4 전사 인자와 마우스 배아 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성, Doxycycline는 Lentiviral 전달 시스템 Inducible

안녕하세요, 저는 STEM Gen의 연구 개발 부서에 근무하는 Brad Hamilton입니다. 오늘은 마우스 배아 섬유아세포로부터 유도만능줄기세포를 생성하는 절차를 보여드리겠습니다.

이 절차는 유도만능줄기세포를 생성하고 리프로그래밍 과정을 연구하는 데 모두 사용될 수 있습니다. 이제 시작하겠습니다. 먼저 마우스 배아 섬유아세포(MEF 세포)를 15 cm 젤라틴 코팅 디쉬에 디쉬당 4 × 10⁵ cells의 밀도로 분주하십시오.

이제 meth 성장 배지 30 milliliters를 첨가하고, 세포가 약 80%confluent가 될 때까지 37 degrees Celsius, 5%carbon dioxide 조건에서 이틀 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 배지를 흡입하여 제거하고, 고농도 렌티바이러스가 보충된 성장 배지 30 milliliters를 첨가합니다.

배지가 고르게 분포되도록 디쉬를 부드럽게 흔들어 줍니다. 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양하여 바이러스 형질전환을 완료합니다. 이제 doxycycline 유도 리프로그래밍 단계로 넘어가겠습니다.

리프로그래밍을 시작하기 위해, 형질도입 20~24시간 후에 트립신으로 형질도입된 세포를 떼어내고 200 Gs에서 5분 동안 원심분리합니다. 다음으로, 세포 펠릿 위의 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거하고 성장 배지로 세포를 재부유시킵니다. 부유가 완료되면, 사용하는 세포 배양 접시 크기에 적절한 농도로 형질도입된 세포를 접종합니다.

여기서는 리프로그래밍 효율 실험 및 IPS 콜로니 분리를 위해 10 cm 디쉬당 2.5 × 10⁵ 개의 세포를 사용하며, 면역화학 실험을 위해서는 4-웰 플레이트의 웰당 2 × 10⁴ 개의 세포를 사용합니다. 형질전환 효율을 모니터링하려면, 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 이 단계에서 필요한 경우, 향후 분석을 위해 세포를 액체 질소에 동결 보존할 수 있습니다.

다음 날, 배지를 흡입하여 제거하고 doxycycline이 최종 농도 2 µg/mL가 되도록 보충된 신선한 성장 배지로 교체합니다. doxycycline이 포함되지 않은 배지를 포함하는 음성 대조군을 설정합니다. 마지막으로 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양합니다.

리프로그래밍 과정을 시작했습니다. 일반적으로, 다능성 줄기세포 콜로니는 16일에서 22일 후에 분리할 수 있을 만큼 충분히 커집니다.

해당 절차를 시연하기 전에, 먼저 화학적 방법을 통해 형질전환 효율을 확인해야 합니다. 면역화학 테스트는 doxycycline 유도 48시간 후 4-웰 플레이트에 다시 분주한 세포를 대상으로 수행합니다. 본 프로토콜에 기재된 모든 부피는 세포 배양 플레이트 크기에 따라 조정해야 하며, 세포를 부드럽게 세척하는 것으로 시작합니다.

마그네슘 또는 칼슘 이온이 포함되지 않은 PBS로 세척한 후, PBS에 녹인 4%paraform aldehyde 500 µL로 15분 동안 세포를 고정합니다. 실온에서 PBS로 세포를 다시 두 번 부드럽게 세척합니다. 다음으로, 얼음처럼 차가운 0.2%Tween 20 in PBS 500 µL를 첨가하여 실온에서 10분 동안 배양함으로써 세포를 투과화합니다.

세포를 두 번 더 세척한 후, 비특이적 항체 결합을 차단하기 위해 블로킹 버퍼 200 µL를 넣고 상온에서 1시간 동안 반응시킵니다. 그다음 원하는 1차 항체 200 µL를 추가합니다.

여기서는 다능성 마커인 T 4K LF four, SOX two 및 cmic를 사용합니다. 세포를 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날, PBS로 세포를 부드럽게 두 번 세척한 후, 빛이 차단된 상태에서 실온의 2차 항체 200 µL와 함께 1시간 동안 배양하십시오.

여기서는 시각화를 위해 형광체가 결합된 적절한 2차 항체를 사용하며, 배양 후 도립 형광 현미경을 이용하여 관찰합니다. 세포를 두 번 더 세척한 다음, 핵을 시각화하기 위해 DPI를 첨가하고 10분 동안 다시 배양합니다. 마지막으로, 최종 세척 후 antifa aqua mount를 첨가하고 도립 형광 현미경으로 세포를 촬영하여 형질전환 효율을 결정합니다.

다능성 줄기세포의 분리 및 증식을 시작합니다. 리프로그래밍 과정을 시작한 후, 매일 배양 상태를 모니터링하고 48시간마다 적절한 배지로 교체합니다. 처음 12일 동안은 doxycycline이 첨가된 배지를 사용하여 세포를 배양하고, 이후 배지에서 doxycycline을 제거합니다.

확장을 위해 수동으로 픽킹한 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell) 또는 IPS 콜로니는 doxycycline입니다. 리프로그래밍 과정을 나타내는 형태학적 변화를 확인하기 위해 독립된 세포들을 매일 모니터링해야 합니다. 실험마다 차이가 있을 수 있으나, 일반적으로 DS 유도 후 16일에서 22일 사이에 콜로니가 분리가 가능할 만큼 충분히 커지며, 리프로그래밍된 콜로니를 분리하고 trypsin 처리하는 과정을 시작하기 전날에 이를 확인합니다.

