Name: RIP 칩을 사용하여 세포 추출물에서 mRNAs, microRNAs 및 Ribonucleoprotein 단지의 단백질 구성 요소의 분리 및 확인에 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: 배우세요 RIP 칩을 사용하여 세포 추출물에서 리보핵단백질 복합체의 RNA와 단백질 구성 요소를 분리하고 확인하는 방법입니다. 이 기술은 RNA 결합 단백질 상호작용을 연구하는 데 활용됩니다.

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실험 준비 실험을 시작하기 전에, 모든 시약, 용기 및 주방기구 RNase 무료를하는 것이 중요합니다. DEPC - 처리 물과 린스 다음 RNase 억제제 (RNaseZAP, Ambion)로 유리를 취급합니다. 모든 시약은 RNase 무료로 확인되어 있는지 확인합니다. 1. mRNP Lysate 준비 <ol><li> 성장하고 각 RIP에 대한 총 단백질 2-5 밀리그램 사이에 생산하기 위해 기하 급수적으로 성장 조직 세포를 수확. <ol class="lalpha"><li> 두 P150 문화 요리는 일반적으로 충분합니다. </li><li> 각 RBP이 조사되는 경우, 총 세포 수와 단백질 양이 적절한 대상 mRNA와 RBP 상호 작용을 극대화하도록 최적화해야합니다. </li><li> qRT-PCR 분석을 위해 RIP는 특히 허, AUF1, TIAR와 같은 높은 풍부한 정보 RBPs위한 증폭 및 검출 방법에 의해 적은 세포 lysate를 (약 400 μg 총 단백질)이 필요할 수 있습니다. </li></ol> &lt;/ 리&gt; <li> 4에 8-10 분 ° C, 200 XG에서 원심 분리를 통해 펠릿 세포는 얼음 차가운 PBS로 세 번 씻어. </li><li> 최종 세척 후, 부드럽게 RNase와 단백 분해 효소 억제제를 준비 polysom​​e 용해 완충액 (PLB)의 동일한 볼륨에 튜브의 바닥에 resuspend 세포 펠렛을 버려야지. <ol class="lalpha"><li> 그것은 세포 펠렛의 정확한 양을 측정하는 것이 좋습니다. </li></ol></li><li> 세포의 clumps을 분리 해제하고 5 분을 위해 얼음에 lysate을 배양하기 위해 조심스럽게 pipet 혼합 (소용돌이하지 않음). </li><li> 4에 20 분에 13,000 XG에서 원심 분리기 ° C 파편의 lysate을 취소 할 수 있습니다. </li><li> 즉시 미리 차가운 microfuge 튜브에 표면에 뜨는 삭제 전송할 수 있습니다. </li><li> -80에서 얼음과 저장소에 보관 ° C. <ol class="lalpha"><li> 즉시 냉동 세포의 적절한 용해를 완료하고 원치 않는 바인딩을 방지 할 수 있습니다. RIP 바로 아래의 예제 해동을 진행하고 RNA 저하를 방지하기 위해 얼음에 샘플을 보관. &lt;/ 리&gt; <li> 이 lysate는 -80에서 6 개월에 저장할 수 있습니다 ° C. 이 단백질 및 / 또는 mRNA 저하로 이어질 수 있으므로 반복 동결 해동 사이클을 피하십시오. </li></ol></li><li> 표준 브래드 포드 단백질 분석을 사용하여 lysate에서 단백질 농도를 Quantitate. </li></ol> 2. 항체 및 워시와 외투 단백질은 세 파로스 비즈 <ol><li> 5 % BSA와 NT2 버퍼 (3-4 권)에서 하룻밤 사전 훌륭한 단백질 세 파로스 (PAS) 구슬. 4 ° C.에 저장 <ol class="lalpha"><li> 4에 몇 개월까지 장기 저장 ° C 0.1 % 나트륨 azide와 보충하면 가능합니다. </li><li> 단백질 세 파로스 비즈는 대상 RBP 항체의 isotype에 따라 선택해야합니다. 단백질 A, G 및 A / G 모두는 특정 isotype 목표를 가지고 대상 선호도에 따라 다양합니다. 단백질 세 파로스 비즈는 허 단백질 항체 isotype에 대한 특이성과 친화력을 바탕으로 사용되었습니다. </li></ol></li><li> 사용하기 전에, 그래서 초과 NT2 버퍼를 제거버퍼 비율 최종 구슬 1:1입니다. </li><li> 1.5 ML RNAse 무료 microcentrifuge 튜브를 사용하여 PAS 슬러리 100 μl를 제거하고 각 개별 IP 반응 (즉, 특정 RBP 및 isotype 제어)에 대한 항체의 30 μg을 추가합니다. </li><li> 항체 구슬 믹스에 NT2 버퍼의 100-200 μl를 추가합니다. <ol class="lalpha"><li> 혼합은 4에서 몇 주 동안 저장 될 수 있습니다 ° C 0.1 % 나트륨 azide와 보충합니다. </li><li> 같은 종의 isotype 검색 항체 또는 전체 일반 커는 배경 RNA에 대한 항체 제어로 병렬로 사용되어야합니다. </li></ol></li><li> 구슬 조합에 적절한 항체를 추가하고 4시에 끝으로 끝을 텀블링​​, 하루 아침에 품다 ° C. <ol class="lalpha"><li> (항체 1, 5, 10 또는 30 μg 일반적으로 충분합니다) 조사중인 특정 단백질에 대한 항체 titer를 최적화 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 1 ML로 세척하여 바로 사용하기 전에 항체 코팅 구슬을 준비얼음처럼 차가운 NT2 버퍼 5 회입니다. <ol class="lalpha"><li> 4의 1-2 분 ° C.