Summary
Vi præsenterer en protokol til assay for transposase-tilgængeligt kromatin med high-throughput sekventering (ATAC-seq) specifikt på adipocytter ved hjælp af kernesortering med fedtvæv isoleret fra transgene reportermus med nuklear fluorescensmærkning.
Abstract
Assay for transposase-tilgængeligt kromatin med high-throughput sekventering (ATAC-seq) er en robust teknik, der muliggør genom-dækkende kromatintilgængelighedsprofilering. Denne teknik har været nyttig til at forstå reguleringsmekanismerne for genekspression i en række biologiske processer. Selvom ATAC-seq er blevet modificeret til forskellige typer prøver, har der ikke været effektive ændringer af ATAC-seq-metoder til fedtvæv. Udfordringer med fedtvæv omfatter den komplekse cellulære heterogenitet, stort lipidindhold og høj mitokondriel forurening. For at overvinde disse problemer har vi udviklet en protokol, der tillader adipocytspecifik ATAC-seq ved at anvende fluorescensaktiveret kernesortering med fedtvæv fra den transgene reporter Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mus. Denne protokol producerer data af høj kvalitet med minimal spildt sekventeringslæsning, samtidig med at mængden af kerneinput og reagenser reduceres. Dette papir indeholder detaljerede trinvise instruktioner til ATAC-seq-metoden, der er valideret til brug af adipocytkerner isoleret fra musefedtvæv. Denne protokol vil hjælpe med undersøgelsen af kromatindynamik i adipocytter ved forskellige biologiske stimuleringer, hvilket vil give mulighed for ny biologisk indsigt.
Introduction
Fedtvæv, der er specialiseret til opbevaring af overskydende energi i form af lipidmolekyler, er et nøgleorgan til metabolisk regulering. Den strenge kontrol af adipocytdannelse og vedligeholdelse er afgørende for fedtvævsfunktion og helkropsenergihomeostase1. Mange transkriptionelle regulatorer spiller en kritisk rolle i kontrollen af adipocytdifferentiering, plasticitet og funktion; Nogle af disse regulatorer er impliceret i metaboliske lidelser hos mennesker 2,3. Nylige fremskridt inden for high-throughput sekventeringsteknikker til genekspression og epigenomisk analyse har yderligere lettet opdagelsen af de molekylære regulatorer af adipocytbiologi4. Molekylære profileringsundersøgelser ved hjælp af fedtvæv er udfordrende at gennemføre på grund af heterogeniteten af disse væv. Fedtvæv består primært af adipocytter, som er ansvarlige for fedtopbevaring, men indeholder også forskellige andre celletyper, såsom fibroblaster, endotelceller og immunceller5. Derudover ændres fedtvævets cellulære sammensætning dramatisk som reaktion på patofysiologiske ændringer såsom temperatur og ernæringsstatus6. For at overvinde disse problemer har vi tidligere udviklet en transgen reportermus, kaldet Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP), som producerer GFP-mærkede ribosomer og mCherry-mærkede biotinylerede kerner på en Cre-rekombinaseafhængig måde7. Dobbeltmærkningssystemet gør det muligt at udføre celletypespecifik transkriptomisk og epigenomisk analyse med væv. Ved hjælp af NuTRAP-mus krydset med adipocytspecifikke adiponectin-Cre-linjer (Adipoq-NuTRAP) har vi tidligere karakteriseret genekspressionsprofiler og kromatintilstande fra rene adipocytpopulationer in vivo og bestemt, hvordan de ændres under fedme 7,8. Tidligere tillod NuTRAP-mus krydset med brune og beige adipocytspecifikke Ucp1-Cre-linjer (Ucp1-NuTRAP) os at karakterisere den epigenomiske ombygning af den sjældne termogene adipocytpopulation, beige adipocytter, som reaktion på temperaturændringer9.
