem 4306311
DNase/RNase-free distilled water Invitrogen 10977015
Dounce tissue grinder DWK Life Sciences 357542
DTT Sigma D9779
DynaMag-96 side skirted magnet Thermo Fishers 12027
FACS tubes Falcon  28719128
HEPES Boston BioProducts BBH-75
Hoechst 33342 Invitrogen 2134015
KCl (2 M) Boston BioProducts MT-252
Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips EpiCypher 10-0008
MgCl2 (1 M) Boston BioProducts MT-200
MinElute PCR purification kit Qiagen 28004
NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix BioLabs M0541S
NP40 Thermo Fishers 28324
PCR 8-tube strip USA scientific 1402-4708
Protease inhibitor cocktail (100x) Thermo Fishers 78439
Qubit dsDNA HS assay kit Invitrogen Q32851
Sucrose Sigma S0389-1KG
SYBR Green I (10,000x) Invitrogen S7563
TDE I enzyme Illumina 15027865
Instruments
Flow cytometer BD Biosciences FACSAria Fusion
Qubit fluorometer Invitrogen Q33226
Real-Time PCR system Thermo Fishers QuantStudio?5

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References

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प्रतिदीप्ति-सक्रिय न्यूक्लियस सॉर्टिंग का उपयोग करके वसा ऊतकों के साथ एडिपोसाइट्स-विशिष्ट एटीएसी-सेक
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Kim, K., Taleb, S., So, J., Wann,… More

Kim, K., Taleb, S., So, J., Wann, J., Cheol Roh, H. Adipocyte-Specific ATAC-Seq with Adipose Tissues Using Fluorescence-Activated Nucleus Sorting. J. Vis. Exp. (193), e65033, doi:10.3791/65033 (2023).

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