Summary
Nous présentons un protocole de dosage de la chromatine accessible par la transposase avec séquençage à haut débit (ATAC-seq) spécifiquement sur les adipocytes en utilisant le tri des noyaux avec des tissus adipeux isolés de souris rapporteures transgéniques avec marquage par fluorescence nucléaire.
Abstract
Le dosage de la chromatine accessible par la transposase avec séquençage à haut débit (ATAC-seq) est une technique robuste qui permet un profilage de l’accessibilité de la chromatine à l’échelle du génome. Cette technique a été utile pour comprendre les mécanismes de régulation de l’expression génique dans une gamme de processus biologiques. Bien que l’ATAC-seq ait été modifié pour différents types d’échantillons, il n’y a pas eu de modifications efficaces des méthodes ATAC-seq pour les tissus adipeux. Les défis avec les tissus adipeux comprennent l’hétérogénéité cellulaire complexe, la grande teneur en lipides et la contamination mitochondriale élevée. Pour surmonter ces problèmes, nous avons développé un protocole qui permet le séquençage ATAC spécifique aux adipocytes en utilisant le tri des noyaux activés par fluorescence avec des tissus adipeux de la souris rapporteur transgénique Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP). Ce protocole produit des données de haute qualité avec un minimum de lectures de séquençage gaspillées tout en réduisant la quantité d’entrée de noyau et de réactifs. Cet article fournit des instructions détaillées étape par étape pour la méthode ATAC-seq validée pour l’utilisation de noyaux adipocytaires isolés à partir de tissus adipeux de souris. Ce protocole aidera à étudier la dynamique de la chromatine dans les adipocytes sur diverses stimulations biologiques, ce qui permettra de nouvelles connaissances biologiques.
Introduction
Le tissu adipeux, spécialisé dans le stockage de l’excès d’énergie sous forme de molécules lipidiques, est un organe clé pour la régulation métabolique. Le contrôle strict de la formation et du maintien des adipocytes est vital pour la fonction du tissu adipeux et l’homéostasie énergétique du corps entier1. De nombreux régulateurs transcriptionnels jouent un rôle essentiel dans le contrôle de la différenciation, de la plasticité et de la fonction des adipocytes ; Certains de ces régulateurs sont impliqués dans les troubles métaboliques chez l’homme 2,3. Les progrès récents dans les techniques de séquençage à haut débit pour l’expression génique et l’analyse épigénomique ont encore facilité la découverte des régulateurs moléculaires de la biologie des adipocytes4. Les études de profilage moléculaire utilisant des tissus adipeux sont difficiles à mener en raison de l’hétérogénéité de ces tissus. Le tissu adipeux se compose principalement d’adipocytes, qui sont responsables du stockage des graisses, mais contient également divers autres types de cellules, telles que les fibroblastes, les cellules endothéliales et les cellules immunitaires5. De plus, la composition cellulaire du tissu adipeux est considérablement modifiée en réponse à des changements physiopathologiques tels que la température et l’état nutritionnel6. Pour surmonter ces problèmes, nous avons précédemment développé une souris rapporteur transgénique, appelée Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP), qui produit des ribosomes marqués GFP et des noyaux biotinylés marqués mCherry d’une manière dépendante de la recombinaseCre 7. Le système de double marquage permet d’effectuer des analyses transcriptomiques et épigénomiques spécifiques au type cellulaire avec des tissus. En utilisant des souris NuTRAP croisées avec des lignées adiponectine-Cre spécifiques aux adipocytes (Adipoq-NuTRAP), nous avons précédemment caractérisé les profils d’expression génique et les états de chromatine des populations d’adipocytes purs in vivo et déterminé comment ils sont modifiés pendant l’obésité 7,8. Auparavant, des souris NuTRAP croisées avec des lignées Ucp1-Cre spécifiques aux adipocytes bruns et beiges (Ucp1-NuTRAP) nous ont permis de caractériser le remodelage épigénomique de la rare population d’adipocytes thermogéniques, les adipocytes beiges, en réponse aux changements de température9.