에 13,000 XG에서 원심 분리하여 구슬 믹스를 씻어 </li><li> 조심스럽게 손 pipettor 또는 흡인기로 supernantant의 최대 양을 제거하지만, 펠렛을 방해하지 않도록 할주의하십시오. </li><li> 세탁은 항체 혼합물로부터 언 바운드 항체뿐만 아니라 RNase의 오염 물질을 제거하는 데 도움이됩니다. </li></ol></li><li> 일단 최종 세척이 완료되었습니다, 100 MM의 40 U / μl, 10 μl의 RNase의 10 μl 출력을 포함하여 대상 mRNAs를 보호하기 위해 다양한 RNase 억제제 치료에 이어 얼음처럼 차가운 NT2 버퍼 700 μl의 구슬을 resuspend DTT, 15 μl EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (15 ㎜). NT2 버퍼로 1,000 μl에 볼륨을 가져와. <ol class="lalpha"><li> Vanadyl의 ribonucleoside 단지는 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 억제 효과로 인해 사용되지 않습니다. </li></ol></li></ol> 3. Immunoprecipitation와 RNA 강수량 <ol><li> 선택 Preclear 단계 :<ol class="lalpha"><li> 배경을 줄이기 위해 구슬 및 제어 항체는 사전 투명한 lysate로 사용할 수 있습니다. 이 출력 신호를 줄일 수 있습니다. </li><li> 이 단계는 microarray 다음 IP을 수행 할 때 배경을 줄이기 위해 필요할 수 있습니다. 그것은 일반적으로 qRT-PCR 다음 IP에 대한 필요가 없습니다. </li><li> Preclear 30 분 / 4 끝 이상 ° C 텀블링 엔드에 대한 isotype 제어의 15 μg을 갖추고 있습니다. </li><li> 단계 2.1에서 항체와 비 코팅 preswollen PAS 비즈의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 마지막 30 분 / 4 ° C 회전 엔드와를 품다 </li><li> 4 ° C.에서 10,000 XG에 원심 분리기 IP에 대한 표면에 뜨는 저장합니다. </li></ol></li><li> 준비된 항체 믹스로 분리 해제 lysate (약 2-5 MG) 100 μl를 추가합니다. <ol class="lalpha"><li> lysate를 Diluting 것은 배경 및 특이 현상 구속력을 줄이기 위해 도움이 될 것입니다. </li><li> lysate 입력 한 금액 검출 방법 및 RBP O의 풍부한에 따라 달라질 수 있습니다RBP 항체의 연구 효율은 단계 1.1.c.에 기록 </li></ol></li><li> (선택 사항) 즉시 부드럽게 4에 10,000 XG에서 간단한 원심 분리 한 다음 여러 번 flicking하여 튜브를 섞어 ° C 펠릿 구슬로 즉시 표준 RNA 절연 기술을 사용하여 qPCR 분석을위한 총 입력 mRNA 표현과 같은 표면에 뜨는 100 μl를 제거합니다. <ol class="lalpha"><li> 이 단계는 입력 lysate RNA는 IP에 대한 최적입니다 만 검사 단계 또는 가난한 RNA 결과 RIP에 따라 문제 해결 단계로 수행해야합니다 확인하기위한 것입니다. </li></ol></li><li> parafilm의 랩 튜브 끝으로 끝을 텀블링​​ 2 ~ 4 시간에 4에 꼭 씰링 및 배양 ° C를 보장합니다. <ol class="lalpha"><li> 부화에 타이밍을 대상 풍부에 따라 최적화되어야하며 복잡한 다시 정리하기 또는 저하를 방지하기 위해 최소화되어야한다. 일부 RBPs를 들어 짧은 incubations 더 최적의 수 있습니다. </li></ol></li><li> 5000 xgf의 펠릿 비즈또는 4에서 5 분 ° C와 서양 얼룩에 의해 잠재적 인 분석을 위해 표면에 뜨는 저장합니다. -80에서 저장 aliquots ° C. <ol class="lalpha"><li> 잔여 대상 단백질의 높은 양이있는 표면에 뜨는의 Aliquots는 세 파로스 구슬에 의해 유발되는 단백질의 실패를 나타낼 수 있습니다. </li></ol></li><li> 이전에 설명한 바와 같이, 얼음처럼 차가운 NT2 버퍼와 원심 분리 1 ML과 비즈를 다섯 번 씻어 (4에서 5 분 5,000 XG ° C)가 손 pipettor 또는 흡인기로 표면에 뜨는 제거합니다. <ol class="lalpha"><li> 더 엄격한 세척 방법은 나트륨 deoxycholate, 우레아 또는 SDS와 NT2 버퍼를 보완하여 배경을 줄이기 위해 사용할 수 있습니다. </li><li> 얼음 최대한의 샘플을 유지하고 목표 mRNA의 저하를 최소화하기 위해 신속하게 작동합니다. </li></ol></li><li> 선택 사항 : 서양 얼룩 분석을 사용하여 대상 단백질의 IP 효율성을 확인을위한 비즈 믹스의 작은 나누어지는 (10 %)를 저장 또는 병렬로 추가 샘플을 실행합니다.</li></ol> 4. DNase와 Proteinase K 처리 <ol><li> 세척 후, NT2 버퍼 100 μl와 resuspend 구슬은 RNase 무료 DNase 1 (2 U / μl)의 5 μl를 보충. </li><li> 5-10 분 동안 37 ° C에서 보관. NT2 버퍼 1 ML을 추가하고 실온에서 1 분에 5,000 XG에 원심 분리기. <ol class="lalpha"><li> 구슬의 작은 (~ 10 %) 나누어지는이 SDS-PAGE 분석하여 IP 효율성을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 100 μl NT2 버퍼, 5 μl Proteinase K (10 MG / ML), 및 1 μl 10% SDS에 Resuspend 펠릿 PAS. </li><li> 부드럽게 매 10 분에서 flicking, 55 ° C 물 목욕시 30 분에 resuspended 비드 혼합물을 품다. <ol class="lalpha"><li> Proteinase K는 RNP 구성 요소의 릴리스에 도움이됩니다. </li></ol></li><li> 5 실온 (RT)에서 분, 표면에 뜨는 (~ 100 μl)를 수집 5,000 XG에서 펠렛의 구슬. </li><li> 구슬 200 μl NT2 버퍼 centri을 추가RT에서 2 분에 fuge 5,000 XG는 표면에 뜨는 (~ 200 μl) 및 폐기 비즈를 수집합니다. </li><li> supernatants (100 μl와 200 μl)을 결합하고 산 페놀-CHCl 3 300 μl 낮은 레이어를 추가합니다. </li><li> 소용돌이, 1 분 RT (또는 37 ° 흔드는에서 C) 및 1 분에 대한 RT에서 16,000 XG에서 원심 분리기. </li><li> 상부 층 250 μl (인터페이스를 방해하지 마십시오)을 수집, 산도 5.2 625 μl 백퍼센트 ETOH 5 μl glycoblue에 25 μl 나트륨 아세테이트를 추가하고 잘 섞는다. </li><li> -20 ° C.