ATAC-seq er en meget anvendt analysemetode til vurdering af genom-dækkende kromatintilgængelighed. Den hyperreaktive Tn5-transposase, der anvendes i ATAC-seq, muliggør identifikation af åbne kromatinregioner ved at mærke sekventeringsadaptere i det kromatintilgængelige område af kerner10. ATAC-seq er en simpel metode, men den giver robuste resultater og er yderst effektiv selv med prøver med lavt input. Det er således blevet en af de mest populære epigenomiske profileringsmetoder og har bidraget til forståelsen af de regulerende mekanismer for genekspression inden for forskellige biologiske sammenhænge. Siden den oprindelige ATAC-seq-protokol blev oprettet, er forskellige ATAC-seq-afledte teknikker blevet videreudviklet til at ændre og optimere protokollen til forskellige typer prøver. For eksempel er Fast-ATAC designet til analyse af blodcelleprøver11, Omni-ATAC er en optimeret protokol til frosne vævsprøver12, og MiniATAC-seq er effektiv til embryoanalyse i tidlig fase13. Anvendelse af ATAC-seq-metoden på adipocytter, især fra vævsprøver, er dog stadig udfordrende. Ud over heterogeniteten af fedtvæv kan dets høje lipidindhold interferere med effektive rekombinationsreaktioner ved Tn5-transposase, selv efter kerneisolering. Desuden forårsager det høje mitokondrieindhold i adipocytter, især i brune og beige adipocytter, høj mitokondriel DNA-forurening og spildte sekventeringslæsninger. Dette papir beskriver en protokol for adipocytspecifik ATAC-seq ved hjælp af Adipoq-NuTRAP-mus (figur 1). Ved at drage fordel af fluorescensmærket kernesortering tillader denne protokol indsamling af rene populationer af adipocytkerner væk fra andre forvirrende celletyper og effektiv fjernelse af lipider, mitokondrier og vævsaffald. Derfor kan denne protokol generere celletypespecifikke data af høj kvalitet og minimere spild fra mitokondrielæsninger, mens der bruges en reduceret mængde input og reagenser sammenlignet med standardprotokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrepleje og eksperimenter blev udført i henhold til procedurer godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee of Indiana University School of Medicine.
1. Forberedelser inden forsøget påbegyndes
- Vævsforberedelse
- Til mærkning af adipocytkerner krydses NuTRAP-mus med adipocytspecifikke adiponectin-Cre-linjer (Adipoq-Cre) for at generere Adipoq-NuTRAP-mus, som er hemizygote for både Adipoq-Cre og NuTRAP.
- Dissekere fedtvæv af interesse fra Adipoq-NuTRAP-musene som beskrevet tidligere14.
- Snap-frys vævene i flydende nitrogen, og opbevar dem ved -80 °C indtil brug.
BEMÆRK: Hver fedtpude kan opbevares som en helhed, og det frosne væv kan senere skæres på tøris i mindre stykker (~ 50 mg) til forsøg. Alternativt kan fedtvævet skæres, aliquoteres og fryses i rør til opbevaring (~ 50 mg pr. Rør). Frosne prøver må aldrig tø op efter frysning før brug.
- Forberedelse af buffer
BEMÆRK: Hold bufferne på is under hele eksperimentet.- Forbered kernepræparationsbuffer (NPB): 250 mM saccharose, 10 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM KCl, 1,5 mMMgCl2 og 0,1% NP40. Forbered 7 ml NPB pr. prøve. Før brug tilsættes frisk 100x proteasehæmmercocktail (endelig 1x), DTT (endelig 1 mM) og Hoechst (endelig 1 μg/ml) til NPB.
BEMÆRK: Det anbefales at tilberede frisk NPB, men den kan opbevares ved 4 °C i op til 1 måned. - Forbered 1x fosfatbufret saltvand med 0,1% NP-40 (PBS-N).
- Forbered kernepræparationsbuffer (NPB): 250 mM saccharose, 10 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM KCl, 1,5 mMMgCl2 og 0,1% NP40. Forbered 7 ml NPB pr. prøve. Før brug tilsættes frisk 100x proteasehæmmercocktail (endelig 1x), DTT (endelig 1 mM) og Hoechst (endelig 1 μg/ml) til NPB.
2. Isolering af kernen
- Chill glas Dounce homogenisatorer, med et glas Dounce pr. prøve, på is. Derefter tilsættes 7 ml NPB-blandingen til hvert glas Dounce.
BEMÆRK: Det anbefales at bruge op til otte prøver i hvert forsøg. At arbejde med mere end otte prøver ville forsinke alle trin betydeligt, og det kan især nedgradere kernekvaliteten under sortering. - Sæt det frosne fedtvæv (50-100 mg) i glasset Dounce, og skær det straks i et par mindre stykker ved hjælp af en lang saks. Slag 10x med en løs stød for alle prøverne, og derefter 10x med en stram støder.
BEMÆRK: Fedtvæv er blødt, så det skal være tilstrækkeligt at skære dem i et par små stykker. Til sjældne prøver kan mindre stykker (10-20 mg) anvendes, selvom det indsamlede adipocytkerneantal kan variere. - Filtrer gennem en 100 μm si til et nyt 50 ml rør. Flyt de filtrerede homogenater til et nyt 15 ml rør ved hældning. Spin ved 200 × g i 10 minutter ved 4 °C i en svingspandcentrifuge. Supernatanten fjernes så meget som muligt.
