Name: 세포는 형광 현미경 Electrofusion와 시각 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: 배우세요 생쥐 흑색종 세포를 이용한 수정된 부착법 기반 전기융합 기술과 형광 현미경을 활용한 융합 효율 분석 방법입니다. 이 프로토콜은 다양한 세포 유형에 적용 가능한 신뢰할 수 있는 실험 기법을 제공합니다.

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이 작품은 슬로베니아어 연구기구 (프로젝트 J2 - 9764 및 프로그램 P2 - 0249)에 의해 지원되었다. 이 비디오는 &quot;Electroporation 기반 기술 및 트리 트먼트&quot;류블랴나, 슬로베니아 대학 전기 공학부 주최 과학 워크샵 및 대학원 과정에 대한 보충 자료를 나타냅니다.

나도 셀 추적기 CMFDA과 CMRA으로 세포 중 <ol><li> 실험 마우스 흑색증 셀 라인 (B16 - F1)의 이전 준비 세포에서 수행되었다. 세포 10% 태아 소 혈청, 0.15 MG / ML L - 글루타민, 16 MG와 보충 DMEM 문화 매체 70~80%의 합류 (Dulbecco의 수정 이글의 중간)에 두 분리된 25cm 두 문화 flasks (TPP, ZDA)에 재배 / ML gentamicin (시그마 - 알드리치, 독일에서), 200 단위 / ML crystacillin (Pliva, 크로아티아), 그리고 37 5 % CO 2에서 incubated ° C. </li><li> 원래의 염료 50 μg에 10.76 μl 및 DMSO (시그마 - 알드리치, 독일) 9 μl를 (그린 CMFDA과 오렌지 CMRA 들어, 각각)을 추가하여 셀 추적기의 두 10 MM 주식 솔루션 (Invitrogen, 미국)를 준비 Invitrogen의 유리병. 주식 솔루션 ° C 몇 달 동안 4 냉장고에 저장할 수 있습니다. DMSO의 크리스탈 녹이신 때까지 실험을 시작하기 전에, 솔루션을 따뜻하게. </li><li> 중탄산염 무료 크렙스 - Hepes 버퍼 (130 MM NaCl, 4.7 MM KCl, 1.2 MM MgSO 4, 1.2 MM KH 2 PO 4, 11.7 MM D - 글루코오스, 1.3 MM CaCl 2, 10 MM HEPES, pH를 7.4) 준비합니다. 두 15 ML Eppendorf 튜브는 별도로 중탄산염 무료 크렙스 - Hepes 버퍼 3 ML 각 재고 솔루션 2.1 μl (10 MM CMFDA 또는 CMRA, 각각)을 섞는다. 이것은 약 7 μm의 CMFDA (또는 CMRA)가 포함된 '로딩 솔루션 "을 산출. </li><li> 중탄산염 무료 크렙스 - Hepes 버퍼와 두 세포를 씻어 후 flasks에 솔루션을 로딩 삽입합니다. 37 5% CO 2에서 30 분 동안 전지를 품어 ° C. 이 첫 번째 배양 시약은 세포 점막을 통해 자유롭게 통과하는 동안, 일단 세포 내부의 시약은 휴대 impermeant 형광 반응 제품으로 변모하고 있습니다. </li><li> 37 첫번째 부화 후 씻어 5% CO 2에있는 다른 두 시간 동안 배지로 세포를 품어 ° C. </li><li> 두 flasks의 세포를 Trypsinize (CMFDA 및 CMRA와 함께로드)과 50 ML의 원심 분리기 튜브의 비율 1시 1분 (TPP, ZDA)에 함께 적색과 녹색의 세포를 섞는다. DMEM 매체로 희석하거나 원심 분리기와 농도가 5 × 10 6 세포 / ML에 세포 농도를 조정합니다. 24 multiwell 플레이트 (TPP, ZDA) 각 우물에 세포 현탁액의 20 μl 드롭 놓습니다. ° C 20 분 위해 약간 우물의 표면에 부착하고 세포 연락처를 설정할 수 있도록 37 5 % CO 2 세포를 품어. </li></ol> II. Electrofusion <ol><li> (10 MM KH2PO4, 10 MM K 2 HPO 4, 1mM MgCl 2, 75 MM의 자당) isoosomolar 칼륨 인산 버퍼를 준비 (10 MM KH2PO4, 10 MM K 2 HPO 4, 1mM MgCl 2, 250 MM의 자당)과 hypoosmolar 칼륨 인산염 버퍼 . </li><li> 잘 하단의 현미경 무대, 위치에 전지 전극으로 multiwell를 삽입하고 펄스 발생기에 연결합니다. </li><li> isoosomolar 인산 칼륨 완충액 1 ML있는 세포를 씻으십시오. 