세포는 형광 현미경 Electrofusion와 시각
July 1st, 2010
이 비디오에서 우리는 세포의 효율적인 electrofusion을 보여주 체외에서 electroporation과 형광 현미경과 세포 융합 시각화의 후속 감지를 사용하여 수정된 준수 방법을 통해서 이루어집니다.
전기 융합은 가까운 맥락에서 세포에 짧은 고전압 전기 펄스를 적용하는 것을 포함합니다. 이 비디오에서는 변형된 Adherence.Method를 통한 in vitro 세포의 전기 융합을 시연합니다. 실험은 마우스 흑색종 세포, BF one에 대해 수행되었습니다.
실험의 경우 다음 단계를 수행합니다. 두 개의 별도 배양 플라스크에서 세포를 80% 합류점으로 성장시킵니다. 별도로 각 원액 2.1마이크로리터를 추가합니다.
원심분리기 튜브에 각각 10밀리몰의 C-M-F-D-A 또는 CMRA를 3ml의 Krebs Hess 버퍼에 주입합니다. Krebs Hess 버퍼로 세포를 두 번 헹구고 플라스크에 로딩 용액을 삽입합니다. 로딩 용액에는 각각 약 7개의 마이크로몰, C-M-F-D-A 또는 CMRA가 포함되어 있습니다.
통제된 분위기에서 30분 동안 세포를 배양합니다. 이 첫 번째 배양 동안 영역은 세포막을 통해 세포질로 자유롭게 통과하여 막 IMP 투과 반응 산물로 변형됩니다. 이 첫 번째 배양 후, 세포를 헹구고 배양 배지로 2 시간 더 배양하십시오.
세포는 수집 소프트웨어에서 냉각된 CCD 카메라가 장착된 형광 현미경을 사용하여 관찰됩니다. excitation 파장을 548 나노미터로 설정하고 C-M-F-D-A가 로드된 세포에 대해 CMRA가 로드된 세포의 적절한 대역 통과 필터 위협 형광 이미지를 선택합니다. excitation 파장을 492 nanometer로 설정하고, 녹색 형광 이미지 트립신 눈을 위한 band pass filter를 선택하고, 두 플라스크의 세포를 세고 적색 세포와 녹색 세포를 1:1 비율로 혼합하여 세포 농도를 밀리리터당 500만 세포로 조정합니다.
각 웰의 중간에 20마이크로리터의 세포 현탁액 한 방울을 떨어뜨립니다. 24개의 멀티웰 플레이트에서 통제된 분위기에서 세포를 20분 동안 배양하여 세포가 단층으로 웰 표면에 약간 부착되고 세포 간에 세포 접촉을 설정할 수 있도록 합니다. 세포가 포함된 멀티웰을 현미경 스테이지에 놓습니다.
전극을 우물 바닥에 배치하고 펄스 발생기에 연결합니다.최적의 전기 융합을 달성하고 세포 생존력을 유지하려면 적절한 전기 펄스 매개변수를 사용해야 합니다. 이러한 매개변수는 세포주에 따라 다르며 예비 실험에서 결정해야 합니다. 배양 배지를 제거하고 세포 팽창을 유도하기 위해 350 마이크로리터 하이포 밀러 인산칼륨 완충액에서 1 밀리리터 ISO 오무 인산칼륨 완충액으로 세포를 세척합니다.
전기 펄스를 적용하기 전에 세포를 과오스톰 완충액에 2분 동안 그대로 두십시오. 전기 펄스는 세포가 최대 부피에 가까울 때 적용되어야 합니다. 그것은 그들이 규제량을 시작하기 전입니다.
실험에서 감소. 1헤르츠에서 100마이크로초의 지속 시간을 가진 8개의 직사각형 펄스의 트레인이 적용되었습니다. 펄스 전달 후.
10분 후 10분 동안 세포를 방해하지 않고 그대로 두십시오. 얼굴 대비와 형광 현미경을 통한 결정된 확산 수율. E는 무작위로 선택된 5개의 시야에서 얼굴 대비, 적색 및 녹색 형광의 3가지 이미지를 획득합니다.
각각에서, 이미지 J 소프트웨어에서 각 이미지 트리플렛으로부터 3개의 채널 이미지를 잘 생성하고, 이미지의 시각적 품질을 향상시키기 위해 사전 처리 단계를 기본 파라미터 세트로 원본 이미지, 배경, 빼기 및 대비 향상에 적용할 수 있습니다. 마지막으로 3채널 이미지는 RGB에서 회색 이미지 J 플러그인을 사용하여 구성됩니다. 이러한 이미지에서 휴지 세포질은 세포막과 함께 볼 수 있습니다.
