Name: 삭스 - 2의 강제 표현을 통해 MEFS에서 IPS 세포를 생성, 10 - 4, C - Myc, 그리고 Klf4 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-07T10:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: 배우세요 마우스 배아 섬유아세포에서 렌티바이러스를 이용하여 Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4 4개 전사인자로 유도만능줄기세포를 생성하는 세포 재프로그래밍 방법을. 이 기술은 재생의학 연구에 활용됩니다.

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1 단계 : lentivirus 생산을위한 293 세포와 플레이트를 녹여. <ol><li> 15 - ML 튜브 DMEM + 중간 9 ML을 준비합니다. </li><li> 액체 질소 탱크에서 냉동 293 주식의 병을 제거하고 (전부는 아니지만) 대부분의 세포가 해동 때까지 37 ° C의 물을 욕조에 병을 넣어. </li><li> 1 단계에서 15ml 튜브에 동결 유리병과 장소에서 세포를 제거합니다. </li><li> 5 분 180g에 원심 분리기 다음 뜨는 폐기하십시오. </li><li> DMEM + 중간의 10 ML있는 세포를 Resuspend 및 젤라틴 코팅 100 - mm 요리로 전송할 수 있습니다. 그들이 80~90%의 합류하기 전까지 37 ° C 5 % CO 2 배양기에서 세포를 품어. </li><li> 293 세포의 통과 : PBS로 세척 세포는 PBS를 대기음, 그리고 0.05 % trypsin/0.53 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 10 cm 요리마다 4 ML을 추가, 37 1 분 품어 ° C.를 </li><li> 10 ML DMEM + 매체 resuspend 감청하여 요리의 세포, 그리고 15 - ML 튜브로 전송을 분리합니다. 5 분 180g에 원심 분리기 및 뜨는을 대기음. </li><li> DMEM + 매체의 적절한 볼륨을 추가하고 몇 시간을 아래와 pipetting하여 단일 세포 현탁액으로 세포를 헤어지게. </li><li> 세포의 개수를 카운트 및 FP 매체와 ML 당 8x10 5 세포에 농도를 조정합니다. </li><li> 종자 100 - mm 배양 접시 당 8x10 6 셀 (10 ML)에서 세포를, 그리고 37 밤새 품어 ° C, 5 % CO 2. </li></ol> 2 단계 : lentivirus의 plasmids과 수확 바이러스 Transfect 293 세포 <ol><li> 각 10 cm 접시, FUW - 테토 - cDNA 10 μg (Oct4, Sox2, Klf4 또는 C - Myc) pMD - G의 2.5ug와 lentivirus 백본 및 pPax2의 7.5 μg을 사용합니다. </li><li> 튜브로 세 plasmids를 aliquoting 동안 혈청없이 DMEM의 500μl를 포함하는 두 번째 튜브로 Fugene 6 transfection 시약의 30μl를 제공하고 실온에서 5 분 도청 손가락과 부화에 의해 부드럽게 섞는다. </li><li> DNA 믹스 Fugene 6/DMEM-containing 튜브에 드롭하여 놓기를 추가, 20 분 손가락 도청 및 부화하여 부드럽게 섞는다. </li><li> 293의 그릇에 DNA / Fugene 6 복잡한 dropwise을 추가하고 37 밤새 품어 ° C 5 % CO 2. </li><li> 다음날 아침 : transfection을 대기음 시약 함유 매체를 신선한 ES 세포 매체의 5 ML을 추가하고, 배양기에 세포를 반환합니다. </li><li> 48 시간 transfection 후 72시간에서 0.45 - μm의 기공 크기 셀룰로스 아세테이트 필터를 통해 필터링, 15 ML 튜브로 전송할 수, 10 ML 멸균 일회용 주사기를 사용하여 293의에서 매체를 수집합니다. </li><li> ultracentrifugation하여 바이러스 뜨는을 집중. 원하는 볼륨의 바이러스 펠렛을 Resuspend하고 Oct-3/4-, Sox2 -, Klf4 및 C - Myc - lentiviruses을 포함하고있는 매체의 동등한 부분 amixture합니다. </li><li> 바이러스를 만드는 동안, (접시 당 2x10 6 셀) 10 - cm 요리 confluency 90 % Oct4-neo/rtTA 또는 Oct4-GFP/rtTA MEFs을 (통과 &lt;3) 준비 </li><li> PBS 10 ML과 문화 미디어와 세척을 대기음. </li><li> 0.05 % trypsin/0.53 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 접시 당 1 ML을 추가하고, 37 품어 ° C, 10 분, PBS 폐기하십시오. </li><li> 문화 매체 9 ML 추가, 단일 세포로 세포를 중단하고, 15 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 세포의 수를 계산하고, ML 당 8x10 4 세포에 농도를 조정합니다. 젤라틴 코팅 10 cm 요리에 세포 현탁액 10 ML (8x10 5 셀)을 전송합니다. 37 밤새 접시를 품어 ° C, 5 % CO 2. </li><li> fibroblast 요리에서 매체를 대기음, 그리고 바이러스가 포함된 매체 10 ML를 추가합니다. 