세포 팽창을 유도하기 위해 hypoosmolar 인산 칼륨 완충액 350 μl를 추가합니다. 버퍼 전극을 커버한다. </li><li> 전기 펄스를 적용하기 전에 2 분 동안 hypoosmolar 버퍼에 세포를 남겨주세요. 인테리어와 세포의 외부 사이의 삼투 불균형에 의한 세포에 물 분자의 시간 동안 유입 세포 볼륨의 증가의 원인이됩니다. 세포가 자신의 최대 볼륨을 가까이 때 전기 펄스는 규제 볼륨 감소 시작하기 전에 적용되어야합니다. </li><li> 최적의 electrofusion를 달성하고 세포 생존을 유지하기 위해 전기 펄스의 최적의 매개 변수를 사용해야합니다. 이들은 [1]를 사용하여 세포주에 따라 달라집니다. 이 실험에 8 직사각형 펄스 (1 Hz에서 100 μs 기간 각)의 기차는 electroporation 장치를 (우리의 경우 Cliniporator, IGEA, 이탈리아)를 사용하여 각 샘플에 적용됩니다. 펄스는 잘 컨트롤을 제외하고, 각 우물에 전극 사이에 약 1,200 V / cm의 전기장을 만들고, 0.8 mm의 직경과 그들 사이에 5mm 거리 두 개의 병렬 PT / IR 와이어 전극에 전달됩니다. </li><li> 펄스 전송 후 10 분 동안 그대로 세포를 남겨주세요. 형광 및 위상 대비 현미경을 통해 퓨전 수율을 결정합니다. </li></ol> III. 이미지 수집 및 융합 수율의 결정 <ol><li> 세포는 객관적 (x20) 및 냉각 CCD 카메라 (VisiCam 1280, Visitron, 독일)이 장착된 형광 현미경 (우리의 경우에는 자이스 혈구 AxioVert 200 자이스 혈구, 독일)를 사용하여 관찰하고 있습니다. 이미지 MetaMorph 7.1.1 (분자 디바이스, 미국)에 인수 있지만, 다른 유사한 수집 소프트웨어도 사용할 수 있습니다. CMFDA는 548 nm의에서 492 nm의에서 단색 (폴리 크롬 IV, Visitron, 독일)와 CMRA와 흥분이다. CMFDA 및 CMRA의 형광은 (D605/55m, C 두 방사 535 nm의 중심 필터, 한 (HQ535/30m, CMFDA)과 510 nm의에서 다른 중심을 사용하여 획득한 것입니다MRA, 채도, 미국) 모두. 이색성 거울 (Q515LP)의 사용은 채널 크로스 이야기를하지 못했습니다. </li><li> 각 잘 다섯 무작위로 선택된 분야 세 가지 이미지 (위상 콘트라스트, 빨간색과 초록색 형광) 취득. 각각의 이미지 플렛에서 3 채널 이미지를 만듭니다. 이러한 이미지의 fluorescing 세포질은 세포 점막과 함께 볼 수 있습니다. 융합 세포 따라서 쉽게 [그림 1]을 결정하실 수 있습니다. </li><li> 각 3 채널 이미지의 모든 세 가지 유형의 세포 (빨강, 녹색 및 dually 형광)을 계산합니다. 각 이미지의 모든 세포의 숫자 dually 형광 세포의 수를 나누어 dually 형광 세포의 비율을 결정합니다. 퓨전 수율은 융합 세포의 절반이 감지되지 않습니다 때문에이 곱한 dually 형광 세포의 비율로 정의 (때 같은 색상 퓨즈의 세포).입니다 </li></ol> 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/1991/1991fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 electrofusion 후 B16F1 세포의 세 채널 현미경 이미지 :. 위상 콘트라스트, CMRA 형광 (548 nm의 여기에서)와 CMFDA 형광 (492 nm의 여기에서), 객관적인 확대 20x

