Name: 포유 동물 세포에서 RNAi 심사를위한 선교 esiRNA (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-12T17:45:00.000+00:00
Duration: 15 min 31 s
Description: 배우세요 포유 동물 세포에서 esiRNA를 활용한 고효율 RNAi 스크리닝 방법을 통해 세포 주기 조절 유전자를 식별하는 기술입니다. 이 방법은 대규모 기능 상실 스크린에 최적화되어 있습니다.

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우리는 토론을위한 뷰큘츠 실험실과 시그마 - 알드리치 RNAi - 팀 구성원을 인정하고 싶습니다. 우리는 맥스 플랑크 사회와 Bundesministerium FÜR Bildung 놀이 Forschung 그랜즈 [0315105] 지원을위한 이동 - 바이오에게 감사를 표합니다. 선교 ®는 시그마 - 알드리치 생명 공학 LP의 등록 상표입니다

1. 고품질 선교 esiRNA 라이브러리 <ol><li> 관심있는 모든 유전자에 대한 RNAi에 가장 취약하고 구체적인 대상 지역은 DEQOR 알고리즘 (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html)를 활용하여 선택됩니다. 4 DEQOR 점수 모두의 입을 가능성을 대상 - mRNA 가능 21 세포핵 긴 siRNAs는 국가 수준의 예술 설계 제약 조건을 기반으로 4. 또한, 각각의 잠재적인 siRNA는 공부 유기체의 transcriptome에 대한 BLAST 검색을 수행하여 다른 유전자 가능한 교차 반응에 대한 분석입니다. 이 프로그램은이를 통해 전반적인 품질과 잠재적인 esiRNA (300-600 BP의 길이)의 교차 입을 용량의 분석 서비스를 제공합니다. </li><li> cDNA 대상 - 유전자의 선택한 지역은 박테리오 파지 RNA - 효소 - 발기인 시퀀스 둘러싸인 유전자 특정 primers를 사용하여 PCR로 증폭됩니다. </li><li> 선교 esiRNA 생산에 사용되는 모든 PCR 제품은 칼리퍼 Labchip 분석하여 시퀀싱의 정체성과 순도에 대해 확인됩니다. </li><li> 롱 더블 좌초 RNA는 베꼈는데 가닥 어닐링 다음 RNA의 효소에 의해 PCR - 제품에서 베꼈는데 있습니다. </li><li> esiRNAs는 Q - 세파 로스의 스핀 컬럼을 이용한 음이온 교환 크로마 토그래피를 통해 정화 다음 RNaseIII를 사용하여 긴 이중 좌초 RNA의 제한 효소 소화에 의해 준비가되어 있습니다. </li><li> esiRNAs는 시켰던 및 TE 버퍼에 resuspended 있습니다. 수율은 UV - 흡수 측정에 의해 측정하고 농도는 TE 버퍼의 적절한 볼륨의 용해에 의해 조정됩니다. 최종 제품의 전반적인 품질은 칼리퍼 Labchip 분석에 의해 확인됩니다. </li></ol> 2. 세포 라인을 선택하고 검사 transfection 최적화 <ol><li> esiRNA (긍정적이고 부정적인 제어로 renilla - 루시페라제로 사용 Eg5)와 384 잘 플레이트의 transfection 시약의 양을 증가의 적정하다 금액이 48 시간 동안 세포와 부화를 추가합니다. Eg5는 바이폴라 스핀들 조립 및 고갈에 필요한 kinesin 모터 단백질 것은 mitotic의 체포로 연결됩니다. 다른 transfection의 시약 및 세포 라인에 대해이 절차를 반복합니다. 여기, 우리는 transfection 시약 같은 표준 절차 및 oligofectamine (Invitrogen) 다음과 같은 양식 헬라 세포를 사용합니다. </li><li> 최적의 transfection 조건을 선택하는 mitotic 연금 (원형 모양)과 가벼운 현미경에 의해 renilla - 루시페라제 (RLUC) esiRNA와 transfected 세포의 총 수를 표시 Eg5 esiRNAs와 transfected 세포를 계산합니다. RLUC에 대한 최소한 독성 및 Eg5에 가장 발음 표현형과 조건을 선택합니다. transfection 조건을 최적화하기위한 대안 방법은 구성적인 활성 발기인의 통제하에 EGFP (또는 다른 적절한 리포터 유전자) 표현 안정 세포주를 포함합니다. EGFP (또는 다른 리포터 유전자)와 RLUC (또는 다른 적절한 대조군의 esiRNA) 예 : 형광 도움 셀 정렬 (외과)에 의해 측정 노크 다운 효능과 독성에 대한 esiRNA의 transfection 후. EGFP에 대한 사용 esiRNA이 대상 - mRNA에 완전히 보완되어 있는지 확인합니다. </li></ol> 3. 기본 화면에게 5,6 설정 <ol><li> 자동 pipetting 역 (예 : 물병자리, Tecan과 WellMate, 매트릭스)에 사용되는 모든 구성 요소에 대한 pipetting 정밀도를 최적화합니다. pipetting 매개 변수는 솔루션 볼륨 및 플레이트 타입의 종류에 따라 변경이 때문에 최적화가 별도로 매 단계마다 반복되어야한다. 