PAR - 클립 - RNA 단백질의 바인딩 Transcriptome 전체 바인딩 사이트를 식별하는 방법

이 절차의 전반적인 목표는 RNA 결합 단백질 또는 RVP의 전사체 넓은 결합 부위를 결정하는 것입니다. 이는 먼저 초기 전사체의 생체 내 표지를 위해 광반응성 뉴클레오시드 유사체를 사용하여 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 365나노미터 자외선으로 RNA와 RNA 결합 단백질을 가교하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 조사된 RNA 결합 단백질을 면역 침전시키고 RNA에 대한 가교를 복구하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 RNA를 CD NA 라이브러리 및 심층 염기서열로 변환하는 것입니다. 궁극적으로 RVP의 전사체 넓은 결합 부위를 보여주고 RNA 인식 요소 및 결합 선호도를 정의할 수 있는 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 제 이름은 뉴욕 록펠러 대학의 톰 SEL 연구실의 마커스 호프너입니다. 오늘 우리는 par lip 또는 photoable rib nucleoside, analog, enhanced cross-linking 및 immunoprecipitation이라는 방법을 보여줄 것입니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 전사체에서 RNA 결합 단백질의 규모 결합 부위와 결합 모티프 및 선호도를 식별합니다.

자, 그럼 시작하겠습니다. In vivo UV 가교는 층류 후드에서 시작됩니다. 이 프로토콜에서는 무균 기술을 사용하여 태그가 지정된 IGF 2개의 BP 1세포를 예시적인 모델로 사용합니다.

HEK 2 93 세포를 안정적으로 발현하는 HEK 2 93 세포 배양 배지에서 Tet 억제제의 제어하에 하나 태그가 지정된 IGF 2 BP 1을 100 및 400 곱하기 10에서 6 번째 세포로 사용하고 약 80 % co 유창성으로 성장시킵니다. 가교결합 14시간 전에, 세포는 티오 우리딘(thio uridine) 또는 SU에 대한 광반응성 리보사이드 유사체를 세포 배양 배지에 직접 갖췄다. 대안적으로, 6 guine 또는 six SG는 광 반응성 리보사이드를 첨가 한 후 사용할 수 있으며, IGF 2 개의 BP를 첨가 한 후 독시사이클린 세포를 첨가하여 1 개의 독시사이클린 세포를 세포 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음으로, 성장 배지의 경사면을 나타냅니다. 그런 다음 플레이트당 10ml의 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수로 세포를 한 번 씻습니다. 그런 다음 디캔팅으로 PBS를 완전히 제거합니다.

뚜껑을 덮지 않은 플레이트를 얼음이 든 트레이에 놓고 스트래들 링커 2, 400 UV 가교제 또는 이에 상응하는 자외선에 365 나노 미터 자외선을 조사하고 UV 방사선 당 1 밀리리터의 PBS로 고무 경찰관으로 세포를 긁어냅니다. 세포를 50ml 원심분리 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 5분 동안 500G로 원심분리합니다. 슈퍼 이름을 버리고 세포 펠릿을 보관하십시오.

이 시점에서 세포 펠릿은 액체 질소에서 급속 냉동하고 최소 12개월 동안 영하 80도로 보관할 수 있습니다. 절차를 계속하려면 펠릿을 X NP 40 용해 완충액 1개씩 3부피로 현탁하고 얼음에서 10분 동안 배양합니다. 13, 4 섭씨 온도에 15 분 동안 000 G에 원심 분리에 의하여 세포 용해물을 맑게 하십시오.

원심분리 후 5미크론 멤브레인 주사기 필터를 통해 여과하여 용해물을 추가로 제거합니다. 마지막으로, RNA T 1을 마이크로리터당 1단위의 최종 농도에 추가하고 섭씨 22도의 수조에서 15분 동안 배양합니다. 그 후, 얼음 위에서 5 분 동안 반응을 식히십시오.

in vivo UV 가교에 이어. 면역침전을 위해 마그네틱 비드를 준비합니다. 세포 용해물 1mil당 10마이크로리터의 dyna beads protein G 자성 입자를 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 구슬이 들어있는 튜브를 마그네틱 스탠드에 1-2 분 동안 놓습니다. 상층액을 제거하고 자기 분리기에 있는 동안 튜브에 1ml의 시트레이트 인산염 완충액을 추가합니다. 다음으로, 튜브를 덮고 샘플을 와류로 만들어 비드를 다시 현탁시킵니다.