<ol><li>Čemazar, M., Jarm, T., Miklavčič, D., Maček-Lebar, A., Ihan, A., Kopitar, N. A., Serša, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+electric-field+intensity+on+electropermeabilization+and+electrosensitivity+of+various+tumor-cell+lines+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Electro.+Magnetobiol%22%5BJournal%5D)">Effect of electric-field intensity on electropermeabilization and electrosensitivity of various tumor-cell lines in vitro.</a> Electro. Magnetobiol. 17, 263-272 (1998).</li>
<li>Trontelj, K., Reberšek, M., Kandušer, M., čurin šerbec, V., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+bulk+cell+electrofusion+in+vitro+for+production+of+human-mouse+heterohybridoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimization of bulk cell electrofusion in vitro for production of human-mouse heterohybridoma cells.</a> Bioelectrochemistry. 74, 124-129 (2008).</li>
<li>Rols, M. -P., Teissié, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+electrically+induced+permeabilization+and+fusion+of+Chinese+hamster+ovary+cells+by+osmotic+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Modulation of electrically induced permeabilization and fusion of Chinese hamster ovary cells by osmotic pressure.</a> Biochemistry. 29, 4561-4567 (1990).</li>
<li>Neil, G., Zimmermann, U. Electrofusion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNeil%2C+G+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 220, 174-196 Forthcoming.</li>
<li>Abidor, I. G., Li, L. -H., Hui, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+cell+pellets%3A+II.+Osmotic+properties%2C+electroporation%2C+and+related+phenomena%3A+Membrane+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Studies of cell pellets: II. Osmotic properties, electroporation, and related phenomena: Membrane interactions.</a> Biophysical journal. 67, 427-435 (1994).</li>
<li>Jaroszeski, M. J., Gilbert, R., Fallon, P. G., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+facilitated+cell-cell+electrofusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mechanically facilitated cell-cell electrofusion.</a> Biophys J. 67 (4), 1574-1581 (1994).</li>
<li>Ramos, C., Bonefant, D., Teissié, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+hybridization+by+electrofusion+on+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell hybridization by electrofusion on filters.</a> Analytical biochemistry. 302, 213-219 (2002).</li>
<li>Cao, Y., Yang, J., Yin, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+high-throughput+cell+electrofusion+in+a+microelectrode-array+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Study of high-throughput cell electrofusion in a microelectrode-array chip.</a> Microfluid Nanofluid. 5, 669-675 (2008).</li>
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<li>Teissié, J., Ramos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+electric+field+pulse+induced+long-lived+permeabilization+and+fusogenicity+in+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Correlation between electric field pulse induced long-lived permeabilization and fusogenicity in cell membranes.</a> Biophys. J. 74, 1889-1898 (1998).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

