Name: IBD의 DSS 유발 모델에서 창자 염증을 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 배우세요 DSS로 유발한 췌장염에서 장면역 반응을 평가하는 방법을 마우스 모델에서. 골수과산화효소 활성과 전염증성 사이토카인 정량화를 통해 염증성 장질환의 면역 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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이 작품은 건강 연구의 캐나다 연구소에서 보조금 (CIHR)와 Crohn의과 캐나다의 대장염 재단 (CCFC)에 의해 지원됩니다.

1. DSS - 유도된 급성 대장염의 Murine 모델 <ol><li> 원하는 최종 농도 (1-5%) (wt / 권) (즉, 5 % DSS 솔루션을 만들 autoclaved 물 500 ML에 DSS 분말 25 밀리그램을 추가하려면)에 autoclaved 식수로 dextran 황산염 나트륨 (DSS)을 추가 . 주식 솔루션은 ° C까지 사용을 한 주일 또는 4 실온에서 남아있을 수 있습니다. </li><li> biosafety 후드에서 50 ML 팔콘 튜브 (케이지마다 필요 하나)로 재고 DSS 솔루션을 따라줘. 필요한 리필 튜브에 재고 솔루션을 유지. </li><li> DSS 솔루션 (50 ML 팔콘 튜브)와 각 마우스 케이지에서 식수를 교체 (기간은 사용되는 DSS 처방에 따라 달라집니다. 예를 들어, 6-8주 오래된 남성 C57BL / 6 마​​우스를 사용하여, 우리가 관리를 5 일간의 총 5 %의 DSS 솔루션). 마우스는 다른 물 소스에 액세스할 수 없습니다. 컨트롤 마우스는 DSS없이 autoclaved 마시는 물을 주어집니다. </li><li> 매일 쥐를 무게와 하루 소비하는 DSS의 양을 기록합니다. 각각의 상위DSS 수준을 기록 후 50 ML하는 병. 이것은 실험 기간 내내 마우스마다 케이지 당 소비 DSS의 대략적인 볼륨을 측정하는 것입니다. 우리의 연구에, 우리는 남성 C57BL / 6 마​​우스 5 일 동안 5 % DSS 솔루션을 사용합니다. 중요한 체중 감소, 변경 대변 일관성과 배설물 혈액의 흔적이 특정 DSS의 처방을 사용하여 3 일 빠르면 볼 수 있습니다. DSS 관리하는 동안 마우스는 동물하거나되는 중요한 생리적 지표로 탈수 및 설사와 체중 감소와 발음 체중 감소 (5 일 그들의 초기 무게의 50-10% 정도) 초기 체중의 20 % 이상을 전시 종점 근처. 동물 5 % DSS의 5 일 후에 정상적인 물에 액세스할 수있는 권한을 부여하는 경우, 그것은 7 일 이내에 회복됩니다. 모든 실험은 기관의 동물 윤리위원회의 승인 및 승인 동물 이용 프로토콜 (AUP)을 준수해야합니다. </li><li> 실험, 질병 활동 색인 (다이)의 기간 동안점수는 대장염의 임상 진행을 평가하기위한 평가하실 수 있습니다. 다이는 초기 체중, 대변 일관성, 그리고 출혈에 비해 체중 감소의 결합 점수입니다. 점수는 다음과 같이 정의됩니다 : 체중 감소 : 0 (없음 손실), 1 (1~5%), 2 (5-10 %), 3 (10-20%), 4 (&gt; 20 %), 대변 일관성을 : 0 (정상), 2 (느슨한 대변) 및 4 (설사) 및 출혈 : 0 (혈흔), 1 (Hemoccult 긍정), 2 (Hemoccult 긍정적인 시각 펠렛의 출혈) 및 4 (총 출혈, 혈액 주위 항문). 다이는 DSS 치료 기간 동안 매일 득점 수 있습니다. </li><li> 선택의 시점에서, 무게와 생쥐를 희생. 생쥐는 기관의 동물 시설의 승인을 isoflurane 혹은 다른 방식의 흡입 다음과 같은 자궁 전위에 의해 euthanized 수 있습니다. </li></ol> 2. colonic 조직 샘플을 수집 <ol><li> 동물의 복부 측면을 노출하고 70 % 에탄올 솔루션 복부 영역을 젖었어. 이 시점에서, 표 1을 참조하고 적어 둡니다직장 출혈 (항문 구멍에서 혈액 현재) 각 동물의 직장 탈출증의 뉴욕 신호. </li><li> 복부 중간선 절개를하여 복부를 절개 표준 해부 가위를 사용하십시오. </li><li> 콜론을 찾아 말초 콜론 자유 가능한 대장암 여백에 가까운 콜론을 가로로 쪼개다. </li><li> 조심스럽게 천천히 주변 장간막에서 분리, 전체 결장 빼낸다. </li><li> 콜론의 근위 끝 무료로 colonocecal 여백에 콜론을 가로로 쪼개다. 배설물은 신중하게 구부러진 핀셋 / 집게 한 켤레를 사용하여 착취하여 3 또는 5 ML 주사기 또는 부착된 gavage 바늘을 사용하여 멸균 PBS로 콜론을 rinsing하여 제거할 수 있습니다. 전체 콜론을 사용하여 (제 3.1 참조) 손상에 대한 평가 </li><li> histological 분석 및 기타 assays에 대한 조직 샘플링은 샘플에서 어떤 영역의 노트를 만들기 1.0 cm 길이 colonic 조각에 0.5 cm을 절단하여 수행할 수 있습니다 (예 : 근위, 중, 또는 말초). </li><li> 조직 샘플assays가 개별적으로 1.5 ML eppendorf 튜브에 배치하고 액체 질소에 냉동 및 -70 ° C.