Dextran의 황산 나트륨 (DSS)를 사용 Murine 대장염 모델링

마우스에 3% DSS를 4일 동안 자유 섭취하게 합니다. 매일 체중과 설사 및 분변 혈흔의 존재 여부를 기록하며, 4일 후에는 DSS를 멸균수로 교체합니다. 멸균수를 3일 동안 섭취시킨 후, 마우스를 안락사시키고 결장을 적출합니다.

결장의 길이를 측정하고 무게를 잽니다. 그 후 결장을 스위스 롤(Swiss roll) 형태나 소시지 형태로 만들어 현미경으로 관찰합니다. 본 비디오 기사에서는 궤양성 대장염 마우스 모델에서 결장의 채취 및 처리 과정을 시연합니다.

이 절차는 덱스트란 황산나트륨 처리를 시작하기 전, 밴더빌트 대학교 암생물학과의 Christopher Williams 박사 연구실에서 대장염을 연구하는 데 사용됩니다. 실험 과정 전반에 걸쳐 기초 체중을 측정합니다. 생쥐의 체중을 매일 측정한 후, 물에 덱스트란 황산나트륨(DSS) 염을 3% w/v 농도로 용해하여 DSS 용액을 만듭니다.

이 모델이 효과적이려면 DSS는 저분자량이어야 합니다. 각 마우스 케이지의 급수병을 채울 수 있을 만큼 충분한 양의 DSS 용액을 조제하고, 0.45 micrometer 셀룰로오스 아세테이트 필터로 용액을 여과하십시오. 마우스 케이지의 식수병을 3% DSS 용액이 담긴 병으로 교체하십시오. 기관에서 자동 급수 시스템을 사용하는 경우, 마우스가 다른 수원에 접근할 수 없도록 급수구에 차단 팁을 장착하십시오.

4일 후, 대장염의 전신적 영향을 정량화하기 위해 마우스의 체중을 다시 측정합니다. 심각한 손상이 있을 때 체중 감소가 흔히 나타나지만, 동일한 날에 몇 일 더 지나야 뚜렷해질 수도 있습니다. 4일 차에 DSS 용액을 물로 교체하여 3일 더 유지함으로써 결장 상피 세포가 일부 회복될 수 있도록 합니다.

3일 후인 7일 차에 마우스의 체중을 다시 측정합니다. 그 후 다음 섹션에 설명된 대로 안락사시킨 마우스에서 결장을 적출할 수 있습니다. 결장을 적출하려면 안락사시킨 마우스의 복부 쪽을 노출시켜 복부에 방해 없이 접근할 수 있도록 합니다.

복부를 70% ethanol로 완전히 적십니다. 조직 포셉으로 복부 중앙선을 잡고 들어 올립니다. 이렇게 하여 미세 팁 가위를 이용해 피부를 텐트 모양으로 띄웁니다.

복부를 절개하여 복강 내 장기를 노출합니다. 절개선을 중앙선 상의 검상돌기 끝까지 확장한 다음, 양측 늑골 가장자리의 하단을 따라 확장합니다. 소장, 맹장 및 결장을 확인합니다.

주변 장간막으로부터 결장을 조심스럽게 박리하거나 떼어냅니다. 그 후, 골반 깊은 곳까지 결장을 횡단하여 직장으로부터 원위부 결장을 분리합니다.

동맥이나 정맥이 절단되지 않도록 주의해야 합니다. 또한, 결장은 쉽게 찢어질 수 있으므로 주의하시기 바랍니다. 따라서 장간막에서 결장을 조심스럽게 분리하십시오.

근위 결장을 분리하기 위해 Colona sequel 경계 부위에서 결장을 절단합니다. 결장을 제거한 후, 20 gauge 피딩 바늘과 10 milliliter 시린지를 사용하여 삽관하고, EIT에서 대변이 완전히 제거될 때까지 얼음처럼 차가운 PBS로 결장을 세척합니다. 결장의 원위부 끝이 본인과 가장 가까이 있도록 유지하여 결장의 올바른 방향을 유지하는 것이 중요합니다.

디지털 캘리퍼를 사용하여 결장 길이를 측정하는 것으로 시작하십시오. 결장 길이는 손상 정도를 나타내는 또 다른 지표입니다. 결장염은 부종을 증가시키고 전체적인 결장 길이를 단축시킵니다.

이 단계에서 수확한 결장은 육안 분석을 위해 소시지 형태로 처리하거나, 급성 결장염의 조직학적 분석을 위해 스위스 롤(Swiss roll) 형태로 제작할 수 있습니다. 다음 섹션에서는 결장을 소시지 형태로 처리하는 기술을 시연하겠습니다. 결장 전체의 육안 분석을 위해서는 결장의 올바른 방향을 유지하는 것이 중요합니다. 따라서 결장의 원위단을 사용자에게 가장 가까운 쪽에 두십시오.

