PDX腫瘍細胞の標識への導入:レンチウイルスを導入して蛍光マーカーを発現する蛍光マーカーをインビトロで腫瘍細胞に導入

レンチウイルスは、RNA遺伝物質を含むレトロウイルスです。このウイルスは、がん細胞株にトランスジーンを導入する効率的かつ安定した方法を提供する。緑色蛍光タンパク質を発現するレンチウイルスを含むチューブにノイラミニダーゼ(GFP)を加えることで開始します。ウイルスの結合効率を高めるために1時間37°Cでチューブを保ちます。

次に、腫瘍細胞懸濁液を含むチューブを遠心分離し、ペレットを形成する。ポリブレンを含むmmosphere培地を加え、細胞を再懸濁させます。ポリブレンはレンチウイルス感染効率を高めるカチコン性ポリマーです。今、6つのウェル組織培養プレートでウェル当たりの腫瘍細胞の最適な数をプレートします。培養プレートの各ウェルにレンチウイルスの必要量を加えます。

プレートを旋回して内容物を混合し、二酸化炭素を連続して供給して96時間摂氏37度に保ちます。レンチウイルスは細胞に入り、RNAを放出する。ウイルス逆転写酵素は、RNAを宿主ゲノムに統合する二本鎖DNAに変換する。プレートを蛍光顕微鏡の下に置き、細胞を監視して正常な伝達を行います。この導入細胞はGFP発現による蛍光を発する。

このプロトコル例では、レンチウイルスベクターを用いたPDX解キセシ化腫瘍細胞の導入を行う。

腫瘍細胞をトランスデュースするために、分離細胞を2ミリリットルのmmosphere培地で再懸濁させる。カウント後、再び細胞を遠心分離し、2ミリリットルのマムモスフィア培地でペレットを再懸濁し、20マイクロリットルのポリブレンを添加する。次に、プレート20〜5番目の生存可能腫瘍細胞を超低接着でウェル1ウェルに10回感染の多重性で細胞に6つのウェル組織培養板およびレンチウイルス粒子を10の多重性で細胞に付着させる。

プレートを旋回させてウイルスを細胞と混合し、共培養物を摂氏37度、二酸化炭素5%を最大96時間インキュベートし、最初の24時間後に500マイクロリットルの新鮮なmmmosphere培地を加える。細胞の少なくとも10%がGFP陽性の場合、少なくとも1つのウェルから氷上の15ミリリットルの円錐管に移し、1ミリリットルのmmosphere培地でウェルを洗浄する。

細胞と洗浄をプールし、HBSSプラスHEPESの10ミリリットルで腫瘍細胞を遠心分離します。最後に、氷上の地下マトリックス抽出物の50マイクロリットルで細胞を再中断し、再移植のために0.5ミリリットルのインスリン注射器に埋め込まれた細胞をロードする。