삭스 - 2의 강제 표현을 통해 MEFS에서 IPS 세포를 생성, 10 - 4, C - Myc, 그리고 Klf4

50여 년 전, 피부 섬유아세포와 같이 완전히 분화된 세포가 배아줄기세포와 유사한 다능성 상태가 되도록 유도될 수 있다는 가설이 제기되었습니다. 이 개념의 근거는 몇 가지 사소한 예외를 제외한 모든 세포 유형이 동일한 유전 코드를 가지고 있으며, 세포 유형 간의 유일한 차이점은 이 코드를 읽는 방식에 있다는 관찰 결과였습니다. 분화된 세포의 세포 정체성을 다능성 상태로 변화시키는 이러한 능력을 세포 리프로그래밍이라고 합니다.

5년간의 연구 끝에, 최근 4가지 전사 인자를 강제로 발현시키면 피부 섬유아세포를 다능성 상태로 리프로그래밍할 수 있다는 것이 밝혀졌습니다. 이 발견의 영향력은 매우 큽니다. 이는 기초 생물학적 중요성을 넘어, 이식 치료를 위한 인간 배아 줄기세포 사용에 따른 주요 윤리적 반대 의견을 극복하는 계기가 되었습니다.

리프로그래밍이 일어나기 위해서는 전사 인자인 Oct4, Sox2, c-Myc 및 Klf4를 인코딩하는 4개의 유전자를 렌티바이러스에 패키징하여 넣어야 합니다. 정제된 바이러스가 포함된 조직 배양 배지를 섬유아세포가 고밀도로 포함된 세포 배양 접시에 첨가하면, 해당 접시 내에서 놀라운 현상이 발생합니다. 섬유아세포의 극히 일부가 4가지 전사 인자를 운반하는 바이러스 모두에 감염되어 탈분화되기 시작합니다.

이들은 형태와 증식 면에서 급격한 변화를 겪으며, 다능성 줄기세포로 구성된 커다란 구형 클러스터로 분열되기 시작합니다. 배아줄기세포 배양 조건에서 2~3주 동안 배양하면, 리프로그래밍된 섬유아세포 콜로니를 수동으로 분리하여 체외에서 증식시킬 수 있습니다. 이렇게 정제된 세포들은 키메라 생쥐를 생성하는 데 사용될 수 있으며, 이때 탈분화된 섬유아세포에서 유래한 일정 비율의 세포들이 생쥐의 다양한 조직에 기여할 수 있습니다.

원래 섬유아세포의 유전 물질이 생식세포주에 기여한 키메라의 경우, 유전 암호가 다음 세대로, 그리고 그다음 세대로 계속해서 전달됩니다. 현재 바이러스 전달 시스템의 사용이 임상 적용의 장애물이 되고 있으나, 이는 조만간 극복될 가능성이 높습니다. 본 영상에서 yin 연구실의 연구원들은 마우스 배아 섬유아세포로부터 유도 만능 줄기세포를 어떻게 유도하는지 시연할 것입니다.

안녕하세요, 매사추세츠주 캠브리지에 위치한 화이트헤드 생물 의학 연구소의 Rudolph Jish 교수 연구실 소속 Grant Welted입니다. 그리고 저 또한 Jish 교수 연구실의 Tobias Bro brink입니다. 오늘은 Tet OCMV 프로모터에서 네 가지 cDNA를 발현하는 렌티바이러스를 사용하여 OCT four, SOX two, CIC, KF four의 네 가지 cDNA를 도입함으로써 유도만능줄기세포를 생성하는 방법을 보여드리겠습니다.

이를 통해 마우스 배아 섬유아세포(mouse Embryonic fibroblasts) 감염 후 4가지 외래 유전자의 발현을 정밀하게 제어할 수 있습니다. 오늘 보여드릴 프로토콜은 인간 세포를 감염시킬 가능성이 있는 렌티바이러스를 다루는 과정을 포함하고 있습니다. 따라서 항상 안전 수칙을 준수해야 하며, 직접 수행하기 전에 반드시 안전 관리 부서에 문의하는 것이 중요합니다.