비흡수성 봉합사를 두 조각 자르는데, 하나는 약 1인치 길이로 하고 다른 하나는 2인치 길이로 합니다. 2인치 길이의 봉합사를 사용하여, 밀봉 상태를 잘 유지하면서 결장 원위단(distal end)을 절단면과 최대한 가깝게 묶습니다. 그런 다음 10% 완충 포르말린 인산염 5mL가 들어 있는 20게이지 피딩 바늘을 결장 근위단(proximal end)에 삽입합니다.

공급 바늘의 벌브 바로 근위측에 남은 봉합사를 느슨하게 묶습니다. 이제 공급 바늘의 벌브 부분에서 결장을 단단히 잡고, 결장이 확장되도록 충분한 양의 포르말린을 주입합니다. 공급 바늘을 뽑으면서 봉합사의 매듭을 조여, 주입된 포르말린으로 확장된 결장 상태를 유지합니다.

소시지와 같은 형태로 15 milliliter 원추형 튜브에 10% 완충 포르말린 인산염 용액을 채우고 튜브에 라벨을 붙입니다. 결장을 튜브에 넣고 24시간 동안 고정합니다. 24시간 후, 포르말린을 적절한 폐기물 용기에 버리고 70% ethanol로 교체하여 추가로 24시간 동안 보관합니다.

결장은 실온의 70% ethanol에 무기한 보관할 수 있습니다. 결장을 분석할 준비가 되면 원뿔형 튜브에서 꺼내십시오. 메스를 사용하여 결장이 손상되지 않도록 주의하며 양 끝의 실을 자릅니다.

원위단에 가장 긴 실이 연결되어 있음을 기억하십시오. 결장을 원위단에서 근위단 방향으로 세로로 절개하여 긴 시트 형태로 만듭니다. 이제 해부 현미경으로 결장을 관찰할 수 있습니다.

결장을 세로로 절개하여 평평한 시트 형태로 펼칩니다. 결장을 말기 위해서는 두 쌍의 포셉과 양손 기술이 필요합니다. 포셉으로 원위부 결장 가장자리의 양측 외측단을 잡고, 포셉을 회전시키고 푸는 과정을 반복하며 근위부 가장자리 방향으로 순차적으로 말아줍니다. 이렇게 하면 3차원 나선형 구조인 스위스 롤(Swiss roll)이 형성됩니다.

결장이 watman 종이에 달라붙은 경우, 형태를 유지하기 위해 소량의 PBS로 종이와 결장을 적십니다. 핀셋으로 롤을 단단히 잡고 27.5 gauge 바늘로 가로 절단합니다. 바늘이 롤을 빠져나갈 때 바늘을 구부려 롤을 고정합니다.

이제 롤을 라벨이 부착된 조직 카세트에 넣고, 카세트를 10% buffered formalin phosphate가 담긴 병에 넣습니다. 조직을 고정하기 위해 실온에서 24시간 동안 둡니다. 24시간 후, 포르말린을 따라내고 70% ethanol로 교체하여 4시간 동안 더 둡니다.

대장은 70% ethanol에 담가 상온에서 무기한 보관할 수 있습니다. 이 모델을 통해 연구자는 대장을 적출, 고정 및 분석하여 대장염의 심각도를 분석할 수 있습니다. 전체 대장의 육안 분석을 위해, 대장을 포르말린으로 충전하여 완전히 확장시킨 소시지 형태로 처리할 수 있습니다.

개방된 소시지는 평평하게 놓여 있어야 합니다. 소시지법이 올바르게 수행되었다면, 고정된 결장은 확장되어 있으며 전체 점막 표면을 해부 현미경 하에서 쉽게 조작하고 관찰할 수 있습니다. 조직학적 분석을 위해 결장은 스위스 롤(Swiss roll) 방식으로 처리할 수 있습니다.

롤을 바늘로 고정하여 고정을 위해 조직 카세트에 넣습니다. 롤을 제대로 말았다면, 절단하여 마운팅했을 때 전체 결장의 대표적인 단면이 형성되어야 하며, 스위스 롤(Swiss roll)의 섹션을 헤마틴(hematin)과 ASIN으로 염색하여 결장 손상의 정도를 결정할 수 있습니다. 슬라이드 상의 롤 중심부에 결장의 원위단(distal end)이 위치한다는 점을 유의하십시오.

이 예시에서는 물을 처리한 대조군과 비교하여 DSS 처리된 결장에서 염증과 은와 손상이 뚜렷하게 나타납니다. 지금까지 급성 결장염 마우스 모델에서 결장을 채취하고 처리하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때는 희생 전 준비를 철저히 하는 것이 중요합니다.

예를 들어, 생쥐 실험의 경우 각 생쥐별로 모든 튜브와 카세트에 라벨을 부착하고, 모든 도구와 시약을 즉시 사용할 수 있도록 준비합니다. 또한, 생쥐의 체중과 결장 길이에 대한 상세한 기록을 유지하십시오. 마지막으로, 처리 과정에 충분한 시간을 할당했는지 확인하십시오.

초보자의 경우 마리당 보통 15분이 소요되며, 이 기술에 숙련된 사람의 경우 6분에서 8분 정도 소요됩니다.