에서 사용까지 저장할 수에 사용되는 </li></ol> 3. 대장염의 심각 성의 평가 <ol><li> 매크로 또는 질병 심각도 점수가 이전에 게시된 채점 시스템 (표 1)를 사용 편견 관찰자에 의해 말기 평가됩니다. 9 대변 일관성이 포셉 한 켤레를 사용하고 일관성을 확인하는 대변에 아래로 누르면 평가하실 수 있습니다. 배설물에 피를 점수를 확인하려면 대변의 색상을 참고 (즉, 검은 엉덩이 비해 밝은 갈색 의자)와 더욱 Hemoccult 검사를 사용하여 확인합니다. 채점 시스템을 사용하여 조건을 각각의 점수를 결정합니다. 각 동물에 대한 최종 매크로 점수는 각 개별 점수의 합계입니다. </li><li> 대장염의 심각의 histological 손상을 평가하기 위해 버퍼 10% 포르말린 용액에있는 작은 콜론의 조각 (0.5 cm), 조직 카세트의 장소와 잠수함 잘라. 5 준비μm의 파라핀에 해당 절차를 사용하여 hematoxylin / eoxin (H &amp; E)와 크로스 섹션과 얼룩 섹션을 내장. 콜론 조각은 근위, 중반 콜론, 또는 콜론의 말초 부분에서 취할 수 있습니다. </li><li> H &amp; E 스테인드 colonic 조직 섹션은 다음과 같은 조치에 대해 이전에 출판 시스템을 사용하여 눈을 멀게 관찰자에 의해 득점 있습니다 : (- 전체 종종 지하실이나 지하 묘지, 3의 손실과 함께 심각한 토굴 왜곡 정상, 0), 염증 세포 침투의 정도 (일반, 0 토굴 아키텍처 - 표시된 근육 농화 선물, 3), 고블렛 세포 고갈 (부재, 0 - - 현재, 1)과 토굴의 농양 (부재, 0 - 현재 밀도 염증은), 근육 농화을 (지하실 기지 muscularis mucosae, 0에 앉아 3 침투 1) 7. histological 손상 평가 점수는 각 개별 점수의 합계입니다. 그것은 인간의 UC 달리, 토굴에 농양이 모델의 특성되지 않으며 거의​​ 본 적이있는 것으로 지적해야, 미세한 ulcerations도 드물다. 여러 개의 콜론 섹션이있다면유사한 섹션 사이의 스테인드, histological 점수는 각 영역에 대한 최종 점수 (말초 콜론에 histological 점수를 비교 근위 결장에서 즉 histological 점수)를 결정하는 데 사용해야합니다. </li></ol> 4. assays에 대한 시약의 재고 솔루션을 준비 <ol><li> 솔루션 (K 2 HPO 4, DH 2 O 1 L에 이염 인산 칼륨의 8.7 g) 솔루션 B를 추가하여 인산 칼륨 버퍼의 50 MM 솔루션을 준비 (KH 2 PO 4, 1L에 일염기의 인산 칼륨의 6.8 g DH 2 O의)까지가 6.0의 산도가 이루어진다. 남은 솔루션은 나중에 사용하기 전까지 냉장고 (2-8 ° C)에 저장할 수 있습니다. </li><li> 인산 칼륨 완충액 1 패 (50 MM, 산도 = 6.0)에 5g HTAB를 추가하여 hexadecyltrimethylammonium의 브로마이드 (HTAB) 버퍼를 준비합니다. 2-8에 용해하고 저장하기 위해 부드럽게 열 ° C까지 사용. 필요한 경우, 다시 디졸브로 가열. </li><li> 하여 단백질 분석을위한 조직 균질에 대한 용해 버퍼를 준비1M 트리스 - 염산 (산도 = 8.0), 5M 나트륨 염화물 6 ML 및 소독 증류수의 트리톤 X - 100-182 ML 2 ML 10 ML을 추가. 트리톤 X - 100은 상온에서 매우 점성 때문에, 가볍게 사용하기 전에 따뜻하게해야합니다. 준비 용해 버퍼는 사용 전까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 5. assays를위한 샘플 준비 <ol><li> MPO 분석을위한 샘플 준비. <ol><li> -70에서 샘플을 제거 얼음 ° C과 장소. 2mL Eppendorf 안전 ​​잠금 microcentrifuge 튜브 (또는 균질 화기와 함께 사용할 수있는 튜브)에 구부러진 forcep / 트위터 및 장소를 사용하여 가시적인 대변이나 지방을 제거한 후에 각 시료의 무게를 기록합니다. 샘플은 항상 얼음에 보관해야합니다. 이와 비슷한 콜론 조각은 각각의 생물 학적 복제 (즉 말초 부분에만 또는 근위 부분에서만)에서 사용해야 참고하는 것이 중요합니다. </li><li> 각 샘플 튜브에 균 질기 비드를 추가합니다. </li><li> HTAB의 buf의 해당 금액을 추가조직 무게에 따라 그다지. 조직 무게 미만 25 MG 경우 12.5mg/mL의 비율로 버퍼를 추가, 조직 중량이 25-50 사이에있는 경우, 25mg/mL의 비율로 추가합니다. 조직 무게가 50보다 큰 경우, 50mg/mL의 비율로 버퍼를 추가합니다. </li><li> 30 Hz에서 4 분 조직 균질 화기와 Homogenize. 조직이 완전히 균질하지 않은 경우 반복합니다. </li><li> 균 질기 비드 6 분 (13,400 XG, 4 ° C)에 대한 원심 솔루션을 제거합니다. </li><li> 뜨는를 수집하고 그 결과 펠렛을 삭제. Supernatent는 -70 ° C에서 사용까지 저장할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 시토킨 분석을위한 샘플 준비. <ol><li> 반복 5.1.1 단계를 반복합니다. 