ATAC-seq est une méthode analytique largement utilisée pour évaluer l’accessibilité de la chromatine à l’échelle du génome. La transposase Tn5 hyper-réactive utilisée dans ATAC-seq permet l’identification de régions ouvertes de chromatine en marquant des adaptateurs de séquençage dans la région accessible à la chromatine des noyaux10. ATAC-seq est une méthode simple, mais elle fournit des résultats robustes et est très efficace même avec des échantillons à faible entrée. Il est ainsi devenu l’une des méthodes de profilage épigénomique les plus populaires et a contribué à la compréhension des mécanismes de régulation de l’expression génique dans divers contextes biologiques. Depuis la création du protocole ATAC-seq original, diverses techniques dérivées de l’ATAC-seq ont été développées pour modifier et optimiser le protocole pour divers types d’échantillons. Par exemple, Fast-ATAC est conçu pour analyser des échantillons de cellules sanguines11, Omni-ATAC est un protocole optimisé pour les échantillons de tissus congelés 12 et MiniATAC-seq est efficace pour l’analyse embryonnaire à un stade précoce13. Cependant, l’application de la méthode ATAC-seq aux adipocytes, en particulier à partir d’échantillons de tissus, reste difficile. En plus de l’hétérogénéité du tissu adipeux, sa teneur élevée en lipides peut interférer avec des réactions de recombinaison efficaces par la transposase Tn5 même après isolement du noyau. En outre, la teneur mitochondriale élevée dans les adipocytes, en particulier dans les adipocytes bruns et beiges, provoque une contamination élevée de l’ADN mitochondrial et des lectures de séquençage gaspillées. Cet article décrit un protocole pour le séquençage ATAC spécifique des adipocytes utilisant des souris Adipoq-NuTRAP (Figure 1). En tirant parti du tri des noyaux marqués par fluorescence, ce protocole permet la collecte de populations pures de noyaux adipocytaires loin des autres types de cellules confondantes et l’élimination efficace des lipides, des mitochondries et des débris tissulaires. Par conséquent, ce protocole peut générer des données de haute qualité spécifiques au type de cellule et minimiser les déchets des lectures mitochondriales tout en utilisant une quantité réduite d’entrées et de réactifs par rapport au protocole standard.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Les soins et l’expérimentation des animaux ont été effectués conformément aux procédures approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de la faculté de médecine de l’Université de l’Indiana.
1. Préparatifs avant de commencer l’expérience
- Préparation des tissus
- Pour le marquage du noyau adipocytaire, croisez des souris NuTRAP avec des lignées adiponectine-Cre spécifiques aux adipocytes (Adipoq-Cre) pour générer des souris Adipoq-NuTRAP, qui sont hémizygotes pour Adipoq-Cre et NuTRAP.
- Disséquer les tissus adipeux d’intérêt des souris Adipoq-NuTRAP comme décrit précédemment14.
- Congeler les tissus dans de l’azote liquide et les conserver à −80 °C jusqu’à utilisation.
REMARQUE: Chaque coussinet de graisse peut être stocké dans son ensemble, et les tissus congelés peuvent ensuite être coupés sur de la glace sèche en plus petits morceaux (~ 50 mg) pour des expériences. Alternativement, les tissus adipeux peuvent être coupés, aliquotes et congelés dans des tubes pour le stockage (~ 50 mg par tube). Les échantillons congelés ne sont jamais autorisés à décongeler après la congélation jusqu’à utilisation.
- Préparation du tampon
REMARQUE: Gardez les tampons sur la glace tout au long de l’expérience.- Préparer le tampon de préparation du noyau (NPB) : 250 mM de saccharose, 10 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2 et 0,1 % NP40. Préparer 7 mL de NPB par échantillon. Ajouter un cocktail d’inhibiteurs de protéase 100x frais (final 1x), du DTT (final 1 mM) et du Hoechst (final 1 μg/mL) à la NPB avant utilisation.
REMARQUE: Il est recommandé de préparer du NPB frais, mais il peut être conservé à 4 ° C jusqu’à 1 mois. - Préparer 1x solution saline tamponnée au phosphate avec 0,1% de NP-40 (PBS-N).
- Préparer le tampon de préparation du noyau (NPB) : 250 mM de saccharose, 10 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2 et 0,1 % NP40. Préparer 7 mL de NPB par échantillon. Ajouter un cocktail d’inhibiteurs de protéase 100x frais (final 1x), du DTT (final 1 mM) et du Hoechst (final 1 μg/mL) à la NPB avant utilisation.
2. Isolement du noyau
- Refroidir le verre Dounce homogénéisateurs, avec un verre Dounce par échantillon, sur glace. Ensuite, ajoutez 7 ml du mélange NPB à chaque verre de rebond.
REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser jusqu’à huit échantillons dans chaque expérience. Travailler avec plus de huit échantillons retarderait considérablement toutes les étapes, et cela pourrait surtout dégrader la qualité du noyau lors du tri. - Mettez le tissu adipeux congelé (50-100 mg) dans le verre Dounce, et coupez-le immédiatement en quelques petits morceaux à l’aide d’une longue paire de ciseaux. Frapper 10x avec un pilon lâche pour tous les échantillons, puis 10x avec un pilon serré.
REMARQUE: Les tissus adipeux sont mous, donc les couper en quelques petits morceaux devrait suffire. Pour les échantillons rares, des morceaux plus petits (10-20 mg) peuvent être utilisés, bien que le nombre de noyaux adipocytaires prélevés puisse varier. - Filtrer à travers une crépine de 100 μm dans un nouveau tube de 50 mL. Déplacer les homogénats filtrés vers un nouveau tube de 15 ml en versant. Faire tourner à 200 × g pendant 10 min à 4 °C dans une centrifugeuse à godet pivotant. Retirez le surnageant autant que possible.