에서 하루 아침에 저장 <ol class="lalpha"><li> RNA의 적절한 복구를 보장하기 위해 glycoblue의 추가는 캐리어 분자의 역할을하여 RNA 펠렛의 가시성을 높일 수 있습니다. </li></ol></li><li> 다음 날, 반전 3-5 배 혼합 튜브는 30 분 4에서 12,000 XG에서 스핀 ° C와 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 파란색 펠렛과 반전이나 vortexing하여 혼합에 70 % ETOH 1 ML을 추가합니다. </li><li> 2 분에 대해 4 ° C에서 12,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 디표면에 뜨는을 iscard와 4에서 1 분에 12,000 XG를 원심 분리기 ° C. </li><li> 5 분에 대한 RT에서 피펫, 공기 건조 펠릿과의 잔여 70 % ETOH를 제거합니다. </li><li> RNase / DNase 무료 물이나 필요에 따라 다른 적절한 양의 20-40 μl에 Resuspend. <ol class="lalpha"><li> 샘플는 현재 qRT-PCR 또는 microarray 등의 추가 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 준비가되었습니다. </li><li> Nanodrop 분광 광도법은 샘플 농도를 평가에 사용될 수 있지만, 귀중한 샘플, 그건 낭비 상대적으로 부정확 할 수 있으므로 nanodropping 샘플을 피할 도움이 될 수 있습니다. 우리는 귀중한거나 낮은 항복 샘플에 대한 순도와 IP 효율성을 평가하는 하우스 키핑 유전자 성적 증명서를 정상화 샘플을하시기 바랍니다. </li></ol></li></ol> 5. 대표 결과 프로 시저가 최적화 올바르게 수행 된 경우 immunoprecipitation는 mRNA 대상의 상당 농축를 얻을 수 있습니다. 일반적으로qRT-PCR에 의해 평가 때 50 배에 - RBP 및 mRNA 대상 (들)에 따라, 우리는 약 10 농축을 참조하십시오. RBPs 많은 타겟이 microarray 분석을 사용하여 실내 masse을 발견 할 수 있습니다. 그러나,이 방법은 qRT-PCR에 비해 저하에 더 민감하다. RBP에 따라 목표와 반응의 효율의 수는, microarray는 소설 대상 수백을 표시 할 수 있습니다, 또는 경우에만, 몇를 발견 할 수 있습니다. 예를 들어, 더 나은 특징 RNA 결합 단백질 허 중 하나 인 후 transcriptionally 여러 중요한 생리 유전자 1, 2의 표현과 번역을 규제하고있다. 유방암 세포 라인에 RIP 칩을 통해 허 - ribonucleo - 복합 절연 예를 들어, 그림 1에서와 같이 qRT-PCR을 사용하여 β-고를 포함한 여러 중요한 알려진 허 대상의 농축을 공개했다. 암 세포 라인 모두에서 β-고를는 12 풍부합니다 - 15 배에. 일반적으로 제대로 수행 할 때 우리는 큰 enr를 참조셀 라인의 다양한 β-고를의 ichment. RIP는 β-고를에 대한 상당한 이득을 공개하지 않는 경우에는이 RIP에 문제가 있음을 나타냅니다과 절차는 반복해야 할 수도 있습니다. 또한, 이러한 세포 라인에서 immunoprecipitated 샘플 microarray 분석은 다른 에스트로겐 수용체의 허 타겟의 독특한 표현 하위 집합 (ER) 등 ER 부정적 메가바이트-231 유방암 세포 라인 대 긍정적 인 MCF-7 암 세포가 그림 2 1 시연을 공개했다. 어느 관련된 암과 관련되지 않은 알려진 알 수없는 허 목표 :이 목표는 여러 범주로 나눌 수 있습니다. 예를 들어, CALM2과 CD9 모두 이전에 허 목표로 식별되지 않은 암 ​​유전자 있습니다. 180 배는 허 단백질하고 이러한 목표 유전자 사이의 눈에 잘 띄는 상호 작용을 나타내는 허 펠릿에 풍부에 - qRT-PCR, CALM2과 CD9으로 microarray를 사용하고 확인은 5가된다는 것을 발견했다. <iMG SRC = &quot;/ files/ftp_upload/3851/3851fig1.jpg&quot;ALT = &quot;그림 1&quot;/&gt; 1 그림. Immunoprecipitation 및 메가바이트-231에서 RIP (ER-)와 MCF-7 (ER +) 유방암 세포. Immunoprecipitations은 안티 - 허 단클론 항체 (3A2)와 IgG1 isotype 컨트롤을 사용하여 메가바이트-231 또는 MCF-7 세포 lysates에서 수행되었다. 3A2에 의해 감지로 허의 A. IP 서양이 예상 크기의 밴드를 공개했다. 오른쪽에있는 패널을로드하는 컨트롤과 같은 β-tubulin과 함께 두 세포 라인에서 사용 lysates 입력에 허의 양을 드러내고있다. 정량 RT-PCR에 의한 B. 검증은 각각 메가바이트-231과 MCF-7에서 3A2 된 IP에서 β-고를의 십오 및 11 배 enrichments, 알려진 허 대상을 보여 주었다. 모든 ΔΔCT 값은 GAPDH로 표준화되었다. 실험은 (N = 2) 중복 이루어했다. <img src="/files/ftp_upload/3851/3851fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 허 RIP-칩은 ER + 및 ER-유방암 세포에 독특한 유전자 프로파일을 식별합니다.허의 immunoprecipitations는 메가바이트-231 또는 허 항체와 Illumina Sentrix 배열 (47,000 유전자)에 hybridized IgG1 isotype 컨트롤을 사용하여 MCF-7 세포 lysates에서 수행되었다. 제어 신호 차감되었습니다. 결과는 12 개의 배열의 누적 데이터를 나타냅니다. 실험은 일치 컨트롤 각 셀 라인에 대한 세중의 (N = 3)에서 수행되었다. 비늘이 log2 있습니다.