5.1.2 수 있습니다. </li><li> 준비 용해 버퍼의 10 ML에 테아제 억제제 칵테일 (PIC) 50 μl를 추가합니다. </li><li> PIC와 상관없이 체중의 각 샘플에 용해 버퍼 용액 1 ML을 추가합니다. </li><li> 30 Hz에서에서 5 분 Homogenize. 조직이 완전히 균질하지 않은 경우 반복합니다. </li><li> 균 질기 비드와 원심 분리기 soluti를 제거3300 X G.에서 5 분 동안 </li><li> 뜨는를 수집하고 그 결과 펠렛을 삭제. 뜨는는 -70 ° C에서 사용까지 저장할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 6. 염증 마커의 양을 정함 <ol><li> MPO 활동 분석 <ol><li> O - dianisidine dihydrochloride, DH 2 O의 90 ML, 그리고 인산 칼륨 완충액 10 ML의 16.7 MG를 결합하여 O - dianisidine의 dihydrochloride (O - dianisidine) 솔루션을 준비합니다. 이 솔루션은 모든 분석을위한 새로운 준비를해야합니다. </li><li> 96 - 웰 플레이트에 세중의의 조직 homogenate (섹션 5.1에서 준비) 7 μL를 추가합니다. </li><li> O - dianisidine 혼합물로 희석 H 2 O 2 (30 % DH 2 O 96 μL에 희석 H 2 O 2 4 μL) 50 μL를 추가합니다. </li><li> 우물 각 H 2 O 2를 포함하고있는 O - dianisidine 혼합 200 μL를 추가하는 멀티 채널 피펫을 사용합니다. </li><li> spectropho를 사용하여 450 nm의 흡광도를 측정에서tometer. 삼십초 간격으로 세 수치를 가져가라. </li><li> MPO 활동을 계산합니다. MPO 활동 MPO 중 하나가 단위는 상온에서 분당 H 2 O 2 단계 중 1 μmoL을 저하하는 데 필요한 금액을 말합니다 MPO / MG 조직의 단위 (U) 단위로 측정됩니다. MPO 한 단위 (U)는 = 1 H 2 O 2 분할의 μmoL하고 H 2 O 2 단계 중 1 μmoL은 1.13 × 10 -2 NM / 분 흡광도의 변화를주는 것을 고려, 각 샘플에서 MPO 단위가 결정됩니다 흡광도의 변화로 [ΔA (T 2 - T 1)] / Δmin X (1.13 × 10 -2). 조직 MG 단위당를 얻으려면 조직을 사용하여 버퍼 비율을. 예를 들어, 조직이있는 경우 : 50 밀리그램 / ML의 버퍼의 비율이 사용된, homogenate 7 μL에서 조직의 0.35 MG있다. 따라서, MG 조직 단위당를 얻으려면, 0.35로 MPO의 단위를 나눕니다. 흡광도 값을 사용하여 샘​​플 계산 (NM)을 (샘플이 세중의에 추가되었다는 가정) 아래에 포함되어 있습니다 : </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> 견본 </td><td colspan="3"> 시간 0 초 </td><td colspan="3"> 시간 30 초 </td><td colspan="3"> 시간 60 초 </td></tr><tr><td> </td><td> 일 </td><td> 이 </td><td> 3 </td><td> 1 &#39; </td><td> 2 &#39; </td><td> 3 &#39; </td><td> 1 &quot; </td><td> 이 &#39; </td><td> 3 &quot; </td></tr><tr><td></td><td> 0.048 </td><td> 0.048 </td><td> 0.051 </td><td> 0.061 </td><td> 0.061 </td><td> 0.065 </td><td> 0.074 </td><td> 0.073 </td><td> 0.078 </td></tr></tbody></table><ol class="lroman"><li> 평균 시간에서 0 초 = (0.048 + 0.048 + 0.051) / 3 = 0.049 NM </li><li> 평균 시간에서 30 초 = 0.0623 NM </li><li> 시간 60 초에서 평균 = 0.075 NM </li><li> 0에서 30 초 / MG 조직 (50 MG / 조직 ML 가정 : 버퍼 비율)로 흡광도 (ΔA)의 변경 = [(0.0623-0.049) / (1.13 × 10 -2)] / 0.35 = 3.363 </li><li> 흡수의 변화ance (ΔA) 30에서 60 초 / MG 조직 = 3.211 </li><li> * MPO 활동 (U / MG 조직) ΔA의 = 평균 (0-30)와 ΔA (30-60) = 3.287 </li></ol><ol start="2"><li> 엘리사에 의해 프로 염증성 크린 시토킨의 부량 <ol><li> 시토킨 (IL - 1β, IL - 6와 TNF - α) 수준은 상용 효소 - 연결 면역 분석 (엘리사) 키트 (; R &amp; D 시스템 Quantikine Murine)를 사용 결정됩니다. </li><li> 각 엘리사의 흡광도 값은 각 샘플에 해당 브래드 포드 단백질 분석을 사용하여 정규화하고 단백질의 PG / MG 단위로 표시됩니다. </li></ol></li></ol> 7. 