Name: 인간의 세포에서 활성 유전자 발현의 어세 동적 히스톤 수정을 염색질 Immunoprecipitation (칩) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 20 s
Description: 배우세요 인간 세포에서 크로마틴 면역침전법(ChIP)을 이용하여 활성 유전자 발현 동안 히스톤 수정의 동적 변화를 연구하는 방법을. 이 기술은 전사 인자 결합과 염색질 역학을 정량 분석하여 유전자 발현 조절 메커니즘을 규명하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 버지니아 대학, 버지니아 암 센터의 대학과 토마스 F.와 케이트 밀러 제프리스 기념 트러스트에 의해 지원됩니다. 우리는 세포 라인에 대한 제임스 E. 다넬 랩 (록펠러 대학교) 로버트 로스 연구실 (포드햄 대학) 감사합니다.

계획 칩 실험이 계획되어 하루 전에, 세포가 충분한 숫자가 제공되도록 교양하여야한다. 각 칩 분석이 ~ 1-1.5 X 10 7 세포가 필요합니다 있다고 가정합니다. 항상 부정적인 (IgG)와 긍정적인 (팬 히스톤 항체) 컨트롤과 중복 실험을 모두 할 계획입니다. 팁 - 2FTGH 전지, 각 칩 분석이 80 % confluency 15 약 cm 조직 문화 요리가 필요합니다. 1 부 : 염색질 준비와 칩을 수행 <ol><li> 문화 미디어를 제거와 10 %의 우주 송아지 혈청 (CCS) / 5 NG / ML에서 IFN - 감마를 포함한 DMEM 20 ML로 필요한 시간에 대한 세포를 유도. CCS / DMEM뿐만 아니라 10 % 20 ML과 uninduced 접시에있는 미디어를 교체합니다. </li><li> 퓸 배출 후드에서는 15cm의 접시 미디어 20 ML (1 % 최종 농도)을 540 μL 37 % 포름 알데히드를 추가합니다. 팁 - 틸트 판과 미디어 수영장에 포름 알데히드를 추가 - 다음 바위 플레이트는 균일하게 그것을 확산합니다. </li><li> 실온에서 10 분 진행 crosslinking을 허용합니다. </li><li> crosslinking를 중지 0.125 M 최종 농도 글리신을 추가합니다. </li><li> 미디어를 대기음 진공 10 ML 얼음 추위 인산염과 함께 한 세포 세차 호수 (PBS)를 버퍼. </li><li> ~ 7 ML PBS에 세포 스크레이퍼와 세포를 수집하고 얼음 50 ML 원뿔 관에 동일하게 취급했다 세포를 (6 판에서) 결합. </li><li> 4 1,800 rpm으로 원심 분리기 (베크맨 Coutler 알레 그라 12 - R 원심 분리기) · 5 분 C와 PBS를 대기음. 팁 - 스냅 동결 세포 펠릿 경우 여기를 중지하고 -80 ° C.에 저장 </li><li> 4 ML 부풀어 올랐고 버퍼 (25 MM의 HEPES 산도 7.8, 1.5 MM MgCl 2, 10 MM KCl, 0.1 % NP40. 1 ㎜의 DTT, 완전한 프로 테아제 억제제 및 사용하기 전에 얼음에 진정을 추가)의 세포 펠렛을 Resuspend과 15 전송 ML 원뿔 관. 팁 -이 붓기 버퍼 볼륨 6 접시 풀링 (~ 6-9 X 10 7 세포)에 적합합니다. 더 많거나 적은 버퍼 douncing 효율성을 변경할 수 있습니다. </li><li> 10 분 얼음에 세포 현탁액을 품어. </li><li> 미리 차게 15 ML douncer (위턴)에 정지를 전송하고 유봉 A. 20 스트로크를 다운스 </li><li> 전송 얼음에 15 ML 원뿔 관에 다시 세포를 dounced. </li><li> 4 5 분 2,500 rpm으로 원심 분리기는 ° C와 뜨는 폐기하십시오. </li><li> Sonication 버퍼 3 ML의 핵 펠릿 (6 접시에서 ~ 200 μL) (15 펠릿 볼륨) (50 MM의 HEPES의 산도 7.9, 140 MM NaCl, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % 트리톤 X - 100, 0.1 %의 나트륨 deoxycholate, Resuspend 0.1 % SDS). 사용하기 직전 얼음 완료 테아제 억제제와 진정을 추가합니다. 팁 -이 sonication 버퍼 볼륨 6 접시 풀링 (~ 6-9 X 10 7 세포)에 적합합니다. 더 많거나 적은 버퍼 sonication 효율을 변경할 수 있습니다. </li><li> microtip 장착된 Misonix의 Sonicator 3000을 사용하여 10 사이클 (20초 8 설정 on/40 초 ON / OFF 진폭)에 얼음 핵 서스펜션을 Sonicate. 크기 200-1000 BPS 평균 염색질 조각이 일반적으로 발생합니다. 팁 - sonicators이 달라집니다 때문에 sonication 효율이 경험적으로 결정되어야합니다. 이렇게하려면, sonication 전에 각 sonication 사이클 이후 20 μL의 aliquots 가져가라. 4 시간 동안 65 ° C에서이 샘플을 가열. DNA 로딩 버퍼를 추가하고 DNA 조각을 시각화하기위한 기준 1퍼센트 아가로 오스 / TBE 젤을 실행합니다.) </li><li> 전송 4 20 분 SS34 원심 분리기 튜브와 원심 분리기에 자료를 sonicated ° 일반적으로 세포 파편의 소량 무엇 SS34 로터의 13,000 RPM (Sorvall RC6 플러스 원심 분리기)에서 펠렛을 C. </li><li> 조심스럽게 얼음 15 ML 원뿔 관에 뜨는을 전송하기만하면됩니다. </li><li> 360 μL 연어 정자 DNA / 단백질 A 또는 G 아가로 오스 비즈 슬러리를 추가하고 적어도 30 분 동안 4 ° C에서 락을에서 미리 취소합니다. 팁 -이 단계가 아닌 특정 바인딩 이벤트에서 발생 분석에서 소음을 감소시킵니다. </li><li> 펠렛 아가로 오스 비즈 5 분 동안 4 ° C에서 1,000 rpm으로 원심 분리기. </li><li> 얼음 다른 15 ML 원뿔 관에 뜨는 사전 허가 전송합니다. </li><li> 미리 지워 염색질의 A260 단위를 측정하고 4 A260 단위 (0.2 MG / ML 1 A260 단위 = 0.050 MG / ML 가정)에 Sonication 버퍼로 음량을 조절 190 μL DDW 10 μL sonication 버퍼와 빈 분광 광도계, - 팁 A260 단위를 측정하려면, 190 μL DDW의 사전 허가 염색질 10 μL를 희석. </li><li> 20 입력 샘플 및 저장소로 염색질의 75 μL (4 A260 단위에서) 저장 ° C crosslinks을 뒤집을 준비까지. 팁 -이 단계는 데이터 분석을 위해 매우 중요합니다. 입력 나누어지는을 위해 게을리하지 마십시오. </li><li> I에서 1.7 ML의 microfuge 튜브로 나누어지는가 준비 염색질CE 1 ML의 aliquots로. 팁 - 여기 중지하는 경우, -80에 드라이 아이스와 저장소에 준비된 염색질을 동결 스냅 ° C. NB가 : 가능하면 저장된 염색질은 덜 최적의 결과를보다 생산 저하시킬 수 있으므로 피하십시오. </li><li> 유도와 uninduced 샘플에 칩 등급 항체를 추가하면 중복으로 설정합니다. 유도 및 uninduced 샘플 세트로 부정과 긍정적인 컨트롤로 IgG (2 μg)과 히스톤 H3 이동 항체 (15 μL)를 추가합니다. 팁 - 사용하는 항체의 금액은 경험적으로 결정 또는 제안 금액에 대한 공급 업체의 제품 시트를 참조해야합니다. 칩 학년 항체의 일반적으로 1-2 μg 잘 작동합니다. 