Name: PAR - 클립 - RNA 단백질의 바인딩 Transcriptome 전체 바인딩 사이트를 식별하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: 배우세요 광반응성 뉴클레오사이드 유사체와 UV 교차결합을 이용한 전사체 전체 RNA 결합 단백질 결합 부위 식별 방법입니다. 이 기술은 RNA 인식 요소와 결합 선호도를 정의하여 전사 후 조절 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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우리는 도움이 토론에 대한 Tuschl 연구소의 회원 감사합니다. MH는 도이쳐 Akademischer Austauschdienst (DAAD)가 지원됩니다. 이 작품은 스위스 국립 기금 부여 MZ에 # 3100A0 - 114001에 의해 지원되었다; TT는 HHMI의 조사이며, 자신의 실험실에서 연구는 NIH 보조금 GM073047과 MH08442과 스타 재단에 의해 지원되었다.

아래의 프로토콜 HEK293 세포가 깃발을 표현 / doxycycline와 유도시 IGF2BP1을 HA - 태그에 대한 PAR - 클립 절차를 설명합니다. 우리는 immunoprecipitation를위한 안티 - 플래그 항체를 사용합니다. PAR - 클립 immunoprecipitation를위한 효율적인 항체를 사용할 경우 모든 세포주 관심의 RNA 결합 단백질 (RBP)를 태그가 지정되지 않은 내생의 감지 수준을 표현과 함께 작동합니다. 확대 셀 <ol><li> 성장 매체 FlpIn-HEK293/TO/FLAG/HA-IGF2BP1 세포를 확장합니다. 우리는 출발점으로 100-400 X 10 6 세포 (약 10-40 15cm의 세포 배양 접시) 사이에 사용하는 것이 좋습니다. 약 80 % confluency로 성장합니다. </li><li> crosslinking 전에 14 H는 직접 세포 배양 매체 100 μm의의 최종 농도 (1 M 4 thiouridine 주식 솔루션 1:1000 V / V)에) 4 thiouridine를 추가하고 B) 국기 / HA의 표현을 유도 doxycycline (10 MG / ML doxycycline 주식 솔루션의 1:10,000 V / V) 1 μg / ML를 추가로 IGF2BP1 태그. 참고 : 대신 4 thiouridine의 당신은 또한 6 thioguanosine 100 μm의를 사용할 수 있습니다. </li></ol> UV - Crosslinking <ol><li> 판 당 10 ML 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 한 번 씻고 완전히 PBS를 제거합니다. </li><li> 얼음 0.15 J / cm 2의 365 nm의 Stratalinker 2400에서 자외선 (Stratagene) 또는 유사한 장치와 덮개 비추다있는 트레이에 플레이스 번호판입니다. </li><li> 50 ML의 원심 분리 튜브에 판, 전송 당 1 ML PBS에서 고무 경찰과 세포를 긁어 4 ° C에서 5 분 500 XG에서 원심 분리하여 수집하고 뜨는 폐기하십시오. 100 X 10 6 HEK293 세포 (10 15cm 접시) 약 얻을 것입니다. 서부 유럽 표준시 세포 펠렛 1 ML. </li><li> (옵션)가 세포 lysis와 직접 계속하기를 원하지 않는다면, 충격 -80에서 액체 질소와 매장의 셀입니다 펠렛 ° C.를 동결 세포 펠렛은 최소한 12 개월 저장할 수 있습니다. </li></ol> 세포 용해와 RNaseT1 다이제스트 <ol><li> 1X NP40 용해 버퍼 3 권 가교 세포의 세포 펠렛을 타고 10 분 얼음에 품어. </li><li> 4 15 분 13,000 XG에서 원심 분리에 의해 삭제 세포 lysate ° C. </li><li> 0.2 μm의 멤브레인 필터 주사기 (팔 Acrodisc 또는 이에 상응하는 금액)를 통해 필터링하여 더욱 lysate를 삭제합니다. </li><li> 22 1 U / 15 분 물 목욕에 μl와 부화 ° C.의 최종 농도 RNase T1을 (Fermentas, 10,000 U / μl) 추가 계속하기 전에 얼음 5 분 이후 쿨 반응. </li></ol> Immunoprecipitation 및 가교 대상 RNA 조각의 복구 자기 분리기를 사용하여 밖으로 건조에서 자기 구슬을 방지하기 위해 샘플 준비 전반에 걸쳐 다음 지침을 따르십시오. <ol><li> 1 2 분 동안 자기 증언대에 구슬이 들어있는 튜브를 놓습니다. </li><li> 튜브는 자기 기호에있는 동안 튜브에 버퍼를 추가합니다. </li><li> 튜브 뚜껑, 자석 구분에서 제거하고, 구슬을 resuspend. 당신은 손가락으로 튜브를 flicking하여 구슬을 resuspend 또는 5 6 세트 vortexer을 사용할 수 있습니다. </li><li> 튜브 뚜껑에 남아있을 수있는 구슬을 수집하기 위해 간단히 원심 분리기. </li><li> 필요에 따라 1-4 단계를 반복합니다. </li></ol> 자기 구슬의 준비 <ol><li> Dynabeads의 단백질 G 자성 입자의 10 μl (Invitrogen) 당 ML 세포 lysate를 전송 (이것은되어야 일반적인 실험을 위해 약. 구슬 40 50 μl) 1.5 ML의 microfuge 튜브 있습니다. 