대표 결과 해당 DSS의 섭생의 관리 생쥐의 급성 대장염을 일으킬 것입니다. DSS 치료 기간 동안 다이는 질병의 임상 진행을 평가하고 평가하는 데 사용할 수 있습니다. DSS로 치료 동물들은 초기 중량에 비해 상당한 체중 감소, 느슨하게 stools 및 배설물이 표시됩니다출혈 (그림 1). (그림 2 및 표 콜론의 희생과 심사시, 대장염의 심각는 macroscopically 대변 일관성의 느슨해진 결장의 길이, colonic 출혈, 지저분한 출혈의 단축에 따라 점수이며, 직장 출혈의 흔적은 물로 취급 컨트롤 비교 1). H &amp; E와 함께 스테인드 colonic 조직 샘플의 크로스 섹션 물 처리 제어 대 DSS - 대우 콜론 (그림 3)에 대한 높은 점수를 histological됩니다. 추가 DSS - 취급 생쥐의 염증의 정도를 특성화, MPO 활동은 균질 colonic 조직 샘플에서 평가 수 있습니다. DSS - 처리 콜론 컨트롤 (그림 4)에 비해 높은 MPO 활동을해야합니다. 또한, 이것은 프로 - 염증성 크린 시토킨의 증가 수준 (IL - 1β, IL - 6, TNF - α) (그림 5)와 연결되어 있습니다. <img alt="그림 1." src="/files/ftp_upload/3678/3678fig1.jpg" /><br/&gt; 그림 1. 남성, C57BL / 6 생쥐은 5 일 동안 물을 마시는 5 %의 DSS를 부여했다. 다이 점수는 각 동물에 대해 매일 평가되었으며 (± SEM, N = 4 마우스 / 그룹을 의미) 각 그룹에 대해 하루 평균되었습니다. <img alt="그림 2." src="/files/ftp_upload/3678/3678fig2.jpg" /> 그림 2. C57BL / 6 생쥐은 5 일 동안 마시는 물에 5 % DSS를 부여했다. 컨트롤 마우스는 DSS없이 물을 받았다. 매크로 손상 점수 / 질병 심각도 점수는 맹목적 5 일 이후 DSS 유도된 대장염에 대한 평가했다. DSS를받은 생쥐로부터 격리 콜론 높은 매크로 손상 점수 (직장 출혈, 직장 탈출증, 설사, colonic 출혈)보다 질병 심각도 (± SEM, N = 4 마우스 / 그룹을 의미) 표시했습니다. <img src="/files/ftp_upload/3678/3678fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. C57BL / 6 마우스는 대장염을 유발하기 위해 마시는 물에 5 % DSS 솔루션을 제공했다. 제어 마우스<html> DSS없이 물을 받았다. (A) Histological 점수는 맹목적 5 일 이후 DSS 관리에 대한 수집 H &amp; E 스테인드 colonic 조직 섹션을 사용하여 득점했다. (B) DSS - 처리된 샘플 (C) 컨트롤 (± SEM, N = 4 마우스 / 그룹을 의미)에 비해 더 많은 histological 손상 (자세한 세포 침투, 더 고블렛 셀 고갈, 큰 왜곡 / 토굴 아키텍처에 손상)를 보여줍니다. 년 (B)와 (C), 별표 (*) 고블렛 세포 고갈과 지하실 건축 왜곡의 영역을 나타냅니다, 숫자 기호 (#) 세포 침투를 나타냅니다. <img alt="그림 4." src="/files/ftp_upload/3678/3678fig4.jpg" /> 그림 4. 모든 마우스는 DSS와 colonic 조직 샘플 5 일 게시물 관리에 희생되었다는 MPO 활동을 평가하기 위해 수집되었다. DSS 유도된 대장염의 심각도는 컨트롤 (± SEM, N = 4 마우스 / 그룹 평균)에 비해 MPO 활동의 높은 수준과 관련있다. _upload/3678/3678fig5.jpg &quot;/&gt; 그림 5. 높은 MPO 수준, DSS 유도된 대장염의 심각 이외에는 또한 IL - 1β, IL - 6, TNF - α와 같은 프로 염증의 크린 시토킨의 증가 수준 (± SEM, N = 4 쥐를 의미와 관련된 / 그룹). <table border="1"><tbody><tr><td> 점수 </td><td> 직장의 출혈 </td><td> 직장 탈출증 </td><td> 대변 ​​일관성 </td><td> 혈액 </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 없음 </td><td> 없음 </td><td> 일반 </td><td> 일반 </td></tr><tr><td> 일 </td><td> 붉은 </td><td> 탈출증의 증상 </td><td> 부드러운 </td><td> 붉은 </td></tr><tr><td> 이 </td><td> 다크 레드 </td><td> 지우기 탈출 </td><td> 매우 부드러운 </td><td> 다크 레드 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 총의 출혈 </td><td> 광범위한 탈출 </td><td> 설사 </td><td> 검정 </td></tr></tbody></t수&gt; 표 1. 매크로 / 질병 심각도 점수