37 4 H에서 하룻밤에 세포 ° C 5 % CO 2 알을 품다. </li><li> 24 후 fibroblast 요리에서 매체를 대기음, 신선한 ES 세포 매체 10 ML를 추가합니다. </li><li> 네 가지 유전자의 표현을 시작하는 매체를 포함하는 Doxycycline와 함께 정기적으로 ES 세포 매체를 교체, 즉, 프로그래밍을 시작합니다. </li><li> Oct4 - 네오 기자를 사용한다면, 6 구일 사이에 언제든지 약물 섹션을 시작합니다. </li><li> 식민지가 뽑힐 정도로 큰이 될 때까지 매일 매체를 변경합니다. 식민지 먼저 프로그래밍의 개시 후 약 일주일 표시가 될 것입니다. 그들은 일 약 20 뽑힐 정도로 커질 것입니다. </li></ol> 3 단계 : IPS 식민지를 따기 따기 전에 일 : <ol><li> γ - DR4 조사 MEFs과 젤라틴 - 코팅 24 - 잘 접시의 필요한 번호 씨앗 </li></ol> 1 일에 클론을 따기 : <ol><li> 1-2시간 따기 전에 접시에 식민지를 공급. </li><li> V - 바닥 96 잘 요리의 우물에 PBS 15 μl를 추가합니다. </li><li> 식민지는 PBS로 한번 잡았 수가 들어있는 접시를 씻고 요리에 PBS의 10ml를 추가합니다. </li><li> 작은 5μl pipet 팁 (4 μl에 P20 pipetman 설정)와 식민지를 선택합니다. 전송 공동96 - 잘 접시에 잘하는 로니스. </li><li> 잘 멀티 채널 (12) pipetor를 사용하여 각 트립신 20 μl를 추가합니다. Pipet 위아래로 3 회. 37 품어 ° C를 4 분간. </li><li> trypsinized 식민지로 ES 매체 100 μl를 추가합니다. Pipet 위, 아래로 10 회. 12 장소 pipetor의 모든 다른 위치에 팁을 사용하여 24 잘 요리에 96 잘 요리에서 한 번에 6 클론을 전송합니다. </li><li> 세포가 ES 세포 매체와 함께 매일 먹이 confluency 80-90%에 도달할 때까지 37 ° C 5 % CO 2 배양기에서 24 잘 접시에 세포를 성장. 세포는 아마 3-7일의 확장 준비됩니다. </li></ol> 4 단계 <ol><li> IPS 세포의 확장 <ol><li> 매체 기음, 그리고 PBS 1 ML로 세포를 씻어. </li><li> 완전히 PBS를 제거, 0.25 % 트립신 / 37 1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 부화 ° 10 분 C의 0.1 ML를 추가합니다. </li><li> ES 매체의 0.4 ML를 추가하고 단일 세포 현탁액과 위아래로 pipetting하여 세포를 일시 중지합니다. </li><li> 6 - 잘 접시의 잘하는 세포 현탁액을 전송, 1.5 ML의 ES 세포 매체를 추가하고, 37 품어 ° C 5 % CO 2 배양기 세포는 6 - 잘 접시에 confluency 80-90%에 도달할 때까지. 이 시점에서 다음과 같이, 세포의 냉동 재고를 준비합니다. </li></ol></li><li> 프리즈 주식의 준비 <ol><li> 매체 기음, 그리고 PBS 2 ML으로 세포를 씻으십시오. </li><li> 완전히 PBS를 제거, 0.25 % 트립신 / 37 1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 부화 ° 10 분 C 0.5 ML를 추가합니다. </li><li> ES 매체 2 ML 추가 및 단일 세포 현탁액과 위아래로 pipetting하여 세포를 일시 중지합니다. </li><li> 15 ML 튜브에 세포 현탁액을 전송, 세포의 수를 계산하고 세포를 스핀 다운. </li><li> , 뜨는을 삭제 ML 당 2x10 6 세포에서 농도 ES 매체와 세포 resuspend. </li><li> 이 ES 세포 냉동 매체 (ES 매체 20 % DMSO)와 유리병 당 0.5 ML로 나누어지는를 준비합니다. </li><li> 튜브를 고정하고 부드럽게 혼합하는 세포 현탁액의 0.5 ML을 전송합니다. </li><li> 세포 동결 용기에 튜브를 넣고 ° C 야간은 -80에서 보관, 장기 보관을 위해 다음날 액체 질소로 전송할 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+.+In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">et al . In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epigenetic+remodeling+in+directly+reprogrammed+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Global epigenetic remodeling in directly reprogrammed fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li>
<li>Brambrink, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+expression+of+pluripotency+markers+during+direct+reprogramming+of+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of somatic cells.</a> Cell Stem Cell. 2, 151-159 (2008).</li>
</ol>

