Summary
Vi presenterar ett protokoll för analys för transposastillgängligt kromatin med high-throughput sekvensering (ATAC-seq) specifikt på adipocyter med hjälp av kärnsortering med fettvävnad isolerad från transgena reportermöss med nukleär fluorescensmärkning.
Abstract
Analys för transposastillgängligt kromatin med sekvensering med hög genomströmning (ATAC-seq) är en robust teknik som möjliggör genomomfattande kromatintillgänglighetsprofilering. Denna teknik har varit användbar för att förstå de reglerande mekanismerna för genuttryck i en rad biologiska processer. Även om ATAC-seq har modifierats för olika typer av prover, har det inte skett några effektiva modifieringar av ATAC-seq-metoder för fettvävnader. Utmaningar med fettvävnader inkluderar den komplexa cellulära heterogeniteten, stort lipidinnehåll och hög mitokondriell förorening. För att övervinna dessa problem har vi utvecklat ett protokoll som tillåter adipocytspecifik ATAC-seq genom att använda fluorescensaktiverad kärnsortering med fettvävnader från den transgena reportern Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mus. Detta protokoll producerar högkvalitativa data med minimala bortkastade sekvensläsningar samtidigt som mängden kärninmatning och reagens minskar. Detta dokument innehåller detaljerade steg-för-steg-instruktioner för ATAC-seq-metoden validerad för användning av adipocytkärnor isolerade från musfettvävnader. Detta protokoll kommer att hjälpa till vid undersökning av kromatindynamik i adipocyter vid olika biologiska stimuleringar, vilket möjliggör nya biologiska insikter.
Introduction
Fettvävnad, som är specialiserad för att lagra överflödig energi i form av lipidmolekyler, är ett nyckelorgan för metabolisk reglering. Den strikta kontrollen av adipocytbildning och underhåll är avgörande för fettvävnadsfunktion och helkroppsenergihomeostas1. Många transkriptionsregulatorer spelar en kritisk roll i kontrollen av adipocytdifferentiering, plasticitet och funktion; Några av dessa regulatorer är inblandade i metaboliska störningar hos människor 2,3. De senaste framstegen inom sekvenseringstekniker med hög genomströmning för genuttryck och epigenomisk analys har ytterligare underlättat upptäckten av de molekylära regulatorerna för adipocytbiologi4. Molekylära profileringsstudier med fettvävnad är utmanande att genomföra på grund av heterogeniteten hos dessa vävnader. Fettvävnad består främst av adipocyter, som är ansvariga för fettlagring, men innehåller också olika andra celltyper, såsom fibroblaster, endotelceller och immunceller5. Dessutom förändras fettvävnadens cellulära sammansättning dramatiskt som svar på patofysiologiska förändringar såsom temperatur och näringsstatus6. För att övervinna dessa problem utvecklade vi tidigare en transgen reportermus, kallad Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP), som producerar GFP-märkta ribosomer och mCherry-märkta biotinylerade kärnor på ett Cre-rekombinasberoende sätt7. Det dubbla märkningssystemet gör det möjligt att utföra celltypspecifik transkriptomisk och epigenomisk analys med vävnader. Med hjälp av NuTRAP-möss korsade med adipocytspecifika adiponektin-Cre-linjer (Adipoq-NuTRAP) karakteriserade vi tidigare genuttrycksprofiler och kromatintillstånd från rena adipocytpopulationer in vivo och bestämde hur de förändras under fetma 7,8. Tidigare tillät NuTRAP-möss korsade med bruna och beige adipocytspecifika Ucp1-Cre-linjer (Ucp1-NuTRAP) oss att karakterisera den epigenomiska ombyggnaden av den sällsynta termogena adipocytpopulationen, beige adipocyter, som svar på temperaturförändringar9.