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

DSS 대장염은 장의 염증의 널리 사용되는 화학적으로 유도된 모델입니다. 이 모델에서는, 마우스는 상피 세포를 직감하고 점막 장벽의 무결성을 방해하기 위해 독성 것으로 생각됩니다 DSS와 보충 식수 제공됩니다. DSS 10 관리가 느슨한 대변, 배설물 출혈이 특징입니다 급성 대장염을 유도, 그리고 granulocytes로 침투 10. DSS 관리하는 동안은 대장염은 일반적으로 배설물 잠혈 검사로 평가 수있는 의자에 상당한 체중 감량과 혈액의 존재와 연결되어 있습니다. 5.10,11 colonic 조직 샘플을 수집 후, 대장염의 심각 될 수 있습니다 이전에 설립 채점 시스템을 사용하여 콜론의 매크로 검사 및 H &amp; E의 histological 분석 스테인드 colonic 크로스 섹션의 특징 9. 이 프로토콜을 따라하면 대장염의 심각도에 의해 유도합니다 것이 중요합니다DSS는 수종이며 구체적인 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비의 이름 : </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> Eppendorf 안전 ​​잠금 Microcentrifuge 튜브 (2mL) </td><td> eppendorf </td><td> 0030 120.094 </td><td></td></tr><tr><td> Biotek EL808 흡광도 플레이트 리더 </td><td> Biotek </td><td> EL808 </td><td></td></tr><tr><td> Dextran 황산염 나트륨 소금 시약 등급 (분자량 36,000-50,000 다) </td><td> MP의 Biomedicals </td><td> 160,110 </td><td></td></tr><tr><td> Gen5 (소프트웨어) </td><td> Biotek </td><td> 버전 1.10.8 </td><td></td></tr><tr><td> Hexadecyltrimethylammonium의 브로마이드 (HTAB) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> H5882 - 100G </td><td></td></tr><tr><td> 과산화수소, 물 30 wt. % 용액 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 216,763 </td><td> 2-8에 보관 ° C </td></tr><tr><td> Microtest PL96 - 웰 평면 바닥을 먹은 </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1581 </td><td> 단일 목적으로만 사용 </td></tr><tr><td> O - Dianisidine </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> D - 3252 </td><td> 민감한 빛. 2-8에 보관 ° C </td></tr><tr><td> 인산 칼륨, 이염 </td><td> Caledon </td><td> 6620-1 </td><td></td></tr><tr><td> 인산 칼륨, 일염기의 </td><td> EMD 화학 </td><td> PX1565 - 1 </td><td></td></tr><tr><td> 테아제 억제제 칵테일 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P8340 </td><td> -20 ° C에 보관 </td></tr><tr><td> 트리톤 X - 100 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> 조직 Lyser II에 대한 텅스텐 탄화물 비즈 </td><td> QUIAGEN </td><td> 69,997 </td><td></td></tr></tbody></table>