구연 산염 인산 버퍼 1 ML로 두 번 구슬을 씻으십시오. </li><li> 비드 정지의 원래 볼륨에 비해 구연 산염 인산 버퍼의 두 배 볼륨 Resuspend. </li><li> 안티 - 플래그 M2 단클론 항체의 0.25 μg (시그마) 실온에서 40 분에 회전 바퀴에서 당 ML 서스펜션과 부화를 추가합니다. </li><li> 언바운드 항체를 제거하는 구연 산염 인산 버퍼 1 ML에 두 구슬을 씻으십시오. </li><li> 비드 정지의 원래 볼륨에 비해 구연 산염 인산 버퍼의 두 볼륨에 비즈를 Resuspend. </li></ol> Immunoprecipitation (IP), 둘째 RNase T1의 소화 및 dephosphorylation <ol><li> 부분 RNase T1 취급 세포 lysate의 ML 당 신선한 항체 - 복합 자석 구슬 20 μl를 추가하고 4 1 H에 대한 회전 바퀴 15 ML의 원심 분리 튜브에 품어 ° C. </li><li> 15 50 ML 원심 분리 튜브 (Invitrogen)에 대한 자성 입자 수집기에 자기 구슬을 모아 1.5 ML의 microfuge 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> IP 세척 버퍼 1 ML에 구슬에게 3 번 씻으십시오. </li><li> 100 U / μl의 최종 농도 RNaseT1을 (Fermentas, 10,000 U / μl) 추가 22 15 분 물 목욕에 비드 현탁액을 품어 ° C. 얼음 이후 쿨5 분. </li><li> 높은 소금 세척 버퍼 1 ML에 구슬에게 3 번 씻으십시오. </li><li> dephosphorylation 버퍼 1 볼륨에 Resuspend 비즈 </li><li> 0.5 U / μl의 최종 농도 송아지 장 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (채워, 코)을 추가, 37 10 분 정학을 품어 ° C. </li><li> 인산 가수 분해 효소 세척 버퍼 1 ML 두 번 구슬 와시 </li><li> 두 폴리 뉴클레오 타이드 키나제 (PNK) 버퍼에 DTT (효소 반응에 필요한 DT​​T 농도 자기 구슬을 손상 정도로 높습니다)하지 않고 구슬을 씻으십시오. </li><li> PNK 버퍼 중 하나가 원래 비즈 볼륨 Resuspend 비즈 </li></ol> immunoprecipitated 단백질 가교 RNA 세그먼트의 Radiolabeling <ol><li> 위에서 설명한 비드 중지, 1 U / 한 원래의 구슬 볼륨 μl을 0.5 μCi / μl와 T4 PNK의 최종 농도 (코)에 Υ - 32 P - ATP를 추가합니다. 37 30 분 정학을 품어 ° C. </li><li> 100 μm의의 최종 농도를 구하고 37 또 다른 5 분 부화되지 않은 방사성 ATP를 추가 ° C. </li><li> DTT없이 PNK 버퍼 800 μl와 자성 비즈에게 5 번 씻으십시오. </li><li> SDS - PAGE 로딩 버퍼의 70 μl의 구슬을 Resuspend. </li></ol> 겔 조각에서 SDS - PAGE와 가교 RNA - 단백질 단지의 electroelution <ol><li> 95에서 열 블록에서 5 분 radiolabeled 정학을 품어 ° C 변성 및 가교 RNA와 와동과 immunoprecipitated RBP을 해제합니다. </li><li> 분리기에 자성 비즈를 제거하고 깨끗한 1.5 ML의 microfuge 관에 뜨는을 전송하기만하면됩니다. </li><li> 40 뜨는의 μl 당 우물 Novex 비스 - 트리스 4-12% (Invitrogen) 프리 캐스트의 polyacrylamide 젤을로드하고 200 55 분에 대한 겔을 실행 V. </li><li> 겔 챔버를 해체하고 한 접시에 장착 떠나, 젤 해체. phosphorimager 용지 출력에 젤의 정렬을 촉진하기 위하여, 우리는 젤의 네 모퉁이의 세에 불균형 작은 세 개의 방사성 겔 조각을 이온 주입하는 것이 좋습니다. 방사성 젤 조각는 이전에 다음 ID로 radiolabeled 합성 oligonucleotides를 정화하는 데 사용되었다 젤에서 수집한 수 있습니다. 오염을 피하기 위해 플라스틱 필름 (예 : 사란 랩)에서 젤 싸서. </li><li> 1 H에 대한 무시 phosphorimager 화면 젤 노출하고 phosphorimager에 시각화. </li><li> 오리 엔테이션에 대한 이식 겔 조각을 사용하여 phosphorimager의 인쇄물 위에 젤 맞춥니다. RBP의 예상 크기 (IGF2BP1 약. 75 KDA)에 대응하고 D - 튜브 Dialyzer 미디 튜브로 전송 800 μl 1X SDS 실행 버퍼를 추가 밴드를 잘라 버릴거야. </li><li> 2 H. 100 V에서 버퍼를 실행 1X SDS의 가교 RNA - RBP 복잡한 Electroelute 겔에서 excised 및 제조 업체의 지시에 따라 800 μl SDS 실행 버퍼에 D - 튜브 Dialyzer 미디 (Novagen)에 electroeluted. </li></ol> Proteinase K의 소화 <ol><li> 1.2 MG / ML의 최종 농도 Proteinase K (로체)의 또한 다음 electroeluate에 대하여 2X Proteinase K 버퍼의 동일한 볼륨을 추가합니다. 55 30 분 품어 ° C. </li><li> 산성 페놀 / 클로로포름 / IAA 추출 (25:24:1, 산도 4.0) 클로로포름 추출에 의해 다음에 의해 RNA를 복구합니다. 글리코겐 1 μl를 (10 MG / ML 주식) 추가 에탄올 3 볼륨을 추가하여 RNA를 침전. 10.5 μl 물에 펠렛을 디졸브. </li></ol> cDNA 라이브러리 준비와 깊은 시퀀싱 원래 작은 규제 RNAS 19 복제에 대한 설명 표준 cDNA 라이브러리 준비 프로토콜을 통해 복구된 RNA를 운반. 