ATAC-seq är en allmänt använd analysmetod för att bedöma tillgängligheten av kromatin i hela genomet. Det hyperreaktiva Tn5-transposaset som används i ATAC-seq möjliggör identifiering av öppna kromatinregioner genom att märka sekvenseringsadaptrar i det kromatintillgängliga området av kärnor10. ATAC-seq är en enkel metod, men den ger robusta resultat och är mycket effektiv även med prover med låg inmatning. Det har därmed blivit en av de mest populära epigenomiska profileringsmetoderna och har bidragit till förståelsen av de reglerande mekanismerna för genuttryck inom olika biologiska sammanhang. Sedan det ursprungliga ATAC-seq-protokollet skapades har olika ATAC-seq-härledda tekniker vidareutvecklats för att modifiera och optimera protokollet för olika typer av prover. Till exempel är Fast-ATAC utformad för analys av blodcellsprover11, Omni-ATAC är ett optimerat protokoll för frysta vävnadsprover12 och MiniATAC-seq är effektivt för embryoanalys i tidigt stadium13. Att tillämpa ATAC-seq-metoden på adipocyter, särskilt från vävnadsprover, är dock fortfarande utmanande. Förutom heterogeniteten hos fettvävnad kan dess höga lipidinnehåll störa effektiva rekombinationsreaktioner av Tn5-transposas även efter kärnisolering. Dessutom orsakar det höga mitokondriella innehållet i adipocyter, särskilt i bruna och beige adipocyter, hög mitokondriell DNA-kontaminering och bortkastade sekvensläsningar. Detta dokument beskriver ett protokoll för adipocytspecifik ATAC-seq med hjälp av Adipoq-NuTRAP-möss (figur 1). Genom att dra nytta av fluorescensmärkt kärnsortering möjliggör detta protokoll insamling av rena populationer av adipocytkärnor bort från andra förvirrande celltyper och effektivt avlägsnande av lipider, mitokondrier och vävnadsskräp. Därför kan detta protokoll generera celltypspecifika högkvalitativa data och minimera avfall från mitokondriella läsningar samtidigt som man använder en minskad mängd indata och reagens jämfört med standardprotokollet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurvård och experiment utfördes enligt förfaranden som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee of Indiana University School of Medicine.
1. Förberedelser innan experimentet påbörjas
- Vävnad förberedelse
- För märkning av adipocytkärna, korsa NuTRAP-möss med adipocytspecifika adiponektin-Cre-linjer (Adipoq-Cre) för att generera Adipoq-NuTRAP-möss, som är hemizygota för både Adipoq-Cre och NuTRAP.
- Dissekera fettvävnaderna av intresse från Adipoq-NuTRAP-mössen som beskrivits tidigare14.
- Snäppfrys vävnaderna i flytande kväve och förvara dem vid −80 °C tills de används.
OBS: Varje fettkudde kan lagras som en helhet, och de frysta vävnaderna kan senare skäras på torris i mindre bitar (~ 50 mg) för experiment. Alternativt kan fettvävnaderna skäras, alikvoteras och frysas i rör för lagring (~ 50 mg per rör). Frysta prover får aldrig tina efter frysning fram till användning.
- Förberedelse av buffert
OBS: Håll buffertarna på is under hela experimentet.- Förbered kärnberedningsbuffert (NPB): 250 mM sackaros, 10 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2 och 0,1% NP40. Bered 7 ml NPB per prov. Tillsätt färsk 100x proteashämmarecocktail (slutlig 1x), DTT (slutlig 1 mM) och Hoechst (slutlig 1 μg/ml) till NPB före användning.
OBS: Det rekommenderas att förbereda färsk NPB, men den kan förvaras vid 4 ° C i upp till 1 månad. - Förbered 1x fosfatbuffrad saltlösning med 0,1% NP-40 (PBS-N).
- Förbered kärnberedningsbuffert (NPB): 250 mM sackaros, 10 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2 och 0,1% NP40. Bered 7 ml NPB per prov. Tillsätt färsk 100x proteashämmarecocktail (slutlig 1x), DTT (slutlig 1 mM) och Hoechst (slutlig 1 μg/ml) till NPB före användning.
2. Kärnisolering
- Kylglas Dounce homogenisatorer, med ett glas Dounce per prov, på is. Tillsätt sedan 7 ml NPB-blandning till varje glas Dounce.
OBS: Det rekommenderas att använda upp till åtta prover i varje experiment. Att arbeta med mer än åtta prover skulle avsevärt fördröja alla steg, och det kan särskilt nedgradera kärnkvaliteten under sortering. - Lägg den frysta fettvävnaden (50-100 mg) i glaset Dounce och skär den omedelbart i några mindre bitar med en lång sax. Stryk 10x med en lös stöt för alla prover, och sedan 10x med en tät stöt.
OBS: Fettvävnader är mjuka, så att skära dem i några små bitar bör vara tillräckligt. För sällsynta prover kan mindre bitar (10-20 mg) användas, även om det uppsamlade antalet adipocytkärnor kan variera. - Filtrera genom en sil på 100 μm till ett nytt 50 ml rör. Flytta de filtrerade homogenaten till ett nytt 15 ml rör genom att hälla. Snurra vid 200 × g i 10 min vid 4 °C i en svängskopecentrifug. Ta bort supernatanten så mycket som möjligt.
