Summary
우리는 핵 형광 표지가 있는 형질전환 리포터 마우스에서 분리된 지방 조직으로 핵 분류를 사용하는 지방 세포에 특히 고처리량 시퀀싱(ATAC-seq)을 사용하여 전치사 효소 접근 가능한 염색질 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
고처리량 염기서열 분석(ATAC-seq)을 통한 전이효소 접근 가능 염색질 분석은 게놈 차원의 염색질 접근성 프로파일링을 가능하게 하는 강력한 기술입니다. 이 기술은 다양한 생물학적 과정에서 유전자 발현의 조절 메커니즘을 이해하는 데 유용했습니다. ATAC-seq는 다양한 유형의 샘플에 대해 변형되었지만 지방 조직에 대한 ATAC-seq 방법의 효과적인 변형은 없었습니다. 지방 조직의 문제에는 복잡한 세포 이질성, 큰 지질 함량 및 높은 미토콘드리아 오염이 포함됩니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 우리는 형질전환 리포터 NuTRAP(Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Pification) 마우스의 지방 조직으로 형광 활성화 핵 분류를 사용하여 지방 세포 특이적 ATAC-seq를 허용하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜은 낭비되는 염기서열 분석 판독을 최소화하면서 핵 입력 및 시약의 양을 줄이면서 고품질 데이터를 생성합니다. 이 논문은 마우스 지방 조직에서 분리된 지방 세포 핵의 사용을 위해 검증된 ATAC-seq 방법에 대한 자세한 단계별 지침을 제공합니다. 이 프로토콜은 다양한 생물학적 자극에 대한 지방 세포의 염색질 역학 조사에 도움이 될 것이며, 이는 새로운 생물학적 통찰력을 가능하게 할 것입니다.
Introduction
지질 분자의 형태로 과도한 에너지를 저장하는 데 특화된 지방 조직은 대사 조절의 핵심 기관입니다. 지방세포 형성 및 유지의 엄격한 제어는 지방 조직 기능과 전신 에너지 항상성에 매우 중요하다1. 많은 전사 조절자는 지방 세포 분화, 가소성 및 기능의 조절에 중요한 역할을 합니다. 이러한 조절인자 중 일부는 인간의 대사 장애와 관련이 있습니다 2,3. 유전자 발현 및 후성유전체학 분석을 위한 고처리량 염기서열 분석 기술의 최근 발전은 지방세포 생물학의 분자 조절인자의 발견을 더욱 용이하게 했다4. 지방 조직을 사용한 분자 프로파일링 연구는 이러한 조직의 이질성으로 인해 수행하기 어렵습니다. 지방 조직은 주로 지방 저장을 담당하는 지방 세포로 구성되지만 섬유아세포, 내피 세포 및 면역 세포와 같은 다양한 다른 세포 유형도 포함합니다5. 또한, 지방조직의 세포 조성은 온도 및 영양 상태와 같은 병태생리학적 변화에 반응하여 극적으로 변화한다6. 이러한 문제를 극복하기 위해, 우리는 이전에 Cre 재조합효소 의존적 방식으로 GFP 태그 리보솜 및 mCherry 태그 바이오티닐화 핵을 생성하는 NuTRAP(Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification )이라는 이름의 형질전환 리포터 마우스를 개발했다7. 이중 라벨링 시스템을 통해 조직으로 세포 유형별 전사체 및 후성유전체 분석을 수행할 수 있습니다. 지방세포 특이적 아디포넥틴-Cre 계통(Adipoq-NuTRAP)과 교배된 NuTRAP 마우스를 사용하여 이전에 생체 내 순수 지방세포 집단의 유전자 발현 프로필과 염색질 상태를 특성화하고 비만 동안 어떻게 변경되는지 결정했습니다 7,8. 이전에는 갈색 및 베이지색 지방세포 특이적 Ucp1-Cre 라인(Ucp1-NuTRAP)과 교배된 NuTRAP 마우스를 통해 온도 변화에 반응하여 희귀한 열발생 지방세포 개체군인 베이지색 지방세포의 후성유전체 리모델링을 특성화할 수 있었다9.
