인간의 세포에서 활성 유전자 발현의 어세 동적 히스톤 수정을 염색질 Immunoprecipitation (칩)

칩 실험은 STAT one 활성화 유전자 발현 변화, 전사 인자 점유, 히스톤 변형 복합체 및 전사 기계 자체에서 발생하는 히스토 변형의 동적 변화를 모니터링하는 데 사용됩니다. 먼저 세포는 인터페론 감마로 유도되어 STAT One 신호를 활성화하고 세포를 포름알데히드로 가교하고 수집하여 핵을 분리하고 초음파 처리하여 염색질을 약 200-1000개의 염기쌍 단편으로 절단합니다. 다음으로, 관심 단백질 또는 히스토 변형을 표적으로 하는 항체를 추가한 다음 면역 복합체를 침전시킵니다.

면역 복합체를 세척하고 가교를 역전시키며 DNA를 정제합니다. 유전자의 특정 영역에 대한 단백질의 히스토 변형 또는 동원의 변화는 면역 침전된 DNA의 정량적 realtime PCR 분석을 기반으로 결정될 수 있습니다. 안녕하세요, 제 이름은 버지니아 대학교 생물학과 멜리사 헨드릭슨 박사 연구실의 로렌 보로우입니다.

오늘은 염색질 면역침전(chromatin immunoprecipitation)을 위한 절차를 소개하려고 한다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 STAT 1 신호의 전사 다운스트림 중에 발생하는 동적 히스토 변형을 연구합니다. 시작하겠습니다.

이 절차를 시작하기 하루 전에 여기에 사용된 두 개의 FTGH 세포에 대해 충분한 수를 사용할 수 있도록 세포를 배양합니다. 각 칩 분석에 대해 15% Co 유창성으로 80cm 조직 배양 접시 하나를 준비합니다. 각 실험에는 음성 IgG 대조군, 양성 팬 히스톤 항체 대조군 및 중복이 포함됩니다.

이 절차를 시작하려면 배양 배지를 제거합니다. 10%의 우주 송아지 혈청이 보충되고 밀리리터당 5나노그램의 인터페론 감마가 함유된 20ml의 DMEM으로 교체하십시오. 또한 UN 유도 플레이트의 매체를 20mL의 10%C-C-S-D-M-E-M으로 교체하십시오.

다음 작업은 흄 후드에서 합니다. 조직 배양 접시를 15cm 기울이고 20ml의 배지에 540마이크로리터의 37%포름알데히드 용액을 추가합니다. 그런 다음 접시를 흔들어 고르게 펴십시오.

가교가 실온에서 10분을 감지하도록 합니다. 그런 다음 125 millimolar Final 농도에 글리신을 첨가하여 가교 반응을 중지합니다. 배지를 진공 흡입하고 세포 스크레이퍼를 사용하여 10ml의 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 한 번 세척한 다음 약 7ml의 PBS에 세포를 수집하고 얼음 위의 50ml 원추형 튜브에서 6개의 15cm 플레이트에서 동일하게 처리된 세포를 결합합니다.

마지막으로 수집된 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 1, 800RPM으로 원심분리하고 PBS를 흡인합니다. 여기서 멈추면 스냅, 셀 팔레트를 동결하고 가교 후 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 다음 단계는 염색질을 준비하는 것입니다.

먼저 얼음에서 차갑게 식힌 팽창 완충액에 1밀리몰 DTT와 완전한 프로테아제 억제제를 첨가합니다. Resus는 펠릿을 6개의 플레이트에 매달아 4밀리리터의 팽창 완충액을 끌어당겨 15밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 더 많거나 적은 버퍼를 사용하면 춤 효율성이 바뀔 수 있습니다.

세포 현탁액을 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 얼음 위의 배양이 완료되면 현탁액을 미리 냉각된 15ml 다우너로 옮기고 춤을 춥니다. 춤을 추기 후에 PEs A를 가진 20 치기는 2, 500 분당 회전수에서 얼음 분리기에 15 밀리리터 원뿔 관으로 세포를 4 섭씨 온도에 5 분 동안 다시 옮기고 핵 펠릿을 떠나는 상등액을 버린다.