OBS: Aspirera först med ett vakuum och ta sedan bort den återstående volymen med hjälp av en mikropipett. - Återsuspendera pelleten i 500 μl PBS-N genom försiktig men noggrann fingertryckning.
OBS: Undvik pipettering, eftersom det kan skada kärnorna. - Filtrera genom en 40 μm sil till ett nytt 50 ml rör med försiktig pipettering. Skölj silen med 250 μL PBS-N. Överför den filtrerade kärnresuspensionen till ett fluorescensaktiverat cellsorteringsrör (FACS) med hjälp av en mikropipett.
OBS: Om det finns tillgängligt kan rör och cellsilar användas för mindre volymer för att minimera provförlust.
3. Kärnsortering
- Förberedelse av uppsamlingsrör
- Tillsätt 500 μL PBS-N till nya 1,5 ml rör och vänd några gånger för att blöta alla inre ytor med bufferten.
- Snurra rören kort för att få ner all vätska och kyl dem sedan på is tills de sorteras.
- FACS (figur 2)
- Använd FSC-A/FSC-H-grinden för singlets och FSC-A/SSC-A för borttagning av små eller stora skräp.
- Grind för mCherry/GFP-positiv adipocytkärnpopulation.
- Samla 10 000 kärnor i vart och ett av uppsamlingsrören som förberetts i steg 3.1.
- Förberedelse av eftersortering av kärna
- Tillsätt 500 μL PBS-N till varje uppsamlingsrör och vänd upp och ned några gånger för att blanda.
- Snurra uppsamlingsrören vid 200 × g i 10 minuter vid 4 °C i en svängskopecentrifug. Ta bort supernatanten helt.
OBS: Använd först ett vakuum för att ta bort bubblor, häll av supernatanten och använd pappersservetter för att ta bort den återstående vätskan helt. Pelleten är osynlig vid denna tidpunkt. Bered masterblandningen Tn5 under centrifugeringssteget enligt beskrivningen nedan.
4. Tn5 Tagmentation (tabell 1)
- För att bereda 25 μL Tn5-masterblandning, blanda 12,5 μL 2x tagmentations-DNA-buffert (TD-buffert), 1,25 μL Tn5-transposas (TDE I-enzym) och 11,25 μL nukleasfritt vatten.
- Tillsätt 25 μl Tn5-masterblandning till varje kärnpellet och suspendera igen genom försiktig pipettering. Inkubera vid 600 rpm i 30 min vid 37 °C med en termomixer.
5. DNA-rening
OBS: I följande procedur används PCR-reningssatsen som nämns i materialförteckningen. Alla andra liknande DNA-reningsmetoder kan användas.
- Tillsätt 25 μl nukleasfritt vatten till 25 μl av blandningen av Tn5-kärnresuspension erhållen efter steg 4.2. Den slutliga volymen är 50 μL per prov.
- Tillsätt 250 μL buffert PB.
- Tillsätt 5 μl 3 M natriumacetat (NaOAc) (pH 5,2).
- Överför blandningen till en kolonn (medföljer den refererade satsen) och centrifugera vid 17 900 × g i 1 min vid rumstemperatur (RT).
- Kassera genomströmningen och placera tillbaka centrifugeringskolonnen i samma uppsamlingsrör. Tillsätt 750 μL buffert PE innehållande absolut etanol (EtOH) och centrifugera vid 17 900 × g i 1 min vid RT.
- Kasta genomströmningen och sätt tillbaka centrifugeringskolonnen i samma uppsamlingsrör. Centrifugera vid 17 900 × g i 1 min vid rumstemperatur och kassera uppsamlingsröret med genomströmningen.
- För att eluera DNA-fragmenten, utrusta kolonnen med ett nytt 1,5 ml rör, tillsätt 10 μL buffert EB och låt stå vid RT i 3 minuter. Centrifugera vid 17 900 × g i 1 min vid rumstemperatur.
OBS: Proverna kan förvaras vid 4 °C i dagar eller vid −20 °C i veckor.
6. PCR-amplifiering (tabell 2)
OBS: De primers som användes i denna studie listas i tabell 3.
- För att förstärka transponerade DNA-fragment, förbered PCR-masterblandning utan att tillsätta en unik Ad2.n-streckkodsprimer (primer #2). Använd 38 μL PCR-masterblandning per prov: 11 μL nukleasfritt vatten, 2 μL 25 μM Ad1_noMX primer (primer #1) och 25 μL 2x PCR Master Mix.