이 비디오에서는, 우리는 Oct4-GFP/R26-M2rtTA과 Nanog-GFP/R26-M2rtTA 생쥐에서 추출한 MEFs에서 GFP 양성, pluripotent IPS 세포를 생성하는 inducible, lentiviral 시스템을 사용하는 방법을 보여줍니다. 그것은 프로그래밍 과정 transgene 표현의 제어를위한 수 있기 때문에이 절차는 IPS 세포를 생성하는 유용한 방법입니다. IPS 세포의 생성에 바이러스의 사용은 임상 환경에서 이러한 세포의 사용을 막는 있지만,이 절차는 우리가 아직 정의 프로그래밍 작업을 밑줄 주요 생물 학적 질문 중 일부에 대답 수 없습니다.

<table><tbody><tr><td>Doxycycline hyclate</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

삭스 - 2의 강제 표현을 통해 mefs에서 ips 세포를 생성, 10 - 4, c - myc, 그리고 klf4

Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4

Pluripotency는 Oct4의 바이러스 도입하여 차별 murine에서 유도된 수 있습니다 Sox2, Klf4, 그리고 C - Myc (타카하시와 야마 나카, 2006; Wernig, 외, 2007;. 오키타, 외, 2007;.. Maherali, 외, 2007). 우리는이 네 전사 요소 doxycycline에서 표현되는 프로그래밍 전략을 고안해야 (독스) lentiviral 벡터 (Brambrink 외., 2008) - inducible. 이러한 inducible 구조를 사용하여, 우리는 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)에서 유도된 pluripotent 줄기 (IPS) 세포를 유도하실 수 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 네 개의 전사 요소를 표현하고 IPS 세포를 생산하기 위해이 바이러스를 감염 MEFs하는 방법을 보여줍니다 inducible의 lentiviruses의 생성에 대한 절차를 설명합니다. inducible의 lentiviruses를 사용하여, 문화 매체 doxycyline의 추가에 의해 제어의 4 가지 요소의 표현. 전통 retroviral 감염을 통해이 시스템의 장점은 프로그래밍과 유전자 발현 요구 사항의 반응 속도론은 세부 분석 수 있도록 해제에 대한 유전자를 켜고있는 능력입니다.

이 동영상은 inducible의 lentivirus를 사용하여 유도된 pluripotent 줄기 세포를 생성하는 절차를 보여줍니다 표현 Oct4, Sox2, C - Myc와 Klf4.

