从人类体细胞与仙台病毒高效的新一代人类诱导多能干细胞
2014年4月23日
在这里，我们提出我们建立的方法重新编程人类体细胞转基因成无人类iPS细胞与仙台病毒，这说明一致的结果，并提高效率。
该程序的总体目标是用仙台病毒生成人类诱导的多能干细胞。这是通过首先制备和铺板要转导的成纤维细胞来实现的。该程序的下一步是用仙台病毒感染细胞。
然后将感染的成纤维细胞转移到新鲜的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层细胞上。最后一步是手动选择重新编程的。现在，多能干细胞，最终将成纤维细胞重编程为 I PSC，而无需使用反基因，可以通过免疫标记和 R-T-P-C-R 来显示。
与现有方法相比，该技术的主要优点是它提高了重编程效率，而无需保持反式，并且以经济高效的方式 对于该方案，在 DMEM 中培养现成的人成纤维细胞。使用 FBS 将这些细胞转移到 24 孔板中进行实验，将细胞进行 6 次连续稀释，以确定细胞贴壁的最佳密度。24 孔板的每一行可容纳一个稀释系列的细胞。
因此，可以在一个板上测试四种细胞类型，孵育稀释液 24 小时。第二天，选择三个汇合水平的孔进行转导。一次在转导前一小时或更长时间内达到 80% 至 90% 的高水平汇合，一次在约 60% 汇合处，第三次在约 30% 汇合处。
用 300 μL 新鲜成纤维细胞培养基更换培养基以进行转导解冻。一组仙台病毒管在 37 摄氏度下放置几秒钟，然后完成。在室温下解冻。
将解冻的病毒以 6， 000 G 离心 10 秒，然后将它们储存在一个微量离心管中的冰上。根据要转导的细胞数计算病毒的混合物。计算详细信息可以在文本协议中找到。
轻轻移液，将病毒充分混合。现在，对于最密集的细胞，添加两倍体积的病毒。向中等密度细胞中加入 1 体积的病毒，向密度最低的细胞中加入半体积的病毒。
旋转板并孵育过夜，以便在第二天发生反应。用 500 微升新鲜的成纤维细胞培养基替换培养基。两天后，即对转导的细胞进行第二次培养基更换三天后，再次执行此作。
用含有 10% FBS 板的 DMEM 在 60 毫米培养皿中制备甲基细胞，每培养皿 500， 000 个细胞，并孵育过夜。第二天，用新鲜培养基更换冰毒细胞上的培养基，然后继续设置共培养。首先，从转导的成纤维细胞中取出培养基，并用 DPBS 洗涤一次。
接下来，在 5 分钟内向每个转导的细胞孔中加入 200 μL 0.25% 胰蛋白酶 EDTA。将所有分离的细胞汇集到一个 15 毫升锥形管中。将细胞以 1， 350 G 的浓度离心 4 分钟。
然后去除上清液，用约 5 毫升新鲜培养基洗涤沉淀的细胞，以中和三分球。现在以 1， 350 G.Next 板再旋转 4 分钟收集细胞。大多数细胞为甲基苯丙胺中的六个连续稀释液。
根据细胞的死亡率，可能不需要第一次和最后一次稀释。保存一些细胞用于 RNA 提取，并将板孵育过夜。第二天，用补充有 10 微摩尔 RO 激酶抑制剂 Y 2 7 6 3 2 的人 ES 培养基替换培养基。
为了提高以下几天的细胞存活率，将培养基更换为正常的 unsu 补充人 ES 培养基。培养一周后，开始每隔几天检查培养皿是否形成 ES 集落，如细胞团块。一旦它们出现，请监控增长。
转导后 3 周，ES 细胞团块的集落应该可以扩增了。在 24 孔板中制备甲基苯丙胺饲养细胞，就像为 60 毫米板制备一样。在挑选任何菌落之前，将甲基细胞上的培养基更换为含有 10 微升 Y 2、7、6、3、2 的 ES 培养基。
一次从盘子中挑选一个菌落。将菌落转移到装有溶液的 15 毫升试管中。使用移液器打碎菌落。
然后盖上一个我。好吧，关于破碎的殖民地。最终，用一个破碎的菌落加载每个孔，并加载尽可能多的孔。
通过每日更换培养基来维护细胞，并将它们扩展到 6 个孔板，然后是 60 毫米培养皿。通常，仙台病毒感染的成纤维细胞在 5 天后才会表现出任何形态变化。然后细胞呈圆形，具有较大的细胞核和较小的细胞质。
这种小规模方案包括几个可以优化的参数，例如成纤维细胞密度、病毒滴度和到中间的接种密度。也可以优化以不同颜色显示的不同共流畅度的细胞转导。与冰毒饲养层细胞共培养一周后，部分重编程的成纤维细胞呈松散的 slike 形状，与使用胰蛋白酶收集相反，很容易被挑选。
完全重编程后，I PSC 可与部分重编程的细胞清晰识别。完全重编程的细胞紧密堆积，集落可以具有清晰的边界。部分重编程的细胞形成松散的簇，很容易分离。
在 IPSC 克隆扩增数周后，与 H 9 细胞相比，干细胞标志物染色是必要的。IPC 对几种预期的抗体呈阳性，包括 SSEA 4、OCT 4、TRA 81 和 nano G，支持其多能性。在人 IPSC 克隆中未观察到使用 R-T-P-C-R 转基因表达。
在外源性 OCT 4、SOX 2、klf 4 和 Cmic 的 10 次引物与显示出强转基因表达水平的阳性对照样品一起使用。看完这个视频后，您应该对如何重编程体细胞以诱导多效干细胞以及如何选择这些细胞，从其他细胞中完全重编程细胞有了很好的了解。
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概述
本文介绍了一种使用仙台病毒将人体细胞重编程为无转基因人类诱导多能干细胞（iPSCs）的方法。该程序展示了在产生iPSCs时一致的结果和提高的效率。
关键研究组成部分
科学领域
- 干细胞生物学
- 细胞重编程
- 病毒学
背景
- 诱导多能干细胞（iPSCs）对再生医学很有价值。
- 传统方法通常涉及使用转基因，这可能会带来安全性问题。
- 仙台病毒是一种非整合载体，可以实现更安全的重编程。
- 该方法旨在提高从体细胞产生iPSCs的效率。
研究目的
- 建立一种无转基因生成iPSCs的可靠方法。
- 提高重编程过程的效率。
- 提供一个可以在研究环境中轻松复制的协议。
使用的方法
- 成纤维细胞的准备和接种。
- 用仙台病毒转导成纤维细胞。
- 将感染的细胞转移到小鼠胚胎成纤维细胞补体细胞上。
- 通过免疫标记和RT-PCR确认重编程细胞的手动选择。
主要结果
- 成功从成纤维细胞中产生无转基因iPSCs。
- 在多次试验中展示了一致的重编程结果。
- 与传统方法相比效率提高。
- 通过既定的测定验证多能性。
结论
- 仙台病毒方法是一种安全有效的iPSCs生成方法。
- 这种技术可以促进再生医学的进一步研究。
