Summary
Vi presenterer en protokoll for analyse for transposase-tilgjengelig kromatin med høy gjennomstrømningssekvensering (ATAC-seq) spesifikt på adipocytter ved bruk av kjernesortering med fettvev isolert fra transgene reportermus med kjernefysisk fluorescensmerking.
Abstract
Analyse for transposase-tilgjengelig kromatin med høy gjennomstrømningssekvensering (ATAC-seq) er en robust teknikk som muliggjør profilering av kromatintilgjengelighet i hele genomet. Denne teknikken har vært nyttig for å forstå reguleringsmekanismene for genuttrykk i en rekke biologiske prosesser. Selv om ATAC-seq har blitt modifisert for forskjellige typer prøver, har det ikke vært effektive modifikasjoner av ATAC-seq-metoder for fettvev. Utfordringer med fettvev inkluderer kompleks cellulær heterogenitet, stort lipidinnhold og høy mitokondriell forurensning. For å overvinne disse problemene har vi utviklet en protokoll som tillater adipocytt-spesifikk ATAC-seq ved å bruke fluorescensaktivert kjernesortering med fettvev fra den transgene reporteren Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mus. Denne protokollen produserer data av høy kvalitet med minimal bortkastet sekvensering av avlesninger samtidig som mengden kjerneinngang og reagenser reduseres. Dette papiret gir detaljerte trinnvise instruksjoner for ATAC-seq-metoden validert for bruk av adipocyttkjerner isolert fra fettvev fra mus. Denne protokollen vil hjelpe til med undersøkelsen av kromatindynamikk i adipocytter ved ulike biologiske stimuleringer, noe som vil muliggjøre ny biologisk innsikt.
Introduction
Fettvev, som er spesialisert for lagring av overflødig energi i form av lipidmolekyler, er et nøkkelorgan for metabolsk regulering. Den strenge kontrollen av adipocytdannelse og vedlikehold er avgjørende for fettvevsfunksjon og helkroppsenergihomeostase1. Mange transkripsjonsregulatorer spiller en kritisk rolle i kontrollen av adipocytdifferensiering, plastisitet og funksjon; Noen av disse regulatorene er involvert i metabolske forstyrrelser hos mennesker 2,3. Nylige fremskritt innen sekvenseringsteknikker med høy gjennomstrømning for genuttrykk og epigenomisk analyse har ytterligere lettet oppdagelsen av molekylære regulatorer av adipocytbiologi4. Molekylære profileringsstudier ved bruk av fettvev er utfordrende å gjennomføre på grunn av heterogeniteten til disse vevene. Fettvev består hovedsakelig av adipocytter, som er ansvarlige for fettlagring, men inneholder også forskjellige andre celletyper, som fibroblaster, endotelceller og immunceller5. I tillegg endres den cellulære sammensetningen av fettvev dramatisk som respons på patofysiologiske endringer som temperatur og ernæringsstatus6. For å overvinne disse problemene utviklet vi tidligere en transgen reportermus, kalt Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP), som produserer GFP-merkede ribosomer og mCherry-merkede biotinylerte kjerner på en Cre rekombinase-avhengig måte7. Det doble merkingssystemet gjør det mulig å utføre celletypespesifikk transkriptomisk og epigenomisk analyse med vev. Ved hjelp av NuTRAP-mus krysset med adipocyttspesifikke adiponektin-Cre-linjer (Adipoq-NuTRAP), karakteriserte vi tidligere genuttrykksprofiler og kromatintilstander fra rene adipocyttpopulasjoner in vivo og bestemte hvordan de endres under fedme 7,8. Tidligere krysset NuTRAP-mus med brune og beige adipocyttspesifikke Ucp1-Cre-linjer (Ucp1-NuTRAP) oss å karakterisere den epigenomiske remodelleringen av den sjeldne termogene adipocytpopulasjonen, beige adipocytter, som respons på temperaturendringer9.