가능하다면, pipetting 역은 contaminations을 피하기 위해 층류 후드 아래에 배치해야합니다. 모든 사용하는 구성 요소가 해당되는 경우 autoclaving 또는 75 % 에탄올로 분사하여 하나를 사용하기 전에 살균해야합니다. 잘부터 교차 오염이 잘 제외되도록 빨래 프로토콜을 최적화합니다. 자동 pipetting의 최적화에 대한 자세한 내용은 공간 제약에 대한 제공 및 활용 pipetting 스테이션에 크게 의존 수 없습니다. 자세한 내용은 프로토콜을 제조를 참조하십시오. </li><li> Eg5 및 RLUC에 대한 esiRNAs 위의에서 최적의 조건을 사용하여 384 자 형식으로 Transfect 세포. 전체 접시를 덮고 Eg5 및 RLUC esiRNA위한 교류 패턴을 사용합니다. </li><li> 48 시간 동안 배양 감기 100 % 에탄올로 세포를 수정 후, 1 μg / ML DAPI 100 μg / ML RNase A (Qiagen)를 포함하는 PBS에서 25 분 얼룩, 15 분 동안 PBS에 rehydrate. 마지막으로 4 PBS 및 저장과 함께 씻어 ° C. </li><li> 올림푸스 ScanR 시스템에 현미경의 예에서 DAPI - 형광의 측정 강도. 휴대폰 번호에 대한 DAPI 강도를 계획하여 히스토그램을 생성하고 G1 - 단계에 대한 DNA - 컨텐츠 2N과 함께 세포의 비율을 계산하여 세포주기의 분포를 평가, &lt;2N&gt; S - 단계에 대한 4N, G2/M-phase에 대한 4N과 aneuploidy / polyploidy위한&gt; 4N. </li><li> 접시 위에 결과의 균등을 평가해보십시오. 결과가 위치 effe를 제외 현저하게 다를 경우에는 추가 최적화가 필요합니다CTS. 멀티 잘 접시를 사용하는 일반적인 문제는 배양 시간 동안 가장자리의 우물에서 향상된 증발됩니다. 이것은 종종 플레이트 위치 특정 효과 번역 다른 우물에서 다양한 실험 조건에 연결됩니다. 이러한 이유로, 우리는 화면 빈 모든 모서리 우물을 떠날 것이 좋습니다. 더 이상 증발이 incubators는 높은 습도에서 보관하고 있는지 확인 최소화합니다. 우리는 또한 정기적으로 이러한 증발을 차단 코닝 통풍 씰링 테이프로 증발 장벽을 사용합니다. 위치 효과에 대한 다른 리소스를 고려, 판독 시스템의 예를 들어 기술 변화 (현미경, 플레이트 판독기 등) 또는 액체 처리 변화 (그라디언트, 솔루션 등의 inhomogeneity)로 이동해야합니다. </li><li> 긍정적이고 부정적인 컨트롤 사이의 통계적 차이는 사용된 분석의 중요성에 대한 측정을 제공합니다. 대조군 (또는 배경 소음, 모의 제어) 사이의 큰 차이와 예제는 실제 심사를 시작하기 전에 설치되어야한다. 통계적 의미에 대한 좋은 측정 Z - 요소입니다. Z - 인자는 다음과 같은 방정식 계산됩니다 : Z = 1 - (3 SD [샘플] + 3 SD [모의]) * (| 아베 [샘플] - 아베 [모의] |) -1, SD와 함께 : 표준 편차, 아베 : 평균. 1 Z - 팩터&gt; Z&gt; 0.5은 긍정적인 제어 7 부정적인 컨트롤의 통계적으로 의미 분리 (소음)을 나타냅니다. </li></ol> 4. 기본 화면 <ol><li> 위에서 최적의 조건을 활용 esiRNAs의 transfection을위한 384 잘 조직 문화 접시를 준비합니다. 여기, 우리는 당 잘 5μl TE 버퍼에 용해 15ng esiRNA을 사용합니다. 판 당 적어도 8 제어 위치가 연구 생물 학적 과정에 적합한 긍정적이고 부정적인 컨트롤 (Eg5 및 RLUC 여기)를로드해야합니다. 방지 위치 효과에 가장자리 우물은 5μl TE 버퍼로로드됩니다. </li><li> 물론 당 0.2μl Oligofectamine을 포함 5μl OptiMEM을 (Invitrogen) 추가 혼합하고 실온에서 20 분 동안 품어. </li><li> 72 시간과 부화; (물론 1000 세포에 해당하는 25 셀 / μl 농도에서 헬라의 세포​​ 현탁액의 40μl 여기) transfection 혼합물에 세포 현탁액을 추가합니다. </li><li> 자동 현미경 (올림푸스 ScanR, 위 참조)에서 DNA - 컨텐츠를 측정합니다. Z - 점수는 참고 자료로 부정적인 제어에 대한 신호를 사용하는 모든 샘플 esiRNAs 계산됩니다 히트 선택에 대한 Z - 점수 통계를 사용하여 평가합니다. 참고 Z - 점수는 Z - 요소와 동일하지 않습니다. Z - 점수 (모형) 제어에 비해 샘플 가치의 중요성에 대한 통계 측정을 제공합니다. 이것은 방정식 다음과 계산됩니다 : Z = (값 [샘플] - 평균 [모의]) * 표준 편차 [조롱] -1. 히트 선택에 대한 임계값 적용되어야한다. 