ATAC-seq는 게놈 전체의 염색질 접근성을 평가하기 위해 널리 사용되는 분석 방법입니다. ATAC-seq에 사용되는 과반응성 Tn5 전이효소는 핵10의 염색질 접근 가능 영역에서 시퀀싱 어댑터를 태깅하여 개방 염색질 영역을 식별할 수 있습니다. ATAC-seq는 간단한 분석법이지만 강력한 결과를 제공하며 저투입 시료에서도 매우 효율적입니다. 따라서 가장 인기 있는 후성유전체 프로파일링 방법 중 하나가 되었으며 다양한 생물학적 맥락에서 유전자 발현의 조절 메커니즘을 이해하는 데 기여했습니다. 오리지널 ATAC-seq 프로토콜이 만들어진 이후, 다양한 유형의 샘플에 대한 프로토콜을 수정하고 최적화하기 위해 다양한 ATAC-seq 파생 기술이 추가로 개발되었습니다. 예를 들어, Fast-ATAC는 혈구 샘플(11)을 분석하기 위해 설계되었고, Omni-ATAC는 냉동 조직 샘플(12)에 최적화된 프로토콜이며, MiniATAC-seq는 초기 단계 배아 분석(13)에 효과적이다. 그러나 ATAC-seq 방법을 지방 세포, 특히 조직 샘플에 적용하는 것은 여전히 어려운 일입니다. 지방 조직의 이질성 외에도 높은 지질 함량은 핵 분리 후에도 Tn5 전이효소에 의한 효율적인 재조합 반응을 방해할 수 있습니다. 또한, 지방 세포, 특히 갈색 및 베이지색 지방 세포의 높은 미토콘드리아 함량은 높은 미토콘드리아 DNA 오염을 유발하고 시퀀싱 판독을 낭비합니다. 이 논문은 Adipoq-NuTRAP 마우스를 사용한 지방세포 특이적 ATAC-seq에 대한 프로토콜을 설명합니다(그림 1). 형광 표지 핵 분류를 활용함으로써 이 프로토콜을 사용하면 다른 교란 세포 유형에서 분리된 순수 지방 세포 핵 집단을 수집하고 지질, 미토콘드리아 및 조직 파편을 효율적으로 제거할 수 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 표준 프로토콜에 비해 적은 양의 입력 및 시약을 사용하면서 세포 유형별 고품질 데이터를 생성하고 미토콘드리아 판독으로 인한 낭비를 최소화할 수 있습니다.
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Protocol
동물 관리 및 실험은 인디애나 대학교 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에서 승인 한 절차에 따라 수행되었습니다.
1. 실험 시작 전 준비 사항
- 조직 준비
- 지방세포 핵 표지의 경우, NuTRAP 마우스를 지방세포 특이적 아디포넥틴-Cre 라인(Adipoq-Cre)과 교차시켜 Adipoq-Cre 및 NuTRAP 모두에 대해 반구성인 Adipoq-NuTRAP 마우스를 생성합니다.
- 앞서 설명한 바와 같이 Adipoq-NuTRAP 마우스로부터 관심 있는 지방 조직을 해부한다14.
- 조직을 액체 질소로 급속 냉동하고 사용할 때까지 -80 ° C에서 보관하십시오.
참고: 각 지방 패드는 전체적으로 보관할 수 있으며 냉동 조직은 나중에 실험을 위해 드라이아이스에서 더 작은 조각(~50mg)으로 절단할 수 있습니다. 대안적으로, 지방 조직은 저장을 위해 튜브에서 절단, 분취 및 냉동될 수 있습니다(튜브당 ~50mg). 냉동 샘플은 냉동 후 사용할 때까지 해동할 수 없습니다.
- 버퍼 준비
알림: 실험 내내 버퍼를 얼음 위에 두십시오.- 250 mM 수크로오스, 10 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM KCl, 1.5 mMMgCl2, 및 0.1% NP40 핵 준비 완충액 (NPB)을 준비한다. 시료 당 7mL의 NPB를 준비합니다. 사용하기 전에 새로운 100x 프로테아제 억제제 칵테일(최종 1x), DTT(최종 1mM) 및 Hoechst(최종 1μg/mL)를 NPB에 추가합니다.
참고: 신선한 NPB를 준비하는 것이 좋지만 4°C에서 최대 1개월까지 보관할 수 있습니다. - 0.1% NP-40(PBS-N)으로 1x 인산염 완충 식염수를 준비합니다.
- 250 mM 수크로오스, 10 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM KCl, 1.5 mMMgCl2, 및 0.1% NP40 핵 준비 완충액 (NPB)을 준비한다. 시료 당 7mL의 NPB를 준비합니다. 사용하기 전에 새로운 100x 프로테아제 억제제 칵테일(최종 1x), DTT(최종 1mM) 및 Hoechst(최종 1μg/mL)를 NPB에 추가합니다.
2. 핵 분리
- Chill glass Dounce 균질화, 샘플당 하나의 유리 Dounce를 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 NPB 혼합물 7mL를 각 유리 Dounce에 추가합니다.
참고: 각 실험에서 최대 8개의 샘플을 사용하는 것이 좋습니다. 8개 이상의 샘플로 작업하면 모든 단계가 크게 지연되며 특히 정렬 중에 핵 품질이 저하될 수 있습니다. - 얼어 붙은 지방 조직 (50-100 mg)을 유리 Dounce에 넣고 즉시 긴 가위를 사용하여 몇 개의 작은 조각으로 자릅니다. 모든 샘플에 대해 느슨한 유봉으로 10배를 친 다음 단단한 유봉으로 10배를 치십시오.