REMARQUE: Aspirez d’abord à l’aide d’un vide, puis retirez le volume restant à l’aide d’une micropipette. - Remettez la pastille en suspension dans 500 μL de PBS-N en tapotant doucement mais soigneusement les doigts.
REMARQUE: Évitez le pipetage, car cela pourrait endommager les noyaux. - Filtrer à travers une crépine de 40 μm dans un nouveau tube de 50 ml à l’aide d’un pipetage doux. Rincer la crépine avec 250 μL de PBS-N. Transférer la remise en suspension nucléaire filtrée dans un tube de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) à l’aide d’une micropipette.
REMARQUE: Si disponible, les tubes et les crépines à cellules peuvent être utilisés pour de plus petits volumes afin de minimiser la perte d’échantillon.
3. Tri des noyaux
- Préparation du tube de prélèvement
- Ajouter 500 μL de PBS-N dans de nouveaux tubes de 1,5 mL et retourner plusieurs fois pour mouiller toutes les surfaces internes avec le tampon.
- Faites tourner brièvement les tubes pour faire descendre tout le liquide, puis refroidissez-les sur de la glace jusqu’au tri.
- FACS (figure 2)
- Utilisez le point de contrôle FSC-A/FSC-H pour les maillots et le point de contrôle FSC-A/SSC-A pour l’enlèvement des petits ou des gros débris.
- Porte pour la population de noyaux adipocytaires positifs pour la cerise et la GFP.
- Prélever 10 000 noyaux dans chacun des tubes de collecte préparés à l’étape 3.1.
- Préparation du noyau post-tri
- Ajouter 500 μL de PBS-N à chaque tube de collecte et retourner plusieurs fois pour mélanger.
- Faire tourner les tubes collecteurs à 200 × g pendant 10 min à 4 °C dans une centrifugeuse à godet pivotant. Retirez complètement le surnageant.
REMARQUE: Utilisez d’abord un aspirateur pour éliminer les bulles, versez le surnageant et utilisez des lingettes en papier pour éliminer complètement le liquide restant. La pastille est invisible à ce stade. Préparer le mélange maître Tn5 pendant l’étape de centrifugation décrite ci-dessous.
4. Étiquetage Tn5 (tableau 1)
- Pour préparer 25 μL de mélange maître Tn5, mélanger 12,5 μL de tampon ADN de marquage 2x (tampon TD), 1,25 μL de transposase Tn5 (enzyme TDE I) et 11,25 μL d’eau exempte de nucléase.
- Ajouter 25 μL de mélange maître Tn5 à chaque pastille de noyau et remettre en suspension par pipetage doux. Incuber à 600 tr/min pendant 30 min à 37 °C à l’aide d’un thermomélangeur.
5. Purification de l’ADN
REMARQUE: La procédure suivante utilise le kit de purification PCR mentionné dans le tableau des matériaux. Toute autre méthode similaire de purification de l’ADN peut être utilisée.
- Ajouter 25 μL d’eau exempte de nucléases aux 25 μL du mélange de resuspension du noyau Tn5 obtenu après l’étape 4.2. Le volume final est de 50 μL par échantillon.
- Ajouter 250 μL de tampon PB.
- Ajouter 5 μL d’acétate de sodium 3 M (NaOAc) (pH 5,2).
- Transférer le mélange dans une colonne (fournie avec le kit référencé), et centrifuger à 17 900 × g pendant 1 min à température ambiante (RT).
- Jetez le flux continu et replacez la colonne de rotation dans le même tube de collecte. Ajouter 750 μL de PE tampon contenant de l’éthanol absolu (EtOH) et centrifuger à 17 900 × g pendant 1 min à TA.
- Jetez le flux continu et replacez la colonne de rotation dans le même tube de collecte. Centrifuger à 17 900 × g pendant 1 min à TA et jeter le tube de collecte avec le flowthrough.
- Pour éluer les fragments d’ADN, équiper la colonne d’un nouveau tube de 1,5 mL, ajouter 10 μL de tampon EB et laisser à TA pendant 3 min. Centrifuger à 17 900 × g pendant 1 min à TA.
REMARQUE: Les échantillons peuvent être conservés à 4 ° C pendant des jours ou à -20 ° C pendant des semaines.
6. Amplification par PCR (tableau 2)
REMARQUE : Les amorces utilisées dans cette étude sont énumérées au tableau 3.
- Pour amplifier les fragments d’ADN transposés, préparez le mélange maître PCR sans ajouter une amorce de codage à barres Ad2.n unique (amorce #2). Utilisez 38 μL du mélange maître PCR par échantillon : 11 μL d’eau sans nucléase, 2 μL d’amorce de Ad1_noMX 25 μM (amorce #1) et 25 μL de 2x PCR Master Mix.
