삭스 - 2의 강제 표현을 통해 MEFS에서 IPS 세포를 생성, 10 - 4, C - Myc, 그리고 Klf4

50여 년 전, 피부 섬유아세포와 같이 말기에 분화된 세포는 배아 줄기세포와 유사한 만능 상태를 강제로 취할 수 있다는 가설이 세워졌습니다. 이 개념의 기초는 몇 가지 사소한 예외를 제외하고는 모든 세포 유형이 동일한 유전 코드를 가지고 있으며 세포 유형 간의 유일한 차이점은 코드를 읽는 방법이라는 관찰이었습니다. 분화된 세포의 세포 정체성을 만능 상태로 변경하는 이러한 능력을 세포 재프로그래밍(cellular reprogramming)이라고 합니다.

50년간의 연구 끝에, 최근 4가지 전사 인자의 강제 발현이 피부 섬유아세포를 재프로그래밍하여 만능으로 만들 수 있음이 밝혀졌습니다. 이 발견의 영향은 엄청납니다. 기초 생물학의 중요성을 넘어서, 그것은 또한 이식 요법을 위해 인간 배아 줄기 세포를 사용하는 것에 대한 주요 윤리적 반대를 극복합니다.

재프로그래밍이 일어나기 위해서는 전사 인자를 암호화하는 4개의 유전자, OC 4개의 sox, 2개의 cmic 및 K 4개의 유전자를 패키징하여 렌티바이러스 조직 배양에 넣어야 합니다. 그런 다음 정제된 바이러스를 포함하는 배지를 고밀도 섬유아세포를 포함하는 세포 배양 접시에 첨가하면 그 접시 내에서 놀라운 일이 발생합니다. 섬유아세포의 작은 부분이 바이러스를 운반하는 4가지 전사 인자 모두에 감염되고 분화가 시작된다.

그들은 형태와 증식에 급격한 변화를 겪고, 형성된 만능 줄기 세포의 큰 영적 클러스터로 분열하기 시작합니다. 배아 줄기 세포 조건에서 2-3주 동안 배양한 후, 재프로그래밍된 섬유아세포의 군체를 수동으로 분리하고 체외에서 확장할 수 있습니다. 일단 정제되면, 이러한 세포는 키메라 마우스를 생성하는 데 사용될 수 있으며, 이러한 탈분화된 섬유아세포에서 파생된 세포의 일정 비율은 마우스의 다른 조직에 기여할 수 있습니다.

원래 섬유아세포의 유전 물질이 생식세포에 기여한 차임에서는 유전 코드가 다음 세대로, 그 다음 세대로, 그 다음 세대로 전달되고 그 다음 세대로 전달됩니다. 바이러스 전달 시스템의 사용은 현재 임상 적용에 장애가 되고 있지만, 이는 곧 극복될 것입니다. 이 비디오에서 yin 연구실 구성원은 마우스 배아 섬유아세포에서 유도된 강력한 줄기 세포가 어떻게 파생되는지 시연합니다.

안녕하세요, 저는 매사추세츠 주 케임브리지에 있는 화이트헤드 생물의학 연구소의 루돌프 지쉬 연구실에서 근무하는 그랜트 웰트입니다. 그리고 저는 ish lab의 Tobias Bro brink입니다. 오늘은 Tet OCMV 프로모터에서 이 4개의 CDNA를 발현하는 렌티바이러스를 사용하여 4개의 CDNA(OCT 4개, SOX 2개, CIC KF 4개)를 도입하여 유도 만능 줄기 세포의 생성을 보여드리겠습니다.

이를 통해 마우스 배아 섬유아세포(mouse Embryonic fibroblast)의 감염 후 이러한 4개의 전이유전자(transgenes)의 발현을 정밀하게 제어할 수 있습니다. 오늘 보여드리는 프로토콜은 인간 세포를 감염시킬 수 있는 렌티바이러스를 처리하는 것과 관련이 있습니다. 직접 시도하기 전에 항상 안전한 절차를 따르고 안전 사무실에 연락하는 것이 중요합니다.

이제 mes를 IPS 세포로 전환하는 렌티바이러스를 생성하기 위해 몇 가지 IPS 세포를 생성해 보겠습니다. 2 9 3 세포는 바이러스 패키징에 필요한 유전 요소를 제공하는 3개의 플라스미드 Paks 2로 transfection되어야 합니다. 바이러스 백본은 4개의 CD 보조제 T four SOX 2, KLA 4 또는 CMIC PMDG 중 하나를 가진 FUW TE OCMV 렌티바이러스로, 수포성 구내염 바이러스 또는 VSV의 외피 당단백질을 발현합니다.

이것은 아트로픽 바이러스를 생성하는 바이러스를 만듭니다. 따라서 적절한 BL 2 플러스 절차를 따라야 합니다. 이 특정 비디오에서 우리는 실제로 전염성 바이러스를 다루지 않기 때문에 일반적인 가운을 입지 않고 BL 2 플러스 시설에 있지 않습니다.

형질주입 2에 앞서, 9,3 세포를 액체 질소로부터 해동하고 90% Co 유창성으로 성장시킨 다음 FU 유전자로 형질주입하고 바이러스를 발현시키기 위해 48 내지 72시간을 주었으며, 이때 세포를 목욕시키는 배지를 0.45 미크론 필터를 사용하여 여과하고 바이러스를 농축한 후 초원심분리를 사용하여 농축합니다. 이제 IPS 클러스터를 생성하기 위해 MES를 감염시킬 준비가 되었습니다.바이러스 준비 단계에서 3회 미만의 마우스 배아 섬유아세포는 10cm 접시에서 90%co로 성장하며, 접시당 6개의 세포에 대해 약 2배 10배입니다. 이 특정 실험 프로토콜에서는 내인성 OC 4개 유전자 자리에서 독시사이클린 발현과 GFP에 중요한 RTTA를 발현하는 MES를 사용하고 있습니다.