비 - 구체적으로, 예를 들어, 외부 전기 분야로를 융합 세포 점막의 능력은 생물학 생명 공학, 의학 및 연구에 중요합니다. 이러한 특이 현상이 융합은 매우 가치있는 하이브리드 전지와 같은 단클론 항체와 같은 자사 제품의 생산을 가능하게하고, 퓨전 [2]의 근본적인 메커니즘에 대한 정보를 제공합니다. 제대로 세포의 다른 유형이 조정될 수 있습니다 이후 Electrofusion은 잠재적으로 매우 효과적인 방법입니다. 가까운 신체 접촉 세포가 자신의 fusogenic 상태로 가지고있을 때 Electrofusion는 고전압 전기 펄스에 의해 (융합하는 경향) 이루어진다. electrofusion의 효율 electrofusion 과정의 두 부분에 영향을 미칠 다양한 매개 변수에 따라 달라집니다. electrofusion 과정의 첫 부분은 세포 사이의 가까운 신체 접촉의 성과이며, 어떤은 다른 방법으로 얻을 수있다 [3-8]. 준수 방법은 (합류로 성장하는 세포) 세포를 효율적으로 사이에 큰 영역에서 자발적으로 설립된 세포 접촉에 의해 사용될 수 있지만, 그것은 많은 핵 매우 큰 융합 세포를 생산하고 있습니다. 생존 가능성이 더 높습니다 그리고 작은 세포가 세포 분열 따위에 의해 번식 (2-5 핵 포함), (그림 1)를 얻을 수있다 어디에 우리는 수정된 준수 방법을 사용하고 있습니다. 세포 사이의 연락도 실험 [9]에서 사용 삼투 치료로 인해 세포의 삼투 부기의 혜택을 누릴 수 있습니다. electrofusion 과정의 두 번째 부분은 세포 점막의 fusogenic 상태의 달성이다. Fusogenic 상태는 멤브레인의 electropermeabilized 상태 (세포가 아닌 구체적으로 정상적으로 그대로 막 통과할 수없는 분자로 permeabilized 아르)와 잘 연결합니다 및 전기 펄스 (진폭, 길이, 횟수 및 빈도와) 같은 매개 변수에 의해 적용됩니다 [10] . 최적의 electroporation을 위해 필요한 전기 매개 변수의 값은 [1]과 electrofusion가 다른 세포와 세포 사이의 차이가 크기와 자신의 생물 학적 특성에 따라 달라집니다. 전기 매개 변수 따라서 융합을 얻기 위해, 융합 파트너로 사용하는 다른 세포 라인에 대한 최적화해야합니다.

<table><tbody><tr><td>CMRA</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>C34551</td><td>세포질 형광 염료</td></tr><tr><td>CMFDA</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td>세포질 형광 염료</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM </td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5671</td><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium</td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>crystacillin</td><td>시약</td><td>Pliva</td><td>625110</td><td>항생제</td></tr><tr><td>gentamicin</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>항생제</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>시약</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>A124873 927</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4248</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시약</td><td>Fluka</td><td>71382</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>시약</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>A154336 908</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16104</td><td></td></tr><tr><td>전기 펄스 발생기</td><td>도구</td><td>IGEA</td><td></td><td>Cliniporator VITAE</td></tr><tr><td>멀티웰 플레이트</td><td>도구</td><td>Techno Plastic Products</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 원심분리 튜브</td><td>도구</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 원심분리 튜브</td><td>도구</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 배양 플라스크</td><td>도구</td><td>Techno Plastic Products</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>전극</td><td>도구</td><td>Custom Made</td><td></td><td>Pt/Ir</td></tr></tbody></table>

세포는 형광 현미경 electrofusion와 시각

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

셀 electrofusion 인간의 치료를위한 하이브리드 전지를 준비 사용할 수있는 안전하고 비 바이러스성 및 비 - 화학 방법입니다. Electrofusion 가까운 접촉에있는 세포에 짧은 고전압 전기 펄스의 응용 프로그램을 포함합니다. 짧은 고전압 전기 펄스의 응용 프로그램 세포 플라즈마 점막의 불안정을 초래합니다. 불안 정한 점막은 다른 분자에 대한 더 투과하고 이웃 불안 정한 세포막과 융합하는 것도 쉽습니다. Electrofusion 따라서 매우 다른 세포가 아닌 구체적인 융합을 달성하기 위해 편리한 방법입니다<em&gt; 체외에서</em&gt;. 전기장에 의해 불안 정한 융합, 세포 세포막을 얻기 위해서는 그들의 지질 bilayers의 합병과 그 결과 그들의 세포질 수 있도록 가까운 접촉에 있어야합니다. 이 비디오에서는, 우리는 세포의 효율적인 electrofusion을 보여주<em&gt; 체외에서</em&gt; 수정된 준수 방법을 통해서 이루어집니다. 이 방법에서는, 세포가 잘의 표면에만 약간 첨부할 수 있으며, 매체는 교환 및 세포가 여전히 자신의 구형 형태를 유지 할 수 있도록. 퓨전 시각화 서로 다른 형광 셀 추적기 염료와 함께 세포의 세포질 사전 라벨 부착에 의해 평가되며 세포의 절반은 오렌지 CMRA 녹색 CMFDA과 나머지 절반으로 표시됩니다. 퓨전 수율은 두 곱한 모든 세포의 숫자로 나누어 dually 형광 세포의 숫자로 결정됩니다.

