4 전사 인자와 마우스 배아 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성, Doxycycline는 Lentiviral 전달 시스템 Inducible

안녕하세요, 제 이름은 브래드 해밀턴입니다. 저는 STEM Gen의 연구 개발 부서에서 일하고 있습니다. 오늘은 마우스 배아 섬유아세포에서 유도 만능 줄기 세포를 생성하는 절차를 보여드리겠습니다.

이 절차는 유도 만능 줄기 세포를 생성하고 재프로그래밍 과정을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 시작하겠습니다. 먼저 쥐의 배아 섬유아세포 또는 필로폰 세포를 15cm 젤라틴으로 코팅된 접시에 접시당 5번째 세포의 4배10의 4배의 밀도로 파종합니다.

이제 30 밀리리터의 필로폰 성장 배지를 추가하고 약 80 % 융합 될 때까지 섭씨 37 도에서 5 % 이산화탄소에서 이틀 동안 세포를 배양합니다. 완료되면 배양은 배지를 흡인하고 30ml의 성장을 추가합니다. 농축된 렌티바이러스가 보충된 배지.

매체가 고르게 분포되도록 접시를 부드럽게 흔듭니다. 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 세포를 배양하고 5%의 이산화탄소를 주입하고 바이러스 형질주입을 완료합니다. 독시사이클린 유도 재프로그래밍으로 넘어가겠습니다.

20-24시간 후에 재프로그래밍을 시작하기 위해 형질도입 후 트립신은 형질도입된 세포를 200Gs에서 5분 동안 원심분리합니다. 다음으로, 세포 펠릿에서 배지를 조심스럽게 흡인하고 성장 배지에서 세포를 재현탁시킵니다. 현탁된 종자가 생성되면 사용 중인 세포 배양 접시 크기에 적합한 농도로 형질주입된 mes를 사용할 수 있습니다.

여기에서는 재프로그래밍 효율 실험 및 IPS 콜로니 분리를 위해 10cm 접시당 2.5배 10에서 5번째 세포를 사용하고, 면역화학 실험을 위해 4개의 웰 플레이트에서 웰당 2배 10에서 4번째 세포를 사용합니다. transduction efficiency를 모니터링하려면 섭씨 37도의 온도와 5%의 이산화탄소에서 밤새 세포를 배양합니다. 이 단계에서 필요한 경우 향후 분석을 위해 세포를 액체 질소에 동결할 수 있습니다.

다음 날, 배지를 흡인하고 독시사이클린이 보충된 새로운 성장 배지로 최종 농도가 밀리리터당 2마이크로그램이 되도록 교체합니다. 우리는 독시사이클린이 없는 매체를 포함하는 음성 대조군을 포함합니다. 마지막으로 섭씨 37도와 이산화탄소 5%에서 세포를 배양합니다.

우리는 재프로그래밍 프로세스를 시작했습니다. 일반적으로. 만능 줄기 세포 군집은 16일에서 22일 후에 격리할 수 있을 만큼 충분히 커집니다.

이 절차를 시연하기 전에 먼저 화학을 사용하여 형질 도입 효율을 검증하여 형질 도입 효율을 확인해야 합니다. 면역화학 검사는 독시사이클린 유도 후 48시간 후에 4개의 웰 플레이트에 재도금된 세포에 대해 수행됩니다. 이 프로토콜에 나열된 모든 부피는 세포 배양 플레이트 크기에 따라 조정해야 하며 먼저 세포를 부드럽게 세척하는 것으로 시작합니다.

PBS에 마그네슘 또는 칼슘 이온이 포함되어 있지 않으면 PBS에 500 마이크로 리터의 4 % 파라 폼 알데히드로 세포를 15 분 동안 고정합니다. 실온에서 PBS로 세포를 다시 부드럽게 두 번 세척합니다. 다음으로, PBS 인큐베이트에 500마이크로리터의 얼음처럼 차가운 0.2%Tween 20을 첨가하여 실온에서 10분 동안 배양하여 세포를 퍼밍합니다.

세포를 두 번 더 씻은 후. 실온에서 1시간 동안 200마이크로리터의 차단 버퍼를 추가하여 비특이적 항체 결합을 차단합니다. 이제 원하는 1차 항체 200마이크로리터를 추가합니다.

여기서는 다능성 마커 T 4K LF 4, SOX 2 및 cmic을 사용합니다. 다음날 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 세포를 배양합니다. PBS로 세포를 부드럽게 두 번 세척한 후 실온에서 1시간 동안 200마이크로리터의 2차 항체로 배양하여 플레이트를 빛으로부터 보호합니다.

여기에서는 배양 후 도립 형광 현미경을 사용하여 시각화를 위해 fluoro fours와 접합된 적절한 2차 항체를 사용하고 있습니다. 세포를 두 번 더 세척한 다음 DPI를 추가하고 10분 동안 다시 배양하여 핵을 시각화합니다. 마지막으로, 마지막 세척 후 antifa aqua mount를 추가한 후 도립 형광 현미경으로 세포를 이미징하기 전에 transduction efficiency를 확인합니다.

만능 줄기 세포의 분리 및 확장을 시작합니다. 재프로그래밍 프로세스를 시작한 후 매일 배양을 모니터링하고 48시간마다 적절한 배지를 교체합니다. 우리는 독시사이클린이 보충된 배지를 사용하여 처음 12일 동안 세포를 배양한 다음 배지에서 독시사이클린을 제거합니다.