ibd의 dss 유발 모델에서 창자 염증을 조사

Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD

염증성 장 질환 (IBD)은 장내 pathologies의 범위, 궤양 대장염 (UC) 및 Crohn의 질병 (CD)하는 가장 일반적인 구성되어 있습니다. UC와 CD, 모두 콜론에 존재하면, 설사, 직장 출혈, 복통 및 체중 감소를 포함시킬 수 있습니다 유사한 증상 프로필을 생성합니다. 1 IBD의 pathogenesis이 알려지지 않은 남아 있지만, 그것은 모두를 포함 multifactorial 질병으로 설명되어 있습니다 유전과 환경 요소 2. IBD의 몇 가지 기능이 유사한 colonic 염증 수많은 변수와 변수의 동물 모델이 있습니다. 이러한 dextran 황산염 나트륨 (DSS)과 같은 대장염 - 유도 화학 물질의 특정 농도의 이러한 요구 관리 특정 종의 변종에 감염될 자발적으로 발생하는 사람의 대장염 범위의 동물 모델. 내장 염증의 화학 유도된 모델은 IBD의 가장 일반적으로 사용되는 최상의 설명 모델입니다. Admini마시는 물 속에 DSS의 stration이 관리 프로토콜에 따라 급성 또는 만성 대장염을 생산하고 있습니다. DSS 전시 체중 감소와 느슨한 대변 또는 설사의 증상 주어진 세 동물은, 때때로 직장 출혈의 증거. 여기 4,5를 우리는 방법을 설명하는 대장염 개발 및 결과 염증 반응은 DSS의 다음과 같은 관리를 특징하실 수 있습니다. 이러한 방법은 염증의 대리 마커로 사용할 수 histological hematoxylin / eosin 스테인드 결장 섹션의 분석, 프로 - 염증 크린 시토킨의 측정 및 myeloperoxidase의 결정 (MPO) 활동 6. 포함 질병 상태에있는 염증 반응의 정도는 임상 증상의 존재 또는 점막 조직의 조직학의 변경에 의해 평가하실 수 있습니다. Colonic histological 피해 지하실 건축, 염증 세포 침투, 근육 t의 손실을 고려 채점 시스템을 사용하여 평가됩니다hickening, 고블렛 셀 고갈, 그리고 토굴 농양. 양적 7과 같은 인터루킨 (IL) - 1β, IL - 6와 종양의 괴사 인자 (TNF) - α와 같은 급성 염증성 속성,와 프로 - 염증성 크린 시토킨 수준을 사용하여 확인할 수 있습니다 기존 엘리사 방법. 또한, MPO 활동은 colorimetric 분석을 사용하여 측정할 수 있으며 염증의 인덱스로 사용 8. 실험적 대장염에서 질병 심각도는 종종 MPO 활동 증가와 프로 염증 크린 시토킨 높은 수준의와 상관있다. 대장염의 심각 및 염증 - 관련 피해 hematoxylin / eosin 스테인드 colonic 조직 섹션을 사용하여 대장의 상​​태를 histopathological 평가 이외에, 대변 일관성과 출혈을 조사하여 평가하실 수 있습니다. Colonic 조직 조각은 MPO 활동 및 시토킨 생산을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 합쳐 놓으면, 이러한 조치는 장의 염증 반응을 평가하는 데 사용할 수 있습니다실험 대장염의 동물 모델.

염증성 장 질환의 실험적 모델은 우리가 pathogenesis와 관련된 복잡한 본래과 적응 면역 반응을 조사 수 있습니다. histological 채점, 프로 - 염증 크린 시토킨 및 myeloperoxidase 활동 부량 사용하여, 하나는 염증성 장 질환에서 볼 이러한 반응을 평가하기 시작할 수 있습니다.

IBD의 DSS 유발 모델에서 창자 염증을 조사

염증성 장질환(IBD)은 다양한 범위의 장 병리를 포함하며, 그 중 가장 흔한 것은 궤양성 대장염(UC)과 크론병입니다...