참고: 지방 조직은 부드럽기 때문에 몇 개의 작은 조각으로 자르는 것으로 충분합니다. 희귀 샘플의 경우 수집 된 지방 세포 핵 수는 다를 수 있지만 더 작은 조각 (10-20mg)을 사용할 수 있습니다. - 100μm 스트레이너를 통해 새 50mL 튜브로 여과합니다. 여과된 균질액을 부어 새 15mL 튜브로 옮깁니다. 스윙 버킷 원심분리기에서 4°C에서 10분 동안 200× g 로 회전시킵니다. 상청액을 가능한 한 많이 제거하십시오.
참고: 먼저 진공을 사용하여 흡인한 다음 마이크로피펫을 사용하여 나머지 부피를 제거합니다. - 부드럽지만 철저한 손가락 두드림으로 500μL의 PBS-N에 펠릿을 재현탁합니다.
알림: 핵을 손상시킬 수 있으므로 피펫팅을 피하십시오. - 부드러운 피펫팅을 사용하여 40μm 여과기를 통해 새 50mL 튜브로 여과합니다. 250μL의 PBS-N으로 여과기를 헹굽니다. 마이크로피펫을 사용하여 여과된 핵 재현탁을 형광 활성화 세포 분류(FACS) 튜브로 옮깁니다.
알림: 가능한 경우 튜브와 셀 스트레이너를 사용하여 더 작은 부피로 사용할 수 있습니다.amp르 손실.
3. 핵 분류
- 수집 튜브 준비
- 500μL의 PBS-N을 새 1.5mL 튜브에 넣고 몇 번 뒤집어 버퍼로 모든 내부 표면을 적십니다.
- 튜브를 짧게 돌려 모든 액체를 내린 다음 분류될 때까지 얼음 위에서 식힙니다.
- FACS(그림 2)
- 싱글렛에는 FSC-A/FSC-H 게이팅을, 작거나 큰 이물질 제거에는 FSC-A/SSC-A를 사용하십시오.
- mCherry/GFP 양성 지방세포 핵 집단에 대한 게이트.
- 3.1단계에서 준비한 각 수집 튜브에 10,000개의 핵을 수집합니다.
- 분류 후 핵 준비
- 각 수집 튜브에 500μL의 PBS-N을 추가하고 몇 번 뒤집어 혼합합니다.
- 스윙 버킷 원심분리기에서 수집 튜브를 200°C에서 10분 동안 4× g 로 회전시킵니다. 상청액을 완전히 제거하십시오.
알림: 먼저 진공 청소기를 사용하여 기포를 제거하고 상층액을 붓고 종이 물티슈를 사용하여 남은 액체를 완전히 제거합니다. 이 시점에서 펠릿은 보이지 않습니다. 후술하는 바와 같이 원심분리 단계 동안 Tn5 마스터 혼합물을 준비한다.
4. Tn5 태깅 (표 1)
- 25 μL의 Tn5 마스터 혼합물을 준비하기 위해, 12.5 μL의 2x tagmentation DNA 완충액(TD 완충액), 1.25 μL의 Tn5 트랜스포사제(TDE I 효소) 및 11.25 μL의 뉴클레아제가 없는 물을 혼합합니다.
- 각 핵 펠릿에 25μL의 Tn5 마스터 혼합물을 추가하고 부드러운 피펫팅으로 재현탁합니다. 써모믹서를 사용하여 37°C에서 30분 동안 600rpm에서 인큐베이션합니다.
5. DNA 정제
참고: 다음 절차에서는 재료 표에 언급된 PCR 정제 키트를 사용합니다. 임의의 다른 유사한 DNA 정제 방법이 사용될 수 있다.
- 4.2단계 후에 얻은 Tn5 핵 재현탁 혼합물 25μL에 뉴클레아제가 없는 물 25μL를 추가합니다. 최종 부피는 시료당 50μL입니다.
- 버퍼 PB 250μL를 추가합니다.
- 5 μL의 3 M 아세트산 나트륨 (NaOAc) (pH 5.2)을 첨가합니다.
- 혼합물을 컬럼(참조된 키트와 함께 제공됨)으로 옮기고 실온(RT)에서 1 분 동안 17,900×g에서 원심분리합니다.
- 플로우 스루를 버리고 스핀 컬럼을 동일한 수집 튜브에 다시 놓습니다. 무수 에탄올(EtOH)을 함유하는 완충액 PE 750μL를 첨가하고, RT에서 1분 동안 17,900× g 에서 원심분리한다.
- 플로우 스루를 버리고 스핀 컬럼을 동일한 수집 튜브에 다시 넣습니다. RT에서 1분 동안 17,900× g 의 원심분리기를 분리하고 플로우스루가 있는 수집 튜브를 폐기합니다.