ATAC-seq er en mye brukt analytisk metode for å vurdere tilgjengeligheten av kromatin i hele genomet. Den hyperreaktive Tn5-transposasen som brukes i ATAC-seq, gjør det mulig å identifisere åpne kromatinregioner ved å merke sekvenseringsadaptere i det kromatintilgjengelige området av kjerner10. ATAC-seq er en enkel metode, men den gir robuste resultater og er svært effektiv selv med prøver med lav inngang. Det har dermed blitt en av de mest populære epigenomiske profileringsmetodene og har bidratt til forståelsen av reguleringsmekanismene for genuttrykk innenfor ulike biologiske sammenhenger. Siden den opprinnelige ATAC-seq-protokollen ble opprettet, har ulike ATAC-seq-avledede teknikker blitt videreutviklet for å modifisere og optimalisere protokollen for ulike typer prøver. For eksempel er Fast-ATAC designet for å analysere blodcelleprøver11, Omni-ATAC er en optimalisert protokoll for frosne vevsprøver 12, og MiniATAC-seq er effektiv for embryoanalyse på tidlig stadium13. Imidlertid er det fortsatt utfordrende å bruke ATAC-seq-metoden på adipocytter, spesielt fra vevsprøver. I tillegg til heterogeniteten i fettvev, kan dets høye lipidinnhold forstyrre effektive rekombinasjonsreaksjoner ved Tn5-transposase selv etter kjerneisolering. Videre forårsaker det høye mitokondrieinnholdet i adipocytter, spesielt i brune og beige adipocytter, høy mitokondriell DNA-forurensning og bortkastet sekvensering. Denne artikkelen beskriver en protokoll for adipocyttspesifikk ATAC-seq ved bruk av Adipoq-NuTRAP-mus (figur 1). Ved å dra nytte av fluorescensmerket kjernesortering, tillater denne protokollen innsamling av rene populasjoner av adipocytkjerner vekk fra andre forvirrende celletyper og effektiv fjerning av lipider, mitokondrier og vevsrester. Derfor kan denne protokollen generere celletypespesifikke data av høy kvalitet og minimere avfall fra mitokondrielle avlesninger mens du bruker redusert mengde inngang og reagenser sammenlignet med standardprotokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrepleie og eksperimentering ble utført i henhold til prosedyrer godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Indiana University School of Medicine.
1. Forberedelser før forsøket begynner
- Vev forberedelse
- For merking av adipocyttkjerner, kryss NuTRAP-mus med adipocyttspesifikke adiponektin-Cre-linjer (Adipoq-Cre) for å generere Adipoq-NuTRAP-mus, som er hemizygote for både Adipoq-Cre og NuTRAP.
- Dissekere fettvevene av interesse fra Adipoq-NuTRAP-musene som beskrevet tidligere14.
- Knips ned vevet i flytende nitrogen, og oppbevar det ved −80 °C til bruk.
MERK: Hver fettpute kan lagres som en helhet, og det frosne vevet kan senere kuttes på tørris i mindre biter (~ 50 mg) for eksperimenter. Alternativt kan fettvevet kuttes, aliciseres og fryses i rør for lagring (~ 50 mg per rør). Frosne prøver får aldri tine etter frysing til bruk.
- Buffer forberedelse
MERK: Hold bufferne på is gjennom hele eksperimentet.- Forbered kjernepreparasjonsbuffer (NPB): 250 mM sukrose, 10 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2 og 0,1% NP40. Forbered 7 ml NPB per prøve. Tilsett fersk 100x proteasehemmercocktail (siste 1x), DTT (siste 1 mM) og Hoechst (siste 1 μg / ml) til NPB før bruk.
MERK: Det anbefales å tilberede fersk NPB, men den kan oppbevares ved 4 °C i opptil 1 måned. - Forbered 1x fosfatbufret saltvann med 0,1% NP-40 (PBS-N).
- Forbered kjernepreparasjonsbuffer (NPB): 250 mM sukrose, 10 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2 og 0,1% NP40. Forbered 7 ml NPB per prøve. Tilsett fersk 100x proteasehemmercocktail (siste 1x), DTT (siste 1 mM) og Hoechst (siste 1 μg / ml) til NPB før bruk.
2. Kjerne isolasjon
- Chill glass Dounce homogenisatorer, med ett glass Dounce per prøve, på is. Deretter tilsettes 7 ml av NPB-blandingen til hvert glass Dounce.
MERK: Det anbefales å bruke opptil åtte prøver i hvert eksperiment. Arbeid med mer enn åtte prøver vil forsinke alle trinnene betydelig, og det kan spesielt nedgradere kjernekvaliteten under sortering. - Sett det frosne fettvevet (50-100 mg) i glasset Dounce, og kutt det umiddelbart i noen mindre biter ved hjelp av en lang saks. Stroke 10x med en løs pestle for alle prøvene, og deretter 10x med en tett pestle.
MERK: Fettvev er mykt, så det bør være tilstrekkelig å kutte dem i noen små biter. For sjeldne prøver kan mindre stykker (10-20 mg) brukes, selv om det oppsamlede adipocytkjernenummeret kan variere. - Filtrer gjennom en 100 μm sil til et nytt 50 ml rør. Flytt de filtrerte homogenatene til et nytt 15 ml rør ved å helle. Spinn ved 200 × g i 10 minutter ved 4 °C i en svingbøtte-sentrifuge. Fjern supernatanten så mye som mulig.
