RIP 칩을 사용하여 세포 추출물에서 mRNAs, microRNAs 및 Ribonucleoprotein 단지의 단백질 구성 요소의 분리 및 확인에 방법

이 비디오의 목표는 면역침전법(immunoprecipitation method)을 사용하여 세포 추출물에서 리보핵단백질 복합체의 RNA 및 단백질 성분을 분리하고 식별하는 방법을 시연하는 것입니다. 안녕하세요, 제 이름은 Garrett Dom이고 University of Missouri의 분자 및 미생물학 및 면역학과에서 Eli sso 박사 밑에서 공부하는 대학원생입니다. 고처리량 염기서열분석 및 효율적인 마이크로어레이 분석의 발전으로 인해 글로벌 유전자 발현 및 분석은 많은 연구 및 질병 모델에서 쉽고 쉽게 사용할 수 있는 데이터 수집 형태가 되었습니다.

그러나 표적 유전자 mRNA의 연구 상태 수준이 항상 정상 상태 단백질 수준과 직접적인 상관관계가 있는 것은 아닙니다. 전사 후 유전자 조절(Post transcriptional gene regulation)은 둘 사이의 차이에 대한 가능한 설명입니다. RNA 결합 단백질의 상호 작용에 의해 주도됩니다.

전사 후 조절(post transcriptional regulation)은 표적 mRNA와 갈비뼈 핵 단백질 복합체를 형성하여 mRNA 국소화, 안정성 및 번역에 영향을 미칩니다. 이 복합체의 세포 추출물에서 이러한 알려지지 않은 Denovo mRNA 표적을 식별하는 것은 RNA 결합 단백질의 메커니즘과 기능, 그리고 단백질 출력에 미치는 영향을 이해하는 데 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 리보 단백질, 면역 면역침전 또는 RIP라고 하는 방법을 간략하게 설명하며, 이를 통해 리보핵단백질 복합체와 관련된 특정 mRNA를 식별할 수 있습니다.

실험을 시작하기 전에 모든 시약, 용기 및기구를 갖추는 것이 중요합니다. RNA는 ambion의 RNA ZAP와 같은 R nase 억제제로 유리 제품을 무처리 처리한 다음 dpci 처리된 물로 헹구어 모든 시약이 RNA가 없는 것으로 확인되도록 합니다. 절차의 첫 번째 단계는 세포 용해물에서 늑골 핵 단백질 복합체를 수확하여 기하급수적으로 성장하는 조직 세포를 사용하여 사용된 각 샘플에 대해 2-5mg의 총 단백질을 생산하는 것이며, 일반적으로 2개의 P, 1, 50 배양 접시로 충분합니다.

여기에서 우리는 7개의 인간 유방암 세포주인 MB 2, 31 및 MC를 수확하고 RNA 결합 단백질의 ribon nucleo 상호 작용을 조사하고 있습니다. 조사 중인 각 RNA 결합 단백질에 대해 적절한 표적 mRNA 및 RNA 결합 단백질 상호 작용을 최대화하기 위해 총 세포 수와 단백질 양을 최적화해야 한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 섭씨 4도에서 약 8-10분 동안 1000RPM에서 원심분리를 통해 세포를 펠릿화한 다음 얼음처럼 차가운 PBS로 3회 세척합니다.최종 세척 후 튜브 바닥을 부드럽게 튕기고 RNA 및 단백질 분해효소 억제제와 함께 준비된 폴리솜 용해 완충액과 동일한 부피로 세포 펠렛을 재현탁합니다.

세포 펠릿의 정확한 부피를 측정하고, 혼합물을 부드럽게 피펫으로 만들어 세포 덩어리를 분해하고, 얼음에서 5분 동안 용해물을 배양하는 것이 좋습니다. 13, 000 G에 분리기는 파편의 용해물을 맑게 하기 위하여 4 섭씨 온도에 20 분 동안 전 냉각된 RNAs에 즉각 맑게 한 상등액을 옮깁니다. 무료 마이크로 원심 분리기 튜브는 얼음에 보관하고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

이 용해물은 섭씨 영하 80도에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다. 반복되는 동결 해동 주기는 단백질 및/또는 mRNA 분해로 이어질 수 있으므로 피하십시오. IP를 즉시 수행하는 것이 가장 좋습니다.