삭스 - 2의 강제 표현을 통해 MEFS에서 IPS 세포를 생성, 10 - 4, C - Myc, 그리고 Klf4

분화된 마우스 세포는 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc의 바이러스 형질전환을 통해 다능성을 유도할 수 있습니다 (Takahashi and Yamanaka, 2006; Wernig, et al., ...

50여 년 전, 피부 섬유아세포와 같이 완전히 분화된 세포가 배아줄기세포와 유사한 다능성 상태가 되도록 유도될 수 있다는 가설이 제기되었습니다. 이 개념의 근거는 몇 가지 사소한 예외를 제외한 모든 세포 유형이 동일한 유전 코드를 가지고 있으며, 세포 유형 간의 유일한 차이점은 이 코드를 읽는 방식에 있다는 관찰 결과였습니다. 분화된 세포의 세포 정체성을 다능성 상태로 변화시키는 이러한 능력을 세포 리프로그래밍이라고 합니다.5년간의 연구 끝에, 최근 4가지 전사 인자를 강제로 발현시키면 피부 섬유아세포를 다능성 상태로 리프로그래밍할 수 있다는 것이 밝혀졌습니다. 이 발견의 영향력은 매우 큽니다. 이는 기초 생물학적 중요성을 넘어, 이식 치료를 위한 인간 배아 줄기세포 사용에 따른 주요 윤리적 반대 의견을 극복하는 계기가 되었습니다.리프로그래밍이 일어나기 위해서는 전사 인자인 Oct4, Sox2, c-Myc 및 Klf4를 인코딩하는 4개의 유전자를 렌티바이러스에 패키징하여 넣어야 합니다. 정제된 바이러스가 포함된 조직 배양 배지를 섬유아세포가 고밀도로 포함된 세포 배양 접시에 첨가하면, 해당 접시 내에서 놀라운 현상이 발생합니다. 섬유아세포의 극히 일부가 4가지 전사 인자를 운반하는 바이러스 모두에 감염되어 탈분화되기 시작합니다.이들은 형태와 증식 면에서 급격한 변화를 겪으며, 다능성 줄기세포로 구성된 커다란 구형 클러스터로 분열되기 시작합니다. 배아줄기세포 배양 조건에서 2~3주 동안 배양하면, 리프로그래밍된 섬유아세포 콜로니를 수동으로 분리하여 체외에서 증식시킬 수 있습니다. 이렇게 정제된 세포들은 키메라 생쥐를 생성하는 데 사용될 수 있으며, 이때 탈분화된 섬유아세포에서 유래한 일정 비율의 세포들이 생쥐의 다양한 조직에 기여할 수 있습니다.원래 섬유아세포의 유전 물질이 생식세포주에 기여한 키메라의 경우, 유전 암호가 다음 세대로, 그리고 그다음 세대로 계속해서 전달됩니다. 현재 바이러스 전달 시스템의 사용이 임상 적용의 장애물이 되고 있으나, 이는 조만간 극복될 가능성이 높습니다. 본 영상에서 yin 연구실의 연구원들은 마우스 배아 섬유아세포로부터 유도 만능 줄기세포를 어떻게 유도하는지 시연할 것입니다.안녕하세요, 매사추세츠주 캠브리지에 위치한 화이트헤드 생물 의학 연구소의 Rudolph Jish 교수 연구실 소속 Grant Welted입니다. 그리고 저 또한 Jish 교수 연구실의 Tobias Bro brink입니다. 오늘은 Tet OCMV 프로모터에서 네 가지 cDNA를 발현하는 렌티바이러스를 사용하여 OCT four, SOX two, CIC, KF four의 네 가지 cDNA를 도입함으로써 유도만능줄기세포를 생성하는 방법을 보여드리겠습니다.이를 통해 마우스 배아 섬유아세포(mouse Embryonic fibroblasts) 감염 후 4가지 외래 유전자의 발현을 정밀하게 제어할 수 있습니다. 