Dextran의 황산 나트륨 (DSS)를 사용 Murine 대장염 모델링

식수에서 실시 Dextran 황산 나트륨 (DSS)은 급성 대장염의 설립 murine 염증성 손상 모델입니다. 이 프로토콜은 DSS 치료와 조직의 준비를 위해 방법을 설명합니다.

생쥐는 4일 동안 성욕에서 3%DSS를 투여합니다. 체중과 설사 및 대변 피의 존재는 매일 기록되지만 TSS는 4일째 이후에는 오토클레이브 물로 대체됩니다. 물 위에서 3일을 보낸 후 쥐는 안락사되고 결장이 제거됩니다.

결장이 측정되고 무게가 측정됩니다. 그런 다음 결장은 스위스 롤 또는 소시지로 형성되어 현미경으로 검사됩니다. 이 비디오 기사는 대장염의 murn 모델에서 결장을 채취하고 처리하는 방법을 보여줍니다.

이 절차는 덱스트린 설페이트 나트륨 치료를 시작하기 전에 밴더빌트 대학 암 생물학과의 크리스토퍼 윌리엄스 박사의 실험실에서 대장염을 연구하는 데 사용됩니다. 기준선 가중치는 실험 과정 전반에 걸쳐 얻어집니다. 쥐의 무게를 잰 후 일일 무게를 측정하고 부피당 3%의 무게, 덱스트린 황산나트륨 염 용액 또는 물에 DSS를 만듭니다.

이 모델이 효과적이려면 DSS가 저분자량이어야 하며, 각 생쥐 케이지에 물병을 채울 수 있을 만큼 충분한 DSS 용액을 만들고 0.45마이크로미터 셀룰로오스 아세테이트 필터로 용액을 여과해야 합니다. 마우스 케이지의 식수병을 3%DSS 용액이 들어 있는 병으로 교체하십시오. 기관에서 자동 급수 시스템을 사용하는 경우 관수 배출구에 제외 팁을 배치하여 생쥐가 다른 수원에 접근할 수 없도록 합니다.

4일 후, 대장염의 전신 결과를 정량화하기 위해 마우스의 무게를 다시 측정합니다. 체중 감소는 심각한 부상과 함께 일반적이지만 같은 날 며칠 동안 더 뚜렷하지 않을 수 있습니다. 4일차, DSS 용액을 물로 교체하여 3일 더 대장 상피가 회복될 수 있도록 합니다.

3일 후인 7일째 되는 날, 쥐의 무게를 다시 잰다. 그런 다음 다음 섹션에서 볼 수 있듯이 안락사된 쥐에서 결장을 적출할 수 있습니다. 결장을 적출하려면 안락사된 쥐의 복부 쪽을 노출시켜 복부에 방해받지 않고 접근할 수 있도록 합니다.

70% 에탄올로 복부를 완전히 적십니다. 티슈 겸자로 복부의 정중선을 잡고 들어 올립니다. 따라서 끝이 가는 가위를 사용하여 피부를 천막합니다.

복부를 절개하여 복부 내용물을 노출시킵니다. 절개를 정중선에서 xiphoid 돌기의 끝으로 확장한 다음 늑골 가장자리의 아래쪽을 따라 양측으로 확장합니다. 소장 맹장과 결장을 확인합니다.

조심스럽게 절개하고, 베고, 주변 장간막에서 결장을 괴롭힙니다. 그 후, 결장을 횡절하고 골반을 깊게 풀어줍니다. 직장의 원위 결장.

동맥이나 정맥이 절단되지 않도록 주의해야 합니다. 또한 결장이 쉽게 찢어질 수 있다는 점에 유의해야 한다. 따라서 장간막에서 결장을 부드럽게 제거하십시오.

근위 결장을 해제하기 위해 Colona 속편 가장자리에서 결장을 횡단합니다. 20게이지 수유 바늘과 10ml 주사기를 사용하여 결장과 총계를 제거하고 삽관을 하고 EIT에서 대변이 완전히 제거될 때까지 얼음처럼 차가운 PBS로 결장을 씻어냅니다. 결장의 원위 끝을 몸에 가장 가깝게 유지하여 결장의 올바른 방향을 유지하는 것이 중요합니다.

디지털 캘리퍼를 사용하여 결장 길이를 측정하는 것으로 시작하십시오. 결장 길이는 부상의 심각성을 나타내는 또 다른 지표입니다. 대장염은 부종을 증가시키고 전체 결장 길이를 단축시킵니다.

이 시점에서 적출된 결장은 거시적 분석을 위해 소시지로 가공하거나 급성 대장염의 조직학적 분석을 위해 스위스 롤로 만들 수 있습니다. 다음 섹션에서는 결장을 소시지로 처리하기 위해 이러한 기술을 시연합니다 결장 전체에 대한 거시적 분석을 위해서는 결장의 올바른 방향을 유지하는 것이 중요합니다. 따라서 결장의 말단부를 몸에 가장 가깝게 유지해야 한다.