MERK: Aspirer først med vakuum, og fjern deretter det gjenværende volumet ved å bruke en mikropipette. - Resuspender pelleten i 500 μL PBS-N ved forsiktig, men grundig fingertapping.
MERK: Unngå pipettering, da dette kan skade kjernene. - Filtrer gjennom en 40 μm sil inn i et nytt 50 ml rør ved hjelp av skånsom pipettering. Skyll silen med 250 μL PBS-N. Overfør den filtrerte kjernefysiske resuspensjonen til et fluorescensaktivert cellesorteringsrør (FACS) ved hjelp av en mikropipette.
MERK: Hvis tilgjengelig, kan rør og cellesiler brukes til mindre volumer for å minimere prøvetap.
3. Kjerne sortering
- Forberedelse av oppsamlingsrør
- Tilsett 500 μL PBS-N til nye 1,5 ml rør, og inverter noen ganger for å fukte alle indre overflater med bufferen.
- Spinn rørene kort for å få ned all væsken, og avkjøl dem deretter på is til sortering.
- FACS (figur 2)
- Bruk FSC-A/FSC-H gating for singleter og FSC-A/SSC-A for fjerning av lite eller stort avfall.
- Port for mCherry/GFP-positive adipocyttkjernepopulasjonen.
- Samle 10 000 kjerner i hvert av oppsamlingsrørene som er utarbeidet i trinn 3.1.
- Klargjøring av kjerne etter sortering
- Tilsett 500 μL PBS-N til hvert oppsamlingsrør, og inverter noen ganger for å blande.
- Spinn oppsamlingsrørene ved 200 × g i 10 minutter ved 4 °C i en svingbøtte-sentrifuge. Fjern supernatanten helt.
MERK: Bruk først vakuum for å fjerne bobler, hell av supernatanten og bruk papirservietter for å fjerne den gjenværende væsken helt. Pelleten er usynlig på dette punktet. Klargjør Tn5-hovedblandingen under sentrifugeringstrinnet som beskrevet nedenfor.
4. Tn5-tagging (tabell 1)
- For å forberede 25 μL Tn5-masterblanding, bland 12,5 μL 2x tagmentasjons-DNA-buffer (TD-buffer), 1,25 μL Tn5-transposase (TDE I-enzym) og 11,25 μL nukleasefritt vann.
- Tilsett 25 μL Tn5-hovedblanding til hver kjernepellet, og resuspender ved forsiktig pipettering. Inkuber ved 600 o / min i 30 minutter ved 37 °C ved hjelp av en termomikser.
5. DNA-rensing
MERK: Følgende fremgangsmåte bruker PCR-rensesettet som er nevnt i materialfortegnelsen. Eventuelle andre lignende DNA-rensingsmetoder kan brukes.
- Tilsett 25 μL nukleasefritt vann til 25 μL av blandingen av Tn5-kjerneresuspensjon oppnådd etter trinn 4.2. Det endelige volumet er 50 μL per prøve.
- Tilsett 250 μL buffer PB.
- Tilsett 5 μL 3 M natriumacetat (NaOAc) (pH 5,2).
- Overfør blandingen til en kolonne (følger med det refererte settet), og sentrifuge ved 17 900 × g i 1 min ved romtemperatur (RT).
- Forkast gjennomstrømningen, og plasser spinnkolonnen tilbake i samme oppsamlingsrør. Tilsett 750 μL buffer PE inneholdende absolutt etanol (EtOH), og sentrifuge ved 17 900 × g i 1 min ved RT.
- Forkast gjennomstrømningen, og plasser spinnkolonnen tilbake i samme oppsamlingsrør. Sentrifuge ved 17 900 × g i 1 min ved RT, og kast oppsamlingsrøret med gjennomstrømningen.
- For å eluere DNA-fragmentene, utstyr kolonnen med et nytt 1,5 ml rør, tilsett 10 μL buffer EB, og la det stå ved RT i 3 minutter. Sentrifuge ved 17 900 × g i 1 min ved RT.
MERK: Prøvene kan oppbevares ved 4 °C i dager eller ved -20 °C i uker.
6. PCR-amplifikasjon (tabell 2)
MERK: Primerne som ble brukt i denne studien er listet opp i tabell 3.
- For å amplifisere transponerte DNA-fragmenter, klargjør PCR-masterblanding uten å legge til en unik Ad2.n-strekkodingsprimer (primer #2). Bruk 38 μL av PCR-masterblandingen per prøve: 11 μL nukleasefritt vann, 2 μL 25 μM Ad1_noMX primer (primer #1) og 25 μL 2x PCR Master Mix.