따라서 mes 세포를 IPS 세포로 전환할 렌티바이러스를 생성하기 위해 일부 IPS 세포를 생성해 보겠습니다. 2 9 3 세포에 세 가지 플라스미드를 트랜스펙션해야 합니다. 하나는 바이러스 패키징에 필요한 유전적 요소를 제공하는 Paks two이며, 다른 하나는 네 가지 CD aid(T four, SOX two, KLA four 또는 CMIC) 중 하나가 포함된 FUW TE OCMV 렌티바이러스 바이럴 백본이고, 마지막으로 소포성 구내염 바이러스(VSV)의 외피 당단백질을 발현하는 PMDG입니다.

이 과정은 트로픽 바이러스를 생성하는 바이러스를 만드는 단계입니다. 따라서 적절한 BL2+ 절차를 준수해야 합니다. 본 영상에서는 실제로 감염성 바이러스를 다루지 않으므로, 일반적인 가운을 착용하지 않았으며 BL2+ 시설 내에 있지 않습니다.

트랜스펙션 전, 293 세포를 액체 질소에서 해동하여 90% 밀도로 배양합니다. 그다음 세포에 FU 유전자를 트랜스펙션하고 바이러스가 발현될 때까지 48~72시간 동안 배양하며, 이때 세포가 담긴 배지를 0.45 micron 필터로 여과하고 초원심분리기를 사용하여 농축합니다. 바이러스를 농축한 후, 이제 iPS 클러스터를 생성하기 위해 MEF를 감염시킬 준비가 되었습니다. 바이러스 준비 단계 동안, 계대 배양 횟수가 3회 미만인 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts)를 10 centimeter 디쉬에서 90% 밀도로 배양하며, 디쉬당 약 2×10⁶ 개의 세포를 사용합니다. 본 실험 프로토콜에서는 doxycycline 발현에 필수적인 RTTA와 내인성 Oct4 궤적의 GFP를 발현하는 MEF를 사용합니다.

MES는 GFP 음성이지만, 진정한 IPS 세포는 GFP 양성이 됩니다. 이 마커를 통해 리프로그래밍된 세포를 식별하는 방법이 가능해집니다. 섬유아세포에서 배양액을 흡입하여 제거하고 10 mL의 HEPES-EDTA로 세척하십시오. HEPES-EDTA를 버리고 1x 트립신 5 mL를 첨가한 후 37 °C에서 10분 동안 배양하십시오. 트립신은 배양 접시 바닥에서 세포를 떼어내는 것을 돕습니다.

이제 배양액 9 mL를 첨가하여 세포를 단일 세포 현탁액으로 재현탁하고 15 mL 튜브로 옮깁니다. 그다음 이 세포들을 원심 분리하여 펠릿으로 만듭니다. 펠릿을 다시 현탁한 후, 현탁액 내의 세포 수를 측정하고 농도를 8 × 10⁴ cells/mL로 조정합니다.

그 다음, 세포 현탁액 10 mL를 젤라틴으로 코팅된 10 cm 디쉬로 옮깁니다. 디쉬를 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 배양 후, 섬유아세포 디쉬의 배지를 흡입하여 제거하고 바이러스가 포함된 배지 10 mL를 추가합니다. 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 4시간부터 하룻밤까지 배양합니다.

다음 날, 섬유아세포 배양 접시에서 배지를 흡입하여 제거한 후 10 mL의 신선한 ESL 배지를 추가합니다. 이 단계에서 세포를 동결 보관하거나, 증식시키거나, 리프로그래밍 개시를 위한 준비를 할 수 있습니다. 리프로그래밍을 시작하려면 일반 ESL 배지를 독시사이클린이 포함된 배지로 교체하여 4가지 유전자의 발현을 유도합니다.