따라서 3채널 이미지 수에서 적색, 녹색 및 이중 형광의 세 가지 유형의 세포를 모두 쉽게 측정할 수 있는 세포는 거의 없습니다. 이중 형광 세포의 수를 각 이미지에 있는 모든 세포의 수로 나누어 이중 형광 세포의 백분율을 결정합니다. 그런 다음 융합 수율은 이중 형광 세포의 백분율에 2를 곱한 값으로 정의됩니다.
보기 셀의 절반은 동일한 색상의 셀이 볼 때 감지되지 않기 때문입니다.
개요
이 동영상은 변형된 접착 방법과 전기 투과법을 결합한 체외 세포의 효율적인 전기 융합을 보여줍니다. 이 과정에는 형광 현미경을 통한 융합된 세포의 탐지가 포함됩니다.
주요 연구 구성 요소
과학 영역
- 세포 융합 기술
- 전기 투과법
- 형광 현미경 응용
배경
- 전기 융합은 세포 융합을 촉진하기 위해 전기 펄스를 적용하는 기술입니다.
- 이 방법은 하이브리드 세포를 만드는 효율성을 향상시킬 수 있습니다.
- 형광 현미경을 통해 융합된 세포를 시각화할 수 있습니다.
- 세포 융합의 이해는 다양한 생물학적 응용을 위해 중요합니다.
연구 목적
- 세포의 전기 융합을 위한 신뢰할 수 있는 방법을 보여주기 위함입니다.
- 세포 융합의 효율성을 시각화하고 정량화하기 위함입니다.
- 다른 연구실에서 재현할 수 있는 프로토콜을 제공하기 위함입니다.
사용된 방법
- 마우스 흑색종 세포를 배양하고 융합을 위해 준비했습니다.
- 융합 전에 세포를 표지하기 위해 형광 염료를 사용했습니다.
- 세포 융합을 유도하기 위해 전기 펄스를 적용했습니다.
- 형광 현미경을 사용하여 융합 결과를 분석했습니다.
주요 결과
- 형광을 통해 나타나듯 성공적인 세포 융합이 이루어졌습니다.
- 융합 수율을 결정하기 위해 이중 형광 세포의 비율을 계산했습니다.
- 세포 생존율을 위해 최적의 전기 펄스 매개변수를 식별했습니다.
- 영상 처리 기법을 통해 이미지의 시각적 품질이 향상되었습니다.
결론
- 변형된 접착 방법은 세포 전기 융합에 효과적입니다.
- 형광 현미경은 융합 효율성을 평가하는 데 귀중한 도구입니다.
- 이 프로토콜은 연구에서 다양한 세포 유형에 적용할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Cell electrofusion visualized by fluorescence microscopy provides a non-viral, non-chemical platform for generating hybrid cells, supporting early-stage biopharma research. Quantitative visualization of fusion events enables robust assessment of cell manipulation techniques, directly impacting target validation and assay development. This approach strengthens predictive confidence in cell-based workflows and informs risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cell fusion mechanisms relevant to therapeutic hypothesis testing.
- Supports functional validation of cell manipulation strategies for hybrid cell generation.
- Facilitates biological de-risking by quantifying fusion efficiency and specificity.
- Provides measurable outputs for portfolio triage and target confidence.
Screening & Assay Development
- Establishes validated cell systems for downstream screening of fusion-dependent phenotypes.
- Delivers standardized, reproducible quantification of fusion yield via dual fluorescence.
- Enables assay scalability and platform reuse for compound evaluation targeting cell fusion processes.
- Supports reliable benchmarking of fusion protocols across cell types.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational workflows by enabling generation of hybrid cells for preclinical modeling.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of cell-based therapies.
- Reduces mechanistic ambiguity in cell manipulation strategies for therapeutic development.
- Supports risk-adjusted advancement of cell fusion-based therapeutic concepts.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust cell fusion quantification and visualization, supporting both early validation and translational research.
- Discovery Biology: Quantitative fusion yield measurement supports hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Dual fluorescence readouts enable reproducible assay development and benchmarking.
- Analytics: Image-based quantification provides objective, comparable outputs for condition assessment.
- Translational Research: Hybrid cell generation supports preclinical modeling and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable across cell types and research programs, enhancing platform value.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell fusion workflows.
- Operational Value: Standardizes fusion quantification and supports reproducibility across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and improves capital efficiency in early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cell-based therapeutic strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, fluorescence microscopy, and image analysis.
- Needs access to pulse generators, fluorescence microscopes, and image processing software.
- Demands cross-team standardization of labeling, imaging, and quantification protocols.
- Adaptation across cell lines may require optimization of pulse parameters and labeling conditions.
- Fusion efficiency and viability are cell line-dependent and must be empirically determined.