- Tilsett 38 μL av PCR-masterblandingen i et 0,2 ml PCR-rør.
- Legg til 10 μL av de eluerte DNA-fragmentene fra trinn 5.7.
- Tilsett 2 μL med 25 μM primer #2, som må være spesifikk for hver prøve.
- Kjør PCR i henhold til sykkelforholdene angitt i tabell 2.
7. Sanntids kvantitativ PCR (qPCR) test (tabell 4)
MERK: Dette trinnet tar sikte på å bestemme de ekstra syklusene som trengs for å amplifisere DNA. Det er valgfritt, men anbefales på det sterkeste, spesielt for nye eksperimenter.
- Forbered qPCR-masterblanding uten å tilsette primer #2. Bruk 9,975 μL av qPCR-masterblandingen per prøve: 4,41 μL nukleasefritt vann, 0,25 μL 25 μM primer #1, 5 μL 2x PCR Master Mix og 0,09 μL 100x SYBR Green I.
MERK: For å tilberede 100x SYBR Green I, fortynn 10 000x lageret med nukleasefritt vann. Siden volumet på 100x SYBR Green som jeg brukte til qPCR-masterblandingen er ubetydelig, er det lettere å lage en ekstra masterblanding av fortynnet 100x SYBR Green I (f.eks. for 8-10 prøver). - Tilsett 9,975 μL av qPCR-masterblandingen i hver brønn på en qPCR-plate.
- Tilsett 0,25 μL 25 μM primer #2 i hver brønn.
MERK: Sørg for å legge til samme primer # 2 for å matche det som ble lagt til hver enkelt prøve i trinn 6.4. - Tilsett 5 μL av PCR-reaksjonen oppnådd etter PCR-amplifikasjonen i trinn 6.5, og bland ved pipettering.
MERK: De resterende 45 μL av PCR-reaksjonen vil bli brukt til den andre PCR-amplifikasjonen. - Kjør qPCR i henhold til sykkelforholdene angitt i tabell 5.
- Kontroller amplifikasjonskurvene, og identifiser antall ekstra PCR-sykluser som trengs ved å estimere antall sykluser som nådde ~ 35% av maksimumet (figur 3A).
MERK: Vanligvis krever 10 000 kjerner fem til åtte ekstra PCR-sykluser.
8. Ytterligere PCR-forsterkning
- Kjør PCR med alle de resterende 45 μL av PCR-reaksjonen i henhold til beregningene fra trinn 7.6 (tabell 6).
MERK: Hver prøve kan kreve et forskjellig antall forsterkningssykluser.
9. Andre DNA-rensing ved bruk av PCR-rensesettet
- Bruk samme prosedyrer som i avsnitt 5, men eluer de amplifiserte DNA-fragmentene med 20 μL buffer EB.
10. Valg av DNA-fragmentstørrelse
MERK: Bruk faste fase reversible immobiliseringsperler, som beskrevet nedenfor. Eventuelle andre lignende DNA-renseperler kan brukes i henhold til produsentens instruksjoner. SPRI-dråpesuspensjonen skal resuspenderes fullstendig og likevektes ved RT med rotasjon før bruk.
- Overfør det eluerte DNA til et nytt PCR-rør, og tilsett 80 μL buffer EB for å lage et endelig volum på 100 μL.
- Tilsett 55 μL SPRI-perler (0,55x prøvevolum), og bland med pipettering. Inkuber i 5 min ved RT, og skill deretter på et minimagnetisk stativ for PCR 8-rørsstrimler i 5 minutter.
- Overfør 150 mikrol av supernatanten til et nytt PCR-rør. Tilsett 95 μL SPRI-perler, og bland med pipettering.
MERK: Supernatanten inneholder DNA på ca. 500 bp eller mindre. - Inkuber i 5 min ved RT, og skill deretter på minimagnetstativet i 5 minutter. Kast supernatanten forsiktig.
- Vask perlene i 1 min med 200 μL 70% EtOH. Gjenta to ganger i tre vasker totalt.
NOTAT: Ikke flytt PCR-rør fra magnetstativet under vask. - Etter den siste vasken, spinn ned rørene ved 1000 × g i 1 min, og piper ut den gjenværende EtOH. Tørk pelleten med lokket åpent ved 37 °C i 2 min på en PCR-maskin.
NOTAT: Perlepellets skal bare vise noen mindre sprekker når de er tørket. Unngå overtørking. - Resuspender pelleten med 20 μL buffer EB ved pipettering, og inkuber i 5 minutter ved RT. Separer på det magnetiske ministativet i 5 minutter, og overfør deretter 18 μL av supernatanten som inneholder det endelige biblioteket til et nytt 1,5 ml rør.