일반적으로 중요한 기준처럼 : 2 &lt;Z &lt;-2를 사용하지만, 데이터 세트의 품질에 따라 생물 학적 처리하거나 화면의 범위를 연구이며, 서로 다른 임계값을 적용할 수 있습니다. 상당히 쉬운 Z - 점수 통계 옆에 또한 더 정교한 수학 평가 방법 (심사 자료의 통계적 평가의 넓은 필드에 첫 번째 내부는 말로 외에서 찾을 수 있습니다. 8) 사용할 수 있습니다. </li></ol> 5. 보조 화면과 히트 검증 <ol><li> 보조 화면이 실험 오류 또는 해제 - 대상 효과에 의한 잘못된 반응을 제거하기 위해 기본 화면을 따릅니다. 선택 조회에 대해 기본 화면에서 사용되는 것과 동일한 절차는 더 나은 통계 평가를 허용하는 복제의 큰 숫자 (3-5)을 반복해야합니다. </li><li> 확인 조회에 대해 초기 화면에서 확인된 목표에 대한 보조가 아닌 중복 esiRNA (또는 다른 비 중복 입을 트리거)를 사용해야합니다. 동일한 분석과 읽기 아웃이 기본 화면으로 적용되어야합니다. </li><li> 궁극적으로 선택된 유전자는 교차 종 RNAi 구조 9 확인할 수 있습니다. 함으로써 유전자의 마우스 ortholog 예를 들어 세균 인공 염색체 (BAC) 인코딩 안정 세포로 transfected 있습니다. BAC - 구조의 게놈 맥락에서 유전자를 보존하고 거의 - 생리적 표현을위한 수 있습니다. 내생 인간의 유전자에 대한 RNAi은 RNAi - 표현형을 구출 마우스 transgene 발현 변형을 떠날 것입니다. RNAi - 구조 날짜에 사용할 RNAi의 phenotypes의 검증을위한 황금 표준을 제공합니다. </li><li> 마지막으로, 검증된 후보는 결국 기계론의 이해를 유도하기 위해 자세히 연구하고 있습니다. 많은 경우에 RNAi는 차, 더 정교한 assays에서 예,이 실험에서 사용할 수 있습니다. </li></ol>

<ol><li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+silencing+RNAs%3A+an+expanding+universe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).</li>
<li>Jackson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+reveals+off-target+gene+regulation+by+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.</a> Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).</li>
<li>Echeverri, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+the+risk+of+reporting+false+positives+in+large-scale+RNAi+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens.</a> Nat Methods. 3, 777-779 (2006).</li>
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<li>Kittler, R., Pelletier, L., Buchholz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+of+mammalian+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Systems biology of mammalian cell division.</a> Cell Cycle. 7, 2123-2128 (2008).</li>
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<li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat Biotechnol. 24, 167-175 (2006).</li>
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<li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+resources+for+endoribonuclease-prepared+short+interfering+RNAs+for+specific+loss-of-function+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide resources for endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies.</a> Nat Methods. 4, 337-344 (2007).</li>
</ol>

저자는 제출된 작품에 관심이있을 상업 기관과 금융 관계를 선언합니다.