- Tillsätt 38 μl av PCR-masterblandningen i ett 0,2 ml PCR-rör.
- Tillsätt 10 μl av de eluerade DNA-fragmenten från steg 5.7.
- Tillsätt 2 μL 25 μM primer #2, som måste vara specifik för varje prov.
- Kör PCR enligt de cykelförhållanden som anges i tabell 2.
7. Kvantitativt PCR-test (qPCR) i realtid (tabell 4)
OBS: Detta steg syftar till att bestämma de ytterligare cykler som behövs för att förstärka DNA. Det är valfritt men rekommenderas starkt, särskilt för nya experiment.
- Förbered qPCR-masterblandningen utan tillsats av primer #2. Använd 9,975 μL qPCR-masterblandning per prov: 4,41 μL nukleasfritt vatten, 0,25 μL 25 μM primer #1, 5 μL 2x PCR Master Mix och 0,09 μL 100x SYBR Green I.
OBS: För att förbereda 100x SYBR Green I, späd 10 000x beståndet med nukleasfritt vatten. Eftersom volymen 100x SYBR Green I som används för qPCR-masterblandningen är försumbar är det lättare att göra en ytterligare masterblandning av utspädd 100x SYBR Green I (t.ex. för 8-10 prover). - Tillsätt 9,975 μl qPCR-masterblandningen i varje brunn på en qPCR-platta.
- Tillsätt 0,25 μL 25 μM primer #2 i varje brunn.
OBS: Var noga med att lägga till samma primer #2 för att matcha vad som lades till varje specifikt prov i steg 6.4. - Tillsätt 5 μl av PCR-reaktionen som erhölls efter PCR-amplifieringen i steg 6.5 och blanda genom pipettering.
OBS: De återstående 45 μL av PCR-reaktionen kommer att användas för den andra PCR-amplifieringen. - Kör qPCR enligt de cykelförhållanden som anges i tabell 5.
- Kontrollera förstärkningskurvorna och identifiera antalet ytterligare PCR-cykler som behövs genom att uppskatta antalet cykler som nådde ~ 35% av det maximala (figur 3A).
OBS: Vanligtvis kräver 10 000 kärnor fem till åtta ytterligare PCR-cykler.
8. Ytterligare PCR-förstärkning
- Kör PCR med alla återstående 45 μl av PCR-reaktionen enligt beräkningarna från steg 7.6 (tabell 6).
OBS: Varje prov kan kräva ett annat antal förstärkningscykler.
9. Andra DNA-rening med PCR-reningssatsen
- Använd samma procedurer som i avsnitt 5, men eluera de amplifierade DNA-fragmenten med 20 μL buffert EB.
10. Val av DNA-fragmentstorlek
OBS: Använd vändbara immobiliseringspärlor i fast fas enligt beskrivningen nedan. Alla andra liknande DNA-reningspärlor kan användas enligt tillverkarens instruktioner. SPRI-strängsuspensionen ska vara helt återsuspenderad och balanseras vid rumstemperatur med rotation före användning.
- Överför det eluerade DNA:t till ett nytt PCR-rör och tillsätt 80 μL buffert EB för att göra en slutlig volym på 100 μl.
- Tillsätt 55 μL SPRI-pärlor (0,55x provvolymen) och blanda genom pipettering. Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur och separera sedan på ett magnetiskt ministativ för PCR 8-rörsremsor i 5 minuter.
- Överför 150 μl av supernatanten till ett nytt PCR-rör. Tillsätt 95 μL SPRI-pärlor och blanda genom pipettering.
OBS: Supernatanten innehåller DNA på cirka 500 bp eller mindre. - Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur och separera sedan på det magnetiska ministativet i 5 minuter. Kassera supernatanten försiktigt.
- Tvätta pärlorna i 1 min med 200 μL 70% EtOH. Upprepa två gånger för totalt tre tvättar.
OBS: Flytta inte PCR-rör från magnetstativet under tvättarna. - Efter den sista tvätten, snurra ner rören vid 1 000 × g i 1 minut och pipettera ut återstående EtOH. Torka pelleten med locket öppet vid 37 °C i 2 minuter på en PCR-maskin.
OBS: Pärlpellets bör endast visa några mindre sprickor när de torkat. Undvik övertorkning. - Återsuspendera pelleten med 20 μL buffert EB genom pipettering och inkubera i 5 minuter vid RT. Separera på det magnetiska ministativet i 5 minuter och överför sedan 18 μl av supernatanten som innehåller det slutliga biblioteket till ett nytt 1,5 ml rör.
