T - 파 이온 모빌리티 분석법 - 질량 : 단백질 복잡한 분석을위한 기본 실험 절차

다음 실험의 일반적인 목표는 단백질 복합체의 전반적인 모양을 결정하는 것입니다. 이는 단백질 복합 이온에 대한 질량 분석법, 철 이동도 데이터를 획득하고 각 전하 상태의 드리프트 시간 값을 측정함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 네이티브 단백질 구조의 이동성 측정을 보장하기 위해 실험 조건을 검증합니다.

다음으로, 측정된 드리프트 시간 값은 단면적과 상관관계가 있습니다. 결과는 알려지지 않은 3차원 구조를 가진 단백질 또는 단백질 복합체의 충돌 단면 값을 결정합니다. 이 정보는 전체 모양, 소단위 패킹 및 토폴로지에 대한 단서를 제공합니다.

안녕하세요, 저는 Wiseman Institute of Sciences의 생물 화학과 Mic 연구실의 Isaac Leski이고, Mi 연구실의 Naam Kirschenbaum입니다. 오늘 우리는 하이브리드 질량 분석법과 철 이동성 기기를 사용하여 충돌 단면 단백질 복합체를 측정하는 절차를 보여줄 것입니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 단백질 복합체의 전반적인 모양과 조직을 연구합니다.

시작하겠습니다. 이 절차는 단백질 복합체의 철 이동도, 질량 분석 또는 IMM MS 분석에 중점을 둡니다. 시료 준비 단계, 기기 보정, MS 및 탠덤 MS 최적화 절차는 관련 JO 프로토콜에 설명되어 있습니다.

일반적으로 이 프로토콜은 아세트산암모늄과 같은 휘발성 완충액에서 복합체의 낮은 마이크로몰 농도를 포함합니다. 나노 흐름 캐필러리당 1-2마이크로리터가 소비된다는 점을 감안할 때, MS 조건을 최적화할 수 있도록 최소 부피로 10-20마이크로리터를 준비합니다. 이 절차를 시작하려면 진행파 또는 T파 시냅 IMMS를 IM 및 비행 시간 모두에 대해 삼파와 압력이 자동으로 설정되는 작동 모빌리티 토프, 이온 분리, 양이온 획득 및 V 모드, 비행 튜브를 통한 이온의 경로 설정 및 여기에서 모든 가스를 켜는 반사

질소는 IM 분리에 사용되고 아르곤은 트랩 및 전달 영역에 사용됩니다. 권장 초기값은 IMS 장치의 경우 분당 24밀리리터, 트랩 영역의 경우 분당 1.5밀리리터의 가스 유량입니다. 다음으로, 미확인 단백질 복합체에 대한 비만전 비율 획득 범위를 설정합니다.

처음에는 넓은 질량 범위를 사용하다가 원하는 값으로 줄일 수 있으며 그에 따라 MS 프로파일을 조정하십시오. 대형 단지의 전송 효율을 극대화하려면 획득 질량 범위를 1030 2000 MA 전하비에서 설정하고 MS 프로파일을 자동으로 설정해야 합니다. 그렇지 않으면 표시된 차트에 따라 프로파일을 설정할 수 있습니다.

RF 설정을 확인하고 필요한 경우 그림과 같이 큰 단백질 복합체에 적합한 값으로 조정합니다. 다음으로, 샘플을 로드하고 모세관 전압과 낮은 나노 흐름 압력을 가합니다. 스프레이가 시작되면 나노 유량 압력을 최소값으로 줄이십시오.

또한 원뿔에 대한 모세관의 위치를 조정하고 잘 분리된 MS 스펙트럼을 획득하기 위해 MS 획득 매개변수를 조정합니다. 기기와 샘플링 콘을 따라 압력 구배를 최적화하고, 관련 JoVE 프로토콜에 자세히 설명된 대로 추출 콘 바이어스 트랩 및 전송의 잠재적 설정을 최적화합니다. 이러한 매개변수는 샘플에 따라 다르지만, 펩타이드에서 단백질 복합체에 이르기까지 다양한 철 덩어리의 MS 스펙트럼을 획득하는 데 사용되는 조건은 다음과 같습니다.

큰 이온은 더 높은 충돌 에너지와 바이어스 전압을 필요로 합니다. 또한 복합체의 활성화를 최소화하기 위해 큰 단백질 복합체의 분석을 위해 배압을 증가시키는 것이 좋습니다. 피크의 위치를 변경하지 않고 약 10V 단위로 샘플 원뿔 추출, 원뿔 트랩 및 바이어스 전압을 점진적으로 줄이십시오.

