暗順応スライス標本におけるマウス網膜神経細胞からパッチクランプ記録

私たちの視覚体験は、網膜の光受容体の視覚色素が光子を吸収し、最終的に細胞膜の環状ヌクレオチド依存性チャネルの閉鎖につながるときに始まります。これにより、桿体と錐体の両方からの神経伝達物質グルタミン酸の放出が抑制されます。放出されたグルタミン酸は、下流の網膜細胞によって感知され、下流のシグナルを研究します。

安楽死させたマウスから目を取り出します。Sを分離し、寒天ブロックに埋め込み、振動ミクロトームを使用してスライスします。次に、網膜スライスを顕微鏡の下に置き、LED照明で刺激します。

一方、パッチクランプ記録は、生成されたシナプス電流または電位を測定するために行われます。一般的に、この方法に不慣れな個人は、暗闇での作業の複雑さが増すため、苦労します。そのため、プロセス全体を視覚化できると、他の方法では説明しにくい感触が得られます。

この手順は、使用される記録線電極と基準線電極に塩化銀の層をコーティングすることから始めます。電極を1モルの塩化ナトリウムに浸します。次に、1ヘルツの正弦波を備えた15ボルトの電源を使用して、それらの間で約20秒間15ボルトを駆動します。

マイクロピペットプーラーを使用して、ファイヤーポリッシュされたBOシリカガラスからパッチピペットを調製し、直径約20ミクロンの細胞体のターゲット細胞のサイズに基づいてピペットチップ抵抗を選択します。セル本体には、先端抵抗が5〜10メガオームのパイプPETを使用してください。直径が約5ミクロンになったら、12〜15メガオームの先端抵抗を使用します。

接地基準電極を調製するには、シリンジを使用して、1ミリモル塩化ナトリウムに調製した3.5%寒天溶液をポリエチレンチューブに充填します。次に、添付の書面によるプロトコルの指示に従って、以下の溶液を調製します。外部浴液スライス溶液、アスパラギン酸カリウムピペット内部溶液、および寒天バックストップ。

すべての溶液は、必要になるまで摂氏4度で保管してください。実験の日に、トールアスパラギン酸カリウムの内部溶液の約1.5ミリリットル。次に、希釈したフッ素を追加します。

重炭酸ナトリウムを含む約50ミリリットルのAIMSメディアを軽く密閉された保存容器に注ぎます。プラスチックチューブを5%の二酸化炭素と95%の酸素を含むガスタンクに接続して、目的の媒体をガスと平衡化し、容器を摂氏30〜32度のウォーターバスに入れます。次に、エンドウ豆を含む中程度の110ミリリットルのエイムをボトルに入れ、氷の上に置きます。

溶液を100%酸素ガスで泡立てることにより、媒体を同一視します。重炭酸ナトリウムを含む残りのエイムス培地を、ファラデーケージの上の加熱されたリザーバーに入れます。チューブとボトルの上部にパラフォームを巻き付けて、溶液の上のスペースにガスを閉じ込め、5%の二酸化炭素、95%の酸素ガスで平衡化します。

ガラス空気分散チューブを使用して、ヒープ熱とAIMS媒体の25ミリリットルに0.75グラムを追加することにより、3%低ゲル化温度のarosを準備します。溶液は攪拌しながら摂氏約115度です。溶液が泡なしで透明になったら、溶かした寒天溶液を摂氏42度の水浴に入れます。

倒立顕微鏡に記録チャンバーを設置します。銀、塩化銀の参照電極の上に5センチメートルの寒天ブリッジをスライドさせ、記録チャンバーに配置します。ピペットチップの抵抗は、ピペットに内部溶液を充填し、ピペットホルダーに置き、ピペットホルダーをアンプヘッドステージに置き、ピペットを溶液に下げて生理学的記録のための視覚色素を保存することによって測定できます。すべての手順は、赤外線ゴーグルを使用して赤外線の下で実行する必要がありますが、すべての手順はここでは室内光で示されます。