MERK: Biblioteket kan oppbevares ved -20 °C mens du utfører en kvalitetskontroll.
11. DNA-kvantifisering ved hjelp av et fluorometer
- For å forberede hovedblandingen, fortynn 200x dsDNA High Sensitivity (HS) reagens med dsDNA HS-buffer til en endelig konsentrasjon på 1x.
- For standarder, tilsett 190 μL av 1x masterblandingen og 10 μL standard 1 eller standard 2 til et fluorometerrør.
MERK: Balanser standardene på RT i mørket før du starter kvantifiseringen. - For bibliotekprøvene, tilsett 198 μL av 1x masterblandingen og 2 μL av hver prøve til et separat fluorometerrør.
MERK: Hvis prøvemengdene er begrenset, kan prøvevolumet reduseres til 1 μL, og 1x hovedblandingsvolumet kan økes til 199 μL. - Virvel eller rist fluorometerrørene, og la dem sitte i 5 min ved RT i mørket. Mål DNA-konsentrasjonen ved hjelp av dsDNA HS-analysen av fluorometeret.
12. Kvalitetskontroll av bibliotek med elektroforesesystemer med høy følsomhet
- Ta ATAC-seq-biblioteket, og fortynn med nukleasefritt vann til en endelig konsentrasjon på 1-5 ng / μL.
- Analyser størrelsesfordelingen av ATAC-seq-bibliotekene ved hjelp av høysensitive, automatiserte elektroforesesystemer etter produsentens protokoller.
13. Kvalitetskontroll av ATAC-seq-biblioteket ved hjelp av målrettet qPCR
- Ta 5-10 ng av ATAC-seq-biblioteket, og fortynn med 50 μL nukleasefritt vann.
- Kjør qPCR ved hjelp av primere rettet mot promotorer og forsterkere som er kjent for å være aktive i adipocytter i henhold til syklingsforholdene angitt i tabell 7.
- Bruk negative kontrollprimere rettet mot lukkede/stille genomiske regioner (tabell 7).
- Beregn anrikningen av promotoren/forsterkerne over de negative kontrollene (tabell 8).
MERK: Det forventes å se ≥10-20 ganger anrikninger med vellykkede prøver.
14. Sekvens av handlinger
- Send inn ATAC-seq-bibliotekene for sekvensering. Bruk sekvensering av den sammenkoblede enden (2 x 34 bp, 2 x 50 bp eller lenger) med gjennomsnittlige lesetall på 10–30 millioner avlesninger per prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å analysere fettvev ved hjelp av denne ATAC-seq-protokollen, genererte vi Adipoq-NuTRAP-mus som ble matet chow-dietter; Deretter isolerte vi adipocyttkjerner fra epididymalt hvitt fettvev (eWAT), inguinalt hvitt fettvev (iWAT) og brunt fettvev (BAT) ved hjelp av flowcytometri. De isolerte kjernene ble brukt til tagning, etterfulgt av DNA-rensing, PCR-amplifikasjon, kvalitetskontrolltrinn, sekvensering og dataanalyse, som beskrevet ovenfor. Formålet med dette representative eksperimentet var å profilere kromatintilgjengeligheten til rene adipocyttpopulasjoner isolert fra forskjellige fettdepoter.
Vi observerte at de mCherry-merkede og GFP-merkede adipocyttkjernene tydelig kunne skilles fra kjernene til andre celletyper isolert fra fettvevet til en Adipoq-NuTRAP-mus ved hjelp av flowcytometri (figur 2A-C). Det var forskjeller i adipocyttfraksjonene avhengig av type fettdepot: ~50 % i eWAT, ~30 % i iWAT og ~65 % i BAT (figur 2D)7. Vi samlet 10 000 kjerner innen 2-10 minutter per prøve og brukte dem til ATAC-seq-prosedyrene. Vi kjørte totalt 10-13 PCR-sykluser (fem sykluser av den første PCR og fem til åtte sykluser av den andre PCR, figur 3A). Hvis prøvene krever mer enn totalt 15 PCR-sykluser, kan dette indikere prøver av lav kvalitet (figur 3B). Størrelsesfordelingsanalysen av ATAC-seq-bibliotekene viste flere topper som tilsvarer nukleosomfri region (NFR) og mono-, di- og multinukleosomer (figur 4A-C), med gjennomsnittlige størrelser på ~ 500-800 bp. Prøver av dårlig kvalitet viste vanligvis mest NFR med ingen eller få nukleosomale topper (figur 4D). Kvalitetskontrolltestene ved qRT-PCR-analysen viste 10-20 ganger anrikninger med de positive genomiske elementene nær adipocyttmarkørgener som Adipoq, Fabp4, Plin1 og Pnpla2, mens ingen anrikning ble vist med den negative kontrollen (figur 5). Vi observerte også anrikning med det termogene genet Ucp1 spesifikt i BAT, men ikke i eWAT eller iWAT (figur 5).