RNA 간섭은 손실 기능 phenotypes을 연구하는 표준 기술이되었습니다. RNAi - 중재자의 대규모 컬렉션 서로 다른 공급 업체에서 사용할 수 있으며, 유전자 입을위한 쉽고 비용 효과적이고 신속한 방법을 제공합니다. 이것은 다른 종과 세포 유형의 다양한 범위에 게놈 규모의 관점을 허용 많은 생물 학적 과정에서 키 플레이어 체계적인 심사를 위해 문을 열었습니다. 높은 거짓 긍정과 거짓 부정적인 요금은 RNAi 화면에서 일반 과​​제입니다. 이 문제를 해결하기 위해 상당한 노력은 효능을 향상시키기 위해 투자하고 특히 입을의 특이성이 트리거되었습니다. 중요한 발견은 동일한 증명서를 대상으로 다양한 siRNAs의 수영장 크게 타겟 특이성을 향상 것이었습니다. 다른 siRNAs 매우 복잡한 수영장이 endoribonuclease에 의해 생산되기 때문에 esiRNAs는 RNAi 화면에서 거짓 긍정적인 속도를 줄이고, 높은 목표 특이성 트리거입니다. esiRNAs도 또한 잘못된 부정적인 속도를 줄이고, 효율적인 knockdowns 달성을 증명하고있다. RNAi 스크린은 기술적으로 요구되기 때문에, 그들은 가능​​성이 몇 시간 동안 일상적으로 수행하기 어려운 상태로 유지됩니다. 시약 및 악기 더 많은 실험실들이 전문 지식을 공유 얻을 그러나, 현대 생물학의 RNAi 화면의 사용은 향후 증가할 것으로 간주됩니다.

<table><tbody><tr><td>MISSION esiRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>추가 정보 문의: rnai@sial.com</td></tr><tr><td>Wellmate</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>통기성 밀봉 테이프</td><td>Corning</td><td>Breathable Sealing Tape, Sterile (제품번호 #3345)</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=E7023%7CSIAL&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">에탄올&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof (absolute), 분자생물학용</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=P5493%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347">인산 완충 식염수&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>BioReagent, 10x 농축액, 세포 배양 및 분자생물학용</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=D8417%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12348">4&amp;#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td>분말, BioReagent, 세포 배양용, &amp;gt;98% (HPLC 및 TLC)</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=R6513%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12349">우췌 유래 Ribonuclease A&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>분자생물학용, &amp;#8805;70 Kunitz units/mg 단백질, 동결건조 분말</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=T9285%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12350">Tris-EDTA 완충 용액&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>100 x, 분자생물학용</td></tr></tbody></table>

