포유 동물 세포에서 RNAi 심사를위한 선교 esiRNA

RNA AI에 의한 세포주기 관련 유전자 스크리닝은 적절한 녹다운 기술 임무를 선택하는 것으로 시작됩니다. 쉬운. Sigma Aldridge의 RNA 라이브러리는 엔도 리보뉴클레아제 제조 si의 높은 효율성과 특이성을 활용합니다. easy RNA는 긴 이중 가닥 RNA의 효소 분해에 의해 준비된 개별 SI RNA의 복잡한 풀로, 동일한 전사체를 표적으로 하는 SI RNA의 표적 MNA 풀링을 보완하고 특이성을 높이며 효율적이고 특이적인 개별 SI RNA에 대한 힘든 검색을 방지합니다.

따라서 Easy RNA는 대형 및 중간 규모의 기능 손실 스크리닝에 특히 적합합니다. 여기에서는 고처리량 transfection 설정부터 적절한 분석 개발에 이르기까지 대규모 RNA eye screening을 수행하는 데 필요한 단계를 보여줍니다. 이는 포유류의 세포주기 진행에 관여하는 유전자에 대한 스크리닝을 설정함으로써 예시됩니다.

먼저, hilar cell의 transfection이 어떻게 최적화되었는지 보여준 다음 분석 품질에 대한 통계적 평가를 수행합니다. 마지막으로, 게놈 스케일 스크리닝을 수행하여 표적 유전자 고갈 후 세포주기 분포를 측정합니다. 유효 물질은 zco 통계량을 사용하여 선택되고 2차 독립적인 easy RNA에 의해 검증됩니다.

또한 RNA 안구 검사를 추적하는 데 사용할 수 있는 잠재적인 실험 절차를 간략하게 설명합니다. 안녕하세요, 저는 Max Plank 분자 세포 생물학 및 유전학 연구소의 Ty입니다. 그리고 트리스탄.

저는 드레스덴에 있는 마르크스 플렁크 연구소(Marx Plunk Institute)의 프랭크 알(Frank Al)입니다. 오늘 우리는 Sigma Aldridge의 mission easy RNA를 사용하여 포유류 세포에서 기능 상실 스크린을 설정하는 절차를 보여 드리겠습니다. 조직 배양 세포 집단에서 세포주기 분포를 측정하기 위한 에세이는 RNAi 스크리닝을 사용하여 유전자를 생물학적 과정에 연결할 수 있는 방법을 보여주기 위한 예로 사용됩니다.

시작하겠습니다. 모든 RNAi 스크리닝 프로젝트는 침묵 유발 인자의 선택으로 시작하며, RNA 3을 사용하여 긴 이중 가닥 RNA의 제한된 효소 분해에 의해 생성되는 엔도 리보뉴클레아제 준비 si, RNA 또는 줄여서 easy RNA를 사용합니다. 모든 easy RNA는 염기서열분석을 통해 식별되고 캘리퍼 실험실 칩 분석을 통해 순도가 검증됩니다.

동일한 transcript를 모두 표적으로 하는 개별 siRNA의 풀링은 pool의 모든 irna가 타겟에 대해 동일한 것을 공유하는 반면 off-target 효과는 희석되기 때문에 특이성을 증가시킵니다. 따라서 easy RNA는 silencing effancy가 우수하고 타겟 특이성이 높아 off-target effect를 피할 수 있습니다. 게놈 규모가 쉽습니다.

RNA 라이브러리는 Sigma Aldrich에서 제공합니다. 384에서는 가장자리 우물이 비어있는 우물 플레이트입니다. 또한 플레이트 중앙의 8개 위치는 컨트롤을 위해 비어 있습니다.

easy RNA의 하위 라이브러리는 모든 well이 여기에 있는 96개의 well plate에 제공되며, 고객은 easy RNA가 해당 plate에 어떻게 배열될지 결정할 수 있습니다. 개별 easy RNA는 단일 튜브로 제공됩니다. easy RNA의 transfection은 다양한 transfection 시약 및 세포주에 대한 최적화를 필요로 합니다.

여기에서는 표준 절차에 따라 배양된 세포를 치료하고 형질주입 시약으로 올리고를 사용합니다. 양극성 방추체 조립에 필요한 EEG 5 E-Z-R-N-A-A 키네신 운동 단백질을 양성 대조군으로 사용하고 루시페라제 easy RNA를 음성 대조군으로 실행했습니다. 예를 들어, 384 웰 플레이트에서 5 나노그램씩 증가하여 1 나노그램에서 56 나노그램으로, 0.05 마이크로리터 증가로 트랜스펙션 시약의 양을 0.1 마이크로리터에서 0.9 마이크로리터로 증가시킵니다.

RNA와 transfection 시약을 혼합한 후 세포를 첨가하고 48시간 동안 배양합니다. 배양 기간이 끝나면 광학 현미경으로 세포를 확인합니다. EEG로 transfection된 세포를 계수합니다.