Etter sekvenseringen og analysen identifiserte vi ~55 000 topper kombinert fra tre forskjellige fettdepoter (eWAT, iWAT og BAT). Mitokondrieavlesningene var <2%, og fraksjonen under toppene var ~ 18% -44% (figur 6A, B). Prøver av dårlig kvalitet kan ha betydelig høyere mitokondrieavlesninger og/eller en lavere andel avlesninger i toppområdene. Visuell inspeksjon av ATAC-seq-biblioteksporene avslørte flere sterke topper med høye signal-støy-forhold nær adipocyttmarkørgener, som Adipoq, Plin1 og Fabp4, fra alle fettdepotene (figur 7A-C). Vi observerte også sterke ATAC-seq-topper ved den brune adipocyttprodusenten Ucp1-lokus i BAT-prøven, men disse toppene ble ikke observert i eWAT- eller iWAT-prøvene (figur 7D). Alle disse dataene indikerer vellykkede ATAC-seq-data generert fra adipocytkjerner.
Figur 1: Skjematisk flytskjema over adipocyttspesifikk ATAC-seq ved bruk av NuTRAP-mus. Trinnene som er unike for denne protokollen, er uthevet i de røde skyggelagte boksene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representativ FACS-gating som illustrerer isolering av mCherry/GFP-merkede adipocyttkjerner fra fettvevet til en Adipoq-NuTRAP-mus. (AC) Flowcytometrianalyse av isolerte kjerner fra eWAT, iWAT og BAT av en Adipoq-NuTRAP-mus. (D) Kvantitativ analyse av kjerner fra adipocytter og ikke-adipocytter i eWAT, iWAT og BAT av en Adipoq-NuTRAP-mus. Data er gjennomsnittlige ± SEM (n = 3). Disse kjernetellingsdataene er fra Roh et al.7. Forkortelser: FACS = fluorescensaktivert cellesortering; GFP = grønt fluorescerende protein; eWAT = epididymalt hvitt fettvev; iWAT = inguinal hvitt fettvev; BAT = brunt fettvev; NuTRAP = kjernefysisk merking og oversettelse av ribosomaffinitetsrensing; Adipoq-NuTRAP = NuTRAP mus krysset med adipocytt-spesifikk adiponektin-Cre linje; FSC-A = fremover scatter-peak område; FSC-H = fremover scatter-peak høyde; SSC-A = side scatter-peak område; FITC-A = fluorescein isotiocyanat-toppområde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative amplifikasjonskurver fra qRT-PCR . (A) Prøve av god kvalitet som trenger syv ekstra forsterkningssykluser. (B) Prøve av dårlig kvalitet som trenger ≥15 ekstra sykluser. Forkortelse: qRT-PCR = kvantitativ revers transkripsjon PCR. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Størrelsesfordelingsprofiler for ATAC-seq-bibliotekene. (A-C) Biblioteker av god kvalitet og (D) av dårlig kvalitet vises som representative resultater. Forkortelser: ATAC-seq = analyse for transposase-tilgjengelig kromatin med høy gjennomstrømningssekvensering; FU = fluorescens enheter; bp = basepar; NFR = nukleosomfri region; eWAT = epididymalt hvitt fettvev; iWAT = inguinal hvitt fettvev; BAT = brunt fettvev. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Kvalitetskontroll qPCR-analyse av ATAC-seq-bibliotekene. Anrikninger for promotorer og forsterkere nær de generelle adipocyttmarkørene Adipoq, Fabp4, Plin1 og Pnpla2 eller den brune adipocyttmarkøren Ucp1. Forkortelser: ATAC-seq = analyse for transposase-tilgjengelig kromatin med høy gjennomstrømningssekvensering; NC = negativ kontroll; eWAT = epididymalt hvitt fettvev; iWAT = inguinal hvitt fettvev; BAT = brunt fettvev. Data er gjennomsnittlige ± SEM (n = 2). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Mitokondrier leser og brøker under toppene i ATAC-seq-bibliotekene. (A) Mitokondrier leser (%) og (B) fraksjoner under toppene (%) fra eWAT, iWAT og BAT. Forkortelser: ATAC-seq = analyse for transposase-tilgjengelig kromatin med høy gjennomstrømningssekvensering; eWAT = epididymalt hvitt fettvev; iWAT = inguinal hvitt fettvev; BAT = brunt fettvev. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: ATAC-seq signalspor på stedet av representative gener. (A-C) Generelle adipocyttmarkørgener. (B) Brun adipocytt-spesifikk markør. Forkortelser: ATAC-seq = analyse for transposase-tilgjengelig kromatin med høy gjennomstrømningssekvensering; eWAT = epididymalt hvitt fettvev; iWAT = inguinal hvitt fettvev; BAT = brunt fettvev. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Komponenter i Tn5-masterblandingen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Komponenter i PCR-masterblandingen og initiale PCR-syklusforhold. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 3: Liste over strekkodede primere for PCR-amplifikasjon. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 4: Komponenter i qPCR-masterblandingen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 5: qPCR sykkelforhold. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 6: Andre PCR-syklusbetingelser for ytterligere forsterkning. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 7: Primersekvenser og målrettede qPCR-syklingsforhold for kvalitetskontroll av ATAC-seq-biblioteket. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 8: Analyse av qPCR-resultatene for kvalitetskontrollen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikkelen har vi presentert en optimalisert ATAC-seq-protokoll for å vurdere adipocyttspesifikk kromatintilgjengelighet in vivo. Denne ATAC-seq-protokollen ved hjelp av Adipoq-NuTRAP-musen genererte vellykket adipocyttspesifikke kromatintilgjengelighetsprofiler. Den mest kritiske faktoren for vellykkede og reproduserbare ATAC-seq-eksperimenter er kjernekvalitet. Det er viktig å knipsefryse de dissekerte fettvevene umiddelbart i flytende nitrogen og oppbevare dem trygt ved -80 °C uten å tine før bruk. Det er også viktig å forhindre skade på adipocytter under isolering og sortering av kjernen. Prøvene må håndteres skånsomt via sentrifugering ved lav hastighet og minimal pipettering under hele prosessen med kjerneisolering.
Forsiktig gating under kjernesortering er avgjørende for selektivt å isolere mCherry/GFP-merkede adipocyttkjerner (figur 1). Det er viktig å sikre et klart skille mellom mCherry/GFP-positive og negative populasjoner. På samme måte er skånsom håndtering og rask sortering nødvendig for å bevare kromatinets natur i kjernene. Hvis fluorescensen er svak, sorteringen tar for lang tid, og / eller adipocytfraksjonene er utenfor de forventede områdene, indikerer dette at det kan være problemer med prøvene eller problemer under kjerneisolasjonsprosedyrene. Denne protokollen kan endres avhengig av eksperimentelle forhold. For det første kan antall kjerner som kreves for ATAC-seq gå ned til 1000 eller opptil 100 000. Hvis det er mindre enn 5000 kjerner, vil bruk av et ytterligere redusert volum (0,6 μL) av TDE I-enzymet forhindre overtagelse. For antall kjerner lik eller høyere enn 50 000, kan volumet av Tn5-masterblandingen dobles til 50 μL, som er det samme volumet som ble brukt i den opprinnelige protokollen10.
For det andre kan andre kjernemerkingssystemer, som INTACT (isolering av kjerner merket i spesifikke celletyper) mus, brukes i stedet for NuTRAP-mus16. Som intakte mus uttrykker GFP-merket SUN1 kjernemembranprotein, kan GFP-merkede kjerner isoleres ved sortering og brukes til ATAC-seq ved å bruke de samme metodene beskrevet i denne protokollen. Eventuelle andre kjernefysiske merkingsmetoder kan også vedtas. Til slutt kan in vitro-dyrkede adipocytter også brukes til ATAC-seq etter denne protokollen. For dette skrapes celler dyrket på tallerkener/tallerkener, samles inn ved hjelp av NPB, og underkastes deretter de samme nedstrømsprosedyrene - bortsett fra at sortering kun skal gjøres basert på størrelse, kompleksitet og Hoechst, ikke mCherry/GFP som beskrevet tidligere15.