복구 RNA의 10.5 μl를 사용하여 20 μl 규모에서 설명하는 것처럼 첫 번째 단계, 3 '어댑터 내고이 진행되었습니다. Solexa 순서 어댑터 설명 집합을 사용합니다. 복구 RNA의 양에 따라 삽입하지 않고 5' - 어댑터 - 3' - 어댑터 제품은 추가 PCR 밴드로 cDNA의 증폭 후 검색됩니다. 이러한 경우에는, 소비세 3 % NuSieve에서 예상 크기의 긴 PCR 제품은 낮은 용융 점 아가로 오스 겔, Solexa 기술을 사용하여 GelElute 키트 (Qiagen)와 순서를 사용하여 겔 조각에서 PCR 제품을 elute. 한 Solexa 순서 실행은 보통 6 천만 순서 사이 내실수 RNA 바인딩 단백질의 바인딩 사이트의 transcriptome 넓은 범위에 대한 충분한 것을 읽습니다. Bioinformatic 분석 순서주의 bioinformatic 분석 순서 대 번역되지 않은 코딩, 요구 사항 등 RNA 인식 요소 RBP이 가진 기본 바인딩 지역 (exonic 대 intronic으로 심사 RBP에 대한 RNA 구속력이 사이트에 의미있는 통찰력을 얻기 위해해야​​ 할 일이 읽습니다 순서). 읽는 순서는 게놈과 동부 표준시 데이터베이스에 대해 정렬해야합니다. 우리는 일반적으로 읽습니다 mappi를 사용하여을 한 불일치, 삽입 또는 시퀀스 클러스터 구축을 삭제까지 고유 게놈에 NG가 나서 더 이상 분석 수 읽습니다. 클러스터 합성의 특성 변이의 빈도는 6 - SG를 사용할 때 전환 4 - SU와 G를 사용하는 경우, C 전환하기 위해 T를 읽는 성공적으로 가교 시퀀스 나타내는 있습니다. 우리의 경험에서 4 - SU으로 표시 uncrosslinked RNAS는 약 20 %의 배경 돌연변이 속도를 보여줍니다. 이 속도는 약으로 증가합니다. crosslinking시 50~80%. bioinformatic 분석에 대한 자세한 설명은 Hafner 외 의해 출판의 보충 자료에서 찾을 수 있습니다. 18 선택 단계 총 RNA에 4 thiouridine의 정관 수준의 결정 안정 100 μm의 사전 수확 4SU 16 H와 보충 매체 성장 후 관심 RBP을 표현하는 세포 라인에서 총 RNA를 분리. 제어로, 수확 전지는 4SU 또한없는 성장. 제조 업체의 지침에 따라 세탁 세포 펠렛을 Trizol 시약 (시그마) 3 권 외에하여 총 RNA를 분리. 또한 제조 업체의 프로토콜에 따라 Qiagen RNeasy를 사용하여 총 RNA를 정화했다. RNA 분리 및 분석하는 동안 4SU의 산화를 방지하기 위해 세척 버퍼와 후속 효소 단계를 0.1 MM dithiothreitol (DTT)을 추가합니다. 다이제스트 및 HPLC 분석을 위해 하나의 nucleosides에 dephosphorylated 총 RNA는 20 전에 설명했다. 간단히, 30 μl 볼륨, 37 16 H에 대한 전체 RNA 투석을 40 μg을했다 품어 ° 0.4 U 세균 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (생물 워싱턴)와 0.09 U의 뱀 독이와 C phosphodiesterase (워싱턴 생물). 참조 표준으로, 합성 4SU - 라벨 RNA (우리가 standardly CGUACGCGGAAUACUUCGA (4SU) U 사용) 또한 효소 소화를 완료하는 데 그것을 제목을 사용합니다. Supelco 디스커버리 C18 (보세 위상 실리카 5 μm의 입자, 250 X 4.6 mm) 반대 위상 열 (펠폰트 PA, 미국)의 HPLC에 의해 ribonucleosides의 결과 혼합물을 분리합니다. HPLC 버퍼는 3 % acetonitrile (A)와 물에 90 % acetonitrile (B)에 0.1 M TEAA 있습니다. 15 분, 20 분 0으로 10 % B, 30 분 10-100%의 B에 대한 0 % B : isocratic 그라데이션을 사용합니다. 사이에 적용 세척은 HPLC의 컬럼을 청소 실행 5 분 100 % B을 적용합니다. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2034/2034fig1.jpg" alt="그림 1"> 그림 1 (오른쪽 패널)은 세포 라인 플래그를 표현 / 4 - SU 6 - SG와 함께 IGF2BP1 HA - 태그와 수행 파 클립의 대표적인 결과를 보여줍니다. IGF2BP1 6 - SG의 crosslinking 효율 4 - SU에 대한 crosslinking 효율보다 낮은합니다. 낮은 crosslinking 효율 풍부한 세포 RN​​AS의 조각에서 파생된 시퀀스의 높은 배경에 결과되며, 따라서 덜 효율적인 photoreactive nucleosides를 사용할 때 실험을 축소 고려해야합니다. 그림 1의 왼쪽 패널은 잠재적으로 기존의 UV 254 나노미터 crosslinking에 비해 PAR - 클립에 사용할 수있는 다른 photoreactive 유리딘의 analogs를 사용하여 비교를 보여줍니다. 올바른 길이의 방사능 밴드의 강도는 당신에게 작은 RNA 순서 프로토콜 (소형의 cDNA 라이브러리 준비에 대한 단계별 설명을 통해 파 클립 실험이 효과가있다 당신이 수행하는 충분한 RNA을 고립 여부 좋은 생각을 제공합니다 RNAS 배열은) 19에서 찾을 수 있습니다. 6 - SG를 사용할 때 전환 4 - SU와 G를 사용하여 C 전환하는 합성 읽는, T의 특성 변이의 빈도는 성공적으로 가교 시퀀스 나타내는 있습니다. 우리의 경험에서 4 - SU으로 표시 uncrosslinked RNAS는 약 20 %의 배경 돌연변이 속도를 보여줍니다. 이 속도는 약으로 증가합니다. crosslinking시 50~80%.