유사분열을 나타내는 둥근 모양을 보여주는 5개의 쉬운 RNA. Rest는 또한 음성 대조군으로 transfection된 세포의 총 수를 계산합니다. 그란 바닐라 루시페라아제 이지 RNA.

최적의 transfection 조건은 vanilla luciferase에 대해 가장 적은 독성을 나타내고 EEG five에 대해 가장 뚜렷한 표현형을 보여줍니다. 이제 transfection 파라미터가 최적화되었으므로 설정 및 기본 스크리닝을 진행합니다. 1차 스크린을 준비하는 데 사용되는 Matrix Wellm Mate 또는 Tecan Aquarius와 같은 자동 피펫팅 스테이션은 오염을 방지하기 위해 층류 후드 아래에 배치해야 합니다.

사용된 모든 구성 요소는 해당되는 경우 고압멸균으로 처리하거나 스크린 전에 75% 에탄올을 분무하여 사용하기 전에 소독해야 합니다. 이러한 기기는 제조업체의 프로토콜에 따라 최적화되어야 합니다. 자동화된 피펫팅 스테이션에서 사용되는 모든 구성 요소에 대한 피펫팅 정확도를 최적화하십시오. 이는 피펫팅 파라미터가 용액의 유형과 부피 및 플레이트 유형에 따라 변경되기 때문입니다.

이 최적화는 모든 단계에 대해 개별적으로 반복해야 합니다. 또한 세척 프로토콜을 최적화하여 자동화된 피펫팅 스테이션이 준비되었을 때 웰에서 웰로의 교차 오염이 배제되도록 합니다. 위치 효과가 관찰되지 않도록 하기 위해 이전에 결정된 최적화된 조건을 사용하여 384웰 형식의 세포를 transfection합니다.

EEG 5에는 easy RNA를 사용하고 플레이트 전체를 교대로 패턴으로 하는 바닐라 루시페라아제를 사용합니다. 다중 웰 플레이트를 사용할 때 일반적인 문제는 배양 시간 동안 가장자리 웰에서 증발이 증가한다는 것이므로 모든 엣지 웰을 비워 두십시오. 이는 서로 다른 유정에서 다양한 실험 조건으로 이어지며, 이는 종종 증발을 더욱 최소화하기 위한 플레이트 위치 효과, 코닝과 같은 직원 증발 장벽, 통기성 천장 테이프로 변환됩니다.

또한 인큐베이터가 높은 습도에 보관되어 있는지 확인하십시오. 그러나 액체 취급의 변동 또는 플레이트 리더와 같은 판독 시스템과 같은 위치 효과에 대한 가능한 원인이 있다는 것을 기억하십시오. 48 시간 동안 배양 한 후 얼음처럼 차갑고 100 % 에탄올로 2 시간 동안 세포를 고정 한 다음 PBS에서 15 분 동안 재수화합니다.

DPI 밀리리터당 1마이크로그램과 RNA 밀리리터당 100마이크로그램을 포함하는 PBS에서 고정된 세포를 25분 동안 염색합니다. 마지막으로 PBS로 3회 세척하고 섭씨 4도에서 보관하십시오. 다음으로, 현미경 검사로 DPI 형광의 강도를 측정합니다.

여기에는 각각에 대해 Olympus 스캐너 시스템이 사용됩니다. 세포를 잘 검사하고 상대적인 DPI 강도를 결정합니다. 히스토그램을 기반으로 셀 번호에 대한 DPI 강도를 플로팅하여 히스토그램을 생성합니다.

DNA 함량이 A인 세포의 비율을 계산하여 세포주기 분포를 평가합니다. 플레이트에 대한 결과의 균질성을 평가하기 위해, EEG 5 및 루시페라제 transfection에 대한 G two M 단계의 세포 비율을 비교하여 서로 다른 웰 간의 세포주기 분포를 비교하고, 플레이트에 걸쳐 결과가 크게 다른 경우 위치 효과를 제거하기 위해 추가 최적화가 필요합니다. 결과의 일관성에 만족하면 양수 대조군과 음수 대조군 간의 통계적 차이를 계산합니다.

여기에 표시된 Z 요인 방정식을 사용하여 결과의 통계적 유의성을 확인합니다. SD는 표준 편차를 나타내고 AV는 평균을 나타냅니다. 1과 0.5 사이의 Z 요인은 음수 통제와 잡음이 양수 통제와 통계적으로 유의미하게 분리되어 있음을 나타냅니다.

이러한 통계적 차이가 성립되면 기본 화면으로 진행할 수 있습니다. 준비 384. 여기에서 사전 결정된 최적화된 조건을 활용하는 간편한 RNA의 transfection을 위한 Well tissue culture plates.

웰당 15나노그램의 easy RNA가 5마이크로리터의 TE 완충액에 용해됩니다. 플레이트당 최소 8개의 제어 위치에는 생물학적 과정에 적합한 포지티브 및 네거티브 컨트롤이 로드됩니다. 여기에서 EEG 5와 ranil luciferase를 공부했습니다.