적절한 볼륨이 혈청으로 제공하는 항체에 대한 경험적으로 결정되어야합니다. </li><li> 4 박 모두 튜브를 록 ° C. </li></ol> 2 부 : IMMUNOCOMPLEXES를 수집 <ol><li> 모든 튜브에 연어 정자 DNA / 단백질 A 또는 단백질 G 아가로 오스 비즈 슬러리의 60 μL를 추가합니다. 팁 사용 단백질 마우스 단클론 항체에 대한 토끼 polyclonal 항체 및 단백질 G위한. </li><li> 적어도 60 분 4 ° C에서 록. </li><li> 4 2,0​​00 rpm으로 부드럽게 microfuging하여 펠렛은 immunocomplexes (아가로 오스 비즈) · 3 분 C. </li><li> 뜨는을 대기음. </li><li> 4 ° C. 로킹 10 분 동안 다음 씻어 버퍼의 각 1 ML로 immunocomplexes 와시 4 2,0​​00 rpm으로 3 분 Microfuge · 각 씻고 뜨는을 대기음 사이에 C. 얼음에 냉장 샘플 보관하십시오. 사용하기 직전 PMSF를 추가합니다. <ul><li> 낮은 소금 워시 - 0.1 % SDS, 1 % 트리톤 X - 100, 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 20 MM 트리스 - CL, 산도 8.0, 150 MM NaCl, 1 MM PMSF </li><li> 고 염분 워시 - 0.1 % SDS, 1 % 트리톤 X - 100, 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 20 MM 트리스 - CL, 산도 8.0, 500 MM NaCl, 1 MM PMSF </li><li> LiCl 워시 - 0.25 M LiCl, 1 % NP - 40, 1 %의 나트륨 deoxycholate, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 10 MM 트리스 - CL, 산도 8.0, 1 ㎜ PMSF </li><li> TE 워시 - TE 버퍼 -10 MM 트리스 - CL, 산도 8.0, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 MM PMSF 두 씻는다 </li></ul></li><li> 최종 TE 버퍼 세척을 제거하고 구슬을 500 μL 용출 버퍼 (50 MM 트리스 - CL, 산도 8.0, 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % SDS)을 추가합니다. 팁 - 용출 버퍼가 신선하게 준비한다. </li><li> 65 30 분 용출 버퍼와 더위에 아가로 오스 비즈를 섞어 소용돌이 ° C. 팁 -이 삼십분 동안 각각의 튜브는 최소한 10 분 간격 와동. </li><li> 2,000 rpm으로 30 초 동안 Microfuge 새로운 microfuge 튜브에 eluent를 전송합니다. 팁 - 용출하는 동안 귀하의 입력 샘플을 해동하고 각 500 μL 용출 버퍼를 추가합니다. 앞으로 모든 단계에서 이러한 샘플을 포함합니다. </li><li> 모든 샘플 및 와동 200 mm의 최종 농도 5 M NaCl을 추가합니다. </li><li> 65 품어 ° C 숙박 (또는 적어도 4 시간). </li></ol> 3 부 : 정화 ChIP'd 및 입력 DNA <ol><li> 뚜껑에 결로를 수집하는 30 초 동안 모든 샘플을 Microfuge. </li><li> 15 분 동안 상온에서 각각의 튜브와 부화 RNAse의 1μL (10 U / μL) 추가합니다. </li><li> 10 μL 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 40 μL 0.5 M 트리스 - CL 산도 6.5, 2 μL Proteinase K (10 MG / ML) 추가 45에서 60 분 ° C 품어. 팁이 시약의 마스터 믹스를 준비하고 각 튜브 52 μL를 추가합니다. </li><li> 페놀 / 클로로포름 / isoamyl 알콜 추출하고 클로로포름 / isoamyl 알콜 농도는 샘플을 추출합니다. </li><li> 2 μL 글리코겐 (25 μg / μL)와 3M 나 아세테이트 산도 5.2과 0.1의 소용돌이 볼륨을 추가합니다. </li><li> 100 % 에탄올과 와동 2.5 볼륨을 추가합니다. </li><li> ° C 하루 20 알을 품다. </li></ol> 4 부 : 정화 ChIP'd 및 입력 DNA 계속해서 <ol><li> 4 13,000 rpm으로 20 분 최소 Microfuge 샘플 ° C DNA / 글리코겐 알약을 촉진합니다. </li><li> 70 % 에탄올 1 ML과 DNA / 글리코겐 알약과 함께 씻으십시오. </li><li> 에어 DNA 사반트 속도 진공 원심 분리기에 알약이나 신속하게 건조 건조. 팁 - 이상의 DNA를 건조하지 마십시오. </li><li> 200 μL TE 버퍼의 DNA / 글리코겐 알약을 Resuspend. </li><li> DNA (1 μL)은 실시간 PCR을 통해 부량 준비가되었습니다. 20 스토어 남아있는 DNA ° C. 팁 - DNA 이상의 1 μL를 사용하여이 실시간 PCR 반응을 억제 수 있으므로주의와 규모. </li></ol> 제 5 부 : 대리인 결과 : 칩 및 입력 DNA 샘플은 관심의 유전자 로커스 특정 primers를 사용하여 리얼 타임 PCR 7,8 (Biosystems 7500 빠른 리얼 타임 PCR 시스템을 적용)과 계량 수 있습니다. 알려진 대상 게놈 시퀀스의 강화 또는 assayed되는 히스톤 수정이 부족하는 것을 Primers는 긍정적이고 부정적인 통제뿐만 아니라 사용할 수 있습니다. 데이터 입력의 비율로 제공됩니다. 칩 절차는 전적으로해야 R세 epeated 생물 학적는 히스톤 수정에 보고된 통계적으로 의미있는 변화된다 보장하기 위해 복제합니다. 뇌관 디자인, PCR 효율, 그리고 입력과 정상화 절차의 %를 계산하는 적절한 방법을 포함하여 DNA를 수치 실시간 PCR를 사용할 때 고려해야 할 몇 가지 중요한 문제가 있습니다. 유전자에 걸쳐 히스톤 수정 인을 프로 파일링 때, PCR 효율은 모든 프라이머 쌍 간의 일치해야합니다. 실시간 PCR 시스템 제조 업체가 필요한 정보와 교육을 제공할 수 있습니다. 그림 1은 염색질의 대표적인 결과는 IFN - γ에 의해 트리거, IRF1 유전자 9 STAT1 활성화하는 동안 immunoprecipitated 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2053/2053fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. STAT1, RNA 중합 효소 II와 H3K36me3의 인 IRF1 유전자의 STAT1 활성화하는 동안 동적입니다. (A, B, C) ​​α - H3K36me3, α - STAT1과 2FTGH 세포에서 수집한 염색질의 α - 폴 II와 칩 IFN - γ를위한 30 분 (빨간색 사각형), 1.5 시간 (파란색 원), 5 시간 (로 유도 녹색 삼각형) 또는 uninduced (블랙 다이아몬드). IgG는 대조군 (회색 십자가)입니다. (D) 팬 H3는 긍정적인 제어이며, 유도 (파란색 원)에 로커스 전체 히스톤 인과 uninduced 조건 (블랙 다이아몬드)를 보여줍니다. -5 BP 주변 딥는 전사 시작 사이트에서 발견 nucleosome 고갈로 인한 것입니다.