- DNA 단편을 용리하기 위해 컬럼에 새 1.5mL 튜브를 장착하고 10μL의 완충액 EB를 추가한 후 실온에서 3분 동안 그대로 두십시오. RT에서 1분 동안 17,900×g의 원심분리기.
참고: 샘플은 4°C에서 며칠 동안 또는 -20°C에서 몇 주 동안 보관할 수 있습니다.
6. PCR 증폭 (표 2)
참고: 이 연구에 사용된 프라이머는 표 3에 나열되어 있습니다.
- 전치된 DNA 단편을 증폭하기 위해 고유한 Ad2.n 바코드 프라이머(프라이머 #2)를 추가하지 않고 PCR 마스터 혼합물을 준비합니다. 뉴클레아제가 없는 물 11 μL, 25 μM Ad1_noMX 프라이머(프라이머 #1) 2 μL, 2x PCR 마스터 믹스 25 μL의 샘플당 38 μL의 PCR 마스터 혼합물을 사용합니다.
- 38μL의 PCR 마스터 혼합물을 0.2mL PCR 튜브에 추가합니다.
- 5.7단계에서 용출된 DNA 단편 10μL를 추가합니다.
- 각 샘플에 특이적이어야 하는 25μM 프라이머 #2 2μL를 추가합니다.
- 표 2에 표시된 사이클링 조건에 따라 PCR을 실행합니다.
7. 실시간 정량적 PCR(qPCR) 검사(표 4)
참고: 이 단계는 DNA를 증폭하는 데 필요한 추가 주기를 결정하는 것을 목표로 합니다. 선택 사항이지만 특히 새로운 실험에 적극 권장됩니다.
- 프라이머 #2를 첨가하지 않고 qPCR 마스터 혼합물을 준비합니다. 뉴클레아제가 없는 물 4.41 μL, 25 μM 프라이머 #1 0.25 μL, 2x PCR 마스터 믹스 5 μL, 100x SYBR Green I 0.09 μL 당 9.975 μL의 qPCR 마스터 혼합물을 사용합니다.
알림: 100x SYBR Green I을 준비하려면 10,000x 스톡을 뉴클레아제가 없는 물로 희석하십시오. qPCR 마스터 혼합물에 사용되는 100x SYBR Green I의 부피는 무시할 수 있는 수준이므로 희석된 100x SYBR Green I의 추가 마스터 혼합물을 만드는 것이 더 쉽습니다(예: 8-10개 샘플의 경우). - 9.975μL의 qPCR 마스터 혼합물을 qPCR 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
- 0.25μL의 25μM 프라이머 #2를 각 웰에 추가합니다.
참고: 각 특정 샘플에 추가된 것과 일치하도록 동일한 프라이머 #2를 추가해야 합니다.amp단계 6.4에서. - 단계 6.5에서 PCR 증폭 후 얻은 PCR 반응물 5 μL를 첨가하고 피펫팅으로 혼합한다.
참고: PCR 반응의 나머지 45μL는 두 번째 PCR 증폭에 사용됩니다. - 표 5에 표시된 사이클링 조건에 따라 qPCR을 실행합니다.
- 증폭 곡선을 확인하고 최대값의 ~35%에 도달한 주기 수를 추정하여 필요한 추가 PCR 주기 수를 식별합니다(그림 3A).
참고: 일반적으로 10,000개의 핵에는 5-8개의 추가 PCR 주기가 필요합니다.
8. 추가 PCR 증폭
- 단계 7.6으로부터의 계산에 따라 PCR 반응의 나머지 45 μL를 모두 사용하여 PCR을 실행한다(표 6).
알림: 각 샘플에는 다른 수의 증폭 주기가 필요할 수 있습니다.
9. PCR 정제 키트를 이용한 2차 DNA 정제
- 섹션 5에서와 동일한 절차를 사용하되 증폭된 DNA 단편을 20μL의 완충액 EB로 용출합니다.
10. DNA 단편 크기 선택
알림: 아래 설명된 대로 고체상 가역 고정 비드를 사용하십시오. 임의의 다른 유사한 DNA 정제 비드는 제조업자의 지시에 따라 사용될 수 있다. SPRI 비드 서스펜션은 사용하기 전에 회전과 함께 RT에서 완전히 재현탁되고 평형을 이루어야 합니다.
- 용출된 DNA를 새 PCR 튜브에 옮기고 80μL의 완충액 EB를 추가하여 최종 부피를 100μL로 만듭니다.
- 55 μL의 SPRI 비드(시료 부피의 0.55배)를 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다. RT에서 5분 동안 배양한 다음 PCR 8-튜브 스트립용 미니 마그네틱 스탠드에서 5분 동안 분리합니다.