튜브 캡에 남아 있는 구슬을 모으기 위해 잠시 원심분리기를 사용합니다. 추가로 1ml의 시트레이트 인산염 완충액으로 이 세척을 반복합니다. 세척 resus 후, 비드와 시트레이트 인산염 완충액을 사탕무 현탁액의 원래 부피의 2배의 부피로 현탁시킵니다.

그런 다음 비트 현탁액 1밀리리터당 0.25mg의 Anti-Flag M 2개의 단클론 항체를 추가합니다. 배양 후 실온에서 40 분 동안 회전하는 휠에 현탁액을 배양하고, 앞서 설명한 바와 같이 1 밀리리터의 시트레이트 인산염 완충액으로 비드를 2 회 세척하고,이 세척은 세척 Resus 후 결합되지 않은 항체를 제거하고, 비드를 현탁시키고 4 회 전과 같이 시트레이트 인산염 완충액을 현탁시키는 역할을합니다. 면역침전을 시작하려면 새로 준비된 항체 접합 마그네틱 비드를 RNA T one 처리된 세포 용해물에 추가합니다.

혼합물을 15ml 원심분리 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 1시간 동안 회전합니다. 배양 후 마그네틱 비드를 수집하고 상등액 재현탁 비드를 1ml의 IP 세척 버퍼에 버리고 1.5ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 앞에서 설명한 대로 비드를 1ml의 IP 세척 버퍼에서 두 번 세척합니다.

최종 세척 후, reus는 IP 세척 버퍼의 원래 비드 부피에 비드를 현탁시킵니다. 그런 다음 RNAT 1을 마이크로리터당 100단위의 최종 농도에 추가합니다. 비드 현탁액을 섭씨 22도의 수조에서 15분 동안 배양합니다.

그런 다음 얼음 위에서 5분 동안 서스펜션을 식힙니다. 다음으로, 1ml의 고염 세척 버퍼로 비드를 세 번 세척합니다. 그런 다음 탈인산화 완충액의 원래 비드 부피 하나에 비드를 재현탁합니다.

송아지 장 알칼리성 인산가수분해효소를 마이크로리터당 0.5단위의 최종 농도에 추가하고 섭씨 37도에서 10분 동안 현탁액을 배양합니다. 1ml의 인산가수분해효소 세척 완충액으로 비드를 두 번 세척한 다음 DTT가 없는 폴리뉴클레오티드 키나아제 또는 PNK 완충액으로 두 번 더 세척합니다. 마지막으로 PNK 버퍼의 원래 비드 부피 하나에 비드를 다시 현탁시킵니다.

가교 결합된 RNA의 무선 라벨링을 시작합니다. 감마 32 PATP 및 T 4 PNK를 갓 준비된 비드 현탁액의 원래 비드 부피 1개에 추가합니다. 섭씨 37도에서 30분 동안 현탁액을 배양합니다.

다음으로, 비방사성 TP를 현탁액에 추가하고 섭씨 37도에서 5분 더 배양합니다. 그런 다음 DTT 없이 800마이크로리터의 PNK 버퍼로 마그네틱 비드를 5회 세척합니다. 마지막으로 70마이크로리터의 SDS 페이지에 비드를 다시 현탁합니다.

로딩 버퍼는 섭씨 95도의 열 블록에서 5분 동안 무선 라벨 현탁액을 배양하여 가교 RNA와 면역 침전된 RNA 결합 단백질을 변성시키고 방출합니다. 그런 다음 분리기의 마그네틱 비드를 제거하고 슈퍼 나틴을 깨끗한 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮기고 novox bis triss 4-12 % 프리 캐스트 폴리 아크릴 아미드 겔의 웰 당 40 마이크로 리터의 suade를 로드하고 200 볼트에서 55 분 동안 젤을 실행합니다. 겔이 실행되면 겔 챔버를 분해하고 플레이트를 분해하고 겔을 한 플레이트에 장착한 상태로 두어 겔을 인광 이미저 용지 인쇄물에 쉽게 정렬할 수 있습니다.