<ol><li>Levy, D., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling%3A+Stats%3A+transcriptional+control+and+biological+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).</li>
<li>Bromberg, J., Darnell, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+STATs+in+transcriptional+control+and+their+impact+on+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function.</a> Oncogene. 19, 2468-2473 (2000).</li>
<li>Hu, X., Ivashkiv, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-regulation+of+signaling+pathways+by+interferon-gamma%3A+implications+for+immune+responses+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cross-regulation of signaling pathways by interferon-gamma: implications for immune responses and autoimmune diseases.</a> Immunity. 31, 539-550 (2009).</li>
<li>Campos, E. I., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histones%3A+annotating+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Histones: annotating chromatin.</a> Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Modifications+and+Their+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin Modifications and Their Function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293, 1074-1080 (2001).</li>
<li>Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+fluorescence+monitoring+of+rapid+cycle+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification.</a> Biotechniques. 22 (130-131), 134-138 (1997).</li>
<li>Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., Griffith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+amplification+and+detection+of+specific+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences.</a> Biotechnology (N Y). 10, 413-417 (1992).</li>
<li>Kroger, A., Koster, M., Schroeder, K., Hauser, H., Mueller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activities+of+IRF-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Activities of IRF-1.</a> J Interferon Cytokine Res. 22, 5-14 (2002).</li>
<li>Ross, R. A., Spengler, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neuroblastoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cancer+biology%22%5BJournal%5D)">Human neuroblastoma stem cells.</a> Seminars in cancer biology. 17, 241-247 (2007).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