오늘 보여드릴 프로토콜은 인간 세포를 감염시킬 가능성이 있는 렌티바이러스를 다루는 과정을 포함하고 있습니다. 따라서 항상 안전 수칙을 준수해야 하며, 직접 수행하기 전에 반드시 안전 관리 부서에 문의하는 것이 중요합니다.따라서 mes 세포를 IPS 세포로 전환할 렌티바이러스를 생성하기 위해 일부 IPS 세포를 생성해 보겠습니다. 2 9 3 세포에 세 가지 플라스미드를 트랜스펙션해야 합니다. 하나는 바이러스 패키징에 필요한 유전적 요소를 제공하는 Paks two이며, 다른 하나는 네 가지 CD aid(T four, SOX two, KLA four 또는 CMIC) 중 하나가 포함된 FUW TE OCMV 렌티바이러스 바이럴 백본이고, 마지막으로 소포성 구내염 바이러스(VSV)의 외피 당단백질을 발현하는 PMDG입니다.이 과정은 트로픽 바이러스를 생성하는 바이러스를 만드는 단계입니다. 따라서 적절한 BL2+ 절차를 준수해야 합니다. 본 영상에서는 실제로 감염성 바이러스를 다루지 않으므로, 일반적인 가운을 착용하지 않았으며 BL2+ 시설 내에 있지 않습니다.트랜스펙션 전, 293 세포를 액체 질소에서 해동하여 90% 밀도로 배양합니다. 그다음 세포에 FU 유전자를 트랜스펙션하고 바이러스가 발현될 때까지 48~72시간 동안 배양하며, 이때 세포가 담긴 배지를 0.45 micron 필터로 여과하고 초원심분리기를 사용하여 농축합니다. 바이러스를 농축한 후, 이제 iPS 클러스터를 생성하기 위해 MEF를 감염시킬 준비가 되었습니다. 바이러스 준비 단계 동안, 계대 배양 횟수가 3회 미만인 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts)를 10 centimeter 디쉬에서 90% 밀도로 배양하며, 디쉬당 약 2×10⁶ 개의 세포를 사용합니다. 본 실험 프로토콜에서는 doxycycline 발현에 필수적인 RTTA와 내인성 Oct4 궤적의 GFP를 발현하는 MEF를 사용합니다.MES는 GFP 음성이지만, 진정한 IPS 세포는 GFP 양성이 됩니다. 이 마커를 통해 리프로그래밍된 세포를 식별하는 방법이 가능해집니다. 섬유아세포에서 배양액을 흡입하여 제거하고 10 mL의 HEPES-EDTA로 세척하십시오. HEPES-EDTA를 버리고 1x 트립신 5 mL를 첨가한 후 37 °C에서 10분 동안 배양하십시오. 트립신은 배양 접시 바닥에서 세포를 떼어내는 것을 돕습니다.이제 배양액 9 mL를 첨가하여 세포를 단일 세포 현탁액으로 재현탁하고 15 mL 튜브로 옮깁니다. 그다음 이 세포들을 원심 분리하여 펠릿으로 만듭니다. 펠릿을 다시 현탁한 후, 현탁액 내의 세포 수를 측정하고 농도를 8 × 10⁴ cells/mL로 조정합니다.그 다음, 세포 현탁액 10 mL를 젤라틴으로 코팅된 10 cm 디쉬로 옮깁니다. 디쉬를 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 배양 후, 섬유아세포 디쉬의 배지를 흡입하여 제거하고 바이러스가 포함된 배지 10 mL를 추가합니다. 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 4시간부터 하룻밤까지 배양합니다.다음 날, 섬유아세포 배양 접시에서 배지를 흡입하여 제거한 후 10 mL의 신선한 ESL 배지를 추가합니다. 