BEMÆRK: Opsug først ved hjælp af et vakuum, og fjern derefter det resterende volumen ved hjælp af en mikropipette. - Resuspender pellet i 500 μL PBS-N ved forsigtig, men grundig fingertapning.
BEMÆRK: Undgå pipettering, da dette kan beskadige kernerne. - Filtrer gennem en 40 μm si til et nyt 50 ml rør ved hjælp af skånsom pipettering. Silen skylles med 250 μL PBS-N. Den filtrerede nukleare resuspension overføres til et FACS-rør (fluorescensaktiveret cellesortering) ved hjælp af en mikropipette.
BEMÆRK: Hvis det er tilgængeligt, kan rør og cellefiltre bruges til mindre mængder for at minimere prøvetab.
3. Sortering af kernen
- Forberedelse af opsamlingsrør
- Tilsæt 500 μL PBS-N til nye 1,5 ml rør, og inverter et par gange for at våde alle indre overflader med bufferen.
- Drej kortvarigt rørene for at bringe al væsken ned, og afkøl dem derefter på is, indtil de sorteres.
- FACS (figur 2)
- Brug FSC-A/FSC-H gating til singlets og FSC-A/SSC-A til fjernelse af små eller store snavs.
- Gate til den mCherry/GFP-positive adipocytkernepopulation.
- Der opsamles 10.000 kerner i hvert af opsamlingsrørene fremstillet i trin 3.1.
- Forberedelse af kerne efter sortering
- Der tilsættes 500 μL PBS-N til hvert opsamlingsrør, og vend det om et par gange for at blande.
- Drej opsamlingsrørene ved 200 × g i 10 minutter ved 4 °C i en centrifuge med svingspand. Supernatanten fjernes helt.
BEMÆRK: Brug først et vakuum til at fjerne bobler, hæld supernatanten af, og brug papirservietter til at fjerne den resterende væske helt. Pelleten er usynlig på dette tidspunkt. Tn5-masterblandingen fremstilles under centrifugeringstrinnet som beskrevet nedenfor.
4. Tn5-mærkning (tabel 1)
- For at fremstille 25 μL Tn5-masterblanding blandes 12,5 μL 2x tagmentations-DNA-buffer (TD-buffer), 1,25 μL Tn5-transposase (TDE I-enzym) og 11,25 μL nukleasefrit vand.
- Der tilsættes 25 μL Tn5-masterblanding til hver kernepellet, og opslæmmes igen ved forsigtig pipettering. Der inkuberes ved 600 o/min i 30 minutter ved 37 °C ved hjælp af en termomixer.
5. DNA-oprensning
BEMÆRK: Følgende procedure bruger PCR-rensningssættet, der er nævnt i materialetabellen. Alle andre lignende DNA-oprensningsmetoder kan anvendes.
- Der tilsættes 25 μl nukleasefrit vand til de 25 μl af blandingen af Tn5-kerneresuspension, der opnås efter trin 4.2. Det endelige volumen er 50 μL pr. prøve.
- Der tilsættes 250 μL buffer PB.
- Der tilsættes 5 μL 3 M natriumacetat (NaOAc) (pH 5,2).
- Blandingen overføres til en kolonne (leveres med referencesættet), og centrifugeres ved 17.900 × g i 1 min ved stuetemperatur (RT).
- Kassér gennemløbet, og placer centrifugeringskolonnen tilbage i det samme opsamlingsrør. Der tilsættes 750 μL buffer PE indeholdende absolut ethanol (EtOH), og centrifugeres ved 17.900 × g i 1 min ved RT.
- Kassér gennemstrømningen, og placer centrifugeringskolonnen tilbage i det samme opsamlingsrør. Der centrifugeres ved 17.900 × g i 1 min ved RT, og opsamlingsrøret kasseres med gennemstrømningen.
- For at eluere DNA-fragmenterne skal du udstyre søjlen med et nyt 1,5 ml rør, tilføje 10 μL buffer EB og lade det stå ved RT i 3 minutter. Der centrifugeres ved 17.900 × g i 1 min ved RT.
BEMÆRK: Prøverne kan opbevares ved 4 °C i flere dage eller ved -20 °C i uger.
6. PCR-forstærkning (tabel 2)
BEMÆRK: De primere, der anvendes i denne undersøgelse, er anført i tabel 3.
- For at forstærke transponerede DNA-fragmenter skal du forberede PCR-masterblanding uden at tilføje en unik Ad2.n-stregkodeprimer (primer #2). Brug 38 μL PCR-masterblandingen pr. prøve: 11 μL nukleasefrit vand, 2 μL 25 μM Ad1_noMX primer (primer #1) og 25 μL 2x PCR Master Mix.