이 비디오에서 우리는 세포의 효율적인 electrofusion을 보여주<em&gt; 체외에서</em&gt; electroporation과 형광 현미경과 세포 융합 시각화의 후속 감지를 사용하여 수정된 준수 방법을 통해서 이루어집니다.

세포는 형광 현미경 Electrofusion와 시각

세포 전기융합은 인간 치료를 위한 하이브리드 세포를 준비하는 데 사용할 수 있는 안전한 비바이러스성 및 비화학적 방법입니다. 전기융합은 ...

전기 융합은 인접한 세포들에 짧은 고전압 전기 펄스를 가하는 과정입니다. 본 영상에서는 수정된 부착법(Adherence Method)을 통해 인비트로(in vitro) 세포 전기 융합 과정을 시연합니다. 실험은 마우스 흑색종 세포인 BF1을 대상으로 수행되었습니다.실험을 위해 다음 단계를 수행하십시오. 두 개의 별도 배양 플라스크에서 세포를 80% 밀도(confluence)까지 배양합니다. 그 후, 각 스톡 용액 2.1 µL를 각각 첨가합니다.원심분리 튜브에 담긴 3 mL의 Krebs Hess Buffer에 각각 10 mM의 C-M-F-D-A 또는 CMRA를 첨가합니다. Krebs Hess buffer로 세포를 두 번 세척한 다음, 플라스크에 로딩 용액을 주입합니다. 로딩 용액에는 각각 약 7 µM의 C-M-F-D-A 또는 CMRA가 포함되어 있습니다.제어된 분위기에서 세포를 30분 동안 배양합니다. 이 1차 배양 동안, 시약들이 세포막을 자유롭게 통과하여 세포질로 들어가며, 여기서 막 투과성 IMP 반응 생성물로 변환됩니다. 1차 배양이 끝나면, 세포를 세척한 후 배양액과 함께 2시간 동안 더 배양합니다.냉각 CCD 카메라가 장착된 형광 현미경과 이미지 획득 소프트웨어를 사용하여 세포를 관찰합니다. 여기 파장을 548 nm로 설정하고, CMRA가 로딩된 세포의 형광 이미지를 얻기 위해 적절한 밴드패스 필터를 선택합니다. CFDA가 로딩된 세포의 경우, 여기 파장을 492 nm로 설정하고 녹색 형광 이미지를 위한 밴드패스 필터를 선택합니다. 두 플라스크의 세포 수를 측정하고, 적색 및 녹색 세포를 1:1 비율로 혼합한 뒤 세포 농도를 5 × 10⁶ cells/mL로 조정합니다.각 웰의 중앙에 20 µL의 세포 현탁액 방울을 떨어뜨립니다. 24-웰 플레이트 내의 세포들을 조절된 분위기에서 20분 동안 배양하여, 세포들이 웰 표면에 단일층으로 약간 부착되고 세포 간 접촉이 형성되도록 합니다. 세포가 담긴 멀티웰 플레이트를 현미경 스테이지 위에 올립니다.전극을 웰 바닥에 배치하고 펄스 발생기에 연결합니다. 최적의 전기 융합을 달성하고 세포 생존력을 유지하려면 적절한 전기 펄스 파라미터를 사용해야 합니다. 이러한 파라미터는 세포주에 따라 다르며 예비 실험을 통해 결정되어야 합니다. 배양액을 제거하고 세포를 1 mL ISO omu 인산칼륨 완충액으로 세척한 후, 세포 팽창을 유도하기 위해 350 µL hypos Miller 인산칼륨 완충액으로 세척합니다.전기 펄스를 가하기 전, 세포를 고삼투압 완충액에 2분 동안 둡니다. 전기 펄스는 세포가 최대 부피에 도달했을 때 가해야 합니다. 즉, 세포가 조절성 부피 감소를 시작하기 전이어야 합니다.본 실험에서의 감소. 1 Hz에서 100 µs 지속 시간을 가진 8개의 직사각형 펄스 열을 가했습니다. 펄스 인가 후.10분 후 세포를 10분 동안 그대로 둡니다. 위상차 및 형광 현미경을 사용하여 확산 수율을 측정합니다. 무작위로 선택한 5개의 시야에서 위상차, 적색 및 녹색 형광 이미지 3장을 각각 획득합니다.Image J 소프트웨어에서 각 이미지 트리플렛(triplet)으로부터 3채널 이미지를 생성하여 이미지의 시각적 품질을 향상시킵니다. 이후 원본 이미지에 배경 제거 및 기본 매개변수 설정을 통한 대비 향상과 같은 전처리 단계가 적용될 수 있습니다. 마지막으로, Image J의 RGB to gray 플러그인을 사용하여 3채널 이미지를 합성합니다. 이렇게 합성된 이미지에서는 세포막과 함께 휴지기 세포질을 확인할 수 있습니다.따라서 3채널 이미지에서 적색, 녹색 및 이중 형광 세포의 세 가지 유형을 모두 세어 소수의 세포를 쉽게 측정할 수 있습니다. 각 이미지의 전체 세포 수로 이중 형광 세포 수를 나누어 이중 형광 세포의 백분율을 결정하십시오. 융합 효율은 이중 형광 세포의 백분율에 2를 곱한 값으로 정의됩니다.동일한 색상의 뷰 셀들을 관찰할 때 뷰 셀의 절반이 검출되지 않기 때문입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 공촛점 현미경과 형광 염료를 사용하여 라이브 파리 애벌레의 소설 내부 아웃 조직 준비에 Glia - 신경근육학 시냅스의 구조 기능을 설명했다. 우리는 HRP에 형광 기본 항체 살 신경 터미널로 표시하고, 또한 형광 Dextrans와 perisynaptic 공간을 시각.