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</ol>

TT는 Alnylam 제약에 cofounder 과학 고문과 레굴루스 치료제에 대한 고문이다.

버퍼 및 시약 성장 매체 HEK293 세포 <ul><li> DMEM </li><li> 10% FBS </li><li> 이 MM L - 글루타민 </li><li> 100 U / ML 페니실린 </li><li> 100 U / ML 스트렙토 마이신 </li><li> 100 μg / ML hygromycin </li><li> 15 μg / ML blasticidin </li></ul> 4 thiouridine 주식 솔루션 (1 M) <ul><li> 260.27 MG 4 thiouridine </li><li> 1 ML DMSO </li></ul> Doxycyclin 주식 (10 MG / ML) <ul><li> 10 MG doxycyclin </li><li> 1 ML DMSO </li></ul> 1X NP40의 용해 버퍼 DTT와 단백 분해 효소 억제제없이 5 배 버퍼의 재고를 준비합니다. 직접 실험을하기 전에 DTT와 프로 테아제 억제제를 추가합니다. <ul><li> 50 MM HEPES, pH를 7.5 </li><li> 150 MM KCl </li><li> 이 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </li><li> 1 ㎜ NaF </li><li> 0.5 % (V / V) NP40 </li><li> 0.5 MM DTT </li><li> 전체 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 무료 프로 테아제 억제제 칵테일 (로체) </li></ul> 구연 산염 인산 버퍼 <ul><li> 4.7 g / L 구연산 산성 </li><li> 9.2 g / L 나 2 HPO 4 </li><li> 산도 5.0 </li></ul> IP - 세척 버퍼 <ul><li> 50 MM HEPES - 코, 산도 7.5 </li><li> 300 MM KCl </li><li> 0.05 % (V / V) NP40 </li><li> 0.5 MM DTT (실험 바로 앞에 추가) </li><li> 전체 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 무료 프로 테아제 억제제 칵테일 (로체) (직접 실험을하기 전에 추가) </li></ul> 높은 소금 세척 버퍼 <ul><li> 50 MM HEPES - 코, 산도 7.5 </li><li> 500 MM KCl </li><li> 0.05 % (V / V) NP40 </li><li> 0.5 MM DTT (실험 바로 앞에 추가) </li><li> 전체 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 무료 프로 테아제 억제제 칵테일 (로체) (실험 바로 앞에 추가) </li></ul> Dephosphorylation 버퍼 <ul><li> 50 MM 트리스 - HCL, pH를 7.9 </li><li> 100 MM NaCl </li><li> 10 MM MgCl 2 </li><li> 1 ㎜ DTT </li></ul> 인산 가수 분해 효소 세척 버퍼 <ul><li> 50 MM 트리스 - HCL, pH를 7.5 </li><li> 20 MM EGTA </li><li> 0.5 % (V / V) NP40 </li></ul> DTT없이 폴리 뉴클레오 타이드의 키나제 (PNK) 버퍼 <ul><li> 50 MM 트리스 - HCL, pH를 7.5 </li><li> 50 MM NaCl </li><li> 10 MM MgCl 2 </li></ul> PNK 버퍼 <ul><li> 50 MM 트리스 - HCL, pH를 7.5 </li><li> 50 MM NaCl </li><li> 10 MM MgCl 2 </li><li> 5 MM DTT </li></ul> SDS 페이지 로딩 버퍼 <ul><li> 10 % 글리세롤 (V / V) </li><li> 50 MM 트리스 - HCL, pH를 6.8 </li><li> 이 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </li><li> 2퍼센트 SDS (W / V) </li><li> 100 MM DTT </li><li> 0.1 % bromophenol 블루 </li></ul> 2X Proteinase K 버퍼 <ul><li> 100 MM 트리스 - HCL, pH를 7.5 </li><li> 150 MM NaCl </li><li> 12.5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </li><li> 2퍼센트 (W / V) SDS </li></ul>