- Tilsæt 38 μL af PCR-masterblandingen i et 0,2 ml PCR-rør.
- Der tilsættes 10 μL af de eluerede DNA-fragmenter fra trin 5.7.
- Der tilsættes 2 μL 25 μM primer #2, som skal være specifik for hver prøve.
- Kør PCR i henhold til cykelbetingelserne angivet i tabel 2.
7. Kvantitativ PCR-test (qPCR) i realtid (tabel 4)
BEMÆRK: Dette trin har til formål at bestemme de yderligere cyklusser, der er nødvendige for at forstærke DNA'et. Det er valgfrit, men anbefales stærkt, især til nye eksperimenter.
- Forbered qPCR-masterblandingen uden tilsætning af primer #2. Brug 9,975 μL af qPCR-masterblandingen pr. prøve: 4,41 μL nukleasefrit vand, 0,25 μL 25 μM primer #1, 5 μL 2x PCR Master Mix og 0,09 μL 100x SYBR Green I.
BEMÆRK: For at forberede 100x SYBR Green I fortyndes 10.000x stammen med nukleasefrit vand. Da volumenet af 100x SYBR Green I, der anvendes til qPCR-masterblandingen, er ubetydeligt, er det lettere at fremstille en yderligere masterblanding af fortyndet 100x SYBR Green I (f.eks. til 8-10 prøver). - Der tilsættes 9,975 μL af qPCR-masterblandingen i hvert hul på en qPCR-plade.
- Tilsæt 0,25 μL 25 μM primer #2 i hvert hul.
BEMÆRK: Sørg for at tilføje den samme primer #2 for at matche det, der blev tilføjet til hver specifik prøve i trin 6.4. - Der tilsættes 5 μL af PCR-reaktionen opnået efter PCR-amplifikationen i trin 6.5, og blandes ved pipettering.
BEMÆRK: De resterende 45 μL af PCR-reaktionen vil blive brugt til den anden PCR-amplifikation. - Kør qPCR i henhold til cykelbetingelserne angivet i tabel 5.
- Kontroller forstærkningskurverne, og identificer antallet af yderligere PCR-cyklusser, der er nødvendige, ved at estimere antallet af cyklusser, der nåede ~ 35% af maksimum (figur 3A).
BEMÆRK: Typisk kræver 10.000 kerner fem til otte yderligere PCR-cyklusser.
8. Yderligere PCR-forstærkning
- PCR køres ved hjælp af alle de resterende 45 μL PCR-reaktion i henhold til beregningerne fra trin 7.6 (tabel 6).
BEMÆRK: Hver prøve kan kræve et forskelligt antal forstærkningscyklusser.
9. Anden DNA-oprensning ved hjælp af PCR-rensningssættet
- Brug de samme procedurer som i afsnit 5, men eluer de amplificerede DNA-fragmenter med 20 μL buffer EB.
10. Valg af DNA-fragmentstørrelse
BEMÆRK: Brug reversible immobiliseringsperler i fast fase som beskrevet nedenfor. Alle andre lignende DNA-oprensningsperler kan bruges i henhold til producentens anvisninger. SPRI-perleophænget skal resuspenderes fuldstændigt og ekvilibreres ved RT med rotation før brug.
- Det eluerede DNA overføres til et nyt PCR-rør, og der tilsættes 80 μL buffer EB for at opnå et slutvolumen på 100 μL.
- Der tilsættes 55 μL SPRI-perler (0,55x prøvevolumen), og blandes ved pipettering. Inkuber i 5 minutter ved RT, og adskil derefter på et mini magnetisk stativ til PCR 8-rørstrimler i 5 min.
- 150 μL supernatant overføres til et nyt PCR-glas. Der tilsættes 95 μL SPRI-perler, og blandingen blandes ved pipettering.
BEMÆRK: Supernatanten indeholder DNA på ca. 500 bp eller derunder. - Inkuber i 5 minutter ved RT, og adskil derefter på det magnetiske ministativ i 5 min. Supernatanten kasseres forsigtigt.
- Vask perlerne i 1 min med 200 μL 70% EtOH. Gentag to gange i tre vaske i alt.
BEMÆRK: Flyt ikke PCR-rør fra magnetstativet under vasken. - Efter den sidste vask drejes rørene ned ved 1.000 × g i 1 min, og den resterende EtOH pipetteres ud. Tør pillen med låget åbent ved 37 °C i 2 min på en PCR-maskine.
BEMÆRK: Perlepillerne bør kun vise nogle mindre revner, når de er tørret. Undgå overtørring. - Pellet resuspenderes med 20 μL buffer EB ved pipettering, og der inkuberes i 5 minutter ved RT. Separat på det magnetiske ministativ i 5 minutter, og derefter overføres 18 μL af supernatanten indeholdende det endelige bibliotek til et nyt 1,5 ml glas.