최적의 질량 스펙트럼을 얻으면 단백질 어셈블리를 분석할 때 드리프트 시간 또는 IM 프로파일을 조정해야 합니다. 질량 측정과 이동도 측정을 위한 최적의 조건은 종종 호환되지 않습니다. 따라서 둘 사이의 적절한 균형을 유지하는 것이 중요합니다.

전반적으로, iron mobility plot은 피크가 전체 드리프트 시간 범위에 걸쳐 분포되고 피크 프로파일이 매끄럽도록 최적화해야 합니다. 지안 분포에 접근하면 상당한 피크 비대칭이 여러 형태의 잘못된 분리와 관련될 수 있으며, T파 속도, T파 높이 및 IMS 가스 유량을 조정하여 이동성 분리를 최적화할 수 있습니다. T파 속도를 높이면 드리프트 시간 분포 프로파일이 넓어집니다.

증가된 T-wave 높이 값은 좁아지지만, 마찬가지로 분당 10밀리리터에서 시작하는 IMS 가스 유량을 증가시키면 드리프트 시간 프로파일이 더 높은 값으로 이동하고, 철 이동성 스펙트럼을 최적화하는 데 효과적입니다. 세 가지 변수 중 두 가지를 수정하고 세 번째 변수를 최적화하여 T파 속도를 초당 250미터로 설정하고 가스 흐름을 분당 24밀리리터로 설정합니다. 그런 다음 시작점으로 높이를 3볼트로 설정하고 단계적으로 1볼트 단위로 증가시킵니다.

높은 바이어스 전압을 사용하는 경우 IMS 가스 압력을 낮추고 이러한 방식으로 바이어스 전압을 감소시키는 것이 좋습니다. 결과적으로 복잡한 활성화 및 해리가 감소합니다. 전복 효과는 조건이 최적화되지 않을 때 나타날 수 있으며, 드리프트 시간 스펙트럼의 첫 번째 부분과 테일링 에지에서 동일한 피크로 관찰됩니다.

이온이 IAM 장치를 통과하지 않으면 사실상 다음 철 패킷이 이동성 셀로 방출되는 데 필요한 시간보다 더 오래 걸릴 수 있습니다. 그 결과, 이전 패킷이 푸셔 영역으로 전달되기 전에 트랩 영역에서 새로운 이온 묶음이 방출됩니다. 이 아티팩트를 제거하려면 T-wave 높이를 늘리고 T-wave 속도와 IMS 압력을 줄입니다.

또한 트랩 해제 시간을 조정할 수 있습니다. 또한 전달 T파 높이가 최소 5볼트로 설정되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 또한 IMS 셀로의 이온 누출을 방지합니다.

모빌리티 트랩 높이는 최대 수준으로 유지해야 합니다. 전달 T파의 낮은 속도와 높은 진폭은 드리프트 시간 분포 프로파일의 파급으로 이어질 수 있습니다. 이 아티팩트는 푸샤 주파수와 전달 T파 속도 사이의 부분적인 동기화로 인해 전달 영역과 터프 영역을 통해 이온의 이동성 분리가 유지되지 않을 때 발생합니다.

이 효과를 제거하려면 푸셔 시간 또는 전달 T파 속도를 조정해야 합니다. 푸샤 주파수는 질량 범위와 관련이 있기 때문에 이 아티팩트가 다시 나타날 수 있습니다. 이 매개 변수가 변경되는 경우.

T파 높이는 약간의 영향을 미칩니다. 그 감소는 또한 잔물결을 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다. 앞서 언급한 매개변수가 최적화되면 IMMS 데이터를 획득하여 높은 분해능을 달성할 수 있습니다.

미시시피. Peaks 단백질 복합체는 종종 질량분석기 내에서 활성화되어 잔류 수분 및 완충 성분의 제거를 촉진합니다. 그러나 활성화 에너지가 임계값 이상으로 증가하면 여러 중간 상태를 형성하는 부분 풀림이 발생할 수 있으며, 이는 기본 솔루션 상태 구조에 해당하지 않을 수 있습니다. 결과적으로, 드리프트 타임 피크는 펼쳐진 구조체의 수소 개체군을 반영하여 이동되고 확장될 수 있습니다.