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</ol>

제작자들은 더 경쟁 관심이 없다는 점 선언합니다.

본 실험, 최적화 및 경험의 특성으로 인해 성공적으로 의도 된 결과를 획득 할 수있는 유일한 보장 방법이 될 것입니다. 이 절차의 여러 단계에서 온도와 시약 및 제품의 효율적인 처리는 매우 중요합니다. 적절한 계획과 기법의 실행 실험이 권장하는 최적의 온도에서 적절한 기간에 수행 된 것을 보장하는 데 도움이됩니다. RNA의 분리 실험과 주요 문제는 RNases의 저하에 RNAs의 감도입니다. 모든 시약은 RNase 무료 저장하거나 RNase 무료 용기에 사용 있어야합니다. 이렇게하면 mRNA 샘플의 무결성을 보장에서 중요한 단계입니다. 실험이 제대로 수행 경우에도 그러나, 원하는 결과는 RBP 및 대상 mRNAs 사이의 상호 작용의 특성으로 인해 달성되지 않을 수 있습니다. 한 잠재적 인 문제가 낮거나 RIP 칩에 의해 고립 된 RNA로부터도없이 신호가 발생했습니다.총 RNA의 신호가 될 수 있지만,이 구슬 타고 내려 오게되고 불충분 한 바인딩 단백질의 결과 일 수 있습니다. 첫 번째 문제 해결 단계는 사용중인 휴대 전화 lysate의 특정 RBP의 적절한 표현을 가지고 있는지 확인하는 것입니다. 확인 후, 단백질은 최종 NT2 세척 한 후 격리 될 수 있으며 5 분에 Laemmli 버퍼 또는 다른 적절한 denaturing 버퍼에 resuspended 95에서 가열 ° C. 서양 얼룩 분석은 충분히 관련된 단백질의 풀다운 보장하기 위해 입력 lysate뿐만 아니라 부정적인 컨트롤 조정에서 이러한 샘플을 사용할 수 있습니다. 또한, 셀을 lysing하면 이러한 구성 요소에 액세스하는 데 필요한 때문에, 일반적으로 분리 된 단백질과 mRNA 사이의 이상 및 원치 않는 상호 작용에 대한 가능성이 유입 될 수있다. 이러한 상호 작용은 잠재적으로 바인딩하고 특이 현상의 상호 작용을 통해 대상 mRNAs 또는 바인딩 단백질 &quot;을 만끽&quot;수 있습니다. 이러한 다양한 공동으로 또한, 단백질nditions는 여러 형태의 공간의 수와 바인딩을 모티브는 상호 작용을 방지, 그들의 목표 mRNAs에 액세스 할 수 없게 될 수 있습니다. 이 모두 효율적으로 작업뿐만 아니라 이러한 원치 않는 상호 작용을 제한하는 나와있는 최적의 온도를 활용의 중요성을 강화. 또한 각 특정 대상 단백질에 대한 조건을 세척의 최적화 상호 작용의 순도를 극대화하는 것이 중요합니다. 더 엄격한 세척 조건이 필요 할 수 있습니다. 예를 들어, 세탁 버퍼는 SDS 또는 신호 출력에 특이 현상 상호 작용과 배경을 줄이기 위해 요소의 적절한 금액을 보충 할 수 있습니다. 이 실험의 대상 RBP뿐만 아니라 독특한 생리적 조건에서 대상 mRNA에 완전히 의존 될 것입니다. 일부 조건은 샘플의 준비에 주목해야한다 특정 mRNA 분석 도구, 적합하지 않습니다. 마지막으로,하지만 RIP는 RNA의 농축에 성공- RBP 상호 작용, RIP (칩) 메소드와 잘 알려진 문제는 과도 mRNA 대상에 RBP의 특정 바인딩 도메인을 식별 할 수 없다는 것입니다. 여러 상호 연결 기술은 고유 한 시퀀스 목표를 분리하기 위해 RIP 뒤에 사용할 수 있지만, 단파 UV의 사용은 핵산 손상 될하는 경향이있다. PAR-CLIP, 또는 photoactivatable ribonucleoside의 crosslinking와 immuoprecipitation,로 알려진 새로운 방법은 안정적이고 과도 모두 RNA 상호 작용의 독특한 바인딩 사이트의 식별을 허용 초기 RNA에 thiouridine를 통합 할 수 긴 웨이브 UV을 사용합니다. 전반적으로, RIP 칩은 우리의 그룹뿐만 아니라 다른 많은 연구 그룹에 의해 RNA 결합 단백질과 mRNA 대상 사이의 상호 작용을 분리하고 공부하는 데 훌륭한 도구로 자리 매김하고 있습니다. 자연과 연습에 민감하지만,이 절차의 적절한 실행 최근까지 inacc되었습니다 이러한 RNP 단지의 고립을 얻을 것입니다발견 및 분석을위한 essible.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 1 M dithiothreitol </td><td> 어부 </td><td> BP172-5 </td><td> DTT </td></tr><tr><td> DNase 1 </td><td> Ambion </td><td> 2235 </td><td> RNase 무료 </td></tr><tr><td> Tetraccetic 산을 Ethylendiamine </td><td> 어부 </td><td> BP118-500 </td><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td></tr><tr><td> 글리코겐 </td><td> Ambion </td><td> 9516 </td><td></td></tr><tr><td> 1 HEPES </td><td> 시그마 </td><td> H3375-100G </td><td> 산도 7.0 </td></tr><tr><td> Igepal Nonidet P-40 </td><td> USB </td><td> 78,641 </td><td> NP40 </td></tr><tr><td> 1 M KCl </td><td> 어부 </td><td> BP366-500 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2 </td><td> 어부 </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> NT2 버퍼 </td><td> * 아래 참조 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Polysom​​e 용해 버퍼 </td><td> * 아래 참조 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 프로테아제 억제제 칵테일 알약 </td><td> 로슈 </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> 단백질 세 파로스 비즈 </td><td> 시그마 </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> 어부 </td><td> BP1700-100 </td><td></td></tr><tr><td> RNase 저해제 아웃 RNase </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td> 40 U / μl </td></tr><tr><td> 1 M NaCl </td><td> 어부 </td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 dodecyl 황산 </td><td> 어부 </td><td> BP166-500 </td><td> SDS </td></tr><tr><td> 1 M 트리스 - HCL </td><td> 어부 </td><td&gt; BP153-500 </td><td> 산도 7.4 </td></tr><tr><td> Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596-026 </td><td></td></tr><tr><td> Vanadyl Ribonucleoside 단지 </td><td> 뉴 잉글랜드 연구소 </td><td> S1402S </td><td> VRC </td></tr></tbody></table> <table border="1"><tbody><tr><td> 시약 정밀 검사 </td></tr><tr><td> RNase / DNase 무료, DEPC - 처리 유리에 시약을 준비 </td></tr><tr><td> Polysome 용해 버퍼 </td></tr><tr><td> 100 MM KCl </td></tr><tr><td> 5 MM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 10 MM HEPES (산도 7.0) </td></tr><tr><td> 0.5 % NP40 </td></tr><tr><td> 1 ㎜ DTT </td></tr><tr><td> 100 단위 / ML RNase 아웃 </td></tr><tr><td> 400 μM VRC </td></tr><tr><td> 프로테아제 억제제 칵테일 태블릿 </td></tr><tr><td> Polysome 용해 버퍼의 5 ML </td></tr><tr><td> 1 M의 HEPES 50 μl (산도 7.0)를 추가 </td></tr><tr><td> 1 M KCL 500 μl </td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2의 25 μl </td></tr><tr><td> NP40의 25 μl </td></tr><tr><td> 4.7 ML RNase-DNase 무료 H 2 O </td></tr><tr><td> 1 M DTT의 50 μl </td></tr><tr><td> 100 U / ML RNase의 12.5 μl 아웃 </td></tr><tr><td> 200 μl 프로테아제 억제제 칵테일 (제조업체에 따라 해산) </td></tr><tr><td> 10 μl 200 MM VRC (사용시) </td></tr><tr><td> NT2 버퍼 </td></tr><tr><td> 50 MM 트리스 - HCL (산도 7.4) </td></tr><tr><td> 150 MM NaCl </td></tr><tr><td> 1 ㎜ MgCl 2 </td></tr><tr><td> 0.05 % NP40 </td></tr><tr><td> NT2 버퍼 1 L </td></tr><tr><td> 50 ML 트리스 (산도 7.4) </td></tr><tr><td> 30 ML 5 M NaCl </td></tr><tr><td> 1 ML 1 M MgCl <suB&gt; 2 </td></tr><tr><td> 500 μl NP40 </td></tr><tr><td> 820 ML RNase-DNase 무료 H 2 O </td></tr></tbody></table>