포유 동물 세포에서 rnai 심사를위한 선교 esirna

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA 간섭 (RNAi)는 유전자 발현의 제어를위한 기본적인 세포 메커니즘입니다. RNAi는 작은 방해 RNAS (siRNAs)로 알려진 짧은 두 번 좌초 RNAS에 의해 유발됩니다. 짧은 이중 좌초 RNAS은 주사위 놀이를하는 사람, endonucleases의 RNase III 제품군의 단백질의 활동에 의해 더 이상 두 번 좌초 엽 성의 전구 물질에서 발생한. 결과 조각은 동족의 목표 mRNA에 지시, RNA 유도 입을 복합 (RISC)의 구성 요소입니다. RISC는이를 인코딩 단백질 1,2,3의 표현을 줄이는 목표 mRNA를 클리브스. RNAi는 작은 간섭 RNAS을 이용한 포유 동물 세포에서 유전자 기능 연구의 손실에 대한 강력하고 널리 사용되는 실험 방법이되었다. 현재 두 가지 방법은 작은 간섭 RNAS의 생산에 사용할 수 있습니다. 다른 방법은 체외에서 RNase III에 의해 대상 특정 긴 이중 좌초 RNAS의 endonucleolytic 절단을 고용하고 반면에 한 가지 방법은, 화학 합성을 포함한다. 따라서, siRNA와 같은 oligonucleotides의 다양한 수영장도 endoribonuclease - 준비 siRNA 또는 esiRNA로 알려져있는 생산됩니다. 화학적 파생 siRNAs와 esiRNAs의 효능의 비교 모두 트리거 대상 - 유전자 입을에 관심이있다는 것을 보여줍니다. 특이성을 비교할 때 차이는, 그러나, 볼 수 있습니다. esiRNAs 고유의 복잡한 혼합물이보다 구체적인 최저 10 리드 반면, 대부분 하나의 화학적 합성 siRNAs는 유명한 오프 대상 효과를 생산하고 있습니다. 본 연구에서는, 우리는 게놈 규모 선교 esiRNA 라이브러리와 세포주기의 진행에 관련된 유전자의 식별을위한 DNA - 컨텐츠 화면에 exemplified RNAi 심사에 대한 활용의 디자인을 제시한다. 우리는 transfection 프로토콜 및 높은 처리량의 심사에 대한 분석을 최적화하는 방법을 보여줍니다. 우리는 또한 통계적으로 평가할 수있는 방법을 대규모 데이터 세트 설명하고 기본 공격을 확인하는 방법을 제시한다. 마지막으로, 우리는 검증된 히트 자세한 기능 characterizations에 대한 잠재적인 시작 포인트를 제공합니다.

여기 우리는 세포 분열에 관련된 유전자에 대한 높은 처리량 화면에 인간의 esiRNA 라이브러리를 사용합니다. 우리는 설정하고 esiRNA 화면뿐만 아니라, 어떻게 결과를 분석하고 검증을 실시하는 방법을 보여줍니다.

포유 동물 세포에서 RNAi 심사를위한 선교 esiRNA

RNA 간섭(RNA interference, RNAi)은 유전자 발현 조절을 위한 기본적인 세포 기전입니다. RNAi는 ...라고도 알려진 짧은 이중 가닥 RNA에 의해 유도됩니다.

RNAi를 이용한 세포 주기 관련 유전자 스크리닝은 적절한 녹다운 기술 미션을 선택하는 것부터 시작됩니다. Sigma Aldridge의 siRNA 라이브러리는 준비된 endoribonuclease si의 높은 효율성과 특이성을 활용합니다. siRNA는 표적 mRNA에 상보적인 긴 이중 가닥 RNA를 효소로 소화하여 준비한 개별 siRNA의 복합 풀입니다. 동일한 전사체를 표적으로 하는 siRNA의 풀링은 특이성을 높이며, 효율적이고 특이적인 개별 siRNA를 찾기 위한 고된 탐색 과정을 방지합니다.이러한 특성 덕분에 easy RNA는 대규모 및 중규모의 기능 상실 스크리닝에 특히 적합합니다. 본 영상에서는 고처리량 형질전환 설정부터 적절한 분석법 개발에 이르기까지, 대규모 RNA eye 스크리닝 수행에 필요한 단계들을 보여줍니다. 이는 포유류 세포 주기 진행에 관여하는 유전자에 대한 스크리닝 구축을 통해 예시됩니다.먼저, 최적화된 폐문(hilar) 세포의 형질전환 방법을 보여준 후, 분석 품질에 대한 통계적 평가를 수행합니다. 