용액상 구조와 일치하는 드리프트 시간 데이터를 얻으려면 IM 분리 전에 이온을 가속하는 데 사용되는 전압을 신중하게 제어해야 하므로 드리프트 시간 스펙트럼에 미치는 영향을 모니터링하면서 모세관 및 원뿔 전압을 단계적으로 증가시키는 것이 중요합니다. 또한, 높은 MS 분해능의 경우 트랩 전압보다 전달을 증가시키는 것이 바람직합니다. IM 장치가 먼저 배치되고 그 다음에 전송 영역과 TOF 분석기가 배치됩니다.

활성화는 IM 측정에 따라 IM에 영향을 받지 않기 때문에 MS 정확도를 높여 복합체의 기본 구조를 유지하는 조건에서 데이터 수집을 수행할 수 있지만 최적화된 단일 매개변수 세트를 고수하는 것보다 다양한 실험 및 용액 조건에서 데이터를 수집하는 것이 중요합니다. 이러한 이유로 트랩 충돌 전압을 단계적으로 증가시키고 10V 간격으로 데이터를 수집하면서 아이언 모빌리티 프로파일에 미치는 영향을 모니터링해야 합니다. 마지막으로, 펼쳐진 확증을 확인하고 획득된 데이터를 평가하기 위해, pH 2 내지 7의 pH 범위에서 샘플을 아세트산으로 적정하여 단백질 복합체의 해리를 수동으로 유도하고, 데이터를 기록하기 위해, 드리프트 시간 보정 접근법에 의해 정의된 단면적 T파 IMS 시스템에서 데이터를 분석하기 위해 진행하고, 알려진 단면 값을 가진 Cain 단백질을 사용합니다.

먼저, 변성 구경 단백질 용액을 각각 10마이크로몰로 준비합니다. 말 사이토크롬 C 말, 심장 미오글로빈 및 소 유비퀴틴을 49, 49 0.2 부피 비율 물 메탄올 아세트산에 사용합니다. 다음으로, 표적 단백질 또는 단백질 복합체에 사용된 것과 정확히 동일한 기기 조건에서 구경 단백질에 대한 IMMS 데이터를 획득하고, 모든 전압 및 압력 값을 동일하게 유지하여 IM 분리 설정을 유지합니다.

데이터를 수집한 후 각 전하에 대한 실험 표류 시간 값을 추출합니다. Cain 단백질의 상태는 다음 방정식을 사용하여 각 구경 드리프트 시간 T 프라임 D를 보정하며, 여기서 MOVZ는 관찰된 이온의 마스터 전하 비율이고 C는 향상된 듀티 사이클 EDC 지연 계수입니다. 일반적으로 1.4에서 1.6 사이의 값은 기기에 따라 다릅니다.

EDC 값은 시스템 하나의 획득 설정, 하나의 획득 설정 탭 내에 표시되며, 철 전하 상태와 감소된 질량 모두에 대해 각 구경 단면을 수정합니다. 여기서 오메가 C는 수정된 단면이고, 오메가는 문헌 단면, Z는 철 전하입니다. 상태 M은 케인 이온의 분자량이고 MG는 철의 분자량입니다.

일반적으로 오메가 C의 thelan에 대한 T 프라임 D의 질소 플롭 thelan인 배경 가스.결과 곡선은 다음 방정식에 해당합니다. 매개변수 X와 A는 플롯을 선형 관계에 피팅하여 추출할 수 있습니다. 기울기 X는 지수 비례 인자에 해당하고, A는 결정된 피팅 상수를 나타냅니다.

피팅 상관 계수 R 제곱을 계산합니다. R 제곱에 사용할 수 있는 값은 0.95보다 큽니다. 낮은 상관 계수 값은 단백질의 불완전한 풀림, 샘플의 노화 때문일 수 있습니다.

서로 다른 구경의 단백질에 사용된 서로 다른 실험 조건, 잡음이 있는 스펙트럼 및 불완전한 데이터 처리 또는 계산 오류. 결정된 지수 계수 X를 사용하여 ca 드리프트 시간을 수정하고 오메가 C 대 T 프라임 D.Define을 다시 상관 계수로 재정렬하여 계산을 검증합니다. 0.95보다 높은 값은 앞에서 설명한 단계와 유사하게 예상되며, 표적 단백질 또는 단백질 복합체의 측정된 드리프트 시간을 수정하고, 계산된 지수 계수 X를 사용하여 표적 단백질 또는 단백질 복합체의 드리프트 시간을 보정합니다. 각 실험 조건에 대해 이 단계를 반복합니다.