- Ajouter 38 μL du mélange maître PCR dans un tube PCR de 0,2 mL.
- Ajouter 10 μL des fragments d’ADN élués de l’étape 5.7.
- Ajouter 2 μL d’amorce #2 de 25 μM, qui doit être spécifique à chaque échantillon.
- Exécuter la PCR en fonction des conditions de cycle indiquées dans le tableau 2.
7. Test PCR quantitatif en temps réel (qPCR) (tableau 4)
NOTE: Cette étape vise à déterminer les cycles supplémentaires nécessaires pour amplifier l’ADN. Il est facultatif mais fortement recommandé, en particulier pour les nouvelles expériences.
- Préparer le mélange maître qPCR sans ajouter l’apprêt #2. Utilisez 9,975 μL du mélange maître qPCR par échantillon : 4,41 μL d’eau exempte de nucléase, 0,25 μL d’apprêt #1 25 μM, 5 μL de 2x PCR Master Mix et 0,09 μL 100x SYBR Green I.
REMARQUE: Pour préparer 100x SYBR Green I, diluer le stock 10,000x avec de l’eau sans nucléase. Comme le volume de 100x SYBR Green I utilisé pour le mélange maître qPCR est négligeable, il est plus facile de faire un mélange maître supplémentaire de 100x SYBR Green I dilué (par exemple, pour 8-10 échantillons). - Ajouter 9,975 μL du mélange maître qPCR dans chaque puits d’une plaque qPCR.
- Ajouter 0,25 μL d’amorce #2 de 25 μM dans chaque puits.
REMARQUE: Assurez-vous d’ajouter le même apprêt #2 pour correspondre à ce qui a été ajouté à chaque échantillon spécifique à l’étape 6.4. - Ajouter 5 μL de la réaction PCR obtenue après amplification PCR à l’étape 6.5, et mélanger par pipetage.
REMARQUE : Les 45 μL restants de la réaction PCR seront utilisés pour la deuxième amplification PCR. - Exécutez la qPCR selon les conditions de cycle indiquées dans le tableau 5.
- Vérifiez les courbes d’amplification et identifiez le nombre de cycles de PCR supplémentaires nécessaires en estimant le nombre de cycles qui ont atteint ~35% du maximum (Figure 3A).
REMARQUE: En règle générale, 10 000 noyaux nécessitent cinq à huit cycles de PCR supplémentaires.
8. Amplification PCR supplémentaire
- Exécutez la PCR en utilisant la totalité des 45 μL restants de la réaction PCR selon les calculs de l’étape 7.6 (tableau 6).
REMARQUE : Chaque échantillon peut nécessiter un nombre différent de cycles d’amplification.
9. Deuxième purification de l’ADN à l’aide du kit de purification PCR
- Utiliser les mêmes procédures que dans la section 5, mais éluer les fragments d’ADN amplifiés avec 20 μL de tampon EB.
10. Sélection de la taille des fragments d’ADN
REMARQUE: Utilisez des billes d’immobilisation réversibles en phase solide, comme décrit ci-dessous. Toute autre perle de purification d’ADN similaire peut être utilisée selon les instructions du fabricant. La suspension du cordon SPRI doit être complètement remise en suspension et équilibrée à RT avec rotation avant utilisation.
- Transférer l’ADN élué dans un nouveau tube de PCR et ajouter 80 μL de tampon EB pour obtenir un volume final de 100 μL.
- Ajouter 55 μL de billes SPRI (0,55x le volume d’échantillon) et mélanger par pipetage. Incuber pendant 5 min à TA, puis séparer sur un mini support magnétique pour les bandes PCR à 8 tubes pendant 5 min.
- Transférer 150 μL du surnageant dans un nouveau tube PCR. Ajouter 95 μL de billes SPRI et mélanger par pipetage.
REMARQUE : Le surnageant contient de l’ADN d’environ 500 pb ou moins. - Incuber pendant 5 min à TA, puis séparer sur le mini support magnétique pendant 5 min. Jetez soigneusement le surnageant.
- Laver les billes pendant 1 min avec 200 μL d’EtOH à 70%. Répétez deux fois pour trois lavages au total.
REMARQUE: Ne déplacez pas les tubes PCR du support magnétique pendant les lavages. - Après le lavage final, faire tourner les tubes à 1 000 × g pendant 1 min et extraire l’EtOH restant. Sécher la pastille avec le couvercle ouvert à 37 °C pendant 2 min sur une machine de PCR.
REMARQUE: Les granulés de billes ne doivent présenter que quelques fissures mineures une fois séchés. Évitez de trop sécher. - Resuspendre la pastille avec 20 μL de tampon EB par pipetage et incuber pendant 5 min à TA. Séparer sur le mini support magnétique pendant 5 min, puis transférer 18 μL du surnageant contenant la bibliothèque finale dans un nouveau tube de 1,5 mL.