마지막으로, 표적 유전자 결핍 후의 세포 주기 분포를 측정하여 게놈 규모의 스크리닝을 실시합니다. zco 통계량을 사용하여 히트(hit) 유전자를 선정하고, 이차적인 독립적 easy RNA를 통해 이를 검증합니다.또한, RNA 안구 스크리닝 이후의 후속 연구에 사용할 수 있는 잠재적인 실험 절차에 대해 설명하겠습니다. 안녕하세요, 저는 막스 플랑크 분자 세포 생물학 및 유전학 연구소의 Ty입니다. 그리고 Tristan입니다.저는 드레스덴의 마르크스 플랑크 연구소 소속인 Frank Al입니다. 오늘은 Sigma Aldridge의 mission easy RNA를 사용하여 포유류 세포에서 기능 상실 스크리닝(loss of function screen)을 설정하는 절차를 보여드리겠습니다. RNAi 스크리닝을 통해 유전자가 생물학적 과정과 어떻게 연결될 수 있는지 입증하기 위해, 조직 배양 세포 집단의 세포 주기 분포를 측정하는 분석법을 예시로 사용하겠습니다.그럼 시작하겠습니다. 모든 RNAi 스크리닝 프로젝트는 사이런싱 트리거의 선택에서 시작됩니다. endo 리보뉴클레아제로 준비된 siRNAs, 또는 간단히 esiRNAs라 불리는 RNA들은 RNase 3를 사용하여 긴 이중 가닥 RNA를 제한적 효소 소화시킴으로써 생성됩니다. 모든 esiRNA는 시퀀싱을 통해 동일성을 확인하고, Caliper LabChip 분석을 통해 순도를 검증합니다.동일한 전사체를 표적으로 하는 개별 siRNA들을 풀링(pooling)하면, 풀 내의 모든 siRNA가 동일한 온타겟(on target)을 공유하는 반면 오프타겟(off-target) 효과는 희석되기 때문에 특이성이 증가합니다. 따라서 easy RNA는 우수한 침묵 효능과 높은 표적 특이성을 가지며, 오프타겟 효과를 방지합니다. 게놈 규모의 easy.RNA 라이브러리는 Sigma Aldrich에서 제공합니다. 384-웰 플레이트의 가장자리 웰은 비워둡니다. 또한, 대조군을 위해 플레이트 중앙의 8개 위치를 비워둡니다.easy RNA의 서브 라이브러리는 모든 웰이 채워진 96 웰 플레이트 형태로 제공되며, 고객은 해당 플레이트 내 easy RNA의 배열 방식을 결정할 수 있습니다. 개별 easy RNA는 단일 튜브에 담겨 제공됩니다. easy RNA의 트랜스펙션은 사용하는 트랜스펙션 시약 및 세포주에 따라 최적화 과정이 필요합니다.표준 절차에 따라 배양된 HeLa 세포를 사용하며, 형질전환 시약으로는 Oligo를 사용합니다. 양성 대조군으로는 양극성 방추사 조립에 필요한 EEG five E-Z-R-N-A-A 키네신 모터 단백질을 사용하고, 음성 대조군으로는 ran luciferase easy RNA를 사용합니다. 384-웰 플레이트에 easy RNA의 양을 예를 들어 1 ng에서 56 ng까지 5 ng씩 증량하여 적정하고, 형질전환 시약의 양을 0.1 µL에서 0.9 µL까지 0.05 µL씩 증량하여 적정합니다.RNA와 transfection 시약을 혼합한 후, 세포를 추가하고 48시간 동안 배양합니다. 배양 기간이 끝나면 광학 현미경으로 세포를 관찰하십시오. eeg가 transfection된 세포의 수를 측정합니다.분열기를 나타내는 둥근 형태를 보이는 다섯 개의 쉬운 RNA들입니다. 또한 음성 대조군으로 형질 도입된 총 세포 수도 세십시오. Gran vanilla luciferase 쉬운 RNA입니다.최적의 transfection 조건은 vanilla luciferase에 대해 가장 낮은 독성을 보이며, EEG five에 대해 가장 뚜렷한 표현형을 나타냅니다. transfection 파라미터가 최적화되었으므로, 셋업 및 1차 스크리닝을 진행하십시오. 1차 스크리닝 준비에 사용되는 Matrix Wellm Mate 또는 Tecan Aquarius와 같은 자동 피펫팅 스테이션은 오염을 방지하기 위해 라미나 흐름 후드(lamina flow hood) 아래에 배치해야 합니다.사용되는 모든 구성 요소는 사용 전에 오토클레이브(해당하는 경우)를 이용하거나 스크리닝 전 75% ethanol로 분사하여 살균해야 합니다. 이러한 기기들은 제조사의 프로토콜에 따라 최적화해야 합니다. 