使用自制细胞离心涂片装置对人类多能干细胞进行免疫细胞化学分析

大家好，我是里克·帕斯夸（Rick Pasqua），来自弗吉尼亚联邦大学化学与生命科学系的干细胞工程实验室。在本视频中，我将演示我们实验室如何使用一种低成本且自制的STO旋转装置，制备出可观察的人类多能干细胞单层，以实现对细胞表面标志物的定量分析。由于许多免疫化学检测方案通常是针对在腔室载玻片上以克隆形式生长的人多能干细胞（hPSCs）而优化的，因此在单个细胞水平上表征生物标志物表达时可能会出现问题。

将细胞培养成单层不仅有助于对细胞进行直观分析，还可能有利于定量检测其表达水平。我们实验室使用的细胞铺展装置可以通过大多数实验室常见的材料制备，仅需少量细胞样本，且无需任何特殊试剂。更重要的是，该装置能够稳定地获得分散的单个细胞，便于观察。以下是构建该细胞铺展装置所需的一些材料。

塑料载玻片，由于不一定需要清洁，因此如有需要，可以使用旧的腔室载玻片。预清洁的玻璃载玻片。这些载玻片需要进行清洁，因为细胞单层将在此形成。

滤纸，任何类型均可，以及微量移液器吸头。我们实验室在开始构建前使用的是1至10微升规格的吸头。应先在塑料载片上打孔。

可以使用台式钻床完成此操作。孔的直径取决于微量移液器吸头的大小，应约为标准1至10微升微量移液器吸头最宽部分的宽度，即大约7 mm。

在塑料载片上打孔的数量完全取决于您的具体用途。例如，在我们实验室的免疫化学染色中，通常使用两个孔，一个用于阳性染色，另一个用于阴性背景对照。这些载片可以无限次重复使用。

对于滤纸，只需将其裁剪成与塑料载片相同的尺寸。以载片上的孔为参考，在滤纸上打上相应位置的孔。滤纸上的孔应足够大，以便微量移液器吸头能够紧密贴合，如图所示。

然后需要剪取适当数量的微量移液器吸头，每个孔对应一个，长度约为其一半。这将作为玻璃载片的基底，用于形成细胞单层。接下来，将滤纸放置在其上方。

滤纸将用于吸收悬液染色过程中多余的培养基。然后用塑料载片覆盖，作为装置的固体支撑。最后，可用普通家用胶带将四边完全密封。

最后，将完整的微量移液器吸头插入装置的切口端。此处用于放置悬浮染色后的细胞样本。为便于识别，也可先在载玻片上标记出切口端吸头所在的位置。

我们实验室使用的免疫化学悬浮染色方案首先涉及将干细胞收集为单细胞悬液，通常通过使用胰蛋白酶或基于EDTA的非酶细胞解离缓冲液进行酶解来完成。然后将细胞转移至1 ml或2 ml的微量离心管中，并加入标准培养基。随后在200 ×g下离心4分钟。

所有后续的洗涤和离心步骤均使用相同的离心速度。然后手动吸除上清液，在吸液时需格外小心，以确保细胞沉淀不受扰动。随后用 1 ml PBS 洗涤两次，每次均需离心并吸除上清液。

下一步是使用4%多聚甲醛（PFA）固定细胞，该试剂的配制方法或所需试剂已在本视频的配套文字说明中列出。将细胞置于4%多聚甲醛溶液中，在室温下孵育10分钟。建议在进行细胞外悬浮染色以及使用细胞离心涂片装置（cyto spin apparatus）之前完成此步骤。

随后，用 PBS 洗涤细胞两次，以去除残留的 PFA。然后应对细胞进行封闭，以防止非特异性染色。在上一步 PBS 洗涤后，吸去洗涤液，并加入 1 ml 封闭液。

然后在室温下放置约45分钟。在等待封闭液作用的同时，可将一抗用推荐的稀释比例溶于封闭液中进行配制，并于4°C保存。

细胞在封闭液中孵育约45分钟后，离心并吸除封闭液，将细胞重悬于一抗溶液中。为了检测非特异性结合和背景信号，最好至少保留一个样本作为阴性对照，即不加一抗，仅将细胞重悬于PBS中。

所有样品在室温下放置约一小时。如有需要，固定后的细胞可在一抗溶液中悬浮过夜，随后用封闭液洗涤两次。洗涤过程中可配制二抗溶液。

二抗通常对光敏感，因此应尽量调暗实验室灯光，并用铝箔包裹所使用的容器，以防止荧光淬灭。可以将抗荧光淬灭剂加入实验步骤中，但需谨慎使用，因其可能导致背景信号升高。将一抗用封闭液稀释至推荐浓度后加入。洗涤完成后，无论样本是否添加了一抗，均需向所有样本中加入一滴抗荧光淬灭剂。

将此置于黑暗处（例如容器内）静置约一小时。用一毫升封闭溶液洗涤细胞两次。此时细胞应已准备好进行DPI染料的核染色。

首先将DPI溶液用PBS按1:10,000的比例稀释，用1 ml PBS洗涤细胞一次，然后重悬并悬浮于DPI溶液中，在室温下静置约5至10分钟。与二抗类似，DAPI对光敏感，因此需采取必要措施避免荧光淬灭。用1 ml PBS洗涤一次，最后重新悬浮。

再次悬浮于1 mL PBS中。此悬液即可用于细胞离心涂片装置。取最多100微升单细胞溶液，加入微量移液器吸头顶部。

建议使用较少的量，以避免不必要的溢出或滴落。随后，将细胞离心装置和平衡物放入台式离心机中，在1000 RPM条件下离心4分钟。之后，小心拆卸细胞离心装置，操作时应尽量减少细胞从玻片上脱落的可能性。

在封片前，需在荧光显微镜下确认细胞已充分沉降。这些图片来自细胞离心涂片装置制备的单层BG one V细胞，经SSCA四细胞表面标志物染色。注意细胞彼此之间分离良好，便于进行单细胞观察和记录。

该实验方案的优点在于能够稳定地培养出单层细胞，具有可行性高、成本效益好以及易于适应各种干细胞培养常规分析的特点。希望本视频对您有所帮助，并能在您自己的研究中应用该实验方案。