rip 칩을 사용하여 세포 추출물에서 mrnas, micrornas 및 ribonucleoprotein 단지의 단백질 구성 요소의 분리 및 확인에 방법

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

높은 처리량 시퀀싱하고 효율적인 microarray 분석의 발전의 결과로서, 글로벌 유전자 발현 분석은 데이터 수집의 간편하고 쉽게 사용할 수 양식이되었습니다. 그러나 많은 연구와 질병 모델에서 대상 유전자 mRNA의 정상 상태 수준은 언제나 정상 상태 단백질 수준 상관 관계를하지 않습니다. 포스트 전사 유전자 조절은 둘 사이의 차이가 크다는의 가능성이 설명입니다. RNA 바인딩 단백질 (RBP)의 바인딩에 힘 입어 포스트 전사 규제 대상 mRNAs와 Ribonucleoprotein (RNP) 복잡한을 형성하여 mRNA의 현지화, 안정성 및 번역에 영향을 미칩니다. RNP 단지의 세포 추출물에서 이러한 알 수없는 드 노보 mRNA 목표를 확인하는 것은 이해 메커니즘과 RBP와 단백질 출력에서​​의 결과에 큰 영향을의 기능에 중요한 것입니다. 이 프로토콜은 s의 식별을 허용 RNP immunoprecipitation-microarray (RIP 칩)를 칭했다 방법을 설명추가로 개별 연구자에 대한 실험을 최적화하는 옵션과 함께 pecific mRNAs는 변화 실험 조건 하에서, ribonucleoprotein 단지에 연결된 상태입니다. 이 중요한 실험 도구, 연구자들은 후 전사 유전자 조절뿐만 아니라 다른 ribonucleoprotein 상호 작용과 관련된 복잡한 메커니즘을 탐색 할 수 있습니다.

RIP 칩을 통해 RNA 관련 단지를 분리하고 식별 단계 프로토콜로 단계.