위치 효과를 피하기 위해 Easy RNA가 사용됩니다. 가장자리 웰에는 5마이크로리터의 TE 버퍼만 적재되어 있습니다. 다음으로, 웰 믹스당 0.2마이크로리터의 올리고가 포함된 5마이크로리터의 opti MEM을 추가하고 실온에서 20분 동안 배양합니다.

RNA를 형질주입 시약과 혼합한 후, 여기에 세포 현탁액을 첨가합니다.40마이크로리터의 R 세포 현탁액을 마이크로리터당 25개의 세포로 첨가하며, 이는 웰당 1000개의 세포를 72시간 동안 배양하는 것과 같습니다. 72 시간 배양 후.

앞서 보여준 것처럼 Olympus scan R과 같은 자동 현미경에서 DNA 함량을 측정합니다. 히트 선택을 위해 라이브러리의 모든 플레이트에 대해 이 절차를 반복합니다. Z-점수 통계량을 사용하여 DNA 함량 값을 평가합니다.

Z-점수는 Z 계수 Z-점수와 동일하지 않습니다. negative 또는 mock control과 비교하여 표본 값의 유의성에 대한 통계적 측정값을 제공합니다. 여기에 표시된 방정식에 따라 계산됩니다.

hit 선택에 대한 참조로 negative vanilla luciferase control에 대한 신호를 사용하여 모든 easy RNA 샘플에 대한 zco를 계산하고 임계값을 적용해야 합니다. 일반적으로 Z가 2보다 크거나 마이너스 2보다 작은 것에 대한 유의 기준이 사용됩니다. 그러나 연구된 생물학적 과정 또는 스크리닝의 범위에 따라 다른 임계값이 적용될 수 있습니다.

Q와 같은 보다 정교한 수학적 평가 방법도 히트 선택에 사용할 수 있습니다. 다음으로, 선택한 히트는 보조 화면과 HIIT 유효성 검사를 받습니다. 선택된 HIIT 유전자의 2차 검사는 실험적 변이로 인한 거짓 양성을 제거하기 위해 1차 검사를 따릅니다.

먼저, 더 나은 통계적 평가를 위해 3에서 5 사이의 더 큰 반복 횟수로 히트를 설정하는 것을 제외하고 기본 화면에서와 동일한 절차를 사용하여 선택한 히트를 확인합니다. 검증된 hits의 경우, 1차 화면에서와 동일한 assay 및 readout을 사용하되, 2차 non-overlapping easy RNA 또는 화학적으로 합성된 si와 같은 다른 non-overlapping silencing trigger를 사용합니다. RNA 궁극적으로 종간 선별된 유전자를 검증합니다.

RNAI는 현재까지 사용 가능한 RNAi 표현형 검증을 위한 황금 표준을 구합니다. 요컨대, 선택된 유전자의 다른 종의 ortho log를 다시 인코딩하는 박테리아 인공 염색체는 안정적으로 세포로 transfection됩니다. Back 구조체는 게놈 맥락에서 유전자를 보존하고 거의 생리학적 발현을 허용합니다.

내인성 유전자에 대한 RNAi는 ortho transgene 발현을 변경하지 않고 RNAi 표현형을 구출합니다. 마지막으로, 검증된 후보는 최종적으로 기계론적 이해를 도출하기 위해 더 자세히 연구했습니다. 많은 경우, RNAi는 이러한 2차적이고 정교한 분석에도 사용될 수 있습니다.

예를 들어, RNAi 표현형의 타임 랩스 현미경 검사가 있습니다. 다음은 인간 게놈에서 16,000개 이상의 유전자를 녹다운한 후 치유 R 세포의 DNA 함량을 측정한 세포주기 스크리닝의 예입니다. 1, 351개의 1차 히트가 세포 분열에 필요한 것으로 확인되었습니다.

2차 스크리닝에서는 2차 분석을 사용하여 2차 독립적인 easy RNA trigger로 743개의 히트를 확인했습니다. G 2 체포를 초래한 넉다운은 유사분열 정지를 초래한 넉다운과 분리되었습니다. 마지막으로, 유전자에 대한 RNA 안구 실험 전반에 걸쳐 Lin 54를 사용하여 적절한 세포 분열을 위한 역할을 검증했습니다.

추가 후속 실험은 Lin 54의 고갈이 많은 세포주기 유전자의 발현을 변화시킨다는 것을 보여주었습니다. 방금 human tissue culture cell line에서 고처리량 mission의 transfection, easy RNA 및 cell cycle distribution 분석을 설정하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 transfection 조건과 분석은 모든 세포 시스템과 생물학적 과정에 대해 별도로 최적화되어야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

자동화된 액체 처리 시스템의 사용은 권장되지만 특히 소규모 스크린의 경우 필수적인 것은 아닙니다. 수동 처리도 가능합니다. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.