비흡수성 봉합사 두 조각을 자르는데, 하나는 길이가 약 1인치이고 다른 하나는 길이가 2인치입니다. 2인치 길이의 봉합사를 사용하여 결장의 말단부를 가능한 한 가장자리에 가깝게 묶으면서 양호한 밀봉을 유지합니다. 그런 다음 10% 완충된 포르말린 인산염 5ml가 들어 있는 20게이지 영양 바늘을 결장 근위부 끝에 놓습니다.

나머지 봉합사 조각을 공급 바늘의 전구 바로 근처에 느슨하게 묶습니다. 이제 영양 공급 바늘의 전구에서 결장을 단단히 잡고 충분한 양의 포르말린을 주입하여 결장이 확장되도록 합니다. 수유 바늘을 빼낼 때 봉합사의 매듭을 조여 주입된 팽창된 결장을 남깁니다.

소시지로 15ml 원뿔형 튜브에 10% 완충, 포멀 및 인산염을 채우고 튜브에 라벨을 붙입니다. 결장을 튜브에 넣고 24시간 동안 고정합니다. 24시간 후, 포르민을 적절한 폐기물 용기에 붓고 추가로 24시간 동안 70% 에탄올로 교체하십시오.

결장은 실온에서 70% 에탄올에 무기한 보관할 수 있습니다. 결장을 분석할 준비가 되면 원뿔형 튜브에서 결장을 제거합니다. 메스로 양쪽 끝의 끈을 자르고 결장이 손상되지 않도록 주의하십시오.

말단 끝에는 가장 긴 끈 조각이 있다는 것을 기억하십시오. 결장을 원위부에서 근위부 끝으로 세로로 잘라 긴 시트를 형성합니다. 이제 결장을 해부 현미경으로 볼 수 있습니다.

결장을 세로로 자르고 결장을 평평한 시트로 배치합니다. 결장을 굴리려면 두 쌍의 집게와 양손 기술이 필요합니다. 집게로 원위 결장 가장자리의 양쪽 측면 가장자리를 잡고 집게를 회전시키고 풀어 근위 가장자리로 진행하여 결장을 순차적으로 굴려 3차원 또는 스위스 롤로 나선형을 생성합니다.

결장이 watman 종이에 달라붙는 경우 종이와 결장을 소량의 PBS로 적셔 형태를 유지합니다. 집게로 롤을 단단히 잡고 27 및 반 게이지 바늘로 교차합니다. 바늘이 롤에서 나올 때 바늘을 구부려 롤을 고정합니다.

이제, 라벨이 붙은 조직 카세트에 롤을 넣고 10% 완충된 포르말린 인산염이 담긴 병에 카세트를 넣습니다. 조직을 고정하기 위해 24시간 동안 실온에 두십시오. 24시간 후 포르말린을 붓고 70% 에탄올로 대체하여 4시간을 더 복용합니다.

결장은 실온에서 70% 에탄올에 무기한 보관할 수 있습니다. 이 모델을 통해 연구자는 결장을 확보, 고정 및 분석할 수 있으므로 대장염의 중증도를 분석할 수 있습니다. 전체 결장에 대한 거시적 분석을 위해 결장을 포르말린이 주입되어 완전히 팽창된 소시지로 처리할 수 있습니다.

열린 소시지는 평평하게 놓아야 합니다. 소시지 방법이 올바르게 수행되면 고정 결장이 확장되고 전체 점막 표면을 쉽게 조작하고 해부 현미경으로 볼 수 있습니다. 조직학적 분석을 위해 결장을 스위스 롤로 처리할 수 있습니다.

롤은 바늘로 고정하고 고정을 위해 조직 카세트에 넣습니다. 롤을 절단하여 장착할 때 제대로 굴리면 전체 결장의 대표 조각을 형성해야 하며, 스위스 롤의 일부를 헤마틴과 ASIN으로 염색하여 결장 부상의 정도를 확인할 수 있습니다. 결장의 말단 끝이 슬라이드의 롤 중앙에 있음을 기억하십시오.

이 예시에서, 염증과 소낭선 손상은 수처리 대조군에 비해 DSS 처리된 결장에서 명백합니다. 우리는 방금 급성 대장염의 쥐 모델에서 결장을 채취하고 처리하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 희생하기 전에 잘 정리하는 것이 중요합니다.

예를 들어, 마우스는 각 마우스에 대해 레이블이 지정된 모든 튜브와 카세트, 그리고 모든 도구와 시약을 쉽게 사용할 수 있습니다. 또한 마우스 무게와 결장 길이에 대한 자세한 기록을 유지하십시오. 마지막으로, 처리에 충분한 시간을 할당했는지 확인하십시오.

일반적으로 초보자의 경우 마우스 당 15분이 소요되며 이 기술에 대한 경험이 더 많은 사람의 경우 6-8분이 소요됩니다.