이 세포들을 인큐베이터에 넣고, 콜로니를 피킹할 수 있을 만큼 충분히 커질 때까지 매일 배지를 교체하십시오. 콜로니는 리프로그래밍 시작 후 약 일주일 뒤부터 보이기 시작합니다. 피킹이 가능할 정도로 충분히 커지기까지는 약 20일 정도가 소요됩니다.

20일이 지났으므로, 콜로니를 채취하기 전에 IPS 콜로니를 먼저 선택할 수 있습니다. 채취 1~2시간 전에 감마선 조사된 DR이 코팅된 젤라틴 코팅 24-well 플레이트가 필요한 수량만큼 준비되어 있는지 확인해야 합니다. 채취 직전에 신선한 배지를 추가하여 플레이트 상의 콜로니에 영양을 공급하십시오. 채취 직전에 V-bottom 96-well 디쉬의 웰에 50 µL의 HEPA 버퍼를 추가합니다. 채취할 콜로니가 포함된 디쉬를 PBS로 한 번 세척하고, 디쉬에 10 mL의 PBS를 추가합니다. IPS 세포 클러스터는 실체 현미경 또는 도립 현미경 하에서 채취할 수 있습니다.

작은 파이펫 팁으로 콜로니를 선택하여 PBS가 담긴 96웰 플레이트의 웰로 옮겨 클러스터를 제거합니다. 파이펫 팁으로 클러스터 주변에 원을 그려 덩어리를 분쇄합니다. 이제 멀티채널 파이펫을 사용하여 리프로그래밍된 세포를 추출할 수 있으며, 각 웰에 20 µL의 trypsin을 첨가합니다.

피펫으로 세 번 위아래로 섞어준 뒤, 37 °C에서 4분 동안 배양합니다. 4분간의 배양이 끝나면, 트리포나이즈된 콜로니에 100 µL의 ES 배지를 첨가합니다. 피펫으로 10번 위아래로 섞은 후, 한 번에 6개의 클론씩 옮깁니다.

12채널 피펫의 매 칸마다 팁을 사용하여 96웰 디쉬에서 24웰 디쉬로 옮깁니다. 그 후 세포를 37 °C, 5% CO2 인큐베이터 내의 24웰 플레이트에서 세포 밀도가 80~90%의 합류도(confluency)에 도달할 때까지 배양하며, ES 세포 배지로 매일 보충해 줍니다. 세포는 보통 3~7일 후에 증식 준비가 됩니다. 며칠 후, iPS 세포가 합류 상태가 되면 배지를 흡입하여 제거하고 1 mL의 HBSS로 세포를 세척합니다. HBSS를 완전히 제거한 후 1× trypsin 100 µL를 첨가하고 37 °C에서 10분간 배양합니다. trypsin 배양 후, ESL 배지 400 µL를 첨가하고 피펫팅으로 상하 혼합하여 세포를 현탁시켜 단일 세포 현탁액을 만듭니다.

24-웰 플레이트에서 얻은 500 µL의 단일 세포 현탁액을 6-웰 플레이트의 단일 웰로 옮긴 후, 세포의 합류도(confluency)가 80~90%에 도달할 때까지 37 °C, 5% CO2 배양기에서 배양합니다. 이 시점에서 Southern 분석, 블라스트(blasts), 주입, 테라토마 분석 또는 인비트로(in vitro) 분화 분석을 위해 세포를 증폭하는 단계로 진행할 수 있습니다. 또한, 귀중한 iPS 세포 스톡을 잃지 않도록 이 세포들의 스톡 앰플(stock vials)을 냉동 보관해야 함을 기억하십시오.

지금까지 유도성 항바이러스 시스템을 사용하여 마우스 배아 섬유아세포에서 다능성을 유도하는 방법을 살펴보았습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.