명시된 칩 프로토콜은 분석보다보다 20 가지 히스톤 수정을 위해 실험실에서 성공적으로 사용되었습니다. 또한, 우리는 전사 요소의 숙박 변화를 특징으로 가지고 히스톤 - 수정 IFN - γ 여러 유발 유전자에서 히스톤 수정 및 RNA 효소 II의 전사 기계를 인식 효소, 단백질. 우리는 또한 암 줄기 세포 10 분화 동안 히스톤 수정의 변화를 특징으로 프로 시저를 사용합니다. 칩 데이터의 품질은 궁극적으로 사용되는 항체의 효과에 의존하고 항체 사이에 상당한 변화가 있습니다. 수정을 칩에 실패, 따라서, 그 변경이 존재하지 않습니다라고 의미로 해석될 수 없습니다. 또한, 칩 실험에서 관찰된 특정 수정 변경은 단순히 가까운 잔류물에 추가 히스톤 수정에 의한 항체에 의해 에피토프의 인식에 변화가 반영될 수 있습니다. 따라서, 칩 결과는 생물 학적 결과에 히스톤 수정에서 관찰된 변화와 관련됩니다 접근과 검증해야합니다. 이것이 완료되면, 칩은 유전자 발현의 조절에 기...

<table><tbody><tr><td>37% 포름알데히드</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름/이소아밀 알코올</td><td>Acros Organics</td><td>AC32715-5000</td><td></td></tr><tr><td>Complete Mini 프로테아제 억제제</td><td>Roche Group</td><td>1836153</td><td></td></tr><tr><td>Cosmic 송아지 혈청</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.04N</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30243</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Pharmco Products, Inc.</td><td>zp1110EP</td><td></td></tr><tr><td>글라이신</td><td>Roche Group</td><td>100149</td><td></td></tr><tr><td>글리코겐</td><td>Roche Group</td><td>901393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>IFN-gamma</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>285-IF-100</td><td></td></tr><tr><td>IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-005-003</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>데옥시콜산 나트륨염</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP349-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>US Biological</td><td>N3500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histone H3, CT, pan</td><td>EMD Millipore</td><td>07-690</td><td></td></tr><tr><td>페놀/클로로포름/이소아밀</td><td>Fisher Scientific</td><td>108-95-2</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>EMD Millipore</td><td>50-230-0316</td><td></td></tr><tr><td>프로테이나제 K</td><td>5 PRIME</td><td>2500140</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>5 PRIME</td><td>2500130</td><td></td></tr><tr><td>연어 정자 DNA/Protein A Agarose</td><td>EMD Millipore</td><td>16-157</td><td></td></tr><tr><td>연어 정자 DNA/Protein G Agaorse</td><td>EMD Millipore</td><td>16-201</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>327372500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-K36me3</td><td>Abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-STAT1</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-345X</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RNA Polymerase II</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-899</td><td></td></tr></tbody></table>

인간의 세포에서 활성 유전자 발현의 어세 동적 히스톤 수정을 염색질 immunoprecipitation (칩)