얼음에서 차갑게 식힌 초음파 처리 완충액에 완전한 단백질 분해 효소 억제제를 첨가하십시오. 6개의 플레이트에서 약 200마이크로리터의 핵 펠릿 Resus가 생성됩니다. 펠릿을 15 펠릿 부피 또는 3 밀리리터의 초음파 처리 완충액에 현탁시킵니다.

이 양의 세포에 대해 다른 부피를 사용하면 초음파 처리 효율이 바뀔 수 있습니다. 초음파 처리 효율은 실험실의 작업자에 대해 미리 결정해야 합니다. 여기에는 마이크로칩이 장착된 Miss Sonic Sonicate 3000이 사용됩니다.

얼음 위에서 핵 현탁액을 10회 주기, 20초 동안 켜고 40초 동안 8의 진폭 설정으로 초음파 처리합니다. 이로 인해 일반적으로 초음파 처리가 완료될 때 평균 200 - 1000 염기쌍 크기의 염색질 단편이 생성됩니다. 초음파 처리된 물질을 SS 34 원심분리기 튜브와 원심분리기로 13, 000RPM에서 섭씨 4도의 20분 동안 이송합니다.

SS 34 로터에서 펠릿 세포 파편으로, 이는 일반적으로 소량입니다. 얼음 위의 15ml 원추형 튜브에 supinate를 조심스럽게 옮깁니다. non-specific binding events의 배경을 줄이기 위해 chip으로 진행합니다.

먼저, 360마이크로리터의 연어 정자 DNA 단백질 A 또는 G 농업 비드 슬러리를 넣고 섭씨 4도에서 최소 30분 동안 흔들어 염색질 준비를 미리 세척합니다. 섭씨 4도에서 5분 동안 1000RPM으로 원심분리기를 사용하여 농업 비드를 펠릿화합니다. 그런 다음 미리 세척된 앙와위 나틴을 얼음 위의 다른 15ml 원뿔 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 260 나노 미터 또는 염색질의 A 260 단위의 흡광도를 측정합니다. 10 마이크로 리터의 preclude chromatin을 190 마이크로 리터의 이중 증류수에 희석합니다. 블랭크의 경우 10 마이크로 리터의 초음파 처리 버퍼와 190 마이크로 리터의 이중 증류수를 결합하십시오.

초음파 처리 버퍼가 있는 샘플의 부피를 4개의 A 260 장치로 조정합니다. 사전 세척된 염색질 75마이크로리터를 4개 60개 단위에서 입력 샘플로 저장하고 교차 결합을 역전시킬 준비가 될 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 이 단계는 데이터 분석에 매우 중요합니다.

따라서 입력 분취를 게을리하지 말고 1 밀리리터 분취량에 남은 염색질 제제를 얼음 위의 1.7 밀리리터 마이크로 쓰레기 튜브에 분배하십시오. 여기서 멈추면 스냅합니다. 준비된 염색질을 드라이아이스에 얼려 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.

그러나 저장된 염색질은 분해될 수 있으므로 ip를 계속 사용하는 것이 가장 좋습니다. 이제 칩 등급 항체를 유도 및 비유도 샘플 세트에 추가합니다. 중복으로.

일반적으로 1-2마이크로그램의 항체가 효과적이지만, 그 양은 사전에 경험적으로 결정해야 합니다. 유도 및 비유도 샘플 세트에 음성 및 양성 대조군으로 2마이크로그램의 IgG와 15마이크로리터의 팬 히스톤 H 3 항체를 추가합니다. 또한 모든 튜브를 섭씨 4도에서 밤새 흔들어 항체와 함께 하룻밤 동안 배양한 후 면역 복합체를 분리하는 작업을 진행합니다.

60마이크로리터의 연어 정자 DNA 단백질 A 또는 단백질 지로 비드 슬러리를 모든 튜브에 추가합니다. 최소 60분 동안 섭씨 4도의 로켓을 발사합니다. 면역 복합체를 비드에 결합하기 위해.

아그로스 비드에 결합된 면역 복합체를 펠렛으로 2000RPM에서 섭씨 4도에서 3분 동안 부드럽게 마이크로로 펠렛화하여 상층액을 흡인합니다. 다음으로 저염 세척으로 시작하여 고염 세척으로 이어지는 일련의 완충 세척을 수행합니다. 그런 다음 염화 리튬 세척.