- 상층액 150μL를 새 PCR 튜브로 옮깁니다. 95 μL의 SPRI 비드를 첨가하고 피펫팅으로 혼합합니다.
참고: 상청액에는 약 500bp 이하의 DNA가 포함되어 있습니다. - RT에서 5분 동안 배양한 다음 미니 마그네틱 스탠드에서 5분 동안 분리합니다. 상청액을 조심스럽게 버리십시오.
- 비드를 200 μL의 70% EtOH로 1분 동안 세척한다. 총 세 번 세척하는 동안 두 번 반복하십시오.
알림: 세척 중에 마그네틱 스탠드에서 PCR 튜브를 이동하지 마십시오. - 최종 세척 후 튜브를 1,000× g 에서 1분 동안 회전시키고 나머지 EtOH를 피펫으로 제거합니다. PCR 기계에서 37°C에서 2분 동안 뚜껑을 연 상태로 펠릿을 건조시킵니다.
알림: 비드 펠릿은 건조 후 약간의 작은 균열만 표시되어야 합니다. 과도한 건조를 피하십시오. - 피펫팅에 의해 20 μL의 완충액 EB로 펠릿을 재현탁하고, RT에서 5 분 동안 인큐베이션한다. 미니 마그네틱 스탠드에서 5분 동안 분리한 다음, 최종 라이브러리를 포함하는 상청액 18μL를 새로운 1.5mL 튜브로 옮긴다.
알림: 라이브러리는 품질 검사를 수행하는 동안 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
11. 형광측정기를 이용한 DNA 정량
- 마스터 혼합물을 준비하기 위해 200x dsDNA 고감도(HS) 시약을 dsDNA HS 완충액으로 최종 농도 1x로 희석합니다.
- 표준물질의 경우, 1x 마스터 혼합물 190 μL과 표준물질 1 또는 표준물질 2 10 μL를 형광계 튜브에 추가합니다.
참고: 정량화를 시작하기 전에 어둠 속에서 RT에서 표준물질을 평형화하십시오. - 라이브러리 샘플의 경우 1x 마스터 혼합물 198μL와 각 샘플 2μL를 별도의 형광계 튜브에 추가합니다.
참고: 샘플의 양이 제한되어 있는 경우 샘플 부피를 1μL로 줄이고 1x 마스터 혼합물 부피를 199μL로 늘릴 수 있습니다. - 형광계 튜브를 소용돌이 치거나 흔들어 어둠 속에서 RT에서 5분 동안 그대로 두십시오. 형광측정기의 dsDNA HS assay를 이용하여 DNA 농도를 측정한다.
12. 고감도 전기영동 시스템에 의한 라이브러리 품질 검사
- ATAC-seq 라이브러리를 사용하여 뉴클레아제가 없는 물로 1-5 ng/μL의 최종 농도로 희석합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 고감도 자동 전기영동 시스템을 사용하여 ATAC-seq 라이브러리의 크기 분포를 분석합니다.
13. 표적 qPCR을 이용한 ATAC-seq 라이브러리의 품질 검사
- ATAC-seq 라이브러리 5-10ng을 섭취하고 뉴클레아제가 없는 물 50μL로 희석합니다.
- 표 7에 나타낸 사이클링 조건에 따라 지방세포에서 활성인 것으로 알려진 프로모터 및 인핸서를 표적으로 하는 프라이머를 사용하여 qPCR을 실행합니다.
- 폐쇄/침묵 게놈 영역을 표적으로 하는 음성 대조군 프라이머를 사용합니다(표 7).
- 음성 대조군에 대한 프로모터/인핸서의 농축을 계산합니다(표 8).
참고: 성공적인 샘플로 ≥10-20배 농축을 볼 수 있을 것으로 예상됩니다.
14. 시퀀싱
- 시퀀싱을 위해 ATAC-seq 라이브러리를 제출합니다. 샘플당 평균 판독 횟수가 10-3000만 회인 paired-end 염기서열분석(2 x 34 bp, 2 x 50 bp 이상)을 사용합니다.
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Representative Results
이 ATAC-seq 프로토콜을 사용하여 지방 조직을 분석하기 위해 차우 사료를 먹인 Adipoq-NuTRAP 마우스를 생성했습니다. 그런 다음 유세포 분석을 사용하여 부고환 백색 지방 조직(eWAT), 사타구니 백색 지방 조직(iWAT) 및 갈색 지방 조직(BAT)에서 지방 세포 핵을 분리했습니다. 분리된 핵을 태깅에 사용한 후, DNA 정제, PCR 증폭, 품질 검사 단계, 염기서열 분석 및 데이터 분석이 위에서 설명한 바와 같습니다. 이 대표적인 실험의 목적은 서로 다른 지방 저장소에서 분리된 순수 지방 세포 집단의 염색질 접근성을 프로파일링하는 것이었습니다.
