Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
Lentivirus er et retrovirus som inneholder RNA genetisk materiale. Dette viruset gir en effektiv og stabil metode for å introdusere transgenes til kreftcellelinjer. Begynn med å tilsette neuraminidase i et rør som inneholder Lentivirus som uttrykker grønt fluorescerende protein, eller GFP. Hold røret på 37 grader Celsius i en time for å øke virusets bindingseffektivitet.
Deretter sentrifugerer du et rør som inneholder tumorcellefjæring for å danne en pellets. Legg til mammosphere media som inneholder polybrene for å resuspendere cellene. Polybrene er en kationisk polymer som øker lentiviral infeksjonseffektivitet. Nå plate det optimale antall tumorceller per brønn i en seks brønn vev kultur plate. Tilsett den nødvendige mengden Lentivirus i hver brønn på kulturplaten.
Virvle platen for å blande innholdet, og hold på 37 grader Celsius i 96 timer med kontinuerlig tilførsel av karbondioksid. Lentiviruset kommer inn i cellen og frigjør RNA. Den virale omvendte transkripsjonen konverterer RNA til dobbeltstrenget DNA som integreres i vertsgenomet. Plasser platen under et fluorescerende mikroskop og overvåk celler for vellykket transduksjon. De transinduserte cellene fluoresce på grunn av GFP-uttrykk.
I eksempelprotokollen vil vi utføre transduksjon av PDX-dissosierte tumorceller med lentivirale vektorer.
For å transdusere tumorcellene, sentrifuger de isolerte cellene for resuspension i to milliliter mammosfæremedium. Etter telling, sentrifuger cellene igjen og resuspender pellet i to milliliter mammosphere medium, supplert med 20 mikroliter polybrene. Deretter plate 2 ganger 10 til femte levedyktige tumorceller per brønn i en ultra lav tilslutning seks godt vev kultur plate og Lentiviral partikler til cellene med en multiplisitet av infeksjon på 10.
Virvle platen for å blande viruset med cellene og inkubere samkulturene ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i opptil 96 timer, og tilsett 500 mikroliter fersk mammosphere medium etter de første 24 timene. Når minst 10% av cellene er GFP-positive, overfør de transinduserte cellene fra minst en brønn til et 15 milliliter konisk rør på is og vask brønnen med en milliliter mammosfæremedium.
Slå sammen vasken med cellene og sentrifuger tumorcellene i 10 milliliter HBSS pluss HEPES. Til slutt, resuspend cellene i 50 mikroliter av kjeller matrise ekstrakt på is og laste de innebygde cellene inn i en 0,5 milliliter insulin sprøyte for reimplantasjon.