OBS: Biblioteket kan lagras vid -20 °C medan du utför en kvalitetskontroll.
11. DNA-kvantifiering med hjälp av en fluorometer
- För att bereda masterblandningen, späd 200x dsDNA High Sensitivity (HS) reagens med dsDNA HS-buffert till en slutlig koncentration av 1x.
- För standardämnen, tillsätt 190 μL av masterblandningen 1x och 10 μl standard 1 eller standard 2 till ett fluorometerrör.
OBS: Balansera standarderna vid RT i mörkret innan kvantifieringen påbörjas. - För biblioteksproverna, tillsätt 198 μL av 1x masterblandningen och 2 μL av varje prov till ett separat fluorometerrör.
Om provmängderna är begränsade kan provvolymen minskas till 1 μl och masterblandningens volym 1x ökas till 199 μl. - Virvla eller skaka fluorometerrören och låt dem sitta i 5 minuter vid RT i mörkret. Mät DNA-koncentrationen med hjälp av dsDNA HS-analysen av fluorometern.
12. Bibliotekets kvalitetskontroll med högkänsliga elektroforessystem
- Ta ATAC-seq-biblioteket och späd med nukleasfritt vatten till en slutlig koncentration på 1-5 ng / μL.
- Analysera storleksfördelningen av ATAC-seq-biblioteken med hjälp av högkänsliga, automatiserade elektroforessystem enligt tillverkarens protokoll.
13. Kvalitetskontroll av ATAC-seq-biblioteket med hjälp av riktad qPCR
- Ta 5-10 ng av ATAC-seq-biblioteket och späd med 50 μL nukleasfritt vatten.
- Kör qPCR med primers riktade mot promotorer och förstärkare som är kända för att vara aktiva i adipocyter enligt de cykelförhållanden som anges i tabell 7.
- Använd negativa kontrollprimers inriktade på slutna/tysta genomiska regioner (tabell 7).
- Beräkna promotorns/förstärkarens berikning över de negativa kontrollerna (tabell 8).
OBS: Det förväntas se ≥10-20-faldiga anrikningar med framgångsrika prover.
14. Sekvensering
- Skicka ATAC-seq-biblioteken för sekvensering. Använd parkopplad sekvensering (2 x 34 bp, 2 x 50 bp eller längre) med genomsnittliga läsnummer på 10–30 miljoner läsningar per prov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att analysera fettvävnad med hjälp av detta ATAC-seq-protokoll genererade vi Adipoq-NuTRAP-möss som matades med chow-dieter; vi isolerade sedan adipocytkärnor från epididymal vit fettvävnad (eWAT), inguinal vit fettvävnad (iWAT) och brun fettvävnad (BAT) med hjälp av flödescytometri. De isolerade kärnorna användes för tagmentation, följt av DNA-rening, PCR-amplifiering, kvalitetskontrollsteg, sekvensering och dataanalys, som beskrivits ovan. Syftet med detta representativa experiment var att profilera kromatintillgängligheten hos rena adipocytpopulationer isolerade från olika fettdepåer.
Vi observerade att de mCherry-märkta och GFP-märkta adipocytkärnorna tydligt kunde särskiljas från kärnorna i andra celltyper isolerade från fettvävnaderna i en Adipoq-NuTRAP-mus med flödescytometri (figur 2A-C). Det fanns skillnader i adipocytfraktionerna beroende på typen av fettdepå: ~ 50% i eWAT, ~ 30% i iWAT och ~ 65% i BAT (figur 2D)7. Vi samlade in 10 000 kärnor inom 2-10 min per prov och använde dem för ATAC-seq-procedurerna. Vi körde totalt 10-13 PCR-cykler (fem cykler av den första PCR och fem till åtta cykler av den andra PCR, figur 3A). Om proverna kräver mer än totalt 15 PCR-cykler kan detta indikera prover av låg kvalitet (figur 3B). Storleksfördelningsanalysen av ATAC-seq-biblioteken visade flera toppar motsvarande den nukleosomfria regionen (NFR) och mono-, di- och multinukleosomer (figur 4A-C), med genomsnittliga storlekar på ~ 500-800 bp. Prover av dålig kvalitet visade vanligtvis mestadels NFR med inga eller få nukleosomala toppar (figur 4D). Kvalitetskontrolltesterna med qRT-PCR-analysen visade 10-20-faldiga anrikningar med de positiva genomiska elementen nära adipocytmarkörgener såsom Adipoq, Fabp4, Plin1 och Pnpla2, medan ingen anrikning visades med den negativa kontrollen (figur 5). Vi observerade också anrikning med den termogena genen Ucp1 specifikt i BAT men inte i eWAT eller iWAT (figur 5).