라이브를 떠올리 Drosophila</em형광 염료와 함께> Glial - 신경근육학 융티온

여기 기능성 분자 단지가 추적 및 계량, 감지 있도록 박테리아 세포를 생활에 단일 분자 형광 현미경을 수행하는 프로토콜을 보여줍니다.

단일 분자 단지를 떠올리 VIVO에서 고급 형광 현미경을 사용하여

클레멘 타인 기술은 microinjected 분자에 의해 영향을 멤브레인, 세포 소기관, 그리고 subcellular 구조 ultrastructural 형태를 분석하도록 구성되었습니다. 이 방법은 다중 나노 미터 해상도 밀리미터 수 있도록 미세 조작 / microinjection의 강력한 기술, 공 촛점 형광 현미경 및 전자 현미경을 자랑합니다. 이 기술은 응용 프로그램의 다양한 의무가 있습니다.

도구로 상호 빛과 전자 현미경 (클레멘 타인)는 Microinjected 분자와 진핵 세포 하위 세포 목표를 시각화하는 방법

출처: Aigrain, L. 외. 전기공공을 통한 생체 미생물 내 형광 생체분자의 내부 추출 및 관찰.  J. Vis. 경험 (2015)이 영상은 전기공공을 이용해 형광 생체분자를 전기적(electroporation)을 이용한 전기적(electro-potation) 미생물 세포에 전달하는 과정을 시연합니다. 이 과정은 형광포자 태그가 부착된 DNA 또는 단백질을 냉각된 세포 현탁액에 주입하는 것으로 시작됩니다. 그 후 고전압 펄스를 가해 임시 막 구멍을 만들어 생체분자가 세포질 내 침투를 가능하게 합니다. 회복 후에는 세포를 세척하고 여과하여 내부화되지 않았거나 표면에 결합된 분자를 제거합니다. 마지막으로, 표지된 세포를 형광 영상을 위해 부착하여 세포 내 구성 요소를 시각화합니다.