BEMÆRK: Biblioteket kan opbevares ved -20 °C under kvalitetskontrol.
11. DNA-kvantificering ved hjælp af et fluorometer
- For at forberede masterblandingen fortyndes 200x dsDNA High Sensitivity (HS) reagens med dsDNA HS-buffer til en slutkoncentration på 1x.
- Til standarder tilsættes 190 μL af 1x masterblandingen og 10 μL af standard 1 eller standard 2 til et fluorometerrør.
BEMÆRK: Ligevægt standarderne ved RT i mørke, før kvantificeringen påbegyndes. - Til biblioteksprøverne tilsættes 198 μL af 1x masterblandingen og 2 μL af hver prøve til et separat fluorometerglas.
BEMÆRK: Hvis prøvemængderne er begrænsede, kan prøvevolumenet reduceres til 1 μL, og 1x masterblandingens volumen kan øges til 199 μL. - Vortex eller ryst fluorometerrørene, og lad dem sidde i 5 minutter ved RT i mørke. Mål DNA-koncentrationen ved hjælp af fluorometrets dsDNA HS-assay.
12. Bibliotekskvalitetskontrol af højfølsomme elektroforesesystemer
- Tag ATAC-seq-biblioteket, og fortynd med nukleasefrit vand til en slutkoncentration på 1-5 ng/μL.
- Analyser størrelsesfordelingen af ATAC-seq-bibliotekerne ved hjælp af højfølsomme, automatiserede elektroforesesystemer efter producentens protokoller.
13. Kvalitetskontrol af ATAC-seq-biblioteket ved hjælp af målrettet qPCR
- Tag 5-10 ng af ATAC-seq-biblioteket, og fortynd med 50 μL nukleasefrit vand.
- qPCR køres ved hjælp af primere rettet mod promotorer og forstærkere, der vides at være aktive i adipocytter i henhold til de cykelbetingelser, der er angivet i tabel 7.
- Brug negative kontrolprimere rettet mod lukkede/tavse genomiske regioner (tabel 7).
- Initiativtagerens/forstærkernes tilsætning til de negative kontroller beregnes (tabel 8).
BEMÆRK: Det forventes at se ≥10-20 gange berigelser med vellykkede prøver.
14. Sekvens af handlinger
- Send ATAC-seq-bibliotekerne til sekvensering. Brug parret sekvensering (2 x 34 bp, 2 x 50 bp eller længere) med gennemsnitlige læsetal på 10-30 millioner læsninger pr. prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at analysere fedtvæv ved hjælp af denne ATAC-seq-protokol genererede vi Adipoq-NuTRAP-mus, der blev fodret med chow-diæter; vi isolerede derefter adipocytkerner fra epididymalt hvidt fedtvæv (eWAT), inguinalt hvidt fedtvæv (iWAT) og brunt fedtvæv (BAT) ved hjælp af flowcytometri. De isolerede kerner blev brugt til mærkning efterfulgt af DNA-oprensning, PCR-amplifikation, kvalitetskontroltrin, sekventering og dataanalyse som beskrevet ovenfor. Formålet med dette repræsentative eksperiment var at profilere kromatintilgængeligheden af rene adipocytpopulationer isoleret fra forskellige fedtdepoter.
Vi observerede, at de mCherry-mærkede og GFP-mærkede adipocytkerner tydeligt kunne skelnes fra kernerne i andre celletyper isoleret fra fedtvævet i en Adipoq-NuTRAP-mus ved hjælp af flowcytometri (figur 2A-C). Der var forskelle i adipocytfraktionerne afhængigt af typen af fedtdepot: ~ 50% i eWAT, ~ 30% i iWAT og ~ 65% i BAT (figur 2D)7. Vi indsamlede 10.000 kerner inden for 2-10 minutter pr. prøve og brugte dem til ATAC-seq-procedurerne. Vi kørte i alt 10-13 PCR-cyklusser (fem cyklusser af den første PCR og fem til otte cyklusser af den anden PCR, figur 3A). Hvis prøverne kræver mere end i alt 15 PCR-cyklusser, kan dette indikere prøver af lav kvalitet (figur 3B). Størrelsesfordelingsanalysen af ATAC-seq-bibliotekerne viste flere toppe svarende til den nukleosomfrie region (NFR) og mono-, di- og multinukleosomer (figur 4A-C) med gennemsnitlige størrelser på ~ 500-800 bp. Prøver af dårlig kvalitet viste typisk for det meste NFR med ingen eller få nukleosomale toppe (figur 4D). Kvalitetskontroltestene ved qRT-PCR-analysen viste 10-20 gange berigelser med de positive genomiske elementer nær adipocytmarkørgener såsom Adipoq, Fabp4, Plin1 og Pnpla2, mens der ikke blev vist nogen berigelse med den negative kontrol (figur 5). Vi observerede også berigelse med det termogene gen Ucp1 specifikt i BAT, men ikke i eWAT eller iWAT (figur 5).