이 단계에서 세포를 동결 보관하거나, 증식시키거나, 리프로그래밍 개시를 위한 준비를 할 수 있습니다. 리프로그래밍을 시작하려면 일반 ESL 배지를 독시사이클린이 포함된 배지로 교체하여 4가지 유전자의 발현을 유도합니다.이 세포들을 인큐베이터에 넣고, 콜로니를 피킹할 수 있을 만큼 충분히 커질 때까지 매일 배지를 교체하십시오. 콜로니는 리프로그래밍 시작 후 약 일주일 뒤부터 보이기 시작합니다. 피킹이 가능할 정도로 충분히 커지기까지는 약 20일 정도가 소요됩니다.20일이 지났으므로, 콜로니를 채취하기 전에 IPS 콜로니를 먼저 선택할 수 있습니다. 채취 1~2시간 전에 감마선 조사된 DR이 코팅된 젤라틴 코팅 24-well 플레이트가 필요한 수량만큼 준비되어 있는지 확인해야 합니다. 채취 직전에 신선한 배지를 추가하여 플레이트 상의 콜로니에 영양을 공급하십시오. 채취 직전에 V-bottom 96-well 디쉬의 웰에 50 µL의 HEPA 버퍼를 추가합니다. 채취할 콜로니가 포함된 디쉬를 PBS로 한 번 세척하고, 디쉬에 10 mL의 PBS를 추가합니다. IPS 세포 클러스터는 실체 현미경 또는 도립 현미경 하에서 채취할 수 있습니다.작은 파이펫 팁으로 콜로니를 선택하여 PBS가 담긴 96웰 플레이트의 웰로 옮겨 클러스터를 제거합니다. 파이펫 팁으로 클러스터 주변에 원을 그려 덩어리를 분쇄합니다. 이제 멀티채널 파이펫을 사용하여 리프로그래밍된 세포를 추출할 수 있으며, 각 웰에 20 µL의 trypsin을 첨가합니다.피펫으로 세 번 위아래로 섞어준 뒤, 37 °C에서 4분 동안 배양합니다. 4분간의 배양이 끝나면, 트리포나이즈된 콜로니에 100 µL의 ES 배지를 첨가합니다. 피펫으로 10번 위아래로 섞은 후, 한 번에 6개의 클론씩 옮깁니다.12채널 피펫의 매 칸마다 팁을 사용하여 96웰 디쉬에서 24웰 디쉬로 옮깁니다. 그 후 세포를 37 °C, 5% CO2 인큐베이터 내의 24웰 플레이트에서 세포 밀도가 80~90%의 합류도(confluency)에 도달할 때까지 배양하며, ES 세포 배지로 매일 보충해 줍니다. 세포는 보통 3~7일 후에 증식 준비가 됩니다. 며칠 후, iPS 세포가 합류 상태가 되면 배지를 흡입하여 제거하고 1 mL의 HBSS로 세포를 세척합니다. HBSS를 완전히 제거한 후 1× trypsin 100 µL를 첨가하고 37 °C에서 10분간 배양합니다. trypsin 배양 후, ESL 배지 400 µL를 첨가하고 피펫팅으로 상하 혼합하여 세포를 현탁시켜 단일 세포 현탁액을 만듭니다.24-웰 플레이트에서 얻은 500 µL의 단일 세포 현탁액을 6-웰 플레이트의 단일 웰로 옮긴 후, 세포의 합류도(confluency)가 80~90%에 도달할 때까지 37 °C, 5% CO2 배양기에서 배양합니다. 이 시점에서 Southern 분석, 블라스트(blasts), 주입, 테라토마 분석 또는 인비트로(in vitro) 분화 분석을 위해 세포를 증폭하는 단계로 진행할 수 있습니다. 또한, 귀중한 iPS 세포 스톡을 잃지 않도록 이 세포들의 스톡 앰플(stock vials)을 냉동 보관해야 함을 기억하십시오.지금까지 유도성 항바이러스 시스템을 사용하여 마우스 배아 섬유아세포에서 다능성을 유도하는 방법을 살펴보았습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