REMARQUE La bibliothèque peut être stockée à −20 °C tout en effectuant un contrôle de qualité.
11. Quantification de l’ADN à l’aide d’un fluoromètre
- Pour préparer le mélange maître, diluer le réactif 200x dsDNA High Sensitivity (HS) avec un tampon dsDNA HS jusqu’à une concentration finale de 1x.
- Pour les étalons, ajouter 190 μL du mélange maître 1x et 10 μL de l’étalon 1 ou de l’étalon 2 dans un tube fluoré.
NOTE: Équilibrer les étalons à RT dans l’obscurité avant de commencer la quantification. - Pour les échantillons de la bibliothèque, ajouter 198 μL du mélange maître 1x et 2 μL de chaque échantillon dans un tube fluoré séparé.
REMARQUE : Si les quantités d’échantillon sont limitées, le volume de l’échantillon peut être réduit à 1 μL et le volume du mélange maître 1x peut être augmenté à 199 μL. - Tourbillonner ou secouer les tubes du fluoromètre et les laisser reposer pendant 5 minutes à RT dans l’obscurité. Mesurer la concentration d’ADN à l’aide du test dsDNA HS du fluoromètre.
12. Contrôle de la qualité de la bibliothèque par des systèmes d’électrophorèse à haute sensibilité
- Prenez la bibliothèque ATAC-seq et diluez avec de l’eau sans nucléase jusqu’à une concentration finale de 1-5 ng / μL.
- Analysez la distribution de taille des bibliothèques ATAC-seq à l’aide de systèmes d’électrophorèse automatisés à haute sensibilité suivant les protocoles du fabricant.
13. Contrôle de la qualité de la bibliothèque ATAC-seq à l’aide de qPCR ciblée
- Prendre 5-10 ng de la bibliothèque ATAC-seq et diluer avec 50 μL d’eau sans nucléase.
- Exécuter la qPCR à l’aide d’amorces ciblant les promoteurs et les amplificateurs connus pour être actifs dans les adipocytes selon les conditions de cycle indiquées dans le tableau 7.
- Utiliser des amorces de contrôle négatif ciblant les régions génomiques fermées/silencieuses (tableau 7).
- Calculer l’enrichissement du promoteur/amplificateur par rapport aux témoins négatifs (tableau 8).
REMARQUE: On s’attend à ce que les enrichissements ≥ 10 à 20 fois avec des échantillons réussis.
14. Séquençage
- Soumettez les bibliothèques ATAC-seq pour le séquencement. Utilisez le séquençage d’extrémité appariée (2 x 34 pb, 2 x 50 pb ou plus) avec des nombres de lecture moyens de 10 à 30 millions de lectures par échantillon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pour analyser le tissu adipeux à l’aide de ce protocole ATAC-seq, nous avons généré des souris Adipoq-NuTRAP qui ont été nourries avec des régimes chow; nous avons ensuite isolé les noyaux adipocytaires du tissu adipeux blanc épididymaire (eWAT), du tissu adipeux blanc inguinal (iWAT) et du tissu adipeux brun (MTD) en utilisant la cytométrie en flux. Les noyaux isolés ont été utilisés pour le marquage, suivi de la purification de l’ADN, de l’amplification par PCR, des étapes de contrôle de la qualité, du séquençage et de l’analyse des données, comme décrit ci-dessus. Le but de cette expérience représentative était de profiler l’accessibilité de la chromatine des populations d’adipocytes purs isolées de différents dépôts de graisse.
Nous avons observé que les noyaux adipocytaires marqués mCherry et GFP se distinguaient clairement des noyaux d’autres types de cellules isolées des tissus adipeux d’une souris Adipoq-NuTRAP par cytométrie en flux (Figure 2A-C). Il y avait des différences dans les fractions adipocytaires selon le type de dépôt adipeux : ~50 % dans eWAT, ~30 % dans iWAT et ~65 % dans BAT (Figure 2D)7. Nous avons recueilli 10 000 noyaux en 2 à 10 minutes par échantillon et les avons utilisés pour les procédures ATAC-seq. Nous avons exécuté un total de 10 à 13 cycles de PCR (cinq cycles de la première PCR et cinq à huit cycles de la deuxième PCR, Figure 3A). Si les échantillons nécessitent plus de 15 cycles de PCR au total, cela peut indiquer des échantillons de faible qualité (figure 3B). L’analyse de la distribution granulométrique des bibliothèques ATAC-seq a montré de multiples pics correspondant à la région exempte de nucléosomes (NFR) et aux mono, di et multinucléosomes (Figure 4A-C), avec des tailles moyennes de ~500-800 pb. Les échantillons de mauvaise qualité présentaient généralement principalement de la NFR avec peu ou pas de pics nucléosomiques (Figure 4D). Les tests de contrôle de qualité par l’analyse qRT-PCR ont montré des enrichissements de 10 à 20 fois avec les éléments génomiques positifs à proximité des gènes marqueurs adipocytaires tels que Adipoq, Fabp4, Plin1 et Pnpla2, tandis qu’aucun enrichissement n’a été montré avec le témoin négatif (Figure 5). Nous avons également observé un enrichissement avec le gène thermogénique Ucp1 spécifiquement dans BAT mais pas dans eWAT ou iWAT (Figure 5).