우리는 유세포 분석을 사용하여 mCherry 표지 및 GFP 표지 지방 세포 핵이 Adipoq-NuTRAP 마우스의 지방 조직에서 분리된 다른 세포 유형의 핵과 명확하게 구별될 수 있음을 관찰했습니다(그림 2A-C). 지방 저장소의 유형에 따라 지방 세포 분획에 차이가 있었습니다: eWAT에서 ~50%, iWAT에서 ~30%, BAT에서 ~65%(그림 2D)7. 샘플당 2-10분 이내에 10,000개의 핵을 수집하여 ATAC-seq 절차에 사용했습니다. 총 10-13 PCR 사이클(첫 번째 PCR의 5 사이클 및 두 번째 PCR의 5 사이클, 그림 3A)을 실행했습니다. 샘플에 총 15회 이상의 PCR 주기가 필요한 경우 이는 품질이 낮은 샘플을 나타낼 수 있습니다(그림 3B). ATAC-seq 라이브러리의 크기 분포 분석은 뉴클레오솜이 없는 영역(NFR)과 모노, 디 및 다중 뉴클레오솜(그림 4A-C)에 해당하는 여러 피크를 보여주었으며 평균 크기는 ~500-800bp입니다. 품질이 좋지 않은 샘플은 일반적으로 뉴클레오솜 피크가 없거나 거의 없는 대부분 NFR을 나타냈습니다(그림 4D). qRT-PCR 분석에 의한 품질 검사 검사는 Adipoq, Fabp4, Plin1 및 Pnpla2와 같은 지방 세포 마커 유전자 근처에서 양성 게놈 요소로 10-20배 농축을 보인 반면, 음성 대조군에서는 농축이 나타나지 않았습니다(그림 5). 우리는 또한 BAT에서 열발생 유전자 Ucp1의 농축을 관찰했지만 eWAT 또는 iWAT에서는 관찰하지 않았습니다(그림 5).
시퀀싱 및 분석 후 세 가지 다른 지방 저장소(eWAT, iWAT 및 BAT)에서 결합된 ~55,000개의 피크를 확인했습니다. 미토콘드리아 판독값은 <2%였고 피크 아래의 분율은 ~18%-44%였습니다(그림 6A, B). 품질이 좋지 않은 샘플은 피크 영역에서 훨씬 더 높은 미토콘드리아 판독 및/또는 더 낮은 판독 비율을 가질 수 있습니다. ATAC-seq 라이브러리 트랙의 육안 검사는 모든 지방 저장소에서 Adipoq, Plin1 및 Fabp4와 같은 지방 세포 마커 유전자 근처에서 높은 신호 대 잡음비를 가진 여러 개의 강력한 피크를 나타냈습니다(그림 7A-C). 우리는 또한 BAT 샘플의 갈색 지방세포 메이커 Ucp1 유전자좌에서 강한 ATAC-seq 피크를 관찰했지만 이러한 피크는 eWAT 또는 iWAT 샘플에서는 관찰되지 않았습니다(그림 7D). 이 모든 데이터는 지방 세포 핵에서 생성된 성공적인 ATAC-seq 데이터를 나타냅니다.
그림 1: NuTRAP 마우스를 사용한 지방세포 특이적 ATAC-seq의 개략도 흐름도. 이 프로토콜에 고유한 단계는 빨간색 음영 상자에 강조 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: Adipoq-NuTRAP 마우스의 지방 조직에서 mCherry/GFP 태그가 부착된 지방세포 핵의 분리를 보여주는 대표적인 FACS 게이팅. (ᄀ씨) Adipoq-NuTRAP 마우스의 eWAT, iWAT 및 BAT에서 분리된 핵의 유세포 분석 분석. (D) Adipoq-NuTRAP 마우스의 eWAT, iWAT 및 BAT에서 지방 세포 및 비지방 세포의 핵을 정량적으로 분석합니다. 데이터는 SEM± 평균(n=3)이다. 이 핵 카운트 데이터는 Roh et al.7에서 가져온 것입니다. 약어: FACS = 형광 활성화 세포 분류; GFP = 녹색 형광 단백질; eWAT = 부고환 백색 지방 조직; iWAT = 사타구니 백색 지방 조직; BAT = 갈색 지방 조직; NuTRAP = 핵 태깅 및 번역 리보솜 친화성 정제; Adipoq-NuTRAP = 지방세포 특이적 아디포넥틴-Cre 라인과 교차한 NuTRAP 마우스; FSC-A = 전방 산란-피크 면적; FSC-H = 전방 산란-피크 높이; SSC-A = 측면 산란-피크 면적; FITC-A = 플루오레세인 이소티오시아네이트-피크 면적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: qRT-PCR의 대표적인 증폭 곡선 . (A) 7번의 추가 증폭 주기가 필요한 양질의 샘플. (B) ≥15 추가 사이클이 필요한 품질이 좋지 않은 샘플. 약어: qRT-PCR = 정량적 역전사 PCR. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: ATAC-seq 라이브러리의 크기 분포 프로파일. (A-C) 좋은 품질의 라이브러리와 (D) 낮은 품질의 라이브러리가 대표적인 결과로 표시됩니다. 약어: ATAC-seq = 고처리량 시퀀싱을 사용한 전이효소 접근 가능한 염색질 분석; FU = 형광 단위; bp = 염기쌍; NFR = 뉴클레오솜 무함유 영역; eWAT = 부고환 백색 지방 조직; iWAT = 사타구니 백색 지방 조직; BAT = 갈색 지방 조직. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: ATAC-seq 라이브러리의 품질 관리 qPCR 분석. 일반 지방세포 마커 Adipoq, Fabp4, Plin1 및 Pnpla2 또는 갈색 지방세포 마커 Ucp1 근처의 프로모터 및 인핸서에 대한 농축. 약어: ATAC-seq = 고처리량 시퀀싱을 사용한 전이효소 접근 가능한 염색질 분석; NC = 음성 대조군; eWAT = 부고환 백색 지방 조직; iWAT = 사타구니 백색 지방 조직; BAT = 갈색 지방 조직. 데이터는 SEM± 평균(n=2)이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 미토콘드리아 판독 및 ATAC-seq 라이브러리의 피크 아래 분획. (A) 미토콘드리아는 eWAT, iWAT 및 BAT에서 피크(%) 아래의 분획(%) 및 (B)를 읽습니다. 약어: ATAC-seq = 고처리량 시퀀싱을 사용한 전이효소 접근 가능한 염색질 분석; eWAT = 부고환 백색 지방 조직; iWAT = 사타구니 백색 지방 조직; BAT = 갈색 지방 조직. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: ATAC-seq 신호는 대표적인 유전자좌에서 추적합니다. (A-C) 일반 지방세포 마커 유전자. (B) 갈색 지방세포 특이적 마커. 약어: ATAC-seq = 고처리량 시퀀싱을 사용한 전이효소 접근 가능한 염색질 분석; eWAT = 부고환 백색 지방 조직; iWAT = 사타구니 백색 지방 조직; BAT = 갈색 지방 조직. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: Tn5 마스터 혼합물의 성분. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: PCR 마스터 혼합물의 성분 및 초기 PCR 사이클링 조건. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: PCR 증폭을 위한 바코드 프라이머 목록. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 4: qPCR 마스터 혼합물의 성분. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 5: qPCR 사이클링 조건. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 6: 추가 증폭을 위한 제2 PCR 사이클링 조건. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 7: ATAC-seq 라이브러리의 품질 검사를 위한 프라이머 서열 및 표적 qPCR 사이클링 조건. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 8: 품질 검사를 위한 qPCR 결과의 분석. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 논문에서 우리는 생체 내에서 지방 세포 특이적 염색질 접근성을 평가하기 위해 최적화된 ATAC-seq 프로토콜을 제시했습니다. Adipoq-NuTRAP 마우스를 사용하는 이 ATAC-seq 프로토콜은 지방 세포 특이적 염색질 접근성 프로파일을 성공적으로 생성했습니다. 성공적이고 재현 가능한 ATAC-seq 실험을 위한 가장 중요한 요소는 핵 품질입니다. 해부된 지방 조직을 액체 질소에서 즉시 급속 동결하고 사용할 때까지 해동하지 않고 -80°C에서 안전하게 보관하는 것이 중요합니다. 또한 핵 분리 및 분류 중에 지방 세포 핵 손상을 방지하는 것이 중요합니다. 샘플은 핵 분리의 전체 과정에서 저속 원심분리와 최소한의 피펫팅을 통해 부드럽게 처리되어야 합니다.
핵 분류 중 신중한 게이팅은 mCherry/GFP 태그가 부착된 지방세포 핵을 선택적으로 분리하는 데 중요합니다(그림 1). mCherry/GFP 양성 집단과 음성 집단을 명확하게 구분하는 것이 중요합니다. 마찬가지로, 핵에서 염색질의 성질을 보존하기 위해서는 부드러운 취급과 신속한 분류가 필요합니다. 형광이 약하거나, 분류가 너무 오래 걸리거나, 지방세포 분획이 예상 범위를 벗어나는 경우, 이는 샘플에 문제가 있거나 핵 분리 절차 중에 문제가 있을 수 있음을 나타냅니다. 이 프로토콜은 실험 상황에 따라 수정될 수 있습니다. 첫째, ATAC-seq에 필요한 핵의 수는 1,000개까지 또는 최대 100,000개까지 내려갈 수 있습니다. 핵이 5,000개 미만인 경우 TDE I 효소의 추가 감소된 부피(0.6μL)를 사용하면 과잉 태그화를 방지할 수 있습니다. 50,000 이상의 핵 수에 대해, Tn5 마스터 혼합물의 부피는 50 μL로 두 배가 될 수 있으며, 이는 원래 프로토콜10에서 사용 된 것과 동일한 부피입니다.