generating-ips-cells-from-mefs-through-forced-expression-sox-2-oct-4

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Stemgent 독스의 Inducible 마우스 TF의 Lentivirus 세트 유도된 pluripotent 줄기 (IPS) 셀에 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)를 재설 정할 수 있습니다. 다음은 마우스 프로그래밍 전사 요인 Oct4의 독스 - inducible 표현에 대한 프로토콜을 보여줍니다, Sox2, Klf4과 c - Myc은 표현하는 일반적인 MES pluripotency 마커 IPS의 식민지를 생성합니다.

4 전사 인자와 마우스 배아 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성, Doxycycline는 Lentiviral 전달 시스템 Inducible

그들은 pluripotency에 대한 표준 테스트를 통과 때도 생성 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 라인이 발달 가능성을 서로 다른 행을 생산하고 있습니다. 여기 가진 전체 pluripotency로 iPSC 라인을 정의 iPSCs에서 완전히 파생 쥐를 생산하기 위해 프로토콜을...

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

여기 하나의 lentiviral 재활 벡터를 사용하여 말초 혈 3-4 ML에서 인간 iPSCs의 생성을위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 보여줍니다. 즉시 사용할 수 혈액 세포의 재 프로그래밍하면 폭 넓은 연구 공동체에 액세스하여 iPSC 기술의 활용을 촉진 것을 약속드립니다.

STEMCCA Lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

여기서, 우리는 인간의 생물학적 기능을 다시 요약 관대 배양 조건 하에서 수축성 근섬유 (myospheres)의 입체 클러스터를 형성하는 골격 근육 원종의 균질 한 집단을 생성 향해 인간 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기 세포)의 후생 유전 학적 리 프로그래밍을 기반 프로토콜을 설명 골격 근육.

성적인 프로그램을 다시 만들에 의해 인간 배아 줄기 세포에서 Myospheres의 생성

여기, 우리는 일관된 결과 및 향상된 효율성을 보여줍니다 센다이 바이러스와 유전자가없는 인간 유도 만능에 인간의 체세포를 재 프로그램하는 우리의 설립 방법을 제시한다.

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

마우스 배아 섬유아세포는 전사 인자 Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc의 강제 발현에 의해 낮은 효율로 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍할 수 있습니다. 재프로그래밍 반응의 드문 중간체는 세포 표면 제작자 Thy-1.2, Ssea-1 및 Epcam에 대한 항체 표지를 통해 분리된 FACS입니다.

재 프로그래밍 가능한 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 중간체의 세포 표면 마커 중재 정화

여기에서는 에피솜 기반 재프로그래밍 전략과 히스톤 탈아세틸화효소 억제제를 사용하여 말초 혈액에서 인간 유도 만능 줄기 세포를 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

에피 솜과 HDAC 억제제를 사용하여 혈액에서 효율적인 유도 만능 줄기 세포 생성

유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 임상 응용 프로그램 및 기초 연구에 대한 환자의 특정 조직의 소스를 나타냅니다. 여기서는 비 - 에피 솜 통합 플라스미드를 사용하여 바이러스 프리 iPSCs에 냉동 버피 코트로부터 얻은 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs)를 재 프로그래밍 상세한 프로토콜을 제시한다.

비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

여기에서는 폴리시스트로닉 구조에서 Gata4, Tbx5 및 Mef2c의 레트로바이러스 매개 전달을 사용하여 iCM을 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 효율성과 품질이 향상된 비교적 균질한 재프로그래밍된 세포 집단을 생성하며 향후 iCM 재프로그래밍에 대한 연구에 유용합니다.

Gata4, Mef2c 및 Tbx5의 최적 비율을 표현하는 폴리 시스 트론 구조를 사용하여 유도 된 심근의 향상 발전

여기에 설명된 프로토콜은 최소 전사 인자 세트의 과발현을 통해 마우스 배아 섬유아세포에서 혈액 프로그램의 유도를 자세히 설명합니다. 이 기술은 조혈, 혈액 질환 및 조혈 줄기 세포 이식에 대한 향후 연구를 위한 플랫폼을 제공하기 위해 인간 시스템으로 변환될 수 있습니다.

전사 인자와 마우스 배아 섬유 아 세포를 재 프로그램하는 것은 Hemogenic 프로그램을 유도하는

이 CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins 및 수정된 된 특성을 사용 하 여 편집 다음 프로토콜 자세히 설명 발자국 없는 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)의 세대 급지대 무료 조건에서 인간의 췌장암 세포에서 단일 셀 복제합니다.

효율적인 생성 및 급지대 무료 Ipsc CRISPR Cas9 시스템을 사용 하 여 인간의 췌 장 세포에서의 편집

배우세요 마우스 배아 섬유아세포에서 렌티바이러스를 이용하여 Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4 4개 전사인자로 유도만능줄기세포를 생성하는 세포 재프로그래밍 방법을. 이 기술은 재생의학 연구에 활용됩니다.

삭스 - 2의 강제 표현을 통해 MEFS에서 IPS 세포를 생성, 10 - 4, C - Myc, 그리고 Klf4

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