Efter sekvenseringen och analysen identifierade vi ~55 000 toppar kombinerade från tre olika fettdepåer (eWAT, iWAT och BAT). Mitokondriella avläsningar var <2%, och fraktionen under topparna var ~ 18% -44% (figur 6A, B). Prover av dålig kvalitet kan ha betydligt högre mitokondrier läsningar och / eller en lägre andel läsningar i toppregionerna. Visuell inspektion av ATAC-seq-biblioteksspåren avslöjade flera starka toppar med höga signal-brusförhållanden nära adipocytmarkörgener, såsom Adipoq, Plin1 och Fabp4, från alla fettdepåer (figur 7A-C). Vi observerade också starka ATAC-seq-toppar vid den bruna adipocyttillverkaren Ucp1-lokus i BAT-provet, men dessa toppar observerades inte i eWAT- eller iWAT-proverna (figur 7D). Alla dessa data indikerar framgångsrika ATAC-seq-data genererade från adipocytkärnor.
Figur 1: Ett schematiskt flödesschema över adipocytspecifika ATAC-seq med NuTRAP-möss. De steg som är unika för det här protokollet markeras i de rödskuggade rutorna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativ FACS-grind som illustrerar isoleringen av mCherry/GFP-märkta adipocytkärnor från fettvävnaderna hos en Adipoq-NuTRAP-mus. (A–C) Flödescytometrianalys av isolerade kärnor från eWAT, iWAT och BAT hos en Adipoq-NuTRAP-mus. (D) Kvantitativ analys av kärnor från adipocyter och icke-adipocyter i eWAT, iWAT och BAT hos en Adipoq-NuTRAP-mus. Data är medelvärde ± SEM (n = 3). Dessa kärnräkningsdata är från Roh et al.7. Förkortningar: FACS = fluorescensaktiverad cellsortering; GFP = grönt fluorescerande protein; eWAT = epididymal vit fettvävnad; iWAT = inguinal vit fettvävnad; BAT = brun fettvävnad; NuTRAP = nukleär märkning och översättning av ribosomaffinitetsrening; Adipoq-NuTRAP = NuTRAP-mus korsad med adipocytspecifik adiponectin-Cre-linje; FSC-A = spridningstoppområde framåt, FSC-H = spridning-topphöjd framåt, SSC-A = sidospridningstoppare; FITC-A = fluoresceinisotiocyanat-topparea. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa amplifieringskurvor från qRT-PCR . (A) Prov av god kvalitet som behöver ytterligare sju amplifieringscykler. (B) Prov av dålig kvalitet som behöver ≥15 ytterligare cykler. Förkortning: qRT-PCR = kvantitativ omvänd transkription PCR. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Storleksfördelningsprofiler för ATAC-seq-biblioteken. (A-C) Bibliotek av god kvalitet och (D) bibliotek av dålig kvalitet visas som representativa resultat. Förkortningar: ATAC-seq = test för transposastillgängligt kromatin med sekvensering med hög genomströmning; FU = fluorescensenheter; bp = baspar; NFR = nukleosomfri region; eWAT = epididymal vit fettvävnad; iWAT = inguinal vit fettvävnad; BAT = brun fettvävnad. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: QPCR-analys av ATAC-seq-biblioteken för kvalitetskontroll. Berikningar för promotorer och förstärkare nära de allmänna adipocytmarkörerna Adipoq, Fabp4, Plin1 och Pnpla2 eller den bruna adipocytmarkören Ucp1. Förkortningar: ATAC-seq = test för transposastillgängligt kromatin med sekvensering med hög genomströmning; NC = negativ kontroll; eWAT = epididymal vit fettvävnad; iWAT = inguinal vit fettvävnad; BAT = brun fettvävnad. Data är medelvärde ± SEM (n = 2). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Mitokondrier läser och fraktioner under topparna i ATAC-seq-biblioteken. (A) Mitokondrier läser (%) och (B) fraktioner under topparna (%) från eWAT, iWAT och BAT. Förkortningar: ATAC-seq = test för transposastillgängligt kromatin med sekvensering med hög genomströmning; eWAT = epididymal vit fettvävnad; iWAT = inguinal vit fettvävnad; BAT = brun fettvävnad. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: ATAC-seq-signalspår på platsen för representativa gener. (A-C) Allmänna gener för adipocytmarkörer. b) Brun adipocytspecifik markör. Förkortningar: ATAC-seq = test för transposastillgängligt kromatin med sekvensering med hög genomströmning; eWAT = epididymal vit fettvävnad; iWAT = inguinal vit fettvävnad; BAT = brun fettvävnad. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Komponenter i Tn5-masterblandningen. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Komponenter i PCR-masterblandningen och initiala PCR-cykelförhållanden. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 3: Förteckning över streckkodade primrar för PCR-amplifiering. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 4: Komponenter i qPCR-masterblandningen. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 5: qPCR-cykelförhållanden. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 6: Andra PCR-cykelförhållanden för ytterligare förstärkning. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 7: Primersekvenser och riktade qPCR-cykelförhållanden för kvalitetskontrollen av ATAC-seq-biblioteket. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 8: Analys av qPCR-resultaten för kvalitetskontrollen. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta dokument har vi presenterat ett optimerat ATAC-seq-protokoll för att bedöma adipocytspecifik kromatintillgänglighet in vivo. Detta ATAC-seq-protokoll som använder Adipoq-NuTRAP-musen genererade framgångsrikt adipocytspecifika kromatintillgänglighetsprofiler. Den mest kritiska faktorn för framgångsrika och reproducerbara ATAC-seq-experiment är kärnkvalitet. Det är viktigt att omedelbart snäppfrysa de dissekerade fettvävnaderna i flytande kväve och förvara dem säkert vid −80 °C utan upptining fram till användning. Det är också viktigt att förhindra skador på adipocytkärnan under isolering och sortering av kärnan. Proverna måste hanteras varsamt via låghastighetscentrifugering och minimal pipettering under hela processen med isolering av kärnor.
Noggrann grindning under kärnsortering är avgörande för att selektivt isolera de mCherry / GFP-märkta adipocytkärnorna (figur 1). Det är viktigt att säkerställa en tydlig åtskillnad mellan mCherry/GFP-positiva och negativa populationer. På samma sätt är skonsam hantering och snabb sortering nödvändig för att bevara kromatinets natur i kärnorna. Om fluorescensen är svag, sorteringen tar för lång tid och / eller adipocytfraktionerna ligger utanför de förväntade intervallen, indikerar detta att det kan finnas problem med proverna eller problem under kärnisoleringsprocedurerna. Detta protokoll kan ändras beroende på experimentella omständigheter. För det första kan antalet kärnor som krävs för ATAC-seq gå ner till 1 000 eller upp till 100 000. Om det finns mindre än 5 000 kärnor skulle användning av en ytterligare reducerad volym (0,6 μl) av TDE I-enzymet förhindra övertaggning. För antal kärnor som är lika med eller högre än 50 000 kan volymen av Tn5-masterblandningen fördubblas till 50 μL, vilket är samma volym som används i originalprotokollet10.
För det andra kan andra kärnmärkningssystem, såsom INTACT (isolering av kärnor taggade i specifika celltyper) möss, användas istället för NuTRAP-möss16. Eftersom intakta möss uttrycker GFP-märkt SUN1-kärnmembranprotein kan GFP-märkta kärnor isoleras genom sortering och användas för ATAC-seq med samma metoder som beskrivs i detta protokoll. Alla andra nukleära märkningsmetoder kan också antas. Slutligen kan in vitro-odlade adipocyter också användas för ATAC-seq enligt detta protokoll. För detta skrapas celler som odlas på tallrikar / tallrikar, samlas in med NPB och utsätts sedan för samma nedströmsprocedurer - förutom att sortering endast bör göras baserat på storlek, komplexitet och Hoechst, inte mCherry / GFP som beskrivits tidigare15.