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

세포외 리간드의 다양한 대응, STAT (전사의 신호 변환기 및 활성)이 전사 요소 빠르게들은 하나의 티로신 잔기 1 인산화에 의해 활성화됩니다 세포 표면 수용체에 세포질에서 숨겨진 상태에서 모집하고 있습니다. 그들은 다음 성장, 분화, 항상성 및 면역 반응에 영향을 미치는 대상 유전자의 전사를 드라이브에 핵을 dimerize 및 이동시키다. 되지 놀랍게도, 정상적인 세포 프로세스에서 광범위한 참여에 따라, STAT 기능의 dysregulation 특히 암 2 면역 질환 3, 인간의 질병에 기여하고 있습니다. 그것은 잘 녹음이 4,5 염색질 템플릿 변경에 의해 규제되어 설정됩니다. 이러한 변경은 ATP에 의존 단지뿐만 아니라 공유 결합 히스톤 수정 및 DNA의 methylation 6 활동을 포함합니다. 유전자 표현의 STAT 활성화가 신속하고 과도 모두이기 때문에, 그것은 STAT - 의존 유전자 loci modulating에서 염색질 템플릿에 대한 구체적인 메커니즘이 필요합니다. 이러한 메커니즘을 정의하려면, 우리는 히스톤 수정 및 STAT 신호에 응답 유전자 loci에서 그들을 생성하는 효소 활동을 특징. 이 프로토콜은 염색질 immunoprecipitation, STAT가 활성 유전자 발현의 염색질에 신호의 연구에 대한 가치있는 방법을 설명합니다.

이 프로토콜은 염색질 immunoprecipitation (칩)가 신호 전달 경로에 의해 유도 전사 조절 염색질 템플릿 동적 변경을 연구하는 데 사용됩니다 방법을 설명합니다.

인간의 세포에서 활성 유전자 발현의 어세 동적 히스톤 수정을 염색질 Immunoprecipitation (칩)

다양한 세포 외 리간드에 반응하여, STAT(신호 전달 및 전사 활성화 인자) 전사 인자들이 빠르게 모집됩니다...