マウスを安楽死させた後、湾曲したハサミを使用して目をすばやく取り除きます。目が転がらないように濾紙の上に置きます。次に、鉗子で目を所定の位置に保持し、薄い両面ブレードを使用して角膜にスリットを入れます。

眼球が穴を開けるとすぐに。照準媒体で満たされた60ミリメートルのペトリ皿に目を移します。角膜のスリットを入り口として、小さなハサミで角膜の残りの部分を切り取ります。

次に、水晶体と硝子体液を取り外し、網膜がアイカップに付着したままになるようにします。照準を詰めた軽い密閉容器に入れます。32°Cで95%酸素中の5%二酸化炭素と平衡化した培地。

次の半秒。10番のメスの刃を使ったアイカップの1つ。網膜を網膜色素上皮から分離します。

網膜の端を取り除き、組織が平らになるようにします。ラテックスバルブ付きの小さなガラスパスタピペットを使用して、35ミリメートルのペトリ皿に溶けた低ゲル化温度の寒天を満たし、鉗子を寒天に引きずり込んでその一貫性をテストします。寒天が固まり始めたら、網膜を寒天の上部に移します。

次に、網膜に触れずに、ねじれたキムワイプを使用して、その周りの余分な溶液を吸収します。さらに2〜3滴の寒天を網膜に直接置き、プラスチックシリンダーをすばやく配置して周囲に壁を形成しますが、シリンダーの中心付近の網膜は追加の溶融寒天に滴下され、ペトリ皿を氷水浴に移して冷却します。30秒後、組織を取り出し、プランジャーを使用して寒天ブロックを押し出し、網膜から最も遠い側から押します。

片面のカミソリの刃を使用して、網膜を含む小さな寒天のブロックを切り取り、ブロックを標本ディスクの寒天バックストップに対して瞬間接着します。標本ディスクを振動するミクロトームツリーに移し、氷冷した照準山をツリーに注ぎます。網膜のブロックを完全に水没させます。網膜を切断するのに4〜5秒かかるように前方ブレード速度を設定した最大ブレード振動速度を使用して、約200ミクロンの厚さで網膜スライスを切断します。ある時。

11番のメスの刃を使用して、ブロックから使用可能な各スライスを一度に1つずつ切り取ります。網膜を含むスライスを記録チャンバーに入れ、保持します。スライスアンカーを使用して、スライスアンカーを横切るナイロン糸

網膜を囲む寒天を押さえ、網膜を遮らないようにします。録音用。記録チャンバーを正立顕微鏡のステージに移します。

カーテンを閉じて赤外線光源をオンにすると、 view 赤外線感度カメラでスライス。顕微鏡下で、適切な切断角度で無傷の視細胞を持つ網膜スライスを特定します。スライスプロセスにより、表面の損傷が明らかになる場合があります。

先端が折れたピペットを使用して、死んだ細胞体をそっと吸い取ります この薄い細胞層を取り除くには、健康な生細胞層が明らかになったら、目的の層に位置がある細胞体を特定します。ピペットの先端を動かして細胞膜をくぼませ、穏やか、負、または内側に圧力をかけて、高耐性のシールを作成します。全細胞モードは、電極に負圧を加えて細胞に侵入することで実現できます。

次に、LEDを使用して光で網膜組織を刺激し、反応を誘発します。記録の最後に、ピペット内部溶液から細胞に透析したFluorの適切な励起光を使用して画像をキャプチャします。ここでは、強度が増す光の閃光に対して、暗く適応した網膜ニューロンの光誘発電位が示されています。

この図は、細胞がFluor Lucifer黄色の誘発蛍光で満たされた網膜スライスから撮影された蛍光写真であり、パッチ記録が行われた細胞の形態を示しています。このビデオを見た後、暗く適応した網膜スライスからパッチクランプ録音を行う際の複雑さについて理解を深めることができるはずです。この手順の目標は、制御された照明下で光誘発反応を測定することです。

これを行うには、最初に網膜を分離し、オーガーに埋め込んでから、単一細胞の記録を作成できる網膜スライスを準備する必要があります。