RIP 칩을 사용하여 세포 추출물에서 mRNAs, microRNAs 및 Ribonucleoprotein 단지의 단백질 구성 요소의 분리 및 확인에 방법

고처리량 시퀀싱과 효율적인 마이크로어레이 분석의 발전 결과로, 전반적인 유전자 발현 분석이 용이하고...

본 영상의 목적은 면역침전법을 이용하여 세포 추출물로부터 리보핵산단백질 복합체의 RNA 및 단백질 구성 성분을 분리하고 식별하는 방법을 시연하는 것입니다. 안녕하세요, 저는 미주리 대학교 분자 미생물 및 면역학과의 대학원생이며 Eli sso 박사님 지도하에 공부하고 있는 Garrett Dom입니다. 고처리량 시퀀싱과 효율적인 마이크로어레이 분석의 발전으로 인해, 전역적 유전자 발현 및 분석은 많은 연구 및 질병 모델에서 쉽고 간편하게 이용 가능한 데이터 수집 형태가 되었습니다.하지만 표적 유전자 mRNA의 정상 상태 수준이 항상 단백질의 정상 상태 수준과 직접적으로 상관관계를 갖는 것은 아닙니다. 두 수치 간의 이러한 차이는 전사 후 유전자 조절로 설명될 가능성이 높으며, 이는 RNA 결합 단백질의 상호작용에 의해 유도됩니다.전사 후 조절은 표적 mRNA와 리보핵단백질 복합체를 형성함으로써 mRNA의 국소화, 안정성 및 번역에 영향을 미칩니다. 세포 추출물 내의 이러한 복합체로부터 알려지지 않은 de novo mRNA 표적을 식별하는 것은 RNA 결합 단백질의 메커니즘과 기능을 이해하고, 그로 인한 단백질 생성 효과를 파악하는 데 매우 중요합니다. 본 프로토콜에서는 리보핵단백질 복합체에 결합된 특정 mRNA를 식별할 수 있는 리보단백질 면역침강법(ribonucleoprotein immunoprecipitation, RIP)이라 불리는 방법을 설명합니다.실험을 시작하기 전에 모든 시약, 용기 및 도구를 준비하는 것이 중요합니다. 유리 기구는 Ambion사의 RNA ZAP와 같은 RNase 억제제로 처리한 후 DEPC 처리된 물로 헹궈 RNase-free 상태로 만들고, 모든 시약이 RNase-free임을 확인하십시오. 절차의 첫 번째 단계는 세포 용해물에서 리보핵단백질 복합체를 회수하는 것입니다. 사용되는 각 샘플당 2~5mg의 총 단백질을 생산할 수 있도록 지수 성장기의 조직 세포를 회수하며, 일반적으로 100mm 배양 접시 2개면 충분합니다.본 실험에서는 MB 231 및 MC seven 인간 유방암 세포주를 수확하여 RNA 결합 단백질의 리보핵산 상호작용을 조사합니다. 조사 대상인 각 RNA 결합 단백질에 대해, 적절한 표적 mRNA와 RNA 결합 단백질 간의 상호작용을 최대화하려면 총 세포 수와 단백질 양을 최적화해야 한다는 점에 유의하십시오. 4°C에서 약 8~10분 동안 1000 RPM으로 원심분리하여 세포를 펠렛화한 후, 차가운 PBS로 3회 세척합니다. 마지막 세척 후, 튜브 바닥을 가볍게 쳐서 세포 펠렛을 RNase 및 프로테아제 억제제가 포함된 조제된 폴리솜 용해 버퍼와 동일한 부피로 재현탁합니다.세포 펠릿의 정확한 부피를 측정하고, 파이펫으로 혼합물을 부드럽게 파이펫팅하여 세포 덩어리를 분해한 뒤, 용해물을 얼음 위에서 5분 동안 배양하는 것이 권장됩니다. 4°C에서 13,000 G로 20분 동안 원심 분리하여 용해물에서 부유물을 제거하십시오. 정제된 상층액을 즉시 미리 냉각된 RNase-free 마이크로 원심 분리 튜브로 옮겨 얼음 위에 보관하고, -80°C에서 저장하십시오.이 용해물은 -80°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다. 단백질 또는 mRNA의 분해를 초래할 수 있으므로 반복적인 동결-해동 주기를 피하십시오. IP는 즉시 수행하는 것이 가장 좋습니다.표준 Bradford 단백질 분석법을 사용하여 라이세이트 내 단백질 농도를 빠르게 정량합니다. 다음으로, 목표로 하는 특정 단백질을 분리하기 위한 재료를 준비해야 합니다. 먼저 단백질을 사전 팽윤시킵니다.5% BSA가 첨가된 NT two buffer에 Sphero 비즈를 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 보관하십시오. NT two buffer를 PAS 비즈와 4:1 비율로 사용하십시오. 4°C에서 최대 수개월 동안 장기 보관이 가능합니다.사용 전 0.1% sodium azi를 첨가한 경우, 최종 비드 대 완충액 비율이 1:1이 되도록 과량의 NT two buffer를 제거합니다. 1.5 milliliter RNA free micro centrifuge tube를 사용하여, 각 IP 반응당 100 microliters의 SRO speed slurry를 취하고 30 micrograms의 항체를 첨가합니다. 예를 들어, 본 실험에서는 mouse IgG one 항체인 who are antibody를 사용합니다.따라서 대조군 항체 또한 IgG를 사용합니다. 다음으로, 항체 비드 혼합물에 NT two 버퍼 100~200 µL를 첨가합니다. 또한, 백그라운드 RNA에 대한 항체 대조군으로 동일 종의 아이소타입 일치 항체 또는 정상 혈청 전체를 병행하여 사용해야 합니다.적절한 항체를 비드 혼합물에 첨가하고 4°C에서 오버엔드 텀블러로 하룻밤 동안 배양합니다. 사용 직전에 1mL의 얼음처럼 차가운 NT 2 버퍼로 5회 세척하여 항체 코팅 비드를 준비합니다. 4°C에서 13,000 G로 1~2분간 원심분리하여 비드를 세척합니다. 핸드 피펫터 또는 흡입기로 상층액을 조심스럽게 제거합니다.이 세척 단계는 항체 혼합물로부터 결합되지 않은 항체와 RNA 오염 물질을 제거하는 데 도움이 됩니다. 