Detta adipocytspecifika ATAC-seq-protokoll som använder NuTRAP-tekniken utgör en begränsning eftersom det inte fungerar utan fluorescerande märkning; Således kommer analys av mänskliga prover inte att fungera med denna teknik. Det är dock fortfarande möjligt att utföra ATAC-seq med adipocyter isolerade genom vävnadsuppslutning och flotationsmetoder. Det bör noteras att arbetet med humana floater adipocyter har vissa begränsningar, såsom kontaminering av andra celltyper vid användning av låghastighetscentrifugering och förlust av stora adipocyter vid användning av centrifugering med högre hastighet. Detta protokoll kan tillämpas på alla celltyper för vilka specifika Cre-linjer finns tillgängliga, vilket möjliggör effektiv celltypspecifik kromatinprofilering även med begränsade cellingångar17. Sammanfattningsvis kommer detta förbättrade ATAC-seq-protokoll att vara till hjälp för forskare som vill utvärdera kromatintillgänglighet från specifika celltyper inom heterogena vävnader ex vivo, förutom de adipocyter vi diskuterade här.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några relevanta eller materiella ekonomiska intressen relaterade till den forskning som beskrivs i denna uppsats.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av IUSM Showalter Research Trust Fund (till H.C.R.), ett IUSM Center for Diabetes and Metabolic Diseases Pilot and Feasibility grant (till H.C.R.), National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK129289 till H.C.R.) och American Diabetes Association Junior Faculty Award (7-21-JDF-056 till H.C.R.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Adiponectin-Cre mouse | The Jackson Laboratory | 28020 | |
| NuTRAP mouse | The Jackson Laboratory | 29899 | |
| Reagents & Materials | |||
| 1.5 mL DNA-LoBind tubes | Eppendorf | 86-923 | |
| 100 µm cell strainer | Falcon | 352-360 | |
| 15 mL tubes | VWR | 525-1071 | |
| 2x TD buffer | Illumina | 15027866 | |
| 384-well PCR plate | Applied biosystem | 4483285 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352-340 | |
| 50 mL tubes | VWR | 525-1077 | |
| AMPure XP reagent (SPRI beads) | Beckman Coulter | A63881 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Clear adhesive film | Applied biosystem | 4306311 | |
| DNase/RNase-free distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Dounce tissue grinder | DWK Life Sciences | 357542 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| DynaMag-96 side skirted magnet | Thermo Fishers | 12027 | |
| FACS tubes | Falcon | 28719128 | |
| HEPES | Boston BioProducts | BBH-75 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 2134015 | |
| KCl (2 M) | Boston BioProducts | MT-252 | |
| Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips | EpiCypher | 10-0008 | |
| MgCl2 (1 M) | Boston BioProducts | MT-200 | |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix | BioLabs | M0541S | |
| NP40 | Thermo Fishers | 28324 | |
| PCR 8-tube strip | USA scientific | 1402-4708 | |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fishers | 78439 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Sucrose | Sigma | S0389-1KG | |
| SYBR Green I (10,000x) | Invitrogen | S7563 | |
| TDE I enzyme | Illumina | 15027865 | |
| Instruments | |||
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACSAria Fusion | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | |
| Real-Time PCR system | Thermo Fishers | QuantStudio?5 |
References
- Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).
- Farmer, S. R.
- Bielczyk-Maczynska, E. White adipocyte plasticity in physiology and disease. Cells. 8 (12), 1507 (2019).
- Basu, U., Romao, J. M., Guan, L. L. Adipogenic transcriptome profiling using high throughput technologies. Journal of Genomics. 1, 22-28 (2013).
- Esteve Rafols, M. Adipose tissue: Cell heterogeneity and functional diversity. Endocrinologia y Nutricion. 61 (2), 100-112 (2014).
- Kwok, K. H., Lam, K. S., Xu, A. Heterogeneity of white adipose tissue: Molecular basis and clinical implications. Experimental and Molecular Medicine. 48, e215 (2016).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Roh, H. C., et al. Adipocytes fail to maintain cellular identity during obesity due to reduced PPARγ activity and elevated TGFβ-SMAD signaling. Molecular Metabolism. 42, 101086 (2020).
- Roh, H. C., et al. Warming induces significant reprogramming of beige, but not brown, adipocyte cellular identity. Cellular Metabolism. 27 (5), 1121.e5-1137.e5 (2018).
- Buenrostro, J. D., et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Wu, J., et al. Chromatin analysis in human early development reveals epigenetic transition during ZGA. Nature. 557 (7704), 256-260 (2018).
- Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and dissection of diverse mouse adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
- So, J., et al. Chronic cAMP activation induces adipocyte browning through discordant biphasic remodeling of transcriptome and chromatin accessibility. Molecular Metabolism. 66, 101619 (2022).
- Loft, A., Herzig, S., Schmidt, S. F. Purification of GFP-tagged nuclei from frozen livers of INTACT mice for RNA- and ATAC-sequencing. STAR Protocols. 2 (3), 100805 (2021).
- Heyward, F. D., et al. Integrated genomic analysis of AgRP neurons reveals that IRF3 regulates leptin's hunger-suppressing effects. bioRxiv. , (2022).