확장을 위해 수동으로 선택한 유도 만능 줄기 세포 또는 IPS 콜로니는 독시사이클린입니다. 독립 세포는 재프로그래밍 과정을 나타내는 형태학적 변화에 대해 매일 모니터링해야 합니다. 각 실험은 다르지만, 콜로니는 일반적으로 콜로니를 분리하고 트립신을 재프로그래밍하는 과정을 시작하기 전날 DS 유도 후 16일에서 22일 사이에 분리할 수 있을 만큼 충분히 큽니다.

웰당 4번째 세포에 10의 5배 밀도로 감마선 조사된 메트의 피더 층을 파종하여 24웰 플레이트를 준비합니다. 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 밤새 배양합니다. 다음 날, 각 IPS 콜로니와 트립스를 수동으로 선택하여 세포 응집체를 해리하고, 마우스 배아 줄기 세포 배지의 IPS 세포를 회수하고, 앞선 24개의 웰 플레이트의 개별 웰에서 세포를 배양하고, 섭씨 37도와 5%의 이산화탄소에서 세포를 배양합니다.

24시간마다 미디어를 교체합니다. 성장 및 GFP 형광에 대해 IPS 콜로니를 매일 모니터링합니다. 우리는 다능성 분석을 위해 4개의 웰 플레이트로 포장하기 전에 6일 동안 배양을 배양했습니다.

24개의 휠 플레이트 중 어느 웰이 균일하게 발현되는지 확인합니다.GFP 발현이 양호한 웰은 트립, 인사이징 및 1-8개의 웰 플레이트로 통과할 수 있으며, 그 앞에 mes의 감마선 피더 층이 선행됩니다. 그런 다음 이 플레이트를 다능성에 대한 ICC 분석에 사용하여 다능성 분석을 시작할 수 있습니다. 마그네슘이나 칼슘 이온이 포함되지 않은 PBS로 세포를 두 번 부드럽게 씻습니다.

PBS에서 20 사이에 얼음처럼 차가운 0.2 % 웰 당 0.5 밀리리터를 추가하고 10 분 동안 세포를 배양합니다. PBS 블록을 3회 더 세척한 후 실온에서 1시간 동안 200마이크로리터의 차단 버퍼로 비특이적 결합. 이제 원하는 1차 항체 200마이크로리터를 추가합니다.

여기서 우리는 SSEA 1 nanog와 OCT four를 사용하여 섭씨 4도에서 밤새 세포를 배양했습니다. 세포를 부드럽게 두 번 씻은 후 200마이크로리터의 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 배양하여 빛을 피하십시오. 여기서 우리는 시각화를 위해 형광력으로 접합된 적절한 2차 항체를 사용하고, 또 두 번 세척한 후 도립 형광 현미경을 사용하여 DPI를 추가하고 10분 동안 세포를 배양합니다.

이제 최종 세척 후 도립 형광 현미경으로 세포를 이미징하기 전에 antifa aqua mount를 추가합니다. IPS 콜로니는 또한 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 알칼리성 인산가수분해효소 활성을 분석할 수 있습니다. Stem Gent Docs 유도성 마우스 TF 렌티바이러스 세트는 전사 인자의 MES 발현을 형질도입한 후 MES를 IPS 세포로 재프로그래밍하는 데 사용할 수 있습니다.

T 4, SOX 2, KLF 4 및 seic은 독시사이클린으로 처리된 세포에서 검출될 수 있지만 처리되지 않은 세포에서는 발현이 거의 또는 전혀 검출되지 않습니다. 형태학적 변화는 시간이 지남에 따라 진행되어 정의된 콜로니 가장자리와 3차원 성장을 가진 더 크고 더 많은 ES 세포 같은 콜로니를 생성합니다. docs가 제거되면 일부 ES 세포 유사 콜로니에 대한 세포 형태가 눈에 띄게 회귀합니다.

그러나 많은 군체는 IPS 형태를 유지했습니다. 이러한 IPS 군체는 선택되고 통과할 때 표시됩니다. 알칼리성 포스파타제, 나노 T 4 및 SSEA 1의 일반적인 다능성 마커 발현.

이 실험에 사용된 필로폰 세포의 유형은 내인성 잔혈 자리에서 GFP를 발현했습니다. 따라서 다능성 상태로 재프로그래밍할 때 GFP 발현은 성공적인 재프로그래밍을 위한 예비 지표로 사용할 수 있습니다. 방금 4개의 전사 인자인 독시사이클린 유도성 항바이러스 시스템을 사용하여 만능 줄기세포를 유도하기 위해 마우스 배아 섬유아세포의 재프로그래밍을 유도하는 방법을 보여드렸습니다.

이 절차를 수행할 때 재프로그래밍 실험을 설계할 때 재프로그래밍의 효율성을 최적화하기 위해 몇 가지 변수를 고려해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 먼저, 1차 감염 단계에서 활성 바이러스 대 표적 세포 비율을 수정하여 형질도입 효율을 높이거나 낮출 수 있으며, 이에 따라 표적 세포 집단 내 통합 바이러스의 수에 영향을 미칠 수 있습니다. 둘째, 셀이 문서에 노출되는 시간을 조정하면 생성되는 IPS 콜로니의 수에 영향을 줄 수 있습니다.

셋째, 표적 세포의 증식 능력은 활발하게 성장하고 분열하는 세포가 재프로그래밍에 더 적합하기 때문에 재프로그래밍에 영향을 미칠 수 있습니다. 마지막으로, 다른 세포 수 또는 다른 크기의 조직 배양 접시에 대한 프로토콜을 수정할 때 표적 세포 수를 배양 접시의 표면적에 비례하여 조정하는 것이 좋습니다. 그게 다야.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.