둘째, NuTRAP 마우스16 대신에 INTACT(특정 세포 유형에서 태그된 핵의 분리) 마우스와 같은 다른 핵 표지 시스템을 사용할 수 있다. INTACT 마우스는 GFP-태그된 SUN1 핵막 단백질을 발현하므로, GFP-태그된 핵은 분류에 의해 분리될 수 있고, 이 프로토콜에 기술된 것과 동일한 방법을 사용하여 ATAC-seq에 사용될 수 있다. 다른 핵 라벨링 방법도 채택할 수 있습니다. 마지막으로, 시험관 내 배양된 지방세포는 이 프로토콜에 따라 ATAC-seq에도 사용할 수 있습니다. 이를 위해, 접시/접시에서 성장한 세포를 긁어내고, NPB를 사용하여 수집한 다음, 동일한 다운스트림 절차를 거친다. 단, 분류는 이전에 설명한 mCherry/GFP가 아닌 크기, 복잡성 및 Hoechst만을 기준으로 수행되어야 한다15.
NuTRAP 기술을 사용하는 이 지방세포 특이적 ATAC-seq 프로토콜은 형광 표지 없이는 작동하지 않기 때문에 한계가 있습니다. 따라서 인간 샘플을 분석하는 것은 이 기술로 작동하지 않습니다. 그러나, 조직 소화 및 부유 선광 방법에 의해 분리된 지방 세포로 ATAC-seq를 수행하는 것은 여전히 가능하다. 인간 부유물 지방세포로 작업하는 것은 저속 원심분리를 사용할 때 다른 세포 유형에 의한 오염 및 고속 원심분리를 사용할 때 큰 지방세포의 손실과 같은 몇 가지 제한 사항이 있다는 점에 유의해야 합니다. 이 프로토콜은 특정 Cre 라인을 사용할 수 있는 모든 세포 유형에 적용할 수 있으므로 제한된 세포 입력에서도 효율적인 세포 유형별 염색질 프로파일링이 가능합니다17. 결론적으로, 이 개선된 ATAC-seq 프로토콜은 여기에서 논의한 지방 세포 외에도 생체 외 이종 조직 내의 특정 세포 유형에서 염색질 접근성을 평가하고자 하는 연구자에게 도움이 될 것입니다.
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Disclosures
저자는 이 논문에 설명된 연구와 관련하여 관련성이 있거나 중요한 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 IUSM Showalter Research Trust Fund (H.C.R.), IUSM Center for Diabetes and Metabolic Diseases Pilot and Feasibility grant (H.C.R.), National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK129289 to H.C.R.) 및 American Diabetes Association Junior Faculty Award (7-21-JDF-056 to H.C.R.)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Adiponectin-Cre mouse | The Jackson Laboratory | 28020 | |
| NuTRAP mouse | The Jackson Laboratory | 29899 | |
| Reagents & Materials | |||
| 1.5 mL DNA-LoBind tubes | Eppendorf | 86-923 | |
| 100 µm cell strainer | Falcon | 352-360 | |
| 15 mL tubes | VWR | 525-1071 | |
| 2x TD buffer | Illumina | 15027866 | |
| 384-well PCR plate | Applied biosystem | 4483285 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352-340 | |
| 50 mL tubes | VWR | 525-1077 | |
| AMPure XP reagent (SPRI beads) | Beckman Coulter | A63881 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Clear adhesive film | Applied biosystem | 4306311 | |
| DNase/RNase-free distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Dounce tissue grinder | DWK Life Sciences | 357542 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| DynaMag-96 side skirted magnet | Thermo Fishers | 12027 | |
| FACS tubes | Falcon | 28719128 | |
| HEPES | Boston BioProducts | BBH-75 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 2134015 | |
| KCl (2 M) | Boston BioProducts | MT-252 | |
| Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips | EpiCypher | 10-0008 | |
| MgCl2 (1 M) | Boston BioProducts | MT-200 | |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix | BioLabs | M0541S | |
| NP40 | Thermo Fishers | 28324 | |
| PCR 8-tube strip | USA scientific | 1402-4708 | |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fishers | 78439 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Sucrose | Sigma | S0389-1KG | |
| SYBR Green I (10,000x) | Invitrogen | S7563 | |
| TDE I enzyme | Illumina | 15027865 | |
| Instruments | |||
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACSAria Fusion | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | |
| Real-Time PCR system | Thermo Fishers | QuantStudio?5 |
References
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