표준 Bradford 단백질 분석을 사용하여 단백질의 농도와 용해물을 빠르게 정량화합니다. 다음으로, 관심 있는 특정 단백질을 분리하기 위한 물질을 준비해야 합니다. 먼저 단백질을 붓습니다.

Sphero는 5% BSA가 보충된 N NT 2개의 완충액에서 하룻밤 동안 구슬을 맺으며 섭씨 4도에서 저장합니다. PAS 비드와 함께 4:1 비율로 NT 2 버퍼를 사용합니다. 섭씨 4도에서 최대 몇 개월까지 장기 보관이 가능합니다.

사용 전에 0.1% sodium azi를 보충할 경우 최종 비드 대 완충 비율이 1:1이 되도록 과도한 NT 2 buffer를 제거합니다. 1.5 밀리리터 RNA free 마이크로 원심분리기 튜브를 사용하여 100 마이크로리터의 SRO 속도 슬러리를 제거하고 각 개별 IP 반응에 대해 30 마이크로그램의 항체를 추가합니다. 예를 들어, 우리 실험에서는 쥐 IgG 하나의 항체인 who is antibody를 사용합니다.

따라서 우리의 대조 항체도 IgG 항체입니다. 다음으로, 100 - 200 마이크로리터의 NT two 버퍼를 항체 비드 혼합물에 첨가합니다. 또한, 동형과 일치하는 항체 또는 동일한 종의 전체 정상 혈청을 배경 RNA에 대한 항체 대조군으로 병행하여 사용해야 합니다.

비드 믹스에 적절한 항체를 추가하고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 사용 직전에 1 밀리리터의 얼음 차가운 NT 2 개의 완충액으로 세척하여 4도에서 1-2 분 동안 13, 000G에서 원심분리로 비드를 5 번 세척하여 항체 코팅 비드를 준비하십시오. 핸드 피펫 또는 흡인기로 상층액을 조심스럽게 제거합니다.

이 세척은 항체 혼합물에서 결합되지 않은 항체와 RNA 오염 물질을 제거하는 데 도움이 됩니다. 최종 세척이 완료되면 Resus는 비드와 700마이크로리터의 얼음처럼 차가운 T 2 완충액을 현탁시킨 다음 다양한 RNA 억제제로 처리하여 10마이크로리터의 RNA, 10마이크로리터의 100밀리몰 DTT 및 15마이크로리터의 EDTA를 포함한 표적 mRNA를 보호합니다. NT 2 버퍼로 부피를 900마이크로리터로 가져옵니다.

다음으로, 표적 복합체를 면역 침전시킵니다. 섭씨 4도에서 30분 동안 15마이크로그램의 이소형을 대조하여 RIP 절차 사전 세척 후 RNA 분석에서 백그라운드 신호를 줄이기 위해 사전 세척 단계를 사용하는 것이 좋습니다. 항체로 코팅되지 않은 pres 팽창 PAS 비드 50 마이크로 리터를 추가합니다.

섭씨 4도에서 30분 동안 회전하고 섭씨 4도에서 10, 000G의 원심분리기에서 배양합니다. 두 개의 펠릿. ip에 대한 슈퍼 나틴을 저장하십시오.

다음으로, 약 2-5mg의 단백질과 함께 100마이크로리터의 분리된 세척 용해물을 준비된 항체 혼합물에 추가합니다. 용해물을 희석하는 것은 배경, 감싸는 관 및 paraform를 단단한 천장을 지키기 위하여 감소시킬 것이고, 5, 000 G에 5 °C에서 다음 펠릿 구슬에서 넘어지고, 4 섭씨 온도에 5 분 동안 넘어지고, 앞서 기술된 바와 같이 영하 80도에 저장해서 잠재적인 분석을 위한 supernat를 저장하는 데 도움이 될 것입니다. 1ml의 얼음처럼 차갑게 비드를 5번 세척하고 T 2개의 완충액과 원심분리를 합니다.

그런 다음 핸드 피펫 또는 흡인기로 수퍼 나틴을 제거합니다. NT 2 완충액에 소듐 데옥시 코에이트, 요뇨증 또는 SDS를 보충하여 백그라운드를 줄이기 위해 보다 엄격한 방법을 사용할 수 있습니다. 샘플을 가능한 한 얼음 위에 보관하고 신속하게 작업하여 타겟 mRNA의 분해를 최소화합니다.