이 실험 과정의 전반적인 목표는 염증에 반응하여 생성되는 마이엘로퍼옥시다제(myelo peroxidase) 활성도와 전염증성 사이토카인의 양을 측정함으로써, 덱스트란 황산나트륨(dextron sulfate sodium)에 의해 유도된 장내 면역 반응을 평가하는 것입니다. 먼저, 음용수에 DSS 염수 용액을 첨가하여 마우스에서 DSS 콜라이티스를 유도합니다. 그 다음, 육안적 점수법(macroscopic scoring)을 통해 콜라이티스의 질병 중증도를 평가하고, 추가 분석을 위해 결장을 적출합니다.적출된 결장을 조직학적 분석, 사이토카인 정량 분석 및 MPO 활성 측정을 위해 세 부분으로 나눕니다. 마지막으로 결장 조직을 균질화하고 상층액을 사용하여 MPO 활성을 측정합니다. 최종적으로 분광광도계를 통해 수집한 흡광도 데이터를 통해 MPO 활성의 변화를 확인할 수 있습니다.이 방법은 DSS 및 TNBS 유도 결장염과 같은 다양한 염증성 장질환 모델의 만성 정보에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한, 이 방법을 폐나 간과 같은 다른 장기에도 적용할 수 있습니다. 절차를 시작하기 전에 각 마우스 케이지의 식수를 DSS 용액으로 교체하여 염증을 유도하십시오.대조군 마우스에게는 DSS가 없는 멸균 음용수를 제공합니다. 그 후 실험 당일에 Whitham Williams와 Williams의 JoVE 논문에서 앞서 시연한 방법대로 결장을 적출합니다. 굽은 핀셋을 사용하여 결장 전체에서 분변을 조심스럽게 짜내고, 멸균 PBS로 조직을 헹구어 분변을 칭량지에 수집합니다.포셉을 사용하여 분변을 눌러 경도를 확인하고, 이를 통해 분변 내 혈액 점수를 결정하십시오. 분변의 색상을 기록하고, 분변을 헤모컬트(hemoccult) 시험지에 도말한 후 현색액을 첨가하는 헤모컬트 검사를 통해 평가 내용을 추가로 검증하십시오. 이때 청색으로 변하면 분변 내 혈액 양성으로 기록합니다. 그런 다음, 이 표를 사용하여 각 조건에 대한 수치를 결정하십시오.다음으로, 결장의 근위부에서 원위부 방향을 유지하면서 결장을 세 개의 동일한 구역으로 절단합니다. 그런 다음 결장의 근위부와 중간 구역에서 샘플 조각을 채취하여 각각 1.5 milliliter eph 튜브에 넣습니다. 결장염 중증도의 조직학적 손상을 평가하기 위해 결장의 가장 원위부 조직 구역에서 0.5~1 cm 길이의 작은 조각을 절단합니다.조각을 조직 카세트에 넣고 10% 완충 포르말린 용액에 담급니다. 그 후 조직 조각의 파라핀 임베딩 횡단면을 제작하고, 눈가림 관찰자가 판독할 수 있도록 절편을 hematoxylin and eosin으로 염색합니다. 마지막으로 근위 및 중간 결장 부위의 샘플을 액체 질소로 급속 냉동한 뒤 -70°C에서 사용 시까지 보관합니다.-70°C 보관소에서 결장 샘플을 꺼낸 후, 얼음 위에 놓습니다. 그 다음 굽은 핀셋을 사용하여 눈에 보이는 분변이나 지방을 제거하고, 호모게나이저 사용에 적합한 개별 2mL 튜브에 넣습니다. 이어서 각 샘플의 무게를 측정하여 기록합니다.다음으로, 각 시료 튜브에 균질화 비즈를 넣고, 방금 측정된 조직 무게에 따라 적절한 양의 H tab buffer를 튜브에 추가한 후, 조직 균질화기를 사용하여 30 hertz에서 4분 동안 파편을 해리시킵니다. 마지막으로, 세포 용액을 13,400 ×g, 4 °C에서 6분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 새 튜브에 수집하고, 균질화 비즈를 그대로 둔 상태에서 생성된 펠릿을 제거합니다.상층액은 사용 전까지 -70°C에서 보관할 수 있습니다. 이전에 준비한 조직 균질액 7 µL를 96-웰 플레이트에 세 번 반복하여 분주하며 이 단계를 시작합니다. 그 다음, 갓 조제한 OD Dion 아이오딘에 희석된 과산화수소 50 µL를 첨가합니다.멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에 과산화수소 혼합물 200 µL를 추가합니다. 이제 분광광도계를 사용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하며, 32초 간격으로 3회 측정합니다. 그런 다음 흡광도 데이터, 조직 무게 및 완충액 부피를 사용하여 이 예시 계산에서 보여주는 것과 같이 균질액의 NPO 활성을 계산합니다.DSS 처리 기간 동안, 질병 활성도 지수(disease activity index)를 사용하여 질병의 임상적 진행 정도를 평가하고 분석할 수 있습니다. DSS 처리된 동물은 초기 체중 대비 유의미한 체중 감소, 묽은 변 및 혈변을 보입니다. 육안적 증상이 더 심할수록 질병 활성도 지수가 더 높아집니다.음용수에 5% DSS를 5일간 투여한 마우스의 대장을 적출하여 검사한 결과, 대장 길이의 단축, 대장 출혈, 분변 출혈, 변 농도 완화 및 직장 출혈 징후에 기반한 육안적 점수 산정 결과, 본 대표 실험에서의 대장염 중증도는 물만 투여한 대조군보다 약 5배 더 심한 것으로 나타났습니다. 이러한 결과는 DSS 처리된 대장 조직 샘플의 단면 데이터에서 확인할 수 있으며, H&E 염색 결과에서도 물 처리 대조군보다 높은 조직학적 점수를 보였습니다. 여기서 물만 투여받은 대조군 동물로부터 수집한 H&E 염색 단면의 별표 표시 영역에서는 정상적인 구조와 세포 침윤의 부재가 관찰되었습니다. 이제 DSS 처리된 동물의 샘플에 대한 H&E 염색 결과를 이전 그림과 비교해 보십시오.이 동물의 결장에서는 파운드 기호(#)로 표시된 더 많은 세포 침윤과 더 심한 술잔세포 고갈 및 더 큰 변형이 나타나 더 많은 조직학적 손상을 보입니다. 별표(*)로 표시된 K crypt 구조의 손상이 관찰됩니다. DSS 처리된 마우스의 질병 중증도 정도를 더욱 구체적으로 분석하기 위해, 염증의 대리 마커인 NPO 활성을 균질화된 결장 조직 샘플에서 측정할 수 있습니다.예상대로 DSS 처리된 결장은 대조군보다 더 높은 MPO 활성을 보입니다. 또한, DSS로 유도된 결장염의 중증도는 IL-1β, IL-6, TNF-α와 같은 전염증성 사이토카인의 수치 증가와 관련이 있습니다. 이 절차를 수행할 때 MPO 활성이 시간이 지남에 따라 감소할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.따라서 장 염증의 중증도를 결정할 때 MPO 분석은 가장 먼저 수행해야 할 분석 중 하나여야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

식수에서 실시 Dextran 황산 나트륨 (DSS)은 급성 대장염의 설립 murine 염증성 손상 모델입니다. 이 프로토콜은 DSS 치료와 조직의 준비를 위해 방법을 설명합니다.