Efter sekventering og analyse identificerede vi ~ 55.000 toppe kombineret fra tre forskellige fedtdepoter (eWAT, iWAT og BAT). Mitokondrieaflæsningerne var <2%, og fraktionen under toppe var ~ 18% -44% (figur 6A, B). Prøver af dårlig kvalitet kan have betydeligt højere mitokondrielæsninger og / eller en lavere brøkdel af aflæsninger i topområderne. Visuel inspektion af ATAC-seq-bibliotekets spor afslørede flere stærke toppe med høje signal-støj-forhold nær adipocytmarkørgener, såsom Adipoq, Plin1 og Fabp4, fra alle fedtdepoterne (figur 7A-C). Vi observerede også stærke ATAC-seq-toppe ved det brune adipocytproducent Ucp1-locus i BAT-prøven, men disse toppe blev ikke observeret i eWAT- eller iWAT-prøverne (figur 7D). Alle disse data indikerer vellykkede ATAC-seq-data genereret fra adipocytkerner.
Figur 1: Et skematisk rutediagram over adipocytspecifik ATAC-seq ved hjælp af NuTRAP-mus. De trin, der er unikke for denne protokol, fremhæves i de røde skraverede felter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentativ FACS-gating, der illustrerer isoleringen af mCherry/GFP-mærkede adipocytkerner fra fedtvævet i en Adipoq-NuTRAP-mus. (A-C) Flowcytometrianalyse af isolerede kerner fra eWAT, iWAT og BAT af en Adipoq-NuTRAP-mus. D) Kvantitativ analyse af kerner fra adipocytter og ikke-adipocytter i eWAT, iWAT og BAT hos en Adipoq-NuTRAP-mus. Data er gennemsnitlige ± SEM (n = 3). Disse kernetællingsdata er fra Roh et al.7. Forkortelser: FACS = fluorescensaktiveret cellesortering; GFP = grønt fluorescerende protein; eWAT = epididymalt hvidt fedtvæv; iWAT = inguinal hvidt fedtvæv; BAT = brunt fedtvæv; NuTRAP = nuklear mærkning og oversættelse af ribosomaffinitetsrensning; Adipoq-NuTRAP = NuTRAP-mus krydset med adipocytspecifik adiponectin-Cre-linje; FSC-A = fremadrettet spredningstopareal; FSC-H = fremadrettet spredningstophøjde; SSC-A = side scatter-peak område; FITC-A = fluorescein isothiocyanat-topareal. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative amplifikationskurver fra qRT-PCR . (A) Prøve af god kvalitet, der har brug for syv yderligere amplifikationscyklusser. (B) Prøve af dårlig kvalitet, der kræver ≥15 ekstra cyklusser. Forkortelse: qRT-PCR = kvantitativ revers transkription PCR. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Størrelsesfordelingsprofiler for ATAC-seq-bibliotekerne. (A-C) Biblioteker af god kvalitet og (D) Biblioteker af dårlig kvalitet vises som repræsentative resultater. Forkortelser: ATAC-seq = assay for transposase-tilgængeligt kromatin med high-throughput sekventering; FU = fluorescensenheder; bp = basepar; NFR = nukleosomfri region; eWAT = epididymalt hvidt fedtvæv; iWAT = inguinal hvidt fedtvæv; BAT = brunt fedtvæv. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Kvalitetskontrol qPCR-analyse af ATAC-seq-bibliotekerne. Berigelser til promotorer og smagsforstærkere nær de generelle adipocytmarkører Adipoq, Fabp4, Plin1 og Pnpla2 eller den brune adipocytmarkør Ucp1. Forkortelser: ATAC-seq = assay for transposase-tilgængeligt kromatin med high-throughput sekventering; NC = negativ kontrol eWAT = epididymalt hvidt fedtvæv; iWAT = inguinal hvidt fedtvæv; BAT = brunt fedtvæv. Data er gennemsnitlige ± SEM (n = 2). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Mitokondrier læser og brøker under toppene af ATAC-seq-bibliotekerne. (A) Mitokondrier læser (%) og (B) fraktioner under toppene (%) fra eWAT, iWAT og BAT. Forkortelser: ATAC-seq = assay for transposase-tilgængeligt kromatin med high-throughput sekventering; eWAT = epididymalt hvidt fedtvæv; iWAT = inguinal hvidt fedtvæv; BAT = brunt fedtvæv. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: ATAC-seq-signalspor ved repræsentative geners loci. (A-C) Generelle adipocytmarkørgener. B) Brun adipocytspecifik markør. Forkortelser: ATAC-seq = assay for transposase-tilgængeligt kromatin med high-throughput sekventering; eWAT = epididymalt hvidt fedtvæv; iWAT = inguinal hvidt fedtvæv; BAT = brunt fedtvæv. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Bestanddele af Tn5-masterblandingen. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Komponenter i PCR-masterblandingen og indledende PCR-cyklusbetingelser. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 3: Liste over stregkodede primere til PCR-forstærkning. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 4: Komponenter i qPCR-masterblandingen. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 5: qPCR-cykelforhold. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 6: Anden PCR-cyklusbetingelser for yderligere forstærkning. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 7: Primersekvenser og målrettede qPCR-cykelbetingelser til kvalitetskontrol af ATAC-seq-biblioteket. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 8: Analyse af qPCR-resultaterne til kvalitetskontrol. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette papir har vi præsenteret en optimeret ATAC-seq-protokol til vurdering af adipocytspecifik kromatintilgængelighed in vivo. Denne ATAC-seq-protokol, der bruger Adipoq-NuTRAP-musen, genererede med succes adipocytspecifikke kromatintilgængelighedsprofiler. Den mest kritiske faktor for vellykkede og reproducerbare ATAC-seq-eksperimenter er kernekvaliteten. Det er vigtigt straks at snapfryse det dissekerede fedtvæv i flydende nitrogen og opbevare dem sikkert ved -80 °C uden optøning indtil brug. Det er også vigtigt at forhindre adipocytkerneskader under kerneisolering og sortering. Prøverne skal håndteres forsigtigt via lavhastighedscentrifugering og minimal pipettering under hele kerneisoleringsprocessen.
Omhyggelig gating under kernesortering er afgørende for selektivt at isolere de mCherry / GFP-mærkede adipocytkerner (figur 1). Det er vigtigt at sikre en klar adskillelse mellem mCherry/GFP-positive og negative populationer. Ligeledes er skånsom håndtering og hurtig sortering nødvendig for at bevare kromatinets natur i kernerne. Hvis fluorescensen er svag, sorteringen tager for lang tid, og / eller adipocytfraktionerne er uden for de forventede intervaller, indikerer dette, at der kan være problemer med prøverne eller problemer under kerneisoleringsprocedurerne. Denne protokol kan ændres afhængigt af de eksperimentelle omstændigheder. For det første kan antallet af kerner, der kræves til ATAC-seq, gå ned til 1.000 eller op til 100.000. Hvis der er mindre end 5.000 kerner, vil anvendelse af et yderligere reduceret volumen (0,6 μL) af TDE I-enzymet forhindre overtagmentation. For antal kerner lig med eller højere end 50.000 kan volumenet af Tn5-masterblandingen fordobles til 50 μL, hvilket er det samme volumen som anvendt i den oprindelige protokol10.
For det andet kan andre kernemærkningssystemer, såsom INTACT (isolering af kerner mærket i specifikke celletyper) mus, bruges i stedet for NuTRAP-mus16. Da INTACT-mus udtrykker GFP-mærket SUN1-kernemembranprotein, kan GFP-mærkede kerner isoleres ved sortering og anvendes til ATAC-seq ved hjælp af de samme metoder, der er beskrevet i denne protokol. Alle andre nukleare mærkningsmetoder kan også vedtages. Endelig kan in vitro-dyrkede adipocytter også anvendes til ATAC-seq efter denne protokol. Til dette formål skrabes celler, der dyrkes på tallerkener/tallerkener, indsamles ved hjælp af NPB og underkastes derefter de samme efterfølgende procedurer - bortset fra at sortering kun bør foretages på grundlag af størrelse, kompleksitet og Hoechst, ikke mCherry/GFP som beskrevet tidligere15.