Après le séquençage et l’analyse, nous avons identifié ~55 000 pics combinés à partir de trois dépôts adipeux différents (eWAT, iWAT et BAT). Les lectures mitochondriales étaient de <2%, et la fraction sous les pics était de ~18%-44% (Figure 6A, B). Les échantillons de mauvaise qualité peuvent avoir des lectures mitochondriales significativement plus élevées et / ou une fraction plus faible de lectures dans les régions de pointe. L’inspection visuelle des pistes de la bibliothèque ATAC-seq a révélé plusieurs pics forts avec des rapports signal sur bruit élevés près des gènes marqueurs adipocytes, tels que Adipoq, Plin1 et Fabp4, de tous les dépôts adipeux (Figure 7A-C). Nous avons également observé de forts pics ATAC-seq au locus Ucp1 du fabricant d’adipocytes bruns dans l’échantillon BAT, mais ces pics n’ont pas été observés dans les échantillons eWAT ou iWAT (Figure 7D). Toutes ces données indiquent des données ATAC-seq réussies générées à partir de noyaux adipocytes.
Figure 1 : Organigramme schématique de l’ATAC-seq spécifique aux adipocytes à l’aide de souris NuTRAP. Les étapes propres à ce protocole sont mises en évidence dans les zones ombragées en rouge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Point de contrôle FACS représentatif illustrant l’isolement de noyaux d’adipocytes marqués mCherry/GFP dans les tissus adipeux d’une souris Adipoq-NuTRAP. (A-C) Analyse par cytométrie de flux de noyaux isolés provenant de l’eWAT, de l’iWAT et de la MTD d’une souris Adipoq-NuTRAP. (D) Analyse quantitative des noyaux d’adipocytes et de non-adipocytes dans l’eWAT, l’iWAT et la MTD d’une souris Adipoq-NuTRAP. Les données sont moyennes ± SEM (n = 3). Ces données sur le nombre de noyaux proviennent de Roh et coll.7. Abréviations : FACS = tri cellulaire activé par fluorescence; GFP = protéine fluorescente verte; eWAT = tissu adipeux blanc épididymaire; iWAT = tissu adipeux blanc inguinal; MTD = tissu adipeux brun; NuTRAP = marquage nucléaire et purification de l’affinité des ribosomes par traduction; Adipoq-NuTRAP = souris NuTRAP croisée avec la lignée adiponectine-Cre spécifique des adipocytes ; FSC-A = aire du pic de diffusion vers l’avant; FSC-H = hauteur du pic de diffusion vers l’avant; SSC-A = aire de pic de diffusion latérale; FITC-A = zone de pic d’isothiocyanate de fluorescéine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Courbes d’amplification représentatives de qRT-PCR. (A) Échantillon de bonne qualité nécessitant sept cycles d’amplification supplémentaires. (B) Échantillon de mauvaise qualité nécessitant ≥15 cycles supplémentaires. Abréviation : qRT-PCR = PCR quantitative à transcription inverse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Profils de distribution de taille des bibliothèques ATAC-seq. (A-C) Les bibliothèques de bonne qualité et (D) de mauvaise qualité sont présentées comme résultats représentatifs. Abréviations : ATAC-seq = dosage de la chromatine accessible par la transposase avec séquençage à haut débit; FU = unités de fluorescence; bp = paires de bases; NFR = région exempte de nucléosomes; eWAT = tissu adipeux blanc épididymaire; iWAT = tissu adipeux blanc inguinal; MTD = tissu adipeux brun. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Analyse qPCR du contrôle qualité des bibliothèques ATAC-seq. Enrichissements pour promoteurs et amplificateurs à proximité des marqueurs adipocytaires généraux Adipoq, Fabp4, Plin1 et Pnpla2 ou du marqueur adipocytaire brun Ucp1. Abréviations : ATAC-seq = dosage de la chromatine accessible par la transposase avec séquençage à haut débit; NC = témoin négatif; eWAT = tissu adipeux blanc épididymaire; iWAT = tissu adipeux blanc inguinal; MTD = tissu adipeux brun. Les données sont des moyennes ± SEM (n = 2). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Lectures et fractions des mitochondries sous les pics des bibliothèques ATAC-seq. (A) Les mitochondries lisent (%) et (B) les fractions sous les pics (%) d’eWAT, iWAT et BAT. Abréviations : ATAC-seq = dosage de la chromatine accessible par la transposase avec séquençage à haut débit; eWAT = tissu adipeux blanc épididymaire; iWAT = tissu adipeux blanc inguinal; MTD = tissu adipeux brun. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Traces du signal ATAC-seq aux loci des gènes représentatifs. (A-C) Gènes marqueurs adipocytaires généraux. (B) Marqueur spécifique de l’adipocyte brun. Abréviations : ATAC-seq = dosage de la chromatine accessible par la transposase avec séquençage à haut débit; eWAT = tissu adipeux blanc épididymaire; iWAT = tissu adipeux blanc inguinal; MTD = tissu adipeux brun. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Composants du mélange maître Tn5. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 2 : Composants du mélange maître PCR et conditions initiales du cycle PCR. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 3 : Liste des amorces à code-barres pour l’amplification par PCR. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 4 : Composants du mélange maître qPCR. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 5 : conditions de cycle qPCR. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 6 : Conditions de cycle de deuxième PCR pour une amplification supplémentaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 7 : Séquences d’amorces et conditions de cycle qPCR ciblées pour le contrôle qualité de la bibliothèque ATAC-seq. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 8 : Analyse des résultats de la qPCR pour le contrôle qualité. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dans cet article, nous avons présenté un protocole ATAC-seq optimisé pour évaluer l’accessibilité de la chromatine spécifique des adipocytes in vivo. Ce protocole ATAC-seq utilisant la souris Adipoq-NuTRAP a généré avec succès des profils d’accessibilité de chromatine spécifiques aux adipocytes. Le facteur le plus critique pour le succès et la reproductibilité des expériences ATAC-seq est la qualité du noyau. Il est essentiel de congeler immédiatement les tissus adipeux disséqués dans de l’azote liquide et de les entreposer en toute sécurité à −80 °C sans les décongeler jusqu’à utilisation. Il est également important de prévenir les dommages au noyau adipocytaire lors de l’isolement et du tri du noyau. Les échantillons doivent être manipulés en douceur par centrifugation à basse vitesse et pipetage minimal pendant tout le processus d’isolement des noyaux.
Un contrôle minutieux lors du tri des noyaux est crucial pour isoler sélectivement les noyaux adipocytaires marqués mCherry/GFP (Figure 1). Il est important d’assurer une séparation claire entre les populations mCherry/GFP-positives et négatives. De même, une manipulation douce et un tri rapide sont nécessaires pour préserver la nature de la chromatine dans les noyaux. Si la fluorescence est faible, que le tri prend trop de temps et/ou que les fractions adipocytaires sont en dehors des plages prévues, cela indique qu’il peut y avoir des problèmes avec les échantillons ou des problèmes pendant les procédures d’isolement des noyaux. Ce protocole peut être modifié en fonction des circonstances expérimentales. Tout d’abord, le nombre de noyaux requis pour l’ATAC-seq peut descendre à 1 000 ou jusqu’à 100 000. S’il y a moins de 5 000 noyaux, l’utilisation d’un volume réduit supplémentaire (0,6 μL) de l’enzyme TDE I empêcherait le surmarquage. Pour un nombre de noyaux égal ou supérieur à 50 000, le volume du mélange maître Tn5 peut être doublé à 50 μL, soit le même volume que celui utilisé dans le protocole original10.
Deuxièmement, d’autres systèmes de marquage des noyaux, tels que les souris INTACT (isolement des noyaux marqués dans des types de cellules spécifiques), peuvent être utilisés à la place des souris NuTRAP16. Comme les souris INTACT expriment la protéine membranaire nucléaire SUN1 marquée GFP, les noyaux marqués GFP peuvent être isolés par tri et utilisés pour ATAC-seq en utilisant les mêmes méthodes décrites dans ce protocole. Toute autre méthode d’étiquetage nucléaire peut également être adoptée. Enfin, les adipocytes cultivés in vitro peuvent également être utilisés pour ATAC-seq suivant ce protocole. Pour cela, les cellules cultivées sur des plats/assiettes sont grattées, collectées à l’aide de NPB, puis soumises aux mêmes procédures en aval - sauf que le tri ne doit être effectué que sur la base, la complexité et le Hoechst, et non sur mCherry/GFP comme décrit précédemment15.