세 개의 작은 방사성 젤 조각을 젤 모서리에 비대칭으로 이식합니다. 오염을 방지하기 위해 젤을 Saran 랩과 같은 플라스틱 필름으로 감쌉니다. 젤을 빈 phospho 이미저 화면에 1시간 동안 노출시키고 phospho 이미저에 노출시킵니다.

다음으로, 방향을 잡기 위해 이식된 젤 조각을 사용하여 phospho imager 인쇄물 위에 젤을 정렬합니다. RNA 결합 단백질 또는 RBP의 예상 크기에 해당하는 밴드를 잘라냅니다. 밴드를 DTU 투석기 MIDI 튜브로 옮기고 800마이크로리터의 XSDS 실행 버퍼 전기 용리를 추가합니다.

가교 결합된 R-N-A-R-B-P 복합체는 제조업체의 지침에 따라 2시간 동안 100볼트에서 작동합니다. 전기 용출 후. proteinase K buffer와 proteinase K를 추가하여 섭씨 55도에서 30분 동안 용액을 배양합니다.

산성 페놀 클로로포름 이소아밀 알코올 추출로 RNA를 회수한 다음 클로로포름 추출을 수행합니다. 그런 다음 1마이크로리터의 글리코겐을 추가하고 3부피의 에탄올을 첨가하여 RNA를 침전시킵니다. 마지막으로 생성 된 펠릿을 10.5 마이크로 리터의 물에 용해시킵니다.

RNA가 회수되면 표준 CDNA 라이브러리 준비 프로토콜을 통해 운반하고 염기서열 판독에 대한 신중한 생물정보학적 분석을 수행합니다. HK 2 93 세포를 발현하는 파 클립에 대한 대표적인 결과는, IGF 2 BP 1 개가 광반응성 뉴클레오시드 유사체 4 SU 및 6 SG 가교 효율로 표시되며, 대안적인 광반응성 리보시드 6 SG의 가교 효율은 일반적으로 4 su보다 낮다. 낮은 cross-linking efficiency는 풍부한 세포 RNA의 단편에서 유래한 sequences의 더 높은 background를 초래할 수 있으므로 초기에 더 많은 세포를 실험에 사용해야 합니다.

여기에서 볼 수 있듯이 다양한 파 클립, 광반응성 우리딘 유사체를 기존의 UV 2, 54 나노미터 가교 또는 클립과 비교합니다. UV 2 54 나노미터 RNA 단백질 가교 결합은 가교 효율이 제한적입니다. 적절한 크기의 방사성 띠의 강도는 파 클립 실험이 효과가 있었는지, 그리고 작은 RNA 염기서열분석 프로토콜을 수행하기에 충분한 RNA가 분리되었는지 여부를 나타냅니다.

생물정보학(bioinformatic) 분석 후 염기서열분석(sequenced read)에서 특징적인 돌연변이(distinctive mutations)의 빈도는 성공적으로 가교된 염기서열(cross-linked sequences)을 나타냅니다. 이러한 돌연변이는 4개의 SU를 사용할 때 T 2개의 C 전이이고 성공을 사용할 때 G 2개의 A 전이입니다. G. park lip의 정의적인 특징은 회수된 RNA에서 준비된 CD NA 라이브러리에 존재하는 특징적인 돌연변이에 대한 점수를 매겨 교차 링크의 위치를 도출할 수 있는 가능성입니다.

이를 통해 풍부한 세포 RNA의 공동 분리된 단편에서 파생된 염기서열의 노이즈로부터 특이적으로 결합된 RNA에서 파생된 신호를 쉽게 분리할 수 있습니다. 그래서 우리는 오늘 RNA 결합 단백질에 의해 특별히 인식되는 RNA 분절을 분리하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때.

RNA를 자유롭게 작동시키는 것이 중요합니다. 그래서 그랬습니다. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.