칩(ChIP) 실험은 STAT1 활성화 유전자 발현 과정에서 발생하는 히스톤 수정의 동적 변화를 모니터링하는 데 사용됩니다. 전사 인자, 히스톤 수정 복합체 및 전사 장치 자체의 점유율 변화 또한 이와 같은 방식으로 분석할 수 있습니다. 분석을 시작하기 위해, 세포를 인터페론 감마(interferon gamma)로 유도하여 STAT1 신호를 활성화합니다. 이어 포름알데히드로 세포를 가교결합(cross-linking)하고 세포를 수집합니다. 이후 핵을 분리하고 초음파 처리(sonication)를 진행하며, 이를 통해 크로마틴을 약 200에서 1000 염기쌍 크기의 단편으로 절단합니다. 다음으로, 표적 단백질이나 관심 히스톤 수정을 타겟팅하는 항체를 첨가한 후 면역 복합체를 침전시킵니다.면역 복합체를 세척하고, 가교 결합을 해제한 후 DNA를 정제합니다. 면역 침전된 DNA의 정량적 실시간 PCR 분석을 통해 히스톤 수정의 변화나 유전자의 특정 영역으로의 단백질 모집 여부를 결정할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 버지니아 대학교 생물학과 Melissa Hendrickson 박사님 연구실의 Lauren Borow입니다.오늘은 염색질 면역침전법(chromatin immunoprecipitation) 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 STAT one 신호 전달 하위 단계의 전사 과정 중에 발생하는 동적인 히스톤 수식(histo modifications)을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.이 절차를 시작하기 하루 전, 여기에서 사용되는 두 종류의 FTGH 세포를 충분한 수로 확보할 수 있도록 배양하십시오. 각 칩 분석당 80% 합류도(confluency)의 15cm 조직 배양 접시 하나를 준비하십시오. 각 실험에는 음성 IgG 대조군, 양성 pan histone 항체 대조군 및 중복 시료를 포함하십시오.이 절차를 시작하려면 배양액을 제거합니다. 이를 10% cosmic calf serum이 첨가되고 5 ng/mL의 interferon gamma가 포함된 DMEM 20 mL로 교체합니다. 또한, 유도되지 않은 플레이트의 배양액을 10% C-C-S-D-M-E-M 20 mL로 교체합니다.다음 작업은 흄 후드 내에서 진행하십시오. 15 centimeter 조직 배양 접시를 기울이고 20 milliliters의 배지에 37% formaldehyde 용액 540 microliters를 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 흔들어 용액이 고르게 퍼지도록 합니다.실온에서 10분 동안 가교 결합이 일어나도록 둡니다. 그런 다음 가교 반응을 중단하기 위해 glycine을 최종 농도 125 millimolar가 되도록 첨가합니다. 배지를 진공 흡입하여 제거하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 얼음처럼 차가운 PBS 10 milliliters로 세포를 한 번 세척합니다. 약 7 milliliters의 PBS로 세포를 수집하고, 15 centimeter 플레이트 6개에서 동일하게 처리된 세포들을 얼음 위의 50 milliliter 원심 분리 튜브(conical tube)에 합칩니다.마지막으로 수집한 세포를 4°C에서 1,800 RPM으로 5분 동안 원심분리하고 PBS를 흡입하여 제거합니다. 여기서 중단할 경우, 가교 결합 후 세포 펠렛을 급속 냉동하여 -80°C에서 보관합니다. 다음 단계는 크로마틴을 준비하는 것입니다.먼저 얼음 위에 냉각시킨 팽윤 완충액(swelling buffer)에 1 mM DTT와 완전 단백질 분해 효소 억제제(complete protease inhibitors)를 첨가하십시오. 6개의 플레이트에서 얻은 펠렛(pellet)을 4 mL의 팽윤 완충액으로 재현탁하여 15 mL 원추형 튜브(conical tube)로 옮깁니다. 완충액의 양을 더 많이 또는 적게 사용할 경우 효율이 달라질 수 있습니다.세포 현탁액을 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 얼음 배양이 완료되면, 현탁액을 미리 냉각시킨 15 mL 다운 파이펫(downer and dance)으로 옮깁니다. PEs A를 사용하여 20회 펌핑(strokes)한 후, 세포를 다시 얼음 위의 15 mL 원추형 튜브(conical tube)로 옮깁니다. 4°C에서 2,500 RPM으로 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 제거하여 핵 펠릿(nuclear pellet)만 남깁니다.얼음에 냉각시킨 초음파 파쇄 버퍼에 완전 단백질 분해 효소 억제제(complete protease inhibitors)를 첨가합니다. 6개의 플레이트에서 약 200 µL의 핵 펠렛 재현탁액(nuclear pellet Resus)이 생성됩니다. 펠렛을 펠렛 부피의 15배 또는 3 mL의 초음파 파쇄 버퍼에 현탁합니다.이 정도 양의 세포에 다른 부피를 사용하면 초음파 처리 효율이 달라질 수 있습니다. 초음파 처리 효율은 해당 실험실의 장비에 맞춰 사전에 결정해야 합니다. 본 실험에서는 마이크로칩이 장착된 Miss Sonic sonicate 3000이 사용되었습니다.핵 현탁액을 얼음 위에서 진폭 설정을 8로 하여 20초간 작동하고 40초간 정지하는 과정을 10회 반복하여 초음파 처리합니다. 초음파 처리가 완료되면 일반적으로 염색질 단편의 평균 크기가 200에서 1000 base pairs가 됩니다. 초음파 처리된 물질을 SS 34 원심분리 튜브로 옮기고 4 °C에서 13,000 RPM으로 20분 동안 원심분리합니다.SS 34 로터를 사용하여 대개 소량인 세포 파편(cell debris)을 펠렛화합니다. 상층액을 얼음 위에 놓인 15 milliliter 원추형 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 비특이적 결합 이벤트로 인한 배경 신호를 줄이기 위해 칩 단계로 진행합니다.먼저, 360 µL의 연어 정자 DNA protein A 또는 G agro bead 슬러리를 첨가하고 4 °C에서 최소 30분 동안 락킹하여 크로마틴 조제물을 사전 제거(pre-clear)합니다. 4 °C에서 1000 RPM으로 5분 동안 원심분리하여 agro bead를 침전시킵니다. 