IBD의 DSS 유발 모델에서 창자 염증을 조사

염증성 장 질환의 실험적 모델은 우리가 pathogenesis와 관련된 복잡한 본래과 적응 면역 반응을 조사 수 있습니다. histological 채점, 프로 - 염증 크린 시토킨 및 myeloperoxidase 활동 부량 사용하여, 하나는 염증성 장 질환에서 볼 이러한 반응을 평가하기 시작할 수 있습니다.

이 절차의 전반적인 목표는 염증에 반응하여 생성되는 골수, 과산화효소 활성 및 전염증성 사이토카인의 양을 결정하여 덱스트론 설페이트 나트륨에 의해 유도된 장 면역 반응을 평가하는 것입니다. 먼저 DSS SALT 용액을 음용수에 주입하여 마우스에서 DSS 대장염을 유발합니다. 다음으로, 대장염의 질병 중증도를 거시적 점수로 평가하고 추가 분석을 위해 결장을 제거합니다.

그런 다음 절개된 결장을 조직학, 사이토카인 정량화 및 NPO 활성을 위해 세 조각으로 절단합니다. 마지막으로, 결장 조직이 균질화되고 상등액이 MPO 활성을 결정하는 데 사용됩니다. 궁극적으로 MPO 활성의 변화는 분광 광도계를 사용하여 수집된 흡광도 데이터를 통해 결정될 수 있습니다.

이 방법은 DSS 및 TNBS 유발 대장염과 같은 다양한 염증성 장 질환 모델의 만성 정보에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 절차를 시작하기 전에 폐 및 간과 같은 다른 장기에서이 방법을 사용할 수 있습니다. 염증을 유발하기 위해 각 마우스 케이지의 식수를 DSS 용액으로 교체하십시오.

제어 마우스에게 DSS 없이 오토클레이브 식수를 제공합니다. 그런 다음 실험 당일, Whitham Williams와 Williams의 JoVE 기사에서 이전에 시연된 대로 결장을 해부합니다. 구부러진 핀셋을 사용하여 결장 전체에서 대변을 조심스럽게 짜내고, 멸균 PBS로 조직을 헹궈 계량지에 모읍니다.

한 쌍의 집게를 사용하여 대변을 눌러 대변의 일관성을 확인하고 대변의 혈액 점수를 결정하여 대변을 평가합니다. 대변의 색깔을 기록하고 혈구 종이에 대변을 바르고 현상액을 추가한 다음 혈액에 대한 대변 검사가 양성임을 나타내는 파란색을 기록하는 혈구 검사를 사용하여 평가를 추가로 검증합니다. 그런 다음 이 표를 사용하여 각 조건의 값을 확인합니다.

다음으로, 결장의 근위부에서 원위부까지의 방향을 유지하면서 결장을 세 개의 동일한 부분으로 자릅니다. 그런 다음 결장의 근위부 및 중간 결장 부분에서 샘플 조각을 채취하여 샘플을 개별 1.5ml eph 튜브에 넣습니다. 대장염의 중증도의 조직학적 손상을 평가하려면 결장의 가장 원위 조직 부분을 사용하여 절반에서 1cm 길이의 작은 조각을 자릅니다.

조직 카세트에 있는 파편을 두고 완충된 10%formalin 해결책에 있는 카세트를 담그십시오. 그런 다음 조직 단편의 파라핀 내장 단면을 준비한 후 맹검 관찰자가 채점할 수 있도록 헤마틴 어인으로 단면을 염색합니다. 마지막으로, 근위 및 중간 콜론 섹션의 샘플을 액체 질소로 동결하고 섭씨 영하 70도에서 사용할 때까지 보관합니다.

영하 70도의 보관소에서 결장 샘플을 제거한 후 얼음 위에 올려 놓습니다. 그런 다음 구부러진 집게를 사용하여 눈에 보이는 대변이나 지방을 제거하고 균질기에 사용하기에 적합한 개별 2 밀리리터 튜브에 넣습니다. 그런 다음 각 샘플의 무게를 결정하고 기록합니다.