마지막 세척이 완료되면, 비즈를 700 µL의 차가운 NT2 버퍼로 재현탁하고, 표적 mRNA를 보호하기 위해 10 µL의 RNase 억제제, 10 µL의 100 mM DTT 및 15 µL의 EDTA를 포함한 다양한 RNA 억제제를 처리합니다. NT2 버퍼를 사용하여 최종 부피를 900 µL로 맞춥니다.다음으로, 표적 복합체를 면역 침전시킵니다. RIP 절차 후 RNA 분석 시 배경 신호를 줄이기 위해 프리클리어(pre-clear) 단계를 수행할 것을 강력히 권장합니다. 4°C에서 30분 동안 15 µg의 아이소타이프 대조군(isotype control)으로 프리클리어를 수행하십시오. 항체가 코팅되지 않은 50 µL의 사전 팽창된 PAS 비드를 추가합니다.4°C에서 30분 동안 회전시키며 배양한 후, 4°C에서 10,000 G로 원심분리합니다. 펠릿을 형성합니다. 면역침강법(ip)을 위해 상층액을 보관합니다.다음으로, 약 2~5 mg의 단백질이 포함된 분리된 투명 용해물 100 µL를 준비된 항체 혼합물에 첨가합니다. 용해물을 희석하면 배경 신호를 줄이는 데 도움이 됩니다. 튜브를 랩으로 감싸고 파라필름으로 밀봉하여 4 °C에서 4시간 동안 회전시키며 배양합니다. 이후 4 °C에서 5,000 ×g로 5분 동안 원심분리하여 비드를 펠렛화하고, 상층액은 앞서 설명한 대로 -80 °C에 보관하여 추후 분석에 사용합니다. 비드를 1 mL의 ice-cold TNT buffer로 5회 세척하고 원심분리합니다.그 다음 핸드 피펫터나 흡입기(aspirator)를 사용하여 상층액을 제거합니다. NT2 버퍼에 sodium deoxy coate, urea 또는 SDS를 첨가하여 배경 신호를 줄이기 위한 더 엄격한 방법을 사용할 수 있습니다. 표적 mRNA의 분해를 최소화하기 위해 샘플을 가능한 한 얼음 위에 보관하고 신속하게 작업하십시오.마지막으로, DNAse 및 proteinase K 처리 후 RNA 침전법을 사용하여 리보핵산단백질(ribonucleoprotein) RNA를 분리합니다. 세척 후, 5 µL의 RNAse-free DNAse I이 첨가된 100 µL의 N NT2 버퍼로 비드를 재부유시킵니다. 샘플을 37 °C에서 5~10분 동안 유지합니다. N NT2 버퍼 1 mL를 추가하고 5,000 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다.상층액을 버리고 SROs 펠릿을 10 mg/mL의 proteinase K 5 µL와 10% SDS 1 µL가 포함된 NT2 버퍼 100 µL로 재부유시킵니다. 재부유된 비드 혼합물을 55 °C 항온수조에서 30분 동안 배양하며, 10분마다 가볍게 튕겨 섞어줍니다. Proteinase K는 리보핵단백질 성분의 방출을 돕습니다. 비드를 펠릿화합니다.실온에서 5,000 G로 5분 동안 원심분리하고, 부피가 약 100 µL인 상층액을 수집합니다. 다음으로 비드에 NT 2 버퍼 200 µL를 첨가하고 5,000 G에서 2분 동안 원심분리합니다. 상층액 약 200 µL를 수집하고 비드는 폐기합니다.상층액을 합친 후 하층 산성 페놀 300 µL를 첨가하고 볼텍싱합니다. 실온에서 1분간 처리한 후, 실온에서 최대 속도로 1분간 원심분리합니다. 상층액 250 µL를 수집합니다.인터페이스가 흐트러지면 오염될 수 있으므로 매우 주의하십시오. RNA 샘플에 pH 5.2의 sodium acetate 25 µL, 냉각된 100% ethanol 625 µL, glyco blue mix 5 µL를 추가합니다. 잘 섞은 후 -20 °C에서 하룻밤 동안 보관하십시오.또한, RNA를 적절하게 회수하기 위해 GlycoBlue를 첨가합니다. GlycoBlue는 운반체 분자로 작용하여 다음 날 RNA 펠렛의 가시성을 높여줍니다. 튜브를 3~5회 반전시켜 혼합한 후, 4°C에서 12,000 G로 30분간 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 냉각된 70% ethanol 1 mL를 푸른색 펠렛에 첨가하고, 반전 혼합 또는 볼텍싱 후 원심분리합니다.4°C에서 12,000 G로 2분간 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 4°C에서 12,000 G로 1분간 다시 원심분리합니다. 피펫으로 남아있는 70% ethanol을 모두 제거하고 펠렛을 공기 건조시킵니다.실온에서 5분 동안 방치합니다. 20~40 µL의 RNA 및 DNA free water로 다시 현탁합니다. 이제 샘플은 NanoDrop 분광법을 통한 정량 분석과, RNA 분리 후 quantitative real-time PCR 또는 microarray 분석과 같은 추가적인 하위 응용 분석을 수행할 준비가 되었습니다. RNA 결합 단백질인 whoare의 mRNA 표적과 면역침강법을 통한 결과적인 농축도를 밝히기 위해 microarray 및 quantitative real-time PCR을 수행하였습니다.웨스턴 블롯(western blot)을 통한 확인 결과, 단백질이 깨끗하게 분리되었음을 알 수 있습니다. 정량적 PCR(Quantitative PCR)은 IgG 컨트롤과 비교하여 표적 mRNA인 beta actin의 배수 농축도를 보여줍니다. 마이크로어레이 분석 결과 MC seven과 MB 2 31 유방암 세포주 사이에 고유한 유전적 프로파일이 나타났으며, 전반적으로 리보핵단백질 면역침강법(rib nucleo protein immunoprecipitation)은 본 연구진뿐만 아니라 많은 다른 연구 그룹에서 RNA 결합 단백질과 그 표적 mRNA 사이의 상호작용을 분리하고 연구하는 데 사용되는 우수한 도구로 확립되었습니다. 이 절차는 특성상 세심한 주의와 숙련도가 필요하지만, 적절하게 수행한다면 최근까지 발견 및 분석이 어려웠던 이러한 리보핵단백질 복합체를 분리해 낼 수 있습니다.