par - 클립 - rna 단백질의 바인딩 transcriptome 전체 바인딩 사이트를 식별하는 방법

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA의 성적은 RNA 결합 단백질의 수백 (RBPs)와 microRNA 함유 자주 dependently 셀 타입에 표현 ribonucleoprotein의 단지 (miRNPs를.)와 상호 작용하여 포스트 transcriptional 유전자 규정의 대상이 아르 이해하는 방법을 다음과 RNA 바인딩 요소의 상호 작용은 개인 성적, 생체내 단백질 - RNA 상호 작용 1 필요의 고해상도지도의 규정에 영향을 미칩니다. 유전자, 생화학 및 전산 접근 방식의 조합은 일반적으로 RNA - RBP 또는 RNA - RNP 상호 작용을 파악하기 위해 적용됩니다. immunopurified의 RBPs과 관련된 RNAS의 Microarray 프로 파일링 (RIP - 칩) 2 transcriptome 수준 목표를 정의하지만, 그 응용 프로그램은 kinetically 안정적인 상호 작용에만 드문 경우 3,4는 RBP 인식 요소 (RRE을 식별할 수의 특성으로 제한됩니다 ) 긴 목표 RNA 이내. 더 직접적인 RBP 대상 사이트 정보 가교 RNA 세그먼트와 cDNA 시퀀싱 (CLIP) 10의 절연 다음 immunoprecipitation 7-9로 생체내의 자외선 crosslinking 5,6에 결합하여 얻을 수 있습니다. 클립 RBPs 11-17의 다수의 대상을 식별하는 데 사용되었다. 그러나, 클립 UV 254 nm의 RNA - 단백질 crosslinking의 낮은 효율에 의해 제한되며, crosslink의 위치는 어려운 배경 이외의 가교에서 UV - 가교 대상 RNA 세그먼트를 분리하고, 합성 가교 조각 이내에 쉽게 식별이되지 않습니다 RNA는 또한 샘플에 존재 조각. 우리는 높은 해상도와 셀룰러 RBPs 및 miRNPs의 transcriptome 전체 바인딩 사이트에서 확인하기 위해 강력한 세포 기반 crosslinking 접근을 개발 우리가 용어 PAR - 클립 (Photoactivatable - Ribonucleoside 강화 Crosslinking 및 Immunoprecipitation) (개요에 대한 그림. 1A를 참조하십시오 방법). 방법은 살아있는 세포에 의해 초기 RNA의 성적에 같은 4 - thiouridine (4 - SU)과 6 - thioguanosine (6 - SG)로 photoreactive ribonucleoside의 analogs의 결합에 의존하고 있습니다. 365 NM의 자외선에 의한 세포의 방사선이 상호 작용 RBPs에 photoreactive 뉴클레오 - 라벨 세포 RN​​AS의 효율적 crosslinking을 유도. 관심 RBP의 Immunoprecipitation은 가교와 coimmunoprecipitated RNA의 분리옵니다. 절연 RNA는 cDNA 라이브러리로 변환하고 깊은 Solexa 기술을 사용하여 합성 수 있습니다. PAR - 클립 준비한 cDNA 라이브러리 중 하나 특징은 crosslinking의 정확한 위치가 합성 cDNA에 거주하는 돌연변이에 의해 식별 될 수있다는 것이다. 변이를 아데노신에 구아 노신 6 - SG 결과를 사용하는 반면 cytidine 전환 4 - SU을 사용하여, 가교 시퀀스 thymidine. 가교 시퀀스에있는 돌연변이의 존재는 그것이 가능한 풍부한 휴대 RNAS에서 파생 시퀀스의 배경에서 분리 수 있습니다. 다양한 RNA 바인딩 단백질의 숫자 방법의 응용은 Hafner 외에 보도되었다. 18

RNA의 성적표는 횡단 행동 RNA 결합 단백질 (RBPs)의 다수에 의해 중재됩니다 광범위한 posttranscriptional 규정이 적용됩니다. 여기 우리는 정확하고 transcriptome 전체 규모 RBPs의 RNA 결합 사이트를 식별할 수있는 generalizable 방법을 제시.