감마선 조사된 MEF 피더 층을 웰당 5 × 10⁴ cells의 밀도로 분주하여 24-웰 플레이트를 준비합니다. 세포를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 각 iPS 콜로니를 수동으로 피킹하고 트립신 처리하여 세포 응집체를 해리시킵니다. 해리된 iPS 세포를 앞서 준비한 24-웰 플레이트의 개별 웰에 마우스 배아줄기세포 배지를 사용하여 분주하고, 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 배양합니다.

24시간마다 배지를 교체합니다. IPS 콜로니의 성장과 GFP 형광을 매일 모니터링합니다. 다능성 분석을 위해 4-well 플레이트에 분주하기 전까지 배양물을 6일 동안 배양하였습니다.

24 웰 플레이트에서 GFP가 균일하게 발현되는 웰을 결정합니다. GFP 발현이 우수한 웰은 트립신 처리하여 분리한 후, 감마선 조사된 mes 피더 세포 층이 미리 준비된 4 웰 플레이트에 1:8 비율로 계대 배양할 수 있습니다. 이 플레이트들은 다능성 분석을 시작하기 위한 다능성 ICC 분석에 사용할 수 있습니다. 마그네슘이나 칼슘 이온이 포함되지 않은 PBS로 세포를 조심스럽게 두 번 세척합니다.

웰당 0.5 milliliters의 얼음처럼 차가운 0.2%between 20 in PBS를 첨가하고 세포를 10분 동안 배양합니다. PBS로 3회 더 세척한 후, 200 microliters의 블로킹 버퍼를 사용하여 실온에서 1시간 동안 비특이적 결합을 차단합니다. 이제 원하는 1차 항체 200 microliters를 첨가합니다.

여기서는 SSEA-1, Nanog 및 OCT4를 사용하여 세포를 4 °C에서 하룻밤 동안 배양했습니다. 세포를 부드럽게 두 번 세척한 후, 빛을 차단한 상태에서 실온의 2차 항체 200 µL와 함께 1시간 동안 배양합니다. 시각화를 위해 Fluoroforce가 결합된 적절한 2차 항체를 사용하며, 두 번 더 세척한 후 도립 형광 현미경을 사용하여 관찰하고, DPI를 첨가하여 세포를 10분 동안 배양합니다.

마지막 세척 후, 도립 형광 현미경으로 세포를 이미징하기 전에 antifa aqua mount를 첨가하십시오. IPS 콜로니는 시판되는 키트를 사용하여 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphatase) 활성을 분석할 수 있습니다. Stem gent docs inducible mouse TF lentivirus 세트를 사용하여 MES에 전사 인자를 발현시키는 트랜스덕션 후, MES를 IPS 세포로 리프로그래밍할 수 있습니다.

Doxycycline으로 처리한 세포에서는 T four, SOX two, KLF four 및 seic가 검출되지만, 처리하지 않은 세포에서는 발현이 거의 또는 전혀 검출되지 않습니다. 시간이 지남에 따라 형태학적 변화가 진행되어, 경계가 뚜렷하고 3차원적으로 성장하는 더 크고 ES 세포와 유사한 콜로니가 형성됩니다. Doxycycline을 제거하면 일부 ES 세포 유사 콜로니에서 세포 형태의 눈에 띄는 되돌림 현상이 나타납니다.

하지만 많은 콜로니가 iPS 형태를 유지했습니다. 이러한 iPS 콜로니를 채취하여 계대 배양했을 때, alkaline phosphatase, nano T four 및 SSEA one과 같은 전형적인 다능성 마커의 발현이 나타났습니다.

본 실험에 사용된 meth 세포 유형은 내인성 nag 유전자좌에서 GFP를 발현했습니다. 따라서 다능성 상태로 재프로그래밍되었을 때 GFP 발현은 성공적인 재프로그래밍의 예비 지표로 사용될 수 있습니다. 지금까지 독시사이클린 유도 항바이러스 시스템의 4가지 전사 인자를 사용하여 마우스 배아 섬유아세포를 유도 다능성 줄기세포로 재프로그래밍하는 방법을 살펴보았습니다.

이 절차를 수행할 때, 리프로그래밍 실험을 설계할 때 리프로그래밍 효율을 최적화하기 위해 여러 변수를 고려해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 첫째, 1차 감염 단계에서 활성 바이러스와 표적 세포의 비율을 수정하여 형질도입 효율을 높이거나 낮출 수 있으며, 이를 통해 표적 세포 집단 내에 통합되는 바이러스의 수에 영향을 줄 수 있습니다. 둘째, 세포가 docs에 노출되는 시간을 조정함으로써 생성되는 IPS 콜로니의 수에 영향을 줄 수 있습니다.

셋째, 활발하게 성장하고 분열하는 세포가 리프로그래밍에 더 적합하므로, 표적 세포의 증식 능력이 리프로그래밍에 영향을 미칠 수 있습니다. 마지막으로, 서로 다른 세포 수나 크기의 조직 배양 접시에 맞춰 프로토콜을 수정할 때는 표적 세포 수를 배양 접시의 표면적에 비례하여 조정하는 것이 좋습니다. 이상입니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.