형광 생체분자를 박테리아 세포에 전기천공 기반 전달

우리는 우리가 살아있는 세포의 공 촛점 이미징에 의해 소포체 (ER)에 거주 형질 전환 형광 단백질의 분포와 이동을 조사하는 데 사용하는 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 또한 ultrastructurally이 세포 내 구획의 구조에 대한 자신의 표현의 효과를 분석 할 수 있습니다.

배양 된 세포의 소포체 하위 도메인의 시각화

사차원 (4D) 영상은 척추 신경 터미널을 살고있는 엔도 좀의 두 가지 유형 사이의 행동과 상호 작용을 연구하기 위해 사용된다. 이 작은 구조의 이동은 같은 엔도 좀의 융합과 세포 외 유출 등의 이벤트의 확인을 허용, 세 가지 차원을 특징으로한다.

네 차원 형광 이미징과 신경 말단 생활에 엔도 좀 역학의 시각화

생체 내 생체 분자에 대한 연구는 생물학적 맥락에서 분자 기능을 이해하는 데 중요합니다. 여기에서는 DNA 또는 단백질과 같은 형광 생체 분자를 살아있는 미생물로 내재화할 수 있는 새로운 방법을 설명합니다. 형광 현미경 검사로 기록된 생체 내 데이터 분석도 제시되고 논의됩니다.

일렉트로을 통해 생활 미생물의 국제화 및 형광 생체 분자의 관측

이 프로토콜은 전기천공법을 사용하여 마우스 근육 섬유에 형광 표지된 단백질을 도입하고 발현합니다. 전기천공법 후 회복 후 섬유가 분리됩니다. 그런 다음 고해상도 컨포칼 현미경을 사용하여 개별 섬유를 이미지화하여 근육 구조를 시각화합니다.

DNA 일렉트로, 근섬유의 분리 및 이미징

이 프로토콜에는 포스터 공명 에너지 전달, 및 현미경 이미징 형광 수명에 따라 무 단백질의 복잡 한 형성의 양적 시각화에 대 한 허용 하는 새로운 방법을 설명 합니다.

형광 일생 화상 현미경 검사 법에 의해 인신 매매 세포내 올 무를 떠 올 리

이 프로토콜의 목적은 하이브리드 셀을 만들기 위해 두 개의 서로 다른 세포 유형을 융합하는 것입니다. 융합 된 세포의 형광 현미경 분석은 세포 소기관의 기원의 세포를 추적하는 데 사용됩니다. 이 분석은 세포 구조와 기능이 세포 융합에 의한 교란에 어떻게 반응하는지 탐구하는 데 사용될 수 있습니다.

세포 구조 및 기능의 교란을 위해 게놈 편집 된 세포주 세포주 간의 세포 융합

이 프로토콜은 소 부신 크로마핀 세포에서 세 가지 융합 모드를 검출하기 위한 공초점 이미징 기술을 기술한다. 이러한 융합 모드에는 1) 융합 기공 개폐 및 폐쇄를 포함하는 근접 융합 (키스 앤 런이라고도 함), 2) 융합 기공 개방 및 개방 된 기공 유지를 포함하는 체류 융합, 3) 융합 된 소낭 수축을 포함하는 수축 융합이 포함됩니다.

부신 크로마핀 세포에서 융합 기공 역학의 세 가지 모드를 측정하는 공초점 현미경 검사

배우세요 생쥐 흑색종 세포를 이용한 수정된 부착법 기반 전기융합 기술과 형광 현미경을 활용한 융합 효율 분석 방법입니다. 이 프로토콜은 다양한 세포 유형에 적용 가능한 신뢰할 수 있는 실험 기법을 제공합니다.

세포는 형광 현미경 Electrofusion와 시각

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