PAR - 클립 - RNA 단백질의 바인딩 Transcriptome 전체 바인딩 사이트를 식별하는 방법

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

이 절차의 전반적인 목표는 RNA 결합 단백질 또는 RVP의 전사체 넓은 결합 부위를 결정하는 것입니다. 이는 먼저 초기 전사체의 생체 내 표지를 위해 광반응성 뉴클레오시드 유사체를 사용하여 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 365나노미터 자외선으로 RNA와 RNA 결합 단백질을 가교하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 조사된 RNA 결합 단백질을 면역 침전시키고 RNA에 대한 가교를 복구하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 RNA를 CD NA 라이브러리 및 심층 염기서열로 변환하는 것입니다. 궁극적으로 RVP의 전사체 넓은 결합 부위를 보여주고 RNA 인식 요소 및 결합 선호도를 정의할 수 있는 결과를 얻을 수 있습니다.안녕하세요, 제 이름은 뉴욕 록펠러 대학의 톰 SEL 연구실의 마커스 호프너입니다. 오늘 우리는 par lip 또는 photoable rib nucleoside, analog, enhanced cross-linking 및 immunoprecipitation이라는 방법을 보여줄 것입니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 전사체에서 RNA 결합 단백질의 규모 결합 부위와 결합 모티프 및 선호도를 식별합니다.자, 그럼 시작하겠습니다. In vivo UV 가교는 층류 후드에서 시작됩니다. 이 프로토콜에서는 무균 기술을 사용하여 태그가 지정된 IGF 2개의 BP 1세포를 예시적인 모델로 사용합니다.HEK 2 93 세포를 안정적으로 발현하는 HEK 2 93 세포 배양 배지에서 Tet 억제제의 제어하에 하나 태그가 지정된 IGF 2 BP 1을 100 및 400 곱하기 10에서 6 번째 세포로 사용하고 약 80 % co 유창성으로 성장시킵니다. 가교결합 14시간 전에, 세포는 티오 우리딘(thio uridine) 또는 SU에 대한 광반응성 리보사이드 유사체를 세포 배양 배지에 직접 갖췄다. 대안적으로, 6 guine 또는 six SG는 광 반응성 리보사이드를 첨가 한 후 사용할 수 있으며, IGF 2 개의 BP를 첨가 한 후 독시사이클린 세포를 첨가하여 1 개의 독시사이클린 세포를 세포 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음으로, 성장 배지의 경사면을 나타냅니다. 그런 다음 플레이트당 10ml의 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수로 세포를 한 번 씻습니다. 그런 다음 디캔팅으로 PBS를 완전히 제거합니다.뚜껑을 덮지 않은 플레이트를 얼음이 든 트레이에 놓고 스트래들 링커 2, 400 UV 가교제 또는 이에 상응하는 자외선에 365 나노 미터 자외선을 조사하고 UV 방사선 당 1 밀리리터의 PBS로 고무 경찰관으로 세포를 긁어냅니다. 세포를 50ml 원심분리 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 5분 동안 500G로 원심분리합니다. 슈퍼 이름을 버리고 세포 펠릿을 보관하십시오.이 시점에서 세포 펠릿은 액체 질소에서 급속 냉동하고 최소 12개월 동안 영하 80도로 보관할 수 있습니다. 절차를 계속하려면 펠릿을 X NP 40 용해 완충액 1개씩 3부피로 현탁하고 얼음에서 10분 동안 배양합니다. 13, 4 섭씨 온도에 15 분 동안 000 G에 원심 분리에 의하여 세포 용해물을 맑게 하십시오.원심분리 후 5미크론 멤브레인 주사기 필터를 통해 여과하여 용해물을 추가로 제거합니다. 마지막으로, RNA T 1을 마이크로리터당 1단위의 최종 농도에 추가하고 섭씨 22도의 수조에서 15분 동안 배양합니다. 그 후, 얼음 위에서 5 분 동안 반응을 식히십시오.in vivo UV 가교에 이어. 면역침전을 위해 마그네틱 비드를 준비합니다. 세포 용해물 1mil당 10마이크로리터의 dyna beads protein G 자성 입자를 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.그런 다음 구슬이 들어있는 튜브를 마그네틱 스탠드에 1-2 분 동안 놓습니다. 상층액을 제거하고 자기 분리기에 있는 동안 튜브에 1ml의 시트레이트 인산염 완충액을 추가합니다. 다음으로, 튜브를 덮고 샘플을 와류로 만들어 비드를 다시 현탁시킵니다.튜브 캡에 남아 있는 구슬을 모으기 위해 잠시 원심분리기를 사용합니다. 추가로 1ml의 시트레이트 인산염 완충액으로 이 세척을 반복합니다. 세척 resus 후, 비드와 시트레이트 인산염 완충액을 사탕무 현탁액의 원래 부피의 2배의 부피로 현탁시킵니다.그런 다음 비트 현탁액 1밀리리터당 0.25mg의 Anti-Flag M 2개의 단클론 항체를 추가합니다. 배양 후 실온에서 40 분 동안 회전하는 휠에 현탁액을 배양하고, 앞서 설명한 바와 같이 1 밀리리터의 시트레이트 인산염 완충액으로 비드를 2 회 세척하고,이 세척은 세척 Resus 후 결합되지 않은 항체를 제거하고, 비드를 현탁시키고 4 회 전과 같이 시트레이트 인산염 완충액을 현탁시키는 역할을합니다. 면역침전을 시작하려면 새로 준비된 항체 접합 마그네틱 비드를 RNA T one 처리된 세포 용해물에 추가합니다.혼합물을 15ml 원심분리 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 1시간 동안 회전합니다. 