마지막으로 각 세척 버퍼에 두 개의 TE 세척이 이루어집니다. 사용 직전에 PMSF를 첨가하고, 1ml의 버퍼로 섭씨 4도에서 흔들면서 10분, 마이크로로 3분, 섭씨 4도에서 2000RPM으로 3분 동안 세척한 다음 상층액을 흡인하여 샘플을 얼음 위에서 식힌 상태로 유지합니다. 최종 차 완충액 세척을 제거한 후 갓 준비한 루시안 완충액 500마이크로리터를 비드 와류에 첨가하여 루시안 버퍼의 아로스 비드를 혼합하고 섭씨 65도에서 30분 동안 가열합니다.

샘플이 용리되는 동안 10분마다 볼텍싱하여 입력 샘플을 해동하고 각 샘플에 500마이크로리터의 용리 버퍼를 추가합니다. 앞으로의 모든 단계에서 이러한 샘플을 포함합니다. 샘플이 완료되면 2000RPM에서 30초당 섭씨 65도 배양 마이크로 융합을 수행하고 EENT를 새로운 마이크로 퍼지 튜브로 옮깁니다.

마지막으로 교차 연결을 반대로 합니다. 모든 샘플에 최종 농도 200 밀리몰에 5몰 염화나트륨을 첨가하고 섭씨 65도의 와류 인큐베이터에서 최소 4시간에서 하룻밤 동안 사용합니다. 면역 복합체의 가교 결합이 역전되면 섭씨 65도에서 배양이 완료되면 결합된 DNA를 회수할 수 있습니다.

30초 동안 마이크로 fuge 샘플. 뚜껑에 응축을 모으려면 각 튜브에 1마이크로리터의 RNA A를 추가하고 RNA 처리 후 각 튜브에 0.5몰 EDTA 10마이크로리터, 0.5몰 트리스 클로라이드 pH 6.5 40마이크로리터 및 단백질 분해 효소 K 2마이크로리터 또는 마스터 믹스에서 총 52마이크로리터에서 60분 동안 배양합니다. 페놀 클로로포름, iso aile 알코올로 샘플을 추출한 다음 클로로포름 ISO A my 알코올로 샘플을 추출합니다.

그런 다음 DNA를 침전시키기 위해 2 마이크로 리터의 글리코겐과 3 몰 아세트산 나트륨 0.1 부피를 첨가하십시오.각 샘플과 와류에 pH 5.2, 100 % 에탄올 와류 2.5 부피를 추가하고 밤새 섭씨 영하 20도에서 배양합니다. 표본 및 마이크로 패물을 13, 4 섭씨 온도에 20 분 동안 000 분당 회전수로 만회하십시오.

DNA 글리코겐 펠릿을 1 밀리리터의 70 % 에탄올과 공기로 세척하십시오. 펠릿을 건조시키거나 고속 진공 원심 분리기를 사용하십시오. DNA를 과도하게 건조하지 말고, 200마이크로리터의 TE 완충액에 펠릿을 현탁시키고, 실시간으로 1마이크로리터 이하를 정량화하십시오.

여기에 나타난 PCR은 H 3 K 36 ME 3의 역학을 따르는 칩 실험의 결과이다. IRF의 인터페론 감마 유도 중에 1개의 유전자 H3 K 36 ME 3개의 항체를 사용하여 인터페론 감마로 유도된 2개의 FTGH 세포에서 수집한 염색질을 30분, 1.5시간 및 5시간 동안 IgG를 음성 대조군으로 하여 끌어내렸습니다. STAT 1의 점유율은 RNA 중합효소 2 점유와 마찬가지로 이 시점에서 결정되었습니다.

IRF one 유전자 좌위를 가로지르는 히스톤 점유는 pan histone three 항체를 사용하여 un induced 및 induced 조건에 대해 결정되었으며, 이는 또한 positive control 역할을 합니다. 마이너스 5 염기쌍 부근의 급강하는, 전사 시작 부위에서 발견되는 뉴클레오솜 고갈 때문입니다. 지금까지 염색질 면역침전(chromatin immunoprecipitation)에 대한 절차를 보여드렸다.

이 분석은 활성화된 유전자 전사 중에 발생하는 염색질 변형을 관찰하는 데 유용합니다. 이 절차를 수행할 때 칩 실험을 시작하기 전에 에이터와 함께 염색질의 전단 절차를 해결하는 것이 중요합니다. 또한 입력 샘플을 채취하는 것을 잊지 마십시오.

그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.