Denne adipocytspecifikke ATAC-seq-protokol, der bruger NuTRAP-teknikken, udgør en begrænsning, da den ikke fungerer uden fluorescerende mærkning; Således vil analyse af humane prøver ikke fungere med denne teknik. Det er dog stadig muligt at udføre ATAC-seq med adipocytter isoleret ved vævsfordøjelse og flotationsmetoder. Det skal bemærkes, at arbejde med humane floater-adipocytter har nogle begrænsninger, såsom forurening med andre celletyper ved anvendelse af lavhastighedscentrifugering og tab af store adipocytter ved anvendelse af højhastighedscentrifugering. Denne protokol kan anvendes på enhver celletype, for hvilken specifikke Cre-linjer er tilgængelige, hvilket muliggør effektiv celletypespecifik kromatinprofilering selv med begrænsede celleinput17. Afslutningsvis vil denne forbedrede ATAC-seq-protokol være nyttig for forskere, der ønsker at evaluere kromatintilgængelighed fra specifikke celletyper inden for heterogent væv ex vivo, ud over de adipocytter, vi diskuterede her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen relevante eller væsentlige økonomiske interesser i forbindelse med den forskning, der er beskrevet i denne artikel.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af IUSM Showalter Research Trust Fund (til HCR), et IUSM Center for Diabetes and Metabolic Diseases Pilot and Feasibility grant (til HCR), National Institute of Diabetes og fordøjelses- og nyresygdomme (R01DK129289 til HCR) og American Diabetes Association Junior Faculty Award (7-21-JDF-056 til HCR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Adiponectin-Cre mouse | The Jackson Laboratory | 28020 | |
| NuTRAP mouse | The Jackson Laboratory | 29899 | |
| Reagents & Materials | |||
| 1.5 mL DNA-LoBind tubes | Eppendorf | 86-923 | |
| 100 µm cell strainer | Falcon | 352-360 | |
| 15 mL tubes | VWR | 525-1071 | |
| 2x TD buffer | Illumina | 15027866 | |
| 384-well PCR plate | Applied biosystem | 4483285 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352-340 | |
| 50 mL tubes | VWR | 525-1077 | |
| AMPure XP reagent (SPRI beads) | Beckman Coulter | A63881 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Clear adhesive film | Applied biosystem | 4306311 | |
| DNase/RNase-free distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Dounce tissue grinder | DWK Life Sciences | 357542 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| DynaMag-96 side skirted magnet | Thermo Fishers | 12027 | |
| FACS tubes | Falcon | 28719128 | |
| HEPES | Boston BioProducts | BBH-75 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 2134015 | |
| KCl (2 M) | Boston BioProducts | MT-252 | |
| Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips | EpiCypher | 10-0008 | |
| MgCl2 (1 M) | Boston BioProducts | MT-200 | |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix | BioLabs | M0541S | |
| NP40 | Thermo Fishers | 28324 | |
| PCR 8-tube strip | USA scientific | 1402-4708 | |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fishers | 78439 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Sucrose | Sigma | S0389-1KG | |
| SYBR Green I (10,000x) | Invitrogen | S7563 | |
| TDE I enzyme | Illumina | 15027865 | |
| Instruments | |||
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACSAria Fusion | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | |
| Real-Time PCR system | Thermo Fishers | QuantStudio?5 |
References
- Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).
- Farmer, S. R.
- Bielczyk-Maczynska, E. White adipocyte plasticity in physiology and disease. Cells. 8 (12), 1507 (2019).
- Basu, U., Romao, J. M., Guan, L. L. Adipogenic transcriptome profiling using high throughput technologies. Journal of Genomics. 1, 22-28 (2013).
- Esteve Rafols, M. Adipose tissue: Cell heterogeneity and functional diversity. Endocrinologia y Nutricion. 61 (2), 100-112 (2014).
- Kwok, K. H., Lam, K. S., Xu, A. Heterogeneity of white adipose tissue: Molecular basis and clinical implications. Experimental and Molecular Medicine. 48, e215 (2016).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Roh, H. C., et al. Adipocytes fail to maintain cellular identity during obesity due to reduced PPARγ activity and elevated TGFβ-SMAD signaling. Molecular Metabolism. 42, 101086 (2020).
- Roh, H. C., et al. Warming induces significant reprogramming of beige, but not brown, adipocyte cellular identity. Cellular Metabolism. 27 (5), 1121.e5-1137.e5 (2018).
- Buenrostro, J. D., et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Wu, J., et al. Chromatin analysis in human early development reveals epigenetic transition during ZGA. Nature. 557 (7704), 256-260 (2018).
- Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and dissection of diverse mouse adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
- So, J., et al. Chronic cAMP activation induces adipocyte browning through discordant biphasic remodeling of transcriptome and chromatin accessibility. Molecular Metabolism. 66, 101619 (2022).
- Loft, A., Herzig, S., Schmidt, S. F. Purification of GFP-tagged nuclei from frozen livers of INTACT mice for RNA- and ATAC-sequencing. STAR Protocols. 2 (3), 100805 (2021).
- Heyward, F. D., et al. Integrated genomic analysis of AgRP neurons reveals that IRF3 regulates leptin's hunger-suppressing effects. bioRxiv. , (2022).