Denne adipocytterspesifikke ATAC-seq-protokollen ved hjelp av NuTRAP-teknikken utgjør en begrensning, da den ikke fungerer uten fluorescerende merking; Dermed vil analyse av menneskelige prøver ikke fungere med denne teknikken. Imidlertid er det fortsatt mulig å utføre ATAC-seq med adipocytter isolert ved vevsfordøyelse og flotasjonsmetoder. Det skal bemerkes at arbeid med humane floateradipocytter har noen begrensninger, for eksempel forurensning av andre celletyper ved bruk av lavhastighets sentrifugering og tap av store adipocytter ved bruk av sentrifugering med høyere hastighet. Denne protokollen kan brukes på alle celletyper som spesifikke Cre-linjer er tilgjengelige for, noe som muliggjør effektiv celletypespesifikk kromatinprofilering selv med begrensede celleinnganger17. Avslutningsvis vil denne forbedrede ATAC-seq-protokollen være nyttig for forskere som ønsker å evaluere kromatintilgjengelighet fra spesifikke celletyper i heterogene vev ex vivo, i tillegg til adipocytter vi diskuterte her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen relevante eller vesentlige økonomiske interesser knyttet til forskningen beskrevet i denne artikkelen.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av IUSM Showalter Research Trust Fund (til HCR), et IUSM Center for Diabetes and Metabolic Diseases Pilot and Feasibility grant (til HCR), National Institute of Diabetes og fordøyelses- og nyresykdommer (R01DK129289 til HCR), og American Diabetes Association Junior Faculty Award (7-21-JDF-056 til HCR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Adiponectin-Cre mouse | The Jackson Laboratory | 28020 | |
| NuTRAP mouse | The Jackson Laboratory | 29899 | |
| Reagents & Materials | |||
| 1.5 mL DNA-LoBind tubes | Eppendorf | 86-923 | |
| 100 µm cell strainer | Falcon | 352-360 | |
| 15 mL tubes | VWR | 525-1071 | |
| 2x TD buffer | Illumina | 15027866 | |
| 384-well PCR plate | Applied biosystem | 4483285 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352-340 | |
| 50 mL tubes | VWR | 525-1077 | |
| AMPure XP reagent (SPRI beads) | Beckman Coulter | A63881 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Clear adhesive film | Applied biosystem | 4306311 | |
| DNase/RNase-free distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Dounce tissue grinder | DWK Life Sciences | 357542 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| DynaMag-96 side skirted magnet | Thermo Fishers | 12027 | |
| FACS tubes | Falcon | 28719128 | |
| HEPES | Boston BioProducts | BBH-75 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 2134015 | |
| KCl (2 M) | Boston BioProducts | MT-252 | |
| Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips | EpiCypher | 10-0008 | |
| MgCl2 (1 M) | Boston BioProducts | MT-200 | |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix | BioLabs | M0541S | |
| NP40 | Thermo Fishers | 28324 | |
| PCR 8-tube strip | USA scientific | 1402-4708 | |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fishers | 78439 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Sucrose | Sigma | S0389-1KG | |
| SYBR Green I (10,000x) | Invitrogen | S7563 | |
| TDE I enzyme | Illumina | 15027865 | |
| Instruments | |||
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACSAria Fusion | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | |
| Real-Time PCR system | Thermo Fishers | QuantStudio?5 |
References
- Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).
- Farmer, S. R.
- Bielczyk-Maczynska, E. White adipocyte plasticity in physiology and disease. Cells. 8 (12), 1507 (2019).
- Basu, U., Romao, J. M., Guan, L. L. Adipogenic transcriptome profiling using high throughput technologies. Journal of Genomics. 1, 22-28 (2013).
- Esteve Rafols, M. Adipose tissue: Cell heterogeneity and functional diversity. Endocrinologia y Nutricion. 61 (2), 100-112 (2014).
- Kwok, K. H., Lam, K. S., Xu, A. Heterogeneity of white adipose tissue: Molecular basis and clinical implications. Experimental and Molecular Medicine. 48, e215 (2016).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Roh, H. C., et al. Adipocytes fail to maintain cellular identity during obesity due to reduced PPARγ activity and elevated TGFβ-SMAD signaling. Molecular Metabolism. 42, 101086 (2020).
- Roh, H. C., et al. Warming induces significant reprogramming of beige, but not brown, adipocyte cellular identity. Cellular Metabolism. 27 (5), 1121.e5-1137.e5 (2018).
- Buenrostro, J. D., et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Wu, J., et al. Chromatin analysis in human early development reveals epigenetic transition during ZGA. Nature. 557 (7704), 256-260 (2018).
- Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and dissection of diverse mouse adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
- So, J., et al. Chronic cAMP activation induces adipocyte browning through discordant biphasic remodeling of transcriptome and chromatin accessibility. Molecular Metabolism. 66, 101619 (2022).
- Loft, A., Herzig, S., Schmidt, S. F. Purification of GFP-tagged nuclei from frozen livers of INTACT mice for RNA- and ATAC-sequencing. STAR Protocols. 2 (3), 100805 (2021).
- Heyward, F. D., et al. Integrated genomic analysis of AgRP neurons reveals that IRF3 regulates leptin's hunger-suppressing effects. bioRxiv. , (2022).