- 未来的研究可能探索这些iPSCs在各种治疗环境中的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Efficient generation of transgene-free human iPSCs using Sendai virus addresses a critical bottleneck in early discovery and disease modeling pipelines. This method enhances predictive confidence by eliminating residual transgene expression, supporting more reliable downstream differentiation and phenotypic screening. Its reproducibility and scalability position it as a foundational capability for translational research and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust generation of patient-specific iPSCs for hypothesis-driven disease modeling.
- Reduces mechanistic ambiguity by removing confounding transgene effects in functional assays.
- Supports target validation through reproducible reprogramming and marker-based confirmation.
- Facilitates portfolio triage by providing high-quality, integration-free cellular models.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, transgene-free iPSC lines for assay development and compound screening.
- Improves assay reproducibility by minimizing genetic and epigenetic artifacts.
- Enables quantitative readouts via immunolabeling and RT-PCR for pluripotency markers.
- Supports scalable workflows for high-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Provides disease-relevant cellular systems for translational biomarker discovery.
- Ensures continuity from discovery to preclinical validation by maintaining genomic integrity.
- Reduces risk of misinterpreting disease phenotypes due to residual transgene expression.
- Aligns with requirements for preclinical model standardization and reproducibility.
Pipeline & Workflow Integration
This Sendai virus-based reprogramming method integrates at the interface of early discovery, target validation, and preclinical model development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by generating high-fidelity iPSC models.
- Screening: Provides reproducible, transgene-free cell lines for assay standardization and compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative assessment of pluripotency via immunolabeling and RT-PCR outputs.
- Translational Research: Maintains disease relevance and biomarker alignment for downstream studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, scalable platform for generating iPSCs across diverse projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic risk in disease modeling.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of iPSC generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling reliable model systems.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, viral transduction, and stem cell characterization.
- Needs access to Sendai virus reagents, feeder cell infrastructure, and molecular analysis tools.
- Demands cross-team standardization of cell density, virus titer, and marker validation protocols.
- Adaptable to various human somatic cell sources with optimization of key parameters.
- Dependent on rigorous immunolabeling and RT-PCR to confirm transgene-free status and pluripotency.
