Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
فيروس النتي هو فيروس ريترو يحتوي على مادة وراثية الحمض النووي الريبي. يوفر هذا الفيروس طريقة فعالة ومستقرة لإدخال المتحولات إلى خطوط الخلايا السرطانية. ابدأ بإضافة النورامينيداز إلى أنبوب يحتوي على فيروس لينتي الذي يعبر عن البروتين الفلوري الأخضر، أو GFP. حافظ على الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لزيادة كفاءة ربط الفيروس.
بعد ذلك ، طرد أنبوب يحتوي على تعليق الخلايا السرطانية لتشكيل بيليه. إضافة وسائط ماموسفير التي تحتوي على polybrene لإعادة إنفاق الخلايا. Polybrene هو البوليمر cationic الذي يزيد من كفاءة العدوى العدسية. الآن لوحة العدد الأمثل من الخلايا السرطانية في بئر في ستة لوحة زراعة الأنسجة جيدا. إضافة الكمية المطلوبة من فيروس لينتي في كل بئر من لوحة الثقافة.
دوامة لوحة لخلط المحتوى، والحفاظ على 37 درجة مئوية لمدة 96 ساعة مع إمدادات مستمرة من ثاني أكسيد الكربون. يدخل فيروس لينتي الخلية ويطلق الحمض النووي الريبي. النسخ العكسي الفيروسي يحول الحمض النووي الريبي إلى الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل والذي يتكامل في الجينوم المضيف. ضع اللوحة تحت مجهر فلوري وراقب الخلايا من أجل عملية نقل ناجحة. تفلور الخلايا المنقولة بسبب تعبير GFP.
في بروتوكول المثال، سنقوم بإجراء تحويل الخلايا السرطانية PDX-فصل مع ناقلات لينتيفيرال.
لتغيير الخلايا السرطانية، والطرد المركزي للخلايا المعزولة لإعادة الإنفاق في اثنين من ملليلتر من المتوسط ماموسفير. بعد العد، والطرد المركزي الخلايا مرة أخرى وإعادة إنفاق بيليه في اثنين من ملليلتر من المتوسطة ماموسفير، تكملها مع 20 ميكرولتر من البوليبرين. بعد ذلك ، لوحة 2 مرات 10 إلى الخلايا السرطانية الخامسة قابلة للحياة لكل بئر في الالتزام منخفضة جدا ستة لوحة زراعة أنسجة البئر والجسيمات لينتيفيرال إلى الخلايا في تعدد العدوى من 10.
قم بتدوير الصفيحة لخلط الفيروس مع الخلايا واحتضان الثقافات المشتركة عند 37 درجة مئوية و5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة تصل إلى 96 ساعة ، مما يضيف 500 ميكرولتر من متوسط الماموسفير الطازج بعد أول 24 ساعة. عندما يكون ما لا يقل عن 10٪ من الخلايا إيجابية GFP، نقل الخلايا المنقولة من بئر واحد على الأقل إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر على الجليد وغسل البئر مع ملليلتر واحد من وسيط ماموسفير.
تجمع الغسيل مع الخلايا والطرد المركزي الخلايا السرطانية في 10 ملليلتر من HBSS بالإضافة إلى HEPES. وأخيرا، إعادة إنفاق الخلايا في 50 ميكرولتر من استخراج مصفوفة الطابق السفلي على الجليد وتحميل الخلايا المضمنة في حقنة الأنسولين 0.5 ملليلتر لإعادة زرعها.