배양 후 마그네틱 비드를 수집하고 상등액 재현탁 비드를 1ml의 IP 세척 버퍼에 버리고 1.5ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 앞에서 설명한 대로 비드를 1ml의 IP 세척 버퍼에서 두 번 세척합니다.최종 세척 후, reus는 IP 세척 버퍼의 원래 비드 부피에 비드를 현탁시킵니다. 그런 다음 RNAT 1을 마이크로리터당 100단위의 최종 농도에 추가합니다. 비드 현탁액을 섭씨 22도의 수조에서 15분 동안 배양합니다.그런 다음 얼음 위에서 5분 동안 서스펜션을 식힙니다. 다음으로, 1ml의 고염 세척 버퍼로 비드를 세 번 세척합니다. 그런 다음 탈인산화 완충액의 원래 비드 부피 하나에 비드를 재현탁합니다.송아지 장 알칼리성 인산가수분해효소를 마이크로리터당 0.5단위의 최종 농도에 추가하고 섭씨 37도에서 10분 동안 현탁액을 배양합니다. 1ml의 인산가수분해효소 세척 완충액으로 비드를 두 번 세척한 다음 DTT가 없는 폴리뉴클레오티드 키나아제 또는 PNK 완충액으로 두 번 더 세척합니다. 마지막으로 PNK 버퍼의 원래 비드 부피 하나에 비드를 다시 현탁시킵니다.가교 결합된 RNA의 무선 라벨링을 시작합니다. 감마 32 PATP 및 T 4 PNK를 갓 준비된 비드 현탁액의 원래 비드 부피 1개에 추가합니다. 섭씨 37도에서 30분 동안 현탁액을 배양합니다.다음으로, 비방사성 TP를 현탁액에 추가하고 섭씨 37도에서 5분 더 배양합니다. 그런 다음 DTT 없이 800마이크로리터의 PNK 버퍼로 마그네틱 비드를 5회 세척합니다. 마지막으로 70마이크로리터의 SDS 페이지에 비드를 다시 현탁합니다.로딩 버퍼는 섭씨 95도의 열 블록에서 5분 동안 무선 라벨 현탁액을 배양하여 가교 RNA와 면역 침전된 RNA 결합 단백질을 변성시키고 방출합니다. 그런 다음 분리기의 마그네틱 비드를 제거하고 슈퍼 나틴을 깨끗한 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮기고 novox bis triss 4-12 % 프리 캐스트 폴리 아크릴 아미드 겔의 웰 당 40 마이크로 리터의 suade를 로드하고 200 볼트에서 55 분 동안 젤을 실행합니다. 겔이 실행되면 겔 챔버를 분해하고 플레이트를 분해하고 겔을 한 플레이트에 장착한 상태로 두어 겔을 인광 이미저 용지 인쇄물에 쉽게 정렬할 수 있습니다.세 개의 작은 방사성 젤 조각을 젤 모서리에 비대칭으로 이식합니다. 오염을 방지하기 위해 젤을 Saran 랩과 같은 플라스틱 필름으로 감쌉니다. 젤을 빈 phospho 이미저 화면에 1시간 동안 노출시키고 phospho 이미저에 노출시킵니다.다음으로, 방향을 잡기 위해 이식된 젤 조각을 사용하여 phospho imager 인쇄물 위에 젤을 정렬합니다. RNA 결합 단백질 또는 RBP의 예상 크기에 해당하는 밴드를 잘라냅니다. 밴드를 DTU 투석기 MIDI 튜브로 옮기고 800마이크로리터의 XSDS 실행 버퍼 전기 용리를 추가합니다.가교 결합된 R-N-A-R-B-P 복합체는 제조업체의 지침에 따라 2시간 동안 100볼트에서 작동합니다. 전기 용출 후. proteinase K buffer와 proteinase K를 추가하여 섭씨 55도에서 30분 동안 용액을 배양합니다.산성 페놀 클로로포름 이소아밀 알코올 추출로 RNA를 회수한 다음 클로로포름 추출을 수행합니다. 그런 다음 1마이크로리터의 글리코겐을 추가하고 3부피의 에탄올을 첨가하여 RNA를 침전시킵니다. 마지막으로 생성 된 펠릿을 10.5 마이크로 리터의 물에 용해시킵니다.RNA가 회수되면 표준 CDNA 라이브러리 준비 프로토콜을 통해 운반하고 염기서열 판독에 대한 신중한 생물정보학적 분석을 수행합니다. HK 2 93 세포를 발현하는 파 클립에 대한 대표적인 결과는, IGF 2 BP 1 개가 광반응성 뉴클레오시드 유사체 4 SU 및 6 SG 가교 효율로 표시되며, 대안적인 광반응성 리보시드 6 SG의 가교 효율은 일반적으로 4 su보다 낮다. 낮은 cross-linking efficiency는 풍부한 세포 RNA의 단편에서 유래한 sequences의 더 높은 background를 초래할 수 있으므로 초기에 더 많은 세포를 실험에 사용해야 합니다.여기에서 볼 수 있듯이 다양한 파 클립, 광반응성 우리딘 유사체를 기존의 UV 2, 54 나노미터 가교 또는 클립과 비교합니다. UV 2 54 나노미터 RNA 단백질 가교 결합은 가교 효율이 제한적입니다. 적절한 크기의 방사성 띠의 강도는 파 클립 실험이 효과가 있었는지, 그리고 작은 RNA 염기서열분석 프로토콜을 수행하기에 충분한 RNA가 분리되었는지 여부를 나타냅니다.생물정보학(bioinformatic) 분석 후 염기서열분석(sequenced read)에서 특징적인 돌연변이(distinctive mutations)의 빈도는 성공적으로 가교된 염기서열(cross-linked sequences)을 나타냅니다. 이러한 돌연변이는 4개의 SU를 사용할 때 T 2개의 C 전이이고 성공을 사용할 때 G 2개의 A 전이입니다. G. park lip의 정의적인 특징은 회수된 RNA에서 준비된 CD NA 라이브러리에 존재하는 특징적인 돌연변이에 대한 점수를 매겨 교차 링크의 위치를 도출할 수 있는 가능성입니다.이를 통해 풍부한 세포 RNA의 공동 분리된 단편에서 파생된 염기서열의 노이즈로부터 특이적으로 결합된 RNA에서 파생된 신호를 쉽게 분리할 수 있습니다. 그래서 우리는 오늘 RNA 결합 단백질에 의해 특별히 인식되는 RNA 분절을 분리하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때.RNA를 자유롭게 작동시키는 것이 중요합니다. 그래서 그랬습니다. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