그런 다음 사전 제거된 상청액을 얼음 위에 놓인 다른 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다.다음으로, 크로마틴의 260 nanometers 흡광도 또는 A 260 단위를 측정합니다. 10 µL의 전처리된 크로마틴을 190 µL의 2차 증류수에 희석합니다. 공시료(blank)의 경우, 10 µL의 초음파 처리 버퍼와 190 µL의 2차 증류수를 혼합합니다.초음파 처리 버퍼(sonication buffer)를 사용하여 샘플의 부피를 4 A 260 units가 되도록 조정하십시오. 4 A 260 units 농도의 전처리된 크로마틴(pre-cleared chromatin) 75 µL를 입력 샘플(input sample)로 따로 보관하고, 역교차결합(reverse cross links) 단계 전까지 -20 °C에서 저장하십시오. 이 단계는 데이터 분석에 매우 중요하다는 점을 유의하시기 바랍니다.따라서 입력 분취물을 챙기는 것을 잊지 마십시오. 남은 크로마틴 조제물을 1 mL씩 1.7 mL 마이크로 원심분리 튜브에 나누어 얼음 위에 분주하십시오. 여기서 중단할 경우, 조제된 크로마틴을 드라이아이스로 급속 냉동하여 -80 °C에서 보관하십시오.하지만 보관된 염색질은 분해될 수 있으므로, 즉시 ip를 진행하는 것이 가장 좋습니다. 이제 유도된 샘플 세트와 유도되지 않은 샘플 세트에 chip 등급 항체를 추가하십시오. 두 번 반복하여 수행합니다.일반적으로 1~2 µg의 항체가 효과적이지만, 정확한 양은 사전에 실험적으로 결정해야 합니다. 유도 및 비유도 시료 세트에 음성 대조군으로 2 µg의 IgG를, 양성 대조군으로 15 µL의 pan histone H3 항체를 추가하십시오. 항체와 함께 하룻밤 동안 배양한 후 면역 복합체를 분리하기 전에, 모든 튜브를 4 °C에서 하룻밤 동안 쉐이킹(rocking) 하십시오.모든 튜브에 60 µL의 salmon sperm DNA protein A 또는 protein G 비드 슬러리를 추가합니다. 면역 복합체를 비드에 결합시키기 위해 4 °C에서 최소 60분 동안 반응시킵니다.agros 비드에 결합된 면역 복합체를 4°C에서 2000 RPM으로 3분 동안 가볍게 원심분리하여 펠렛화한 후 상층액을 제거합니다. 다음으로 저염 세척을 시작으로 고염 세척 순으로 일련의 버퍼 세척을 수행합니다. 그 후 염화리튬 세척을 수행합니다.마지막으로, 각 세척 완충액으로 두 번의 TE 세척을 수행합니다. 사용 직전에 PMSF를 첨가하고, 1 mL의 완충액으로 4 °C에서 10분 동안 쉐이킹하며 세척한 후, 4 °C에서 2000 RPM으로 3분 동안 원심분리하고 샘플을 얼음 위에서 차갑게 유지하며 상층액을 흡입하여 제거합니다. 마지막 TE 완충액 세척 단계를 마친 후, 갓 조제한 Lucian 완충액 500 µL를 비드에 첨가하고, 볼텍싱하여 Lucian 완충액 내의 aros 비드를 혼합한 다음 65 °C에서 30분 동안 가열합니다.시료가 용출되는 동안 10분마다 볼텍싱을 수행하며, 입력 시료를 해동하고 각 시료에 500 µL의 용출 버퍼를 첨가하십시오. 이후의 모든 단계에 이 시료들을 포함하십시오. 시료의 65 °C 배양이 완료되면, 2000 RPM에서 30초 동안 마이크로 원심분리하고 EENT를 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮기십시오.마지막으로, 가교 결합을 해제합니다. 모든 시료에 최종 농도가 200 millimolar가 되도록 5 molar sodium chloride를 첨가하고, 65 °C 인큐베이터에서 최소 4시간에서 최대 하룻밤 동안 볼텍싱하며 배양합니다. 면역 복합체의 가교 결합이 해제되면, 65 °C 배양이 완료된 후 결합된 DNA를 회수할 수 있습니다.샘플을 30초 동안 마이크로 원심분리합니다. 뚜껑에 맺힌 응축물을 수집하기 위해, 각 튜브에 RNAs A 1 µL를 첨가합니다. 그 후 각 튜브에 0.5 M EDTA 10 µL, 0.5 M Tris chloride pH 6.5 40 µL, proteinase K 2 µL(또는 마스터 믹스로부터 총 52 µL)를 처리하고 45 °C에서 60분 동안 배양합니다. 페놀-클로로포름, 이소아밀 알코올로 샘플을 추출한 후, 다시 클로로포름-이소아밀 알코올로 추출합니다.그런 다음 DNA를 침전시키기 위해, 각 샘플에 2 µL의 글리코젠과 0.1 부피의 3 M 아세트산나트륨(pH 5.2)을 넣고 볼텍싱합니다. 2.5 부피의 100% 에탄올을 넣고 볼텍싱한 후 -20 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 샘플을 회수하여 4 °C에서 13,000 RPM으로 20분 동안 원심분리합니다.70% ethanol 1 mL로 DNA 글리코젠 펠렛을 세척하고 공기 중에서 건조시키거나 스피드 진공 원심분리기를 사용하십시오. DNA를 과하게 건조하지 마십시오. 200 µL의 TE 버퍼에 펠렛을 재현탁하고, 1 µL 이하의 양을 사용하여 실시간 정량 분석을 수행하십시오.여기에 제시된 PCR은 H3K36me3의 동태를 추적한 ChIP 실험 결과입니다. IRF1 유전자의 인터페론 감마 유도 과정 동안, 인터페론 감마로 30분, 1.5시간 및 5시간 동안 처리한 2FTGH 세포에서 수집한 염색질을 침전시키기 위해 H3K36me3 항체를 사용하였으며, 음성 대조군으로는 IgG를 사용하였습니다. 동일한 시점에서 STAT1의 점유율과 RNA polymerase II의 점유율 또한 측정하였습니다.양성 대조군으로도 사용되는 pan histone three 항체를 이용하여, 유도되지 않은 조건과 유도된 조건에서 IRF one 유전자 궤적 전체의 히스톤 점유율을 측정하였습니다. -5 base pairs 주변에서 나타나는 감소는 전사 개시 부위에서 발견되는 뉴클레오솜 결핍으로 인한 것입니다. 지금까지 염색질 면역침강법의 절차를 보여드렸습니다.이 분석법은 활성화된 유전자 전사 과정에서 일어나는 염색질 수식(chromatin modifications)을 관찰하는 데 유용합니다. 이 절차를 수행할 때, ChIP 실험을 시작하기 전 지도 교수 또는 책임자와 함께 염색질 전단(shearing) 절차를 확립하는 것이 중요합니다. 또한, 인풋(input) 샘플을 반드시 채취해야 함을 기억하십시오.이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