Dextran의 황산 나트륨 (DSS)를 사용 Murine 대장염 모델링

이 비디오는 염증성 장 질환인 대장염의 화학적 유도 쥐 모델을 생성하는 기술을 보여줍니다. 마우스는 적절한 기간 동안 덱스트란 황산나트륨(DSS) 용액을 섭취할 수 있습니다. DSS를 섭취하면 결장의 점액과 상피층 장벽이 손상되어 장내 미생물이 기저 조직으로 들어가 상주 면역 세포가 이를 감지하여 과장된 면역 반응을 매개하여 염증을 유발합니다.

덱스트란 황산염 나트륨 유발 대장염의 쥐 모델을 생성하는 기술

이 비디오는 염증성 장 질환인 DSS 유발 대장염의 쥐 모델에서 결장 손상을 평가하기 위한 헤마톡실린 및 에오신(H&amp;E) 염색 방법을 보여줍니다. DSS를 투여한 쥐에서 결장을 분리하고 조직 절편을 채취한 후, 해당 절편의 H&amp;E 염색은 염증에 의한 조직 손상을 확인하는 데 도움이 됩니다.

DSS 유발 대장염에서 결장 손상을 평가하기 위한 Hematoxylin 및 Eosin 염색

DNBS / TNBS 유도 대장염은 다른 염증성 장 질환의 한테 진찰 Pathobiology을 연구하는 저렴한 방법을 제공합니다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 생쥐와 쥐 대장염을 유도하는 DNBS의 성공적인 응용 프로그램을 설명 하나는 철저하게 호스트 매개 장 반응을 연구 할 수 있습니다.

DNBS / TNBS 대장염 모델 : 염증성 장 질환에 대한 통찰력과식이 지방의 효과를 제공

염증성 장질환 치료를 위한 잠재적 신약의 평가에는 항염증 효과의 정확한 평가가 가장 중요합니다. 디지털 홀로그램 현미경은 쥐 및 인간 결장 조직 샘플의 염증 평가뿐만 아니라 상피 상처 치유의 체외 자동 다중 모드 평가를 제공합니다.

디지털 홀로그램 현미경과 복합 양적 위상 이미징 정확하게 장내 염증과 상피 상처 치유를 평가

염증성 장 질환 (IBD)의 현재 치료는 질병의 증상을 완화 목표로하지만 심각한 부작용을 일으킬 수 있습니다. 따라서, 대안 전략은 동물 대장염 모델에서 연구되고있다. 여기서 우리는 임상 IBD 표지판에 다이어트 보조제의 유익한 효과는 이러한 대장염 모델에서 분석 방법에 대해 설명합니다.

실험 성 대장염 동안 장내 상피 장벽 기능에 영양 보조 식품의 유익한 효과 분석

특정 대상 프로브 질병 (예를 들어, 염증, 감염, 및 tumorigenesis)의 다양 한 종류의 단백질 표정 등의 분자 메커니즘을 분석 하기 위한 혁신적인 도구를 나타냅니다. 이 연구에서 우리는 murine 모델 f 4/80 전용 형광 중재 단층 촬영을 사용 하 여 대 장 염의 장 대 식 세포 침투의 양적 차원 단층 평가 설명 합니다.

검색 및 대 식 세포 관련 Murine 창 자 염증의 정량화에 대 한 단층 형광 중재

여기에 우리가 dextran 황산 나트륨 (DSS)에 면역 반응에 맛보기 관련 유전자의 무효의 효과 조사 하기 위해 프로토콜을 제시-선 동적인 장 질병 (IBD) 마우스 모델을 유도.

선 동적인 장 질병 마우스 모델에서 창 자 염증 단백질 폐지를 신호 하는 맛의 효과

무료 컴퓨터 보조 시스템을 사용하여 장 염증의 체계적인 점수는 궤양과 염증 변화의 존재를 특징으로 하는 대장염 모델의 조직 병리학적 변화를 정량적으로 비교할 수 있는 강력한 도구입니다. 조직학 대장염 점수 평가는 임상 관찰을 강화하고 데이터 해석을 용이하게합니다.

뮤린 Dextran 나트륨 황산염 유도 대장염 모형에 있는 장 염증을 위한 체계적인 채점 분석

흰개미 - 굿 미생물 커뮤니티 미생물 사이의 복잡한 상호 작용을 공부하고있는 훌륭한 시스템입니다 왜 제라드 레드 버터는 설명합니다. 호스트 곤충과 lignocellulose - 굴욕 굿 미생물 사이의 기존의 공생 관계는 물론 굴욕적인 식물 바이오 매스 및 바이오 연료 생성 이러한 미생물의 산업 사용으로 설명합니다.

인터뷰 - 마이트의 H​​indgut에서 미생물 커뮤니티를 조사

배우세요 DSS로 유발한 췌장염에서 장면역 반응을 평가하는 방법을 마우스 모델에서. 골수과산화효소 활성과 전염증성 사이토카인 정량화를 통해 염증성 장질환의 면역 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

IBD의 DSS 유발 모델에서 창자 염증을 조사

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