사전 mRNA의 과도 특성으로 인해, 그것은 분리하고 공부하기에 어려울 수...

인간 사전 mRNA에 매핑 Ribonucleoproteins에 대한 신속한 하이 스루풋 방법 (RNPs)

성적표에서 RNA 결합 단백질의 공간적 배열이 포스트 transcriptional 규칙의 주요 결정자이다. 따라서, 우리는 RNA 결합 단백질의 바인딩 사이트의 정확한 게놈 차원의 매핑을 허용 개별 - 염기 해상도 자외선 crosslinking 및 immunoprecipitation (iCLIP)를 개발하였습니다.

iCLIP - 개인 염기 해상도와 단백질 RNA 상호 작용의 Transcriptome 전체 매핑

RNA-단백질 상호 작용은 많은 세포 과정의 핵심에 있습니다. 여기에서는 특정 RNA를 분리하고 이와 관련된 새로운 단백질을 식별하는 in vivo 방법에 대해 설명합니다. 이것은 RNA가 세포에서 어떻게 조절되는지에 대한 새로운 빛을 비출 수 있습니다.

빠른 방법론에 의해 소설 RNA 결합 단백질 분리

우리는 RNA 의무적인 단백질을 확인 하 고 중재 하는 UV photocrosslinking 및 질량 분석을 사용 하 여 라이브 셀에서 그들의 RNA 바인딩 영역 지도를 프로토콜을 설명 합니다.

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

여기, 우리는 Arabidopsis thaliana 엽초 엽 원형체에 적용된 상호 작용 캡처 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 생체 내 UV 가교 결합에 비판적으로 의존하며 생리 환경으로부터 식물 mRNA 결합 단백질의 분리 및 동정을 허용합니다.

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

단백질 바인딩 두 코딩 및 noncoding 식별을 클릭 화학 기반 RNA 위하여 캡처 (CARIC) 전략을 적용 하기 위한 자세한 프로토콜 RNAs 제공 됩니다.

캡처 클릭 화학 기반 RNA 위하여를 사용 하 여 RNA 의무적인 단백질의 포착 (CARIC) 전략

서열 특이성은 유전자 조절에 매우 중요합니다. 특정 서열을 인식하는 조절 단백질은 유전자 조절에 중요합니다. 이러한 단백질에 대한 기능적 결합 부위를 정의하는 것은 어려운 생물학적 문제입니다. RNA 결합 단백질에 대한 결합 부위의 식별을 위한 반복적 접근법은 여기에 기재되어 있으며 모든 RNA 결합 단백질에 적용가능하다.

규제 RNA 결합 단백질에 대한 결합 부위를 식별하기 위한 서열 공간 탐색

여기에서, 우리는 고환에서 RBP 후보자의 주요 RNA 표적을 결정 하는 eCLIP 프로토콜을 제시 합니다.

마우스 고환에서 단백질 결합 RNA를 효율적으로 식별 하기 위한 향상 된 가교 면역 침전 (eCLIP) 방법

여기서 우리는 포유류 세포에서 RNA 결합 단백질 (RBPs)의 RNA 표적을 결정하기 위하여 플래그 비오틴 탠덤 정제를 가진 FbioCLIP-seq에게 불린 수정된 CLIP-seq 프로토콜을 제시합니다.

플래그-비오틴 탠덤 정화에 의해 중재된 상호 연결 및 면역 침전을 통해 단백질-RNA 상호 작용의 전사-전체 프로파일링

cDNA의 키네틱 가교 및 분석은 높은 시간 분해능에서 살아있는 세포에서 단백질-RNA 상호작용의 역학을 조사할 수 있는 방법입니다. 여기에서 프로토콜은 효모 세포의 성장, UV 가교, 수확, 단백질 정제 및 차세대 시퀀싱 라이브러리 준비 단계를 포함하여 자세히 설명됩니다.

χCRAC를 사용하여 높은 시간 분해능에서 생체 내 단백질-RNA 상호 작용 역학 모니터링

여기에서 우리는 인간 세포의 총 단백질 추출물, 비오티닐화 RNA로 코팅된 스트렙타비딘 비드 및 질량 분석 분석을 사용하여 특정 RNA 서열의 단백질 상호작용자를 발견, 정량화 및 검증하기 위한 최적화된 시험관 내 방법을 제시합니다.

짧은 비오티닐화 RNA를 사용한 RNA 결합 단백질의 최적화된 정량적 풀다운 분석

배우세요 광반응성 뉴클레오사이드 유사체와 UV 교차결합을 이용한 전사체 전체 RNA 결합 단백질 결합 부위 식별 방법입니다. 이 기술은 RNA 인식 요소와 결합 선호도를 정의하여 전사 후 조절 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

PAR - 클립 - RNA 단백질의 바인딩 Transcriptome 전체 바인딩 사이트를 식별하는 방법

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