미지의 단백질 또는 단백질 복합체의 단면적을 정의할 때, 각 실험을 최소 3회 반복하고 충돌 단면적 값이 결정되면 이러한 삼중 측정의 표준 편차를 결정하는 것이 좋습니다. 복합 단지의 토폴로지 또는 배열을 예측하기 위해 모델링 접근 방식이 사용됩니다. 이는 전체적으로 생성된 모델 구조에서 계산된 실리코 오메가 값 내에 실험적 충돌 단면 값을 피팅하여 수행되며, 이 분야는 아직 초기 단계이며 이 접근 방식을 일반화하고 광범위한 복합체에 적용할 수 있도록 하려면 추가 개발이 필요합니다.

소 헤모글로빈의 사합체 형태의 표면 표현이 여기에 나와 있습니다. 산소 수송체 헤모글로빈 복합체는 위에서 언급한 접근법의 예가 될 수 있습니다. 헤모글로빈은 각각 파란색과 빨간색으로 표시된 두 개의 알파 소단위와 두 개의 베타 소단위로 구성된 사량체 단백질 복합체로, 알파 베타 이량체의 이량체를 형성합니다.

헤모글로빈의 IMMS 스펙트럼은 다음과 같습니다. 복합체의 획득된 IM ms 스펙트럼은 알파 베타 이량체와 알파 및 베타 단량체 소단위체의 질량에 맞는 온전한 복합체 및 작은 전하 계열에 해당하는 주요 전하 계열 분포를 나타냅니다. 다양한 형태의 헤모글로빈에 대한 이론적이고 측정된 CCS가 여기에 나와 있습니다.

di meric 및 tetrameric 형태의 여러 전하 상태에 대해 검색된 드리프트 시간 값을 사용하여 오메가 값을 계산했습니다. 이를 이론적 값과 비교했습니다. tetrameric complex는 cyclic dihedral 또는 chain과 같은 packings의 세 가지 연관 가능성을 가지고 있습니다.

이량체에서 사량체로 이동할 때 오메가의 증가를 계산하여 구조적 조직을 예측할 수 있습니다. 이전 연구와 자체 실험은 측정된 CCSS와 결정 구조 데이터에서 파생된 단백질 표면적 사이에 강력한 상관관계가 있음을 보여주었습니다. 이 상관 관계는 서로 다른 패킹 형태에 대한 이량체와 비교하여 사량체의 예상 표면적 증가를 계산하는 데 사용할 수 있습니다.

이것은 각 소단위 비구면 물체를 고려하여 수행됩니다. 어셈블리와 같은 체인은 사량체 CCS를 약 2배 증가시키는 반면 C 4 또는 D 2 패킹은 각각 약 1.5 및 1.67의 증가를 산출합니다. 헤모글로빈의 사합체 및 DME 형태의 측정된 CCS 값 간의 계산된 비율은 1.57 플러스 마이너스 0.03이었습니다.

이 숫자는 기본 구조가 선형으로 조직되지 않고 순환 또는 이면체 사면체로 더 조밀한 형태로 배열되어 있음을 보여줍니다. 헤모글로빈의 분해된 결정 구조에 대해 동일한 계산을 반복할 때 DME 형태에 대한 사량체의 표면적 비율은 1.63으로 D 2 대칭에 맞았습니다. 분명히, 이 기하학적 모델은 단순화되었고 단백질 소단위는 단순히 구형이 아닙니다.

그러나 이 계산은 IMMS가 알려지지 않은 고해상도 구조를 가진 복합체의 패킹을 밝힐 수 있는 흥미로운 잠재력을 보여줍니다. 방금 단백질과 단백질 복합체의 드리프트 시간을 측정하는 방법을 보여 드렸고, 단백질 복합체는 충돌 단면 값을 계산하는 방법을 수반합니다. 이 절차를 수행할 때 표적 단백질 또는 단백질 복합체에 사용된 것과 정확히 동일한 조건을 사용하여 구경 단백질에 대한 IMMS 데이터를 획득하는 것이 중요합니다.

또한 이러한 실험을 최소 3회 반복하고 이러한 삼중 측정의 표준 편차를 결정할 것을 강력히 권장합니다. 그게 다야. 지켜봐 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.