마지막으로, DNA와 proteinase K 처리제와 RNA 침전을 사용하여 100마이크로리터의 N NT 2 완충액으로 세척 후 ribon 핵 단백질 RNA를 분리하고 5마이크로리터의 RNA free DNAs 1로 보충합니다. 샘플을 섭씨 37도에서 5-10분 동안 보관합니다. N NT 2 버퍼 1 밀리리터를 추가하고 5, 000 G에서 5 분 동안 회전합니다.

SUPERNAT Reese 스핀 단백질, SRO 펠렛 및 NT 2 완충액 100 마이크로 리터를 버리고, 밀리리터당 10 밀리그램의 단백질 분해 효소 K 5 마이크로 리터와 1 마이크로 리터의 10 % SDS를 10 분마다 부드럽게 튕기면서 섭씨 55 도의 수조에서 30 분 동안 재현 탁 된 비드 혼합물을 배양합니다. Proteinase K는 갈비뼈 핵 단백질 성분의 방출을 돕습니다. 펠릿 비즈.

5, 실내 온도에 5 분 동안 000 G를 추가하고십시오, 양에 있는 대략 100 마이크로리터이어야 하는 최고 이름을 모으십시오. 다음 두 개의 비드, 200 마이크로 리터의 NT 두 버퍼 원심 분리기를 5, 2 분 동안 000 G에 추가합니다. 약 200마이크로리터의 슈퍼 나틴을 모으고 구슬을 버립니다.

슈퍼 나틴을 결합하고 300 마이크로 리터의 하부 층 산 페놀 소용돌이를 첨가하십시오. 실온에서 1분, 실온에서 1분 동안 원심분리기 최대 속도. 250마이크로리터의 상층을 수집합니다.

인터페이스를 방해하면 오염될 수 있으므로 매우 주의하십시오. RNA 샘플은 5.2 625 마이크로 리터의 냉장, 100 % 에탄올 및 5 마이크로 리터의 글리코 블루 믹스의 pH에서 25 마이크로 리터의 아세트산 나트륨을 추가합니다. 글쎄, 영하 20도에서 밤새 보관하십시오.

또한 RNA의 적절한 회수를 보장합니다. 글리코 블루를 첨가하면 다음날 운반 분자로 작용하여 RNA 펠릿의 가시성을 높이고 3-5 번 반전하여 튜브를 혼합 한 다음 섭씨 4도에서 12, 000G에서 30 분 동안 회전하고 슈퍼 나틴을 버립니다. 파란색 펠릿에 냉각된 70% 에탄올 1ml를 넣고 반전 또는 볼텍싱 원심분리기로 혼합합니다.

섭씨 4도에서 2분 동안 12, 000G에서 샘플링합니다. 슈퍼네이트와 원심분리기는 섭씨 4도에서 1분 동안 12, 000G에서 폐기합니다. 피펫과 공기 건조 펠릿으로 잔류 70% 에탄올을 제거합니다.

실내 온도를 5분 동안 올립니다. 20-40 마이크로 리터의 RNA, DNA가없는 물에 다시 소비하십시오. 이제 샘플은 NanoDrop 분광법으로 정량화할 준비가 되었으며, RNA 분리, 마이크로어레이 및 정량적 real-time PCR을 수행한 후 정량적 real-time PCR 또는 마이크로어레이 분석과 같은 추가 다운스트림 응용 분야에서 RNA 결합 단백질의 mRNA 표적과 면역침전으로 인한 농축을 밝힐

웨스턴 블롯에 의한 확인은 누가 단백질인지에 대한 깨끗한 격리를 보여줍니다. 정량적 PCR은 IgG one 대조군과 비교하여 mRNA 표적 베타 액틴의 접힘 농축을 보여줍니다. 마이크로어레이 분석은 MC seven과 MB 2 31 사이의 고유한 유전적 프로필을 드러내지만, 유방암 세포주 전체 갈비뼈 핵 단백질 면역침전은 RNA 결합 단백질과 MR 간의 상호 작용을 분리하고 연구하는 데 사용되는 훌륭한 도구로 확립되었습니다. 우리 그룹과 다른 많은 연구 그룹의 목표는 본질적으로 민감하고 실제적이지만 이 절차를 적절하게 실행하면 최근까지 발견 및 분석을 위해 접근할 수 없었던 이러한 늑골 핵 단백질 복합체를 분리할 수 있습니다.