용액의 부피와 플레이트 유형에 따라 피펫팅 파라미터가 달라지므로, 자동 피펫팅 스테이션에서 사용되는 모든 구성 요소의 피펫팅 정확도를 최적화하십시오.이러한 최적화 과정은 각 단계별로 개별적으로 반복되어야 합니다. 또한, 자동 피펫팅 스테이션이 준비되었을 때 웰 간의 교차 오염이 배제되도록 세척 프로토콜을 최적화하십시오. 위치 효과(position effects)가 관찰되지 않는지 확인하기 위해, 이전에 결정된 최적 조건을 사용하여 384웰 형식으로 세포를 형질전환하십시오.EEG five용 easy RNA와 일반 luciferase를 플레이트 전체에 교차 패턴으로 사용하십시오. 멀티웰 플레이트를 사용할 때 흔히 발생하는 문제는 배양 시간 동안 가장자리 웰에서 증발이 촉진된다는 점이므로, 모든 가장자리 웰은 비워 두십시오. 이는 웰마다 서로 다른 실험 조건으로 이어지며, 종종 플레이트 위치 효과(plate position effects)를 유발합니다. 증발을 더욱 최소화하기 위해 Corning의 통기성 실링 테이프와 같은 증발 차단제를 사용하십시오.또한 인큐베이터가 고습도 상태로 유지되도록 하십시오. 다만, 액체 핸들링의 편차나 플레이트 리더와 같은 판독 시스템 등 위치 효과(position effects)를 유발할 수 있는 요인이 존재함을 유의하십시오. 48시간 동안 배양한 후, 얼음처럼 차가운 100% ethanol로 2시간 동안 세포를 고정하고, PBS에서 15분 동안 재수화하십시오.1 µg/mL의 DPI와 100 µg/mL의 RNase가 포함된 PBS에서 고정된 세포를 25분 동안 염색합니다. 마지막으로 PBS로 3회 세척한 후 4 °C에서 보관합니다. 다음으로, 현미경을 통해 DPI 형광 강도를 측정합니다.각 단계마다 Olympus 스캐너 시스템을 사용합니다. 세포를 검사하여 상대적인 DPI 강도를 측정합니다. 히스토그램을 기반으로 DPI 강도에 따른 세포 수를 도표로 나타내어 히스토그램을 생성합니다.DNA 함량이 2N인 세포는 G1/G0기로, 2N에서 4N 사이인 세포는 S기로, 4N인 세포는 G2/M기로, 4N보다 큰 세포는 이배성 또는 다배성으로 계산하여 세포 주기 분포를 평가합니다. 플레이트 전반에 걸친 결과의 균질성을 평가하기 위해, EEG5 및 루시페라아제(luciferase) 형질전환 세포의 G2/M기 세포 비율을 비교하여 서로 다른 웰 간의 세포 주기 분포를 비교합니다. 만약 플레이트 상에서 결과의 차이가 유의미하게 나타난다면, 위치 효과를 제거하기 위한 추가적인 최적화가 필요합니다. 결과의 일관성이 확인되면, 양성 대조군과 음성 대조군 사이의 통계적 차이를 계산합니다.여기에 표시된 Z factor 공식을 사용하여 결과의 통계적 유의성을 결정하십시오. SD는 표준편차를, AV는 평균을 나타냅니다. 0.5에서 1 사이의 Z factor는 음성 대조군 및 노이즈와 양성 대조군이 통계적으로 유의미하게 분리되었음을 나타냅니다.이러한 통계적 차이가 입증되었다면, 1차 스크리닝을 진행할 수 있습니다. 미리 결정된 최적 조건에 따라 esiRNA 트랜스펙션을 위한 384웰 조직 배양 플레이트를 준비하십시오.웰당 15 nanograms의 easy RNA를 5 µL의 TE buffer에 녹입니다. 플레이트당 최소 8개의 대조군 위치에 해당 생물학적 공정에 적합한 양성 및 음성 대조군인 EEG five와 ranil luciferase를 분주합니다.위치 효과(position effects)를 방지하기 위해 Easy RNAs를 사용합니다. 가장자리 웰에는 5 µL의 TE buffer만을 분주합니다. 그다음, 0.2 µL의 oligo가 포함된 5 µL의 opti MEM을 웰당 혼합하여 넣고 상온에서 20분 동안 배양합니다.RNA와 transfection 시약을 혼합한 후, 여기에 세포 현탁액을 추가합니다. 25 cells/µL 농도로 조절된 HeR 세포 현탁액 40 µL를 첨가하여 웰당 1,000 cells이 되도록 하고 72시간 동안 배양합니다. 72시간의 배양 후.이전에 설명한 바와 같이 Olympus scan R과 같은 자동 현미경을 사용하여 DNA 함량을 측정하십시오. 