MES는 GFP 음성이지만 실제 IPS 셀은 GFP 양성이 됩니다. 이 마커는 재프로그래밍된 mes를 식별하고, 섬유아세포에서 배양 배지를 흡인하고, 10mils의 히피, EDTA로 세척하고, 히피 EDTA를 버리고, 1회 트립신 5mil을 첨가하고 37도에서 10분 동안 배양하는 방법을 가능하게 합니다. 트립신은 접시 바닥에서 세포를 들어 올리는 데 도움이 됩니다.

이제 9mil의 배양 배지를 추가하여 세포를 단일 세포 현탁액에 재현탁시키고 15mil 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 이러한 세포를 분리하여 펠릿화합니다. 펠릿을 현탁액으로 복원한 후, 현탁액의 세포 수를 계수하고 농도를 mil당 4개의 세포에 대해 8 곱하기 10으로 조정합니다.

그런 다음 10mils의 세포 현탁액을 젤라틴으로 코팅된 10cm 접시로 옮깁니다. 접시를 섭씨 37도에서 밤새 배양한 후 섬유아세포 접시에서 하룻밤 배양 배지를 흡입하고 10mil의 바이러스 함유 배지를 필로폰에 첨가합니다. 세포를 섭씨 37도, 5%CO2에서 4시간에서 밤새 배양합니다.

다음날 섬유 블라스트 접시에서 배지를 흡인 한 다음 10mil의 새로운 ESL 배지를 추가합니다. 이 단계에서 세포는 동결, 확장 또는 재프로그래밍의 시작을 위해 준비될 수 있습니다. 재프로그래밍을 시작하려면 일반 ESL 배지를 독시사이클린을 함유한 배지로 교체하여 4개의 유전자 발현을 시작합니다.

이 세포를 인큐베이터에 넣고 집락이 채취할 수 있을 만큼 충분히 커질 때까지 매일 배지를 교체하십시오. 군체는 재프로그래밍이 시작된 후 약 일주일 후에 먼저 볼 수 있어야 합니다. 20일쯤에 주울 수 있을 만큼 커져야 합니다.

이제 20일이 지났으므로 군체를 선택하기 전에 IPS 군체를 선택할 수 있습니다. 피킹 1-2시간 전에 감마선이 조사된 DR 4가지 오해로 코팅된 젤라틴 코팅 24웰 플레이트의 필요한 수를 확인해야 한다는 것을 기억해야 합니다. 하나는 피킹 직전에 신선한 배지를 추가하여 플레이트에 콜로니를 공급해야 하며, 피킹 직전에 V 바닥 96 웰 접시의 웰에 HEPA 버퍼의 50마이크로리터를 추가하고, PBS로 한 번 피킹할 콜로니가 포함된 접시를 세척하고 접시에 PBS 10ml를 추가하면 IPS 세포 클러스터는 스테레오 또는 도립 현미경으로 선택할 수 있습니다.

작은 피펫 팁으로 콜로니를 선택하고 클러스터를 제거하기 위해 PBS가 포함된 96웰 접시의 웰로 옮깁니다. 수학을 나누기 위해 클러스터 주위에 피펫 팁이 있는 원이 그려집니다. 이제 멀티채널 피펫터를 사용하여 재프로그래밍된 세포를 추출할 수 있으며, 각각에 20마이크로리터의 트립신이 추가됩니다.

우물 파이프를 위아래로 세 번 파이프하고 37°C에서 4분 동안 배양합니다. 4 분 배양 후, 100 마이크로 리터의 ES 배지가 트립스 니스 콜로니에 추가됩니다. 위아래로 10번 파이프하고 한 번에 6개의 클론을 전송합니다.

96 웰 디쉬에서 24 웰 디쉬까지 12 장소의 다른 모든 위치에서 팁을 사용하여 피펫 세포를 24 웰 플레이트에서 37 센트 정도로 성장시킨 다음 세포가 80 내지 90%Co 유창성에 도달할 때까지 5%CO2 인큐베이터에서 ES 세포 배지 세포를 가진 델리는 아마도 며칠 후 3-7일 내에 팽창할 준비가 될 것입니다. 이제 IPS 세포가 합류하므로 배지를 흡인하고 1mil의 히피로 세포를 완전히 세척합니다.히피를 제거하고 100마이크로리터의 1회 트립신을 첨가하고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 트립신으로 배양한 후 400마이크로리터의 ESL 배지를 추가하고 위아래로 피펫팅하여 세포를 현탁시키고 단일 세포 현탁액을 생성합니다.

그런 다음 24웰의 500마이크로리터 단일 세포 현탁액을 6웰 플레이트의 단일 웰로 옮기고 세포가 6웰 플레이트에서 80-90%co 유창성에 도달할 때까지 섭씨 37도의 5%CO2 인큐베이터에서 배양합니다. 이 시점에서 southern 분석, blasts, injection, 기형종 분석 또는 in vitro 분화 분석을 위한 세포 증폭을 진행할 수 있습니다. 그리고 이 귀중한 IPS 세포 재고를 잃지 않도록 이러한 세포의 스톡 밸브를 동결하는 것을 기억해야 합니다.

우리는 유도성 항바이러스 시스템을 사용하여 마우스 배아 섬유아세포에서 다능성을 유도하는 방법을 보여드렸습니다. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.