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연구

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Biology

생물학

사전 mRNA의 과도 특성으로 인해, 그것은 분리하고 공부하기에 어려울 수...

인간 사전 mRNA에 매핑 Ribonucleoproteins에 대한 신속한 하이 스루풋 방법 (RNPs)

특정 조직에서 세포의 서브 세트의 유전자 발현 분석가 중대한 과제이다. 이 문서에서는 레이저 캡처 미세 절제와 빠른 immunolabeling 방법을 결합하여 특정 세포 집단에서 고품질의 총 RNA를 분리하는 방법에 대해 설명합니다.

셀 특정 부분 집단에서 RNA 분리 빠른 Immunolabeling과 결합 레이저 캡처 이외에 Microdissection을 사용하여

이 원고는 특정 올리고뉴클레오티드 유도 농축을 통해 진핵 세포에서 형성된 동족 RNP를 선별하는 방법을 설명합니다. DHX9/RNA 헬리카제 A로 구성된 레트로바이러스 5' 미번역 영역에 결합된 동족 RNP를 분리하여 이 접근법의 적용 가능성을 입증합니다.

올리고 뉴클레오티드 지시 용출을 사용하여 세포에서 동족 RNA 단백질 단지의 분리

RNA-단백질 상호 작용은 많은 세포 과정의 핵심에 있습니다. 여기에서는 특정 RNA를 분리하고 이와 관련된 새로운 단백질을 식별하는 in vivo 방법에 대해 설명합니다. 이것은 RNA가 세포에서 어떻게 조절되는지에 대한 새로운 빛을 비출 수 있습니다.

빠른 방법론에 의해 소설 RNA 결합 단백질 분리

이 보고서 mRNA 표적 세포 miRNAs의 유효성 검사에 대 한 신속 하 고 신뢰할 수 있는 방법을 설명 합니다. 잠겨 핵 산 LNA 기반 miRNA 합성 biotinylated 캡처를 모방한 메서드 사용 대상 mRNA. 그 후, 자석 구슬 streptavidin 입히는 풀 다운 고용 되어 대상 mRNA 정량 연쇄 반응에 의해 정량화에 대 한.

Biotin 기반 풀 다운 유효성 검사 mRNA를 표적 세포 miRNAs 분석 결과

Endogenously 구성 된 mRNA 단백질 복합물의 복구에 대 한 협동 RNA 격리 절차 (여행) 설명 되어 있습니다. 특히, RNA-단백질 복합물 가교 된에서 vivo에서, polyadenylated RNAs는 격리 oligo(dT) 구슬, 추출 물 이며 특정 한 mRNAs와 수정 된 RNA 센스 oligonucleotides 캡처됩니다. 단백질 mRNAs에 바인딩된 immunoblot 분석에 의해 검색 됩니다.

진 핵 세포 mRNA 단백질 복합물을 복구 하는 Oligonucleotide 기반 협동 RNA 격리 절차

단백질 바인딩 두 코딩 및 noncoding 식별을 클릭 화학 기반 RNA 위하여 캡처 (CARIC) 전략을 적용 하기 위한 자세한 프로토콜 RNAs 제공 됩니다.

캡처 클릭 화학 기반 RNA 위하여를 사용 하 여 RNA 의무적인 단백질의 포착 (CARIC) 전략

여기서는 작은 RNA를 격리하고, microRNAs를 보강하고, 처리량이 높은 시퀀싱을 위한 샘플을 준비하기 위한 단계별 전략을 설명합니다. 그런 다음 시퀀스 읽기를 처리하고 오픈 소스 도구를 사용하여 microRNAs에 정렬하는 방법을 설명합니다.

MicroRNAs를 격리하고 시퀀싱하고 오픈 소스 도구를 사용하여 분석하기 위한 완벽한 파이프라인

여기에서, 우리는 포유류 세포에서 내인성 RNA 결합 사이트 또는 RNA의 "발자국"을 풍부하게 하는 프로토콜을 제시합니다:단백질 (RNP) 복합체. 이 접근은 RNP 소단위의 2개의 면역 강절을 관련시키고 그러므로 나란히 RNA 면역 침전이라고 불립니다 (RIPiT).

RNA의 발자국 의 식별:연속RNA 면역 침전을 통한 단백질 복합체 시퀀싱 (RIPiT-Seq)

여기서, 우리는 리보태그 시스템을 사용하여 성인 남성 마우스 생식세포의 선택집단으로부터 리보솜 및 관련 RNA의 면역침전을 기술한다. 전략적 번식과 신중한 면역 침전은 세균 세포 트랜스라토메에 알리고 돌연변이 표현형의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 깨끗하고 재현 가능한 결과를 초래합니다.

남성 마우스의 생식 세포에서 리보태그 면역 강하

배우세요 RIP 칩을 사용하여 세포 추출물에서 리보핵단백질 복합체의 RNA와 단백질 구성 요소를 분리하고 확인하는 방법입니다. 이 기술은 RNA 결합 단백질 상호작용을 연구하는 데 활용됩니다.

RIP 칩을 사용하여 세포 추출물에서 mRNAs, microRNAs 및 Ribonucleoprotein 단지의 단백질 구성 요소의 분리 및 확인에 방법

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