Ce protocole ATAC-seq spécifique aux adipocytes utilisant la technique NuTRAP pose une limite car il ne fonctionne pas sans marquage fluorescent; Ainsi, l’analyse d’échantillons humains ne fonctionnera pas avec cette technique. Cependant, il est toujours possible d’effectuer ATAC-seq avec des adipocytes isolés par des méthodes de digestion et de flottation des tissus. Il convient de noter que le travail avec des adipocytes flottants humains présente certaines limites, telles que la contamination par d’autres types de cellules lors de l’utilisation de la centrifugation à basse vitesse et la perte de gros adipocytes lors de l’utilisation de la centrifugation à grande vitesse. Ce protocole peut être appliqué à n’importe quel type de cellule pour lequel des lignées Cre spécifiques sont disponibles, ce qui permet un profilage efficace de la chromatine spécifique au type de cellule, même avec des entrées cellulaires limitées17. En conclusion, ce protocole ATAC-seq amélioré sera utile aux chercheurs souhaitant évaluer l’accessibilité de la chromatine à partir de types cellulaires spécifiques dans des tissus hétérogènes ex vivo, en plus des adipocytes dont nous avons parlé ici.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier pertinent ou matériel lié à la recherche décrite dans cet article.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le Fonds fiduciaire de recherche Showalter de l’IUSM (à H.C.R.), une subvention pilote et de faisabilité du Centre IUSM pour le diabète et les maladies métaboliques (à H.C.R.), l’Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales (R01DK129289 à H.C.R.) et le prix du corps professoral junior de l’American Diabetes Association (7-21-JDF-056 à H.C.R.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Adiponectin-Cre mouse | The Jackson Laboratory | 28020 | |
| NuTRAP mouse | The Jackson Laboratory | 29899 | |
| Reagents & Materials | |||
| 1.5 mL DNA-LoBind tubes | Eppendorf | 86-923 | |
| 100 µm cell strainer | Falcon | 352-360 | |
| 15 mL tubes | VWR | 525-1071 | |
| 2x TD buffer | Illumina | 15027866 | |
| 384-well PCR plate | Applied biosystem | 4483285 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352-340 | |
| 50 mL tubes | VWR | 525-1077 | |
| AMPure XP reagent (SPRI beads) | Beckman Coulter | A63881 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Clear adhesive film | Applied biosystem | 4306311 | |
| DNase/RNase-free distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Dounce tissue grinder | DWK Life Sciences | 357542 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| DynaMag-96 side skirted magnet | Thermo Fishers | 12027 | |
| FACS tubes | Falcon | 28719128 | |
| HEPES | Boston BioProducts | BBH-75 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 2134015 | |
| KCl (2 M) | Boston BioProducts | MT-252 | |
| Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips | EpiCypher | 10-0008 | |
| MgCl2 (1 M) | Boston BioProducts | MT-200 | |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix | BioLabs | M0541S | |
| NP40 | Thermo Fishers | 28324 | |
| PCR 8-tube strip | USA scientific | 1402-4708 | |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fishers | 78439 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Sucrose | Sigma | S0389-1KG | |
| SYBR Green I (10,000x) | Invitrogen | S7563 | |
| TDE I enzyme | Illumina | 15027865 | |
| Instruments | |||
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACSAria Fusion | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | |
| Real-Time PCR system | Thermo Fishers | QuantStudio?5 |
References
- Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).
- Farmer, S. R.
- Bielczyk-Maczynska, E. White adipocyte plasticity in physiology and disease. Cells. 8 (12), 1507 (2019).
- Basu, U., Romao, J. M., Guan, L. L. Adipogenic transcriptome profiling using high throughput technologies. Journal of Genomics. 1, 22-28 (2013).
- Esteve Rafols, M. Adipose tissue: Cell heterogeneity and functional diversity. Endocrinologia y Nutricion. 61 (2), 100-112 (2014).
- Kwok, K. H., Lam, K. S., Xu, A. Heterogeneity of white adipose tissue: Molecular basis and clinical implications. Experimental and Molecular Medicine. 48, e215 (2016).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Roh, H. C., et al. Adipocytes fail to maintain cellular identity during obesity due to reduced PPARγ activity and elevated TGFβ-SMAD signaling. Molecular Metabolism. 42, 101086 (2020).
- Roh, H. C., et al. Warming induces significant reprogramming of beige, but not brown, adipocyte cellular identity. Cellular Metabolism. 27 (5), 1121.e5-1137.e5 (2018).
- Buenrostro, J. D., et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Wu, J., et al. Chromatin analysis in human early development reveals epigenetic transition during ZGA. Nature. 557 (7704), 256-260 (2018).
- Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and dissection of diverse mouse adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
- So, J., et al. Chronic cAMP activation induces adipocyte browning through discordant biphasic remodeling of transcriptome and chromatin accessibility. Molecular Metabolism. 66, 101619 (2022).
- Loft, A., Herzig, S., Schmidt, S. F. Purification of GFP-tagged nuclei from frozen livers of INTACT mice for RNA- and ATAC-sequencing. STAR Protocols. 2 (3), 100805 (2021).
- Heyward, F. D., et al. Integrated genomic analysis of AgRP neurons reveals that IRF3 regulates leptin's hunger-suppressing effects. bioRxiv. , (2022).