chromatin-immunoprecipitation-chip-to-assay-dynamic-histone

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

ESC의 차별은 셀 타입의 특정 구조의 변화와 염색질의 구성과 일치한다. 이러한 변화의 감지는 stemcellness 및 세포 분화를 정의하는 메커니즘에 중요한 통찰력을 제공합니다. 염색질 immunoprecipitation (칩)은 줄기 세포 분화를 기본 분자 메커니즘을 해부하다하는 소중한 방법을 나타냅니다.

인간 배아 줄기 세포에서 염색질의 Immunoprecipitation

기본 결합 및 고해상도 질량 분석과 크로 마틴 면역 가교으로 ChroP 접근 방식은 히스톤 수정, 변형 및 기능적으로 구별 염색질 영역에서 시너지 효과가 아닌 histonic 단백질의 복합 단백체 구조를 해부 할 수 있습니다.

ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

이 작품은 성숙 마우스 T 세포 라인을 사용하여 염색질 immunoprecipitation (ChIP)에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 특정 프로모터 사이트 또는 게놈 전체에서 특정 히스톤 마크의 분포를 조사하는 데 적합합니다.

마우스 T- 세포주에서 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

여기, 우리는 chromatin immunoprecipitation (칩) 및 칩 seq 라이브러리 준비 프로토콜 낮은 풍부한 닭 배아 샘플에서 글로벌 epigenomic 프로 파일 생성을 설명 합니다.

낮은 풍부 배아 샘플 chromatin Immunoprecipitation (칩) 프로토콜

여기, 우리는 신진 효 모 Saccharomyces cerevisiae에서 수정 된 히스톤의 염색 질 immunoprecipitation에 대 한 프로토콜을 설명합니다. Immunoprecipitated DNA가 풍부 하 고 지역화의 게놈을 통해 히스톤 포스트 번역 상 수정 양이 많은 PCR 이후에 사용 됩니다.

히스톤 수정 Saccharomyces cerevisiae 에서 chromatin Immunoprecipitation (칩)

Chromatin 환경 규칙은 적절 한 유전자 발현에 필요한 필수적인 과정 이다. 우리가 chromatin 수정의 채용을 통해 유전자 발현을 제어 하기 위한 메서드를 설명 하는 여기, 유전자 및 가역 방식 기계.

세포질 기계 화학 Epigenetic 한정자를 리디렉션하여 억압 유전자 전사

탠덤 chromatin 위한 단계별 프로토콜 설명 immunoprecipitation 시퀀싱 (tChIP-Seq) 셀 형식 관련 게놈 넓은 히스톤 수정의 분석을 가능 하 게.

TChIP-Seq: 셀 형식 관련 Epigenome 프로 파일링

크로마틴 면역 침전 (ChIP)은 유전자 조절의 분자 메커니즘을 이해하는 강력한 도구입니다. 그러나, 이 방법은 기계적 전단에 의한 재현가능한 크로마틴 단편화를 얻는 데 어려움을 수반한다. 여기서, 우리는 효소 소화를 사용하여 ChIP 분석에 대한 향상된 프로토콜을 제공한다.

포유류 세포에서 미세 Coccal 뉴클레아제사용 염색질 면역침전 분석

CBP/p300과 같은 히스톤 아세틸 트랜스퍼라제(HATs, 리신 아세틸 트랜스퍼라아제라고도 함)의 억제제는 암 치료에 대한 잠재적 치료법이다. 그러나 이러한 억제제의 유효성을 검사하기 위한 엄격한 방법이 필요합니다. 검증을 위한 3개의 시험관내 방법은 재조합 아세틸 전달을 가진 HAT 분석, 세포 배양에 있는 히스톤 아세틸화를 위한 면역blotting 및 ChIP-qPCR를 포함합니다.

히스톤 아세틸트랜스퍼효소 억제제 검증을 위한 아세서

이 프로토콜은 스냅 냉동 조직의 염색질 준비에 중점을 두고 있으며 X-ChIP(Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation)에 이어 정량적 PCR 분석(X-ChIP-qPCR) 또는 차세대 시퀀싱 접근법(X-ChIP-seq)에 적합합니다.

염색질 면역침전 분석을 위한 냉동 키메라 간 조직에서 염색질 추출

배우세요 인간 세포에서 크로마틴 면역침전법(ChIP)을 이용하여 활성 유전자 발현 동안 히스톤 수정의 동적 변화를 연구하는 방법을. 이 기술은 전사 인자 결합과 염색질 역학을 정량 분석하여 유전자 발현 조절 메커니즘을 규명하는 데 활용됩니다.

인간의 세포에서 활성 유전자 발현의 어세 동적 히스톤 수정을 염색질 Immunoprecipitation (칩)

더 많은 동영상 탐색