다음으로, 각 샘플 튜브에 균질화 비드를 추가 한 다음 방금 결정한 조직의 무게에 따라 튜브에 적절한 양의 H 탭 버퍼를 첨가하고 30 Hz에서 4 분 동안 조직 균질기로 단편을 해리합니다. 마지막으로, 세포 용액을 13, 400배 G 및 섭씨 4도에서 6분 동안 원심분리합니다. 상층액을 새 튜브에 모은 다음 균질화 비드가 생성된 펠릿을 버리도록 합니다.

그런 다음 상등액을 사용할 때까지 영하 70도에서 저장할 수 있습니다. 이전에 준비된 조직 균질화 7마이크로리터를 96웰 플레이트에 3중으로 추가하여 이 단계를 시작합니다. 그런 다음 50마이크로리터의 희석된 과산화수소를 새로 준비된 OD Dion 요오드에 첨가합니다.

멀티 채널 피펫을 사용하여 200마이크로리터의 과산화수소 혼합물을 각 웰에 추가합니다. 이제 분광 광도계를 사용하여 550나노미터의 흡광도를 측정하고 32번째 간격으로 세 번 판독합니다. 그런 다음 흡광도 데이터, 조직 중량 및 완충액 부피를 사용하여 이 샘플 계산에서 입증된 대로 균질액의 NPO 활성을 계산합니다.

DSS 치료 기간 동안 질병 활성 지수는 질병의 임상 진행을 평가하고 평가하는 데 사용할 수 있습니다. DSS로 치료받은 동물은 초기 체중에 비해 상당한 체중 감소, 묽은 변 및 배설물 출혈을 보입니다. 거시적 시스템보다 실체가 클수록 질병 활성 지수가 높습니다.

5일 동안 식수에 5%의 DSS를 투여한 쥐의 결장을 제물로 조사한 결과, 본 대표 실험에 대한 대장염의 중증도는 결장 길이 단축, 대장 출혈, 대변 출혈, 대변 농도 완화 및 직장 출혈 징후에 대한 거시적 점수에 기초한 대장염의 중증도는 처리된 DSS의 단면에 의해 입증된 바와 같이 물만 투여한 대조군보다 약 5배 더 나쁜 것으로 확인되었습니다 H 및 E와 동일한 결장 조직 샘플은 수처리 대조군보다 조직학적 점수가 더 높습니다. 여기서, 정상적인 구조와 세포 침투의 부족은 물만 받은 대조 동물로부터 수집된 이 h 및 e 염색 단면의 별표로 표시된 영역에서 주목할 수 있습니다. 이제 A DSS 처리 동물의 샘플에 대한 h 및 e 염색을 이전 그림과 비교합니다.

이 동물의 결장은 파운드 기호에서 알 수 있듯이 더 많은 세포 침투와 더 많은 배상 세포 고갈 및 더 큰 왜곡으로 입증된 바와 같이 더 많은 조직학적 손상을 나타냅니다. 별표로 표시된 K crypt 아키텍처에 대한 손상. DSS 투여된 마우스의 질병 중증도 정도를 추가로 특성화하기 위해 균질화된 대장 조직 샘플에서 염증에 대한 대리 마커인 NPO 활성을 평가할 수 있습니다.

예상대로 DSS 처리된 결장은 대조군보다 NPO 활성이 더 높습니다. 또한, DSS 유발 대장염의 중증도는 IL 1 베타 IL 6 및 TNF 알파와 같은 전염증성 사이토카인 수치 증가와 관련이 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 MPO 활동은 시간이 지남에 따라 감소할 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다.

따라서 MPO 분석은 장 염증의 중증도를 결정할 때 수행되는 첫 번째 분석 중 하나여야 합니다.