히트 선택을 위해 라이브러리의 모든 플레이트에 대해 이 절차를 반복하십시오. Z-score 통계법을 사용하여 DNA 함량 값을 평가하십시오.Z-score는 Z-factor Z-score와 동일하지 않다는 점에 유의하십시오. 이는 음성 대조군 또는 mock 대조군과 비교하여 샘플 값의 유의성을 나타내는 통계적 척도를 제공합니다. 이는 여기에 표시된 식에 따라 계산됩니다.히트 선택을 위한 기준점으로 음성 바닐라 루시페레이스 대조군의 신호를 사용하여 모든 RNA 샘플의 zco를 계산합니다. 이때 임계값을 적용해야 합니다. 일반적으로 Z가 2보다 크거나 -2보다 작은 경우를 유의성 기준으로 사용합니다. 다만, 연구 대상이 되는 생물학적 과정이나 스크리닝 범위에 따라 서로 다른 임계값이 적용될 수 있습니다.히트 선택을 위해 Q와 같이 더 정교한 수학적 평가 방법을 사용할 수도 있습니다. 다음으로, 선택된 히트들에 대해 2차 스크리닝과 HIIT 검증을 수행합니다. 실험적 변동으로 인한 위양성을 제거하기 위해 1차 스크리닝 이후 선택된 HIIT 유전자들에 대한 2차 스크리닝을 진행합니다.먼저, 1차 스크리닝과 동일한 절차를 사용하여 선택된 히트(hits)를 검증하되, 더 나은 통계적 평가가 가능하도록 히트의 반복 횟수를 3회에서 5회 사이의 더 큰 수로 설정하십시오. 검증된 히트의 경우, 1차 스크리닝과 동일한 분석 및 판독법을 사용하되, 겹치지 않는 2차 easy RNA 또는 화학적으로 합성된 si. RNA와 같이 겹치지 않는 다른 사이런싱 트리거(silencing trigger)를 사용하십시오. 최종적으로 선택된 유전자들을 종 간 교차 검증을 통해 확증하십시오.RNAi 구조(rescue)는 현재까지 이용 가능한 RNAi 표현형 검증의 표준 방법입니다. 간단히 말해, 선택된 유전자의 다른 종 유래 오솔로그(ortholog)를 인코딩하는 세균 인공 염색체(BAC)를 세포에 안정적으로 형질전환시킵니다. BAC 컨스트럭트는 게놈 맥락 내에서 유전자를 보존하며, 거의 생리적인 수준의 발현을 가능하게 합니다.내인성 유전자에 대한 RNAi는 오르토(ortho) 외래유전자 발현을 변화시키지 않으며, 이는 RNAi 표현형을 회복시킵니다. 마지막으로, 검증된 후보군을 더 상세히 연구하여 궁극적으로 기전적 이해를 도출합니다. 많은 경우, RNAi는 이러한 2차의 더 정교한 분석법에서도 사용될 수 있습니다.예를 들어, RNAi 표현형의 타임랩스 현미경 관찰이 있습니다. 여기서는 인간 게놈에서 16,000개 이상의 유전자를 넉다운시킨 후 HeLa 세포의 DNA 함량을 측정한 세포 주기 스크리닝의 예시가 제시되어 있습니다. 이를 통해 세포 분열에 필수적인 1,351개의 1차 히트(primary hits)가 식별되었습니다.2차 스크리닝에서는 2차 분석법과 독립적인 2차 easy RNA trigger를 사용하여 743개의 hit을 검증하였습니다. G2기 정지를 유발한 knockdown과 유사분열 정지를 유발한 knockdown을 구분하였습니다. 마지막으로, Lin 54 유전자에 대한 종 간 RNAi rescue 실험을 통해 정상적인 세포 분열에서의 역할을 검증하였습니다.추가적인 하위 실험 결과, Lin 54의 고갈이 많은 세포 주기 유전자의 발현을 변화시키는 것으로 나타났습니다. 지금까지 인간 조직 배양 세포주에서 Mission Easy RNA의 고처리량 트랜스펙션을 설정하고 세포 주기 분포를 분석하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 트랜스펙션 조건과 분석법은 각 세포 시스템과 생물학적 과정에 맞추어 개별적으로 최적화해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.자동 액체 핸들링 시스템의 사용이 권장되지만, 특히 소규모 스크리닝의 경우에